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ミクログリアは、環境刺激によって変更両方 pro - と抗炎症、能力を持っています。前の研究は、ミクログリアの活性化の変調は神経保護を与えることができる示されています。ニューロンに保護を提供して損傷を修復する能力は、これらの複雑な細胞の現在の理解を促進するためのより多くの研究を必要とします。したがって、高純度プライマリ ミクログリアの分離は重要かつ有用な手法です。これは非常に純粋なプライマリ ミクログリア 2 日以内の in vitro実験の準備を取得する比較的簡単な方法です。
マウスの脳からプライマリ ミクログリアの分離のための文献に記載されているプロトコルの範囲があります。主な課題は十分なサンプル、生存率と純度の高いを効率的に生成します。このプロトコルの主な利点は、培養時間を必要とせず非常に純粋なサンプルの収量です。したがって、メソッドが 2 週間から 2 日間に短縮、これは容易に高速な結果。評価の手順は、ミクログリア、これらの複雑な細胞の現在の理解を向上させる情報の堅牢な機能を得られます。プロトコルは、2 つの現在のアプローチ - 密度勾配遠心法と磁気分離を組み合わせたものです。他の分離テクニック14,15,16に比べて比較的穏やかな方法で、磁気分離ミクログリアの隔離のための文学にも検証されています。上記開発アッセイにおけるミクログリアのプロパティに変更をもとにしながら間違いなく、本来生体内でに比べて分離プライマリ ミクログリアの機能特性に変更がある、後消化基準などがこの免疫のサブセットの直接変調の反射と。
プロトコルは比較的簡単です、しながら重要なステップ中のケアはよい収穫を保障を助けます。まず、グリア細胞の成長をサポートする低血糖メディアを使用することが重要です。さらに、マウスの脳保たれなければならない氷で冷たい常時隔離中。したがって、可能であれば、楽器と同様、すべての媒体を事前寒さし、氷の上の手順を実行することをお勧めします。重要なは、長時間分離時間が貧しい細胞の健康につながるし、収量、ことがすぐに仕事に重要です。また、硬膜層の適切な除去は、成体マウス使用されるそれ以外の場合、線維芽細胞成長の面でグリア細胞を引き起こしたり、重要なステップです。脳の酵素の消化力の間にそれは重要なない細胞死を増やすことができますこのように小さすぎる部分に脳をカットする、理想的な組織の 1 mm2個セットを目指します。メディアで徹底的にリンス セル ストレーナーを介して組織を研削するとき数分ごとにすべてのセルを確認を洗浄したこし器に閉じ込め得ることは、さらに 100 μ m セル ストレーナーを使用する勧めします、小さいフィルターは、低収量。もう一つの重要なステップは、慎重にこの手順を実行する、勾配媒体層 70% の密度のアンダーレイとゆっくりと明確な界面が見られていることを確認するために不可欠ですが、パスツール ピペットの使用は推奨します。また、50 mL の円錐管を利用していた場合、細胞の分離はより少なく有能だったと、15 mL の円錐管の使用は推奨します。最後に、密度勾配遠心法は、温度は密度勾配に影響を与える部屋の温度で実行されなければなりません。
このプロトコルでは、CD45 の高発現と (末梢単球に見られる低 CD45 表現) と比較すると Cd11b の肯定的な表現で示すように、非常に純粋なプライマリ ミクログリア細胞の生産の信頼性の高い方法について説明します。セルすることができます分離比較的迅速に、これらグリア細胞の有意な増加を理解するスコープになっています。病気/けが、健康な動物から分離されたミクログリアの違いを明らかにする研究を可能にするさまざまな背景から異なるミクログリア集団を識別するために使用できます。純粋なミクログリアの人口の分離によるこの免疫細胞人口の治療変調を評価できます。例えば、hAEC エアコン メディアは affording 治療効果17、炎症性の刺激の間にミクログリア生存を改善させただけでなく貪食能を増加するが分かった。相関これはアポトーシスの残骸を減らす、従ってこれらのデブリのクリアランスがあります神経保護効果を示唆しています。
プロトコルは、新生児やアダルト マウス、しかし古いマウスは低収量を生成に適用できます。さらに、それは新生児や大人のマウスからプライマリ アストロ サイトの分離に適応させること、再び、古いマウスは、減収になります。さらに、大きい細孔径 100 μ m の細胞ストレーナーとは対照的に特注のナイロン メッシュに機械的解離ステップの変更はセル収量18をさらに改善するかもしれない。
このプロトコルの制限には、低い収量およびこのプロトコルに必要な時間が含まれます。利回りは、細胞培養の週間を通じて得ることができる数百万対六つの動物の処分につき約 150,000-200,000 セルです。さらに、しながら 2 日間内のセルから取得できます、最初の日に手順はかなり時間がかかり、約 6 時間を取ってします。
それにもかかわらず、このメソッドは、病気、隔離し、2 日以内のセルを我国の対応におけるミクログリアの役割を理解する上で非常に有用なツールです。正確で効率的な研究を促進する高純度プライマリ ミクログリア細胞が生成されます。

炎症、低酸素虚血および出血から周産期の期間中に取得した損傷は長期的後遺症の配列を持つことができます。周産期の脳損傷の複雑な病態は炎症や虚血後の神経細胞と軸索の死1理論します。生得の免疫反応は、傷害2につながるイベントの連鎖で重要な役割を果たしています。
ミクログリア、中枢神経系 (CNS)、内居住者の免疫細胞は、傷害3の最初の反応です。ミクログリアは、4の環境保護や毒性、依存する容量を持つプラスチック電池種類です。走化性、食作用、抗原提示、サイトカインや活性酸素種4、5の生産に関与しています。老齢ミクログリアは常に環境を調査し、外国または有害物質4の存在によってアクティブ化されます。活性化は、中枢神経系の保護4で重要な炎症応答に します。これらの M1「炎症」表現型ミクログリア主に抗原提示と病原体4の死に関与しています。にもかかわらず、神経保護の炎症反応の重要な役割は、自由なまたは長期の炎症が神経損傷4につながる有害なにできます。ただし、特定の環境の刺激にさらされると、ミクログリアは抗炎症の表現型を表わすことができます。これら pro 修復 M2 ミクログリア創傷治癒と修復6各種のサイトカインを放出する重要な役割があるし、他の溶性メディエーター レセプター炎症、貪食能を増加し、促進する修復4, 7. ミクログリアの役割は多様であり、再髄鞘化8、脳卒中モデル9で酸素とグルコース枯渇中に神経細胞を保護して神経突起を推進運転オリゴデンドロ サイト分化脊髄損傷は、10をモデル化します。
これらのグリア細胞の研究を理解および neuroinflammation への応答の処理で重要な側面を表します。記述のプロトコル アミロイド疾患におけるミクログリアの変調方式の治療の可能性をさらに調査できます。
ミクログリア活性化神経の役割への変調は、条件11,12,13の範囲で観察されています。したがって、現在の理解と活性化ミクログリアの変調をさらに勉強して改善は重要なin vitroとin vivoの両方を含むさまざまなモデルの使用を必要とします。In vitroの研究より効率、低いコストと能力孤立セル人口を調査するための重要なツールを表します。
ミクログリア マウス脳から効率的に良い生存率および高純度と高収率のサンプルを生成する課題の分離のための文献に記載されているプロトコルの範囲があります。プライマリ ミクログリアの分離の一般的に使用される方法は、磁気分離と混合培養の揺れです。個人的な経験を通して、磁気の列を妨げ細胞の残骸の高度があったことが分られました。したがって、次のプロトコルは、CD11b 磁気分離に続いて初期密度勾配遠心法手順を組み込んだに利用されました。下記プロトコルは、十分な量の非常に純粋なサンプルを生成する最適化されています。その高純度と短い期間のために有利である-1 つは、2-3 週間培養することがなく 2 日以内の試金を実行できます。このプロトコルは、プライマリ マウスアストロの隔離のため潜在的適応ことができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="929">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td style="width:133px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">11885084</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">DNaseI grade II from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3125-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18770</td>
			<td>EasySep magnet variant</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">EasySep magnet</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">EasySep Buffer</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>20144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Dulbecco&#39;s Phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Trypsin (2.5%) (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block&#8482;)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">175cm&#178; Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Paraformaldehyde (powder, 95%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Triton-X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Rabbit Anti-Iba1</td>
			<td>Wako</td>
			<td>01919741&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">FACS Antibodies</td>
			<td style="width:133px;">Company</td>
			<td style="width:344px;">Catalog Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO</td>
			<td style="width:133px;">BD Biosciences</td>
			<td>560501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">PerCP-Cy5.5 CD11b&#160;</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>45-0112-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">ZombieNIR</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P35361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Annexin.V_FITC</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Propodium Iodide solution</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-233</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization and isolation of mouse primary microglia by density gradient centrifugation

ミクログリア、脳内の居住者の免疫細胞は、炎症や中枢神経系に傷害の最初の反応です。最近の研究は、動的、プロ炎症性と抗炎症の表現型を想定しての対応するミクログリアを明らかにしました。M1 (炎症) と M2 (pro 修復) 表現型プレイ アミロイド条件周産期の脳損傷など展示異なる重要な役割機能ある特定の環境刺激に応答します。ミクログリア活性化の変調は神経保護ミクログリアが脳損傷の治療の可能性あるかもしれませんが示唆を与えるに指摘されています。しかしより多くの研究は病気におけるミクログリアの役割を理解するために必要なこのプロトコルを容易にします。プロトコルは下記を組み合わせた磁気分離、体外実験のために使用できる主要な小グリア細胞の純度の高いサンプルの生産と細胞の残骸を減らすために密度勾配の遠心分離プロセス、2-3 週間培養の必要があります。さらに、評価手順は、ミクログリア、偏光の私達の理解を改善するための研究を支援し、これらの細胞のプライミング再生医療の分野で強力な影響を持っている情報の堅牢な機能を得られます。

ここで説明した方法を使用して、ミクログリアの純粋な人口は分離できるので、体外と FACS 解析を用いた特性評価のために準備することができます。そもそも、18 動物まで使用できます選別、約 450,000 600,000 ミクログリア細胞の期待利回りあたり。最初に単離細胞の純度を確認することが重要だし、CD45 と CD11b ミクログリアの同定、2 つのマーカーの染色で FACS 解析を行ったように証明できる面倒、ミクログリアによって表現される多くのマーカーはまた表明しました。大食細胞、およびこれらの 2 つのマーカーの使用は、正確かつ信頼性の高い定量をことができます。具体的には、ミクログリア CD45、中枢神経系と末梢のマクロファージで高発現と比較しての低表現し、CD11b 陽性があります (図 1)。この特定の分離から 89.3% の純度が報告されました。CD11b の汚損の後、我々 はことを注意してください私たちの主のミクログリアが (より小さいより多くとより分岐し、はっきりと unramified (大きい球状細胞体からほとんど、あるいは全くの拡張プロセスの) 形態の範囲で類似の形態学的特徴を共有楕円形の突起と第 2 優先順序プロセスまで通常)生体内で(図 2) を参照してくださいに期待どおりにアクティブ化の状態の範囲に相関します。
次に、ミクログリアの機能および生存のための 2 つの特性アッセイを実行しました。マイクログリアは中枢神経系の主要な貪食細胞と pHrodo 分析により、この特定の機能特性の定量化。蛍光 pHrodo 粒子の定量化による測定、貪食能 hAEC 24 h 共培養培地 (図 3) を調節された後でほぼ 3 倍向上が認められました。最後に、次の炎症性の侮辱ミクログリアの生存を識別するために AnnexinV-PI 染色次共培養を行った。ミクログリア アポトーシス馴化培地 (図 4) による治療が認められた後に削減。そのエアコン hAEC メディア ミクログリアを保護し、周産期脳障害とアミロイド疾患の治療があるかもしれない彼らの貪食能を高めることが示唆されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57065/57065fig1.jpg"> 図 1: CD45 とミクログリアによって CD11b の発現。各ドットはラベル付きセルをでき、FACS 解析の独立した細胞集団の解明。ミクログリア末梢単球由来マクロファージと比較して CD45 抗原発現が低い、正 CD11b。 抗体のラベルの下の数字は親の人口の割合として表されるゲートの細胞の割合を示しています。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57065/57065fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57065/57065fig2.jpg"> 図 2: 隔離されたプライマリ ミクログリアの形態。この図でわかるように、ミクログリアは、球形の細胞体と明確な区分された構造を保持します。スケール バー = 20 μ m。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57065/57065fig3.jpg"> 図 3: 隔離されたプライマリ ミクログリアの貪食能の定量化します。pHrodo ラベルの粒子だけ酸性環境では、次の貪食細胞のエンドソームのようなときに蛍光を発する。ここでは、エアコン hAEC 媒体で扱われるミクログリアの pHrodo 粒子摂取量の増加が観察されます。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57065/57065fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57065/57065fig4.jpg"> 図 4: 炎症性侮辱後ミクログリアの生存の解析。(A) 代表的な FACS 分離ミクログリアのプロット。AnnexinV と propidium のヨウ化物イオンの結合された染色には、LPS 刺激後アポトーシス、壊死、または生きているセルのいずれかに分類することができます。(B) hAEC エアコン コントロールは、この型のセルの保護のフォームを示唆を基準にして中の大幅に削減ミクログリア アポトーシス。* p を意味する < 0.05、スチューデントの t 検定。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57065/57065fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>洗浄媒体</td>
		</tr>
<tr>
<td>低血糖ダルベッコ変法イーグル培地</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 %v/v ペニシリン-ストレプトマイシン</td>
		</tr>
<tr>
<td>(脳) あたり・ ダイジェスト培地</td>
		</tr>
<tr>
<td>150 μ L DNase 私</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 μ L パパイン (17U/mg 株式)</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 ml 洗浄中</td>
		</tr>
<tr>
<td>成長培地</td>
		</tr>
<tr>
<td>低血糖ダルベッコ変法イーグル培地</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% 胎児血清</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 %v/v ペニシリン-ストレプトマイシン</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: ソリューションの表。

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Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

マウスの脳からプライマリ ミクログリアの隔離のためのプロトコルが表示されます。この手法は、神経学的な条件の現在の理解の促進に役立ちます。密度勾配遠心法と磁気分離は、純度の高いサンプルの十分な収量を生成する結合されます。さらに、ミクログリアの特性評価のための手順をまとめました。

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

characterization-isolation-mouse-primary-microglia-density-gradient

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.1K ビュー.  Hudson Institute of Medical Research. マウスの脳からプライマリ ミクログリアの隔離のためのプロトコルが表示されます。この手法は、神経学的な条件の現在の理解の促進に役立ちます。密度勾配遠心法と磁気分離は、純度の高いサンプルの十分な収量を生成する結合されます。さらに、ミクログリアの特性評価のための手順をまとめました。

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Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

不連続パーコール-ショ糖密度勾配を用いてマウスの皮質からSynaptoneurosomesの調製

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

神経科学

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in the late 1960&#8217;s, proteins associated with the synaptic plasma membrane can be isolated by ultracentrifugation on a sucrose density gradient. Once synaptic membranes are isolated, the macromolecular complex known as the post-synaptic density can be subsequently isolated due to its detergent insolubility. The techniques used to isolate synaptic plasma membranes and post-synaptic density proteins remain essentially the same after 40 years, and are widely used in current neuroscience research. This article details the fractionation of proteins associated with the synaptic plasma membrane and post-synaptic density using a discontinuous sucrose gradient. Resulting protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

This article details the enrichment of proteins associated with the synaptic plasma membrane by ultracentrifugation on a discontinuous sucrose gradient. The subsequent preparation of post-synaptic density proteins is also described. Protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

不連続ショ糖勾配を用いてシナプス形質膜とシナプス後肥厚タンパク質の調製

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

低密度初代海馬ニューロンの文化

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. Microglia are mesodermal cells that function similarly to macrophages in surveying inflammatory stress. The classical (M1-type) and alternative (M2-type) activations of macrophages have also been extended to microglia in an effort to better understand the underlying interplay these phenotypes have in neuroinflammatory conditions such as Parkinson&#39;s, Alzheimer&#39;s, and Huntington&#39;s Diseases. In vitro experimentation utilizing primary microglia offers rapid and reliable results that may be extended to the in vivo environment. Although this is a clear advantage over in vivo experimentation, isolating microglia while achieving adequate yields of optimal purity has been a challenge. Common methods currently in use either suffer from low recovery, low purity, or both. Herein, we demonstrate a refinement of the column-free CD11b magnetic separation method that achieves a high cell recovery and enhanced purity in half the amount of time. We propose this optimized method as a highly useful model of primary microglial isolation for the purposes of studying neuroinflammation and neurodegeneration.

Here, we present a protocol to isolate microglia from postnatal mouse pups (day 1) for in vitro experimentation. This improvised method of isolation generates both high yield and purity, a significant advantage over alternate methods that allows broad range experimentation for the purposes of elucidating microglial biology.

強化された純度と汎用性を持つ初代ミクログリアの迅速かつ洗練されたCD11b磁気分離

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

分離およびゼブラフィッシュ稚魚の脳から神経細胞、大食細胞、ミクログリアの RNA の抽出

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of oligodendroglia as well as the biology of demyelinating diseases such as multiple sclerosis and Pelizaeus-Merzbacher-like disease (PMLD). Here, we present a simple and efficient selection method for the immunomagnetic isolation of stage three O4+ preoligodendrocytes cells from neonatal mice pups. Since immature OL constitute more than 80% of the rodent-brain white matter at postnatal day 7 (P7) this isolation method not only ensures high cellular yield, but also the specific isolation of OLs already committed to the oligodendroglial lineage, decreasing the possibility of isolating contaminating cells such as astrocytes and other cells from the mouse brain. This method is a modification of the techniques reported previously, and provides oligodendrocyte preparation purity above 80% in about 4 h.

We describe the immunomagnetic isolation of primary mouse oligodendrocytes, which allows the rapid and specific isolation of the cells for in vitro culture.

マウスの主なオリゴデンドロ サイトの特異的・迅速免疫分離

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.

初代細胞培養のための新生児マウスからのミクログリア細胞の磁気単離

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to use these cells for the purpose of studying the pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) in the rat hSOD1G93A model. First, the protocol shows how to isolate and culture astrocytes and microglia from postnatal rat cortices, and then how to characterize and test these cultures for purity by immunocytochemistry using the glial fibrillary acidic protein (GFAP) marker of astrocytes and the ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba1) microglial marker. In the next stage, methods are described for dye-loading (calcium-sensitive Fluo 4-AM) of cultured cells and the recordings of Ca2+ changes in video imaging experiments on live cells.
The examples of video recordings consist of: (1) cases of Ca2+ imaging of cultured astrocytes acutely exposed to immunoglobulin G (IgG) isolated from ALS patients, showing a characteristic and specific response compared to the response to ATP as demonstrated in the same experiment. Examples also show a more pronounced transient rise in intracellular calcium concentration evoked by ALS IgG in hSOD1G93A astrocytes compared to non-transgenic controls; (2) Ca2+ imaging of cultured astrocytes during a depletion of calcium stores by thapsigargin (Thg), a non-competitive inhibitor of the endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase, followed by store-operated calcium entry elicited by the addition of calcium in the recording solution, which demonstrates the difference between Ca2+ store operation in hSOD1G93A and in non-transgenic astrocytes; (3) Ca2+ imaging of the cultured microglia showing predominantly a lack of response to ALS IgG, whereas ATP application elicited a Ca2+ change. This paper also emphasizes possible caveats and cautions regarding critical cell density and purity of cultures, choosing the correct concentration of the Ca2+ dye and dye-loading techniques.

We present here a protocol on how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from rat cortices for time-lapse video imaging of intracellular Ca2+ for research on pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis in the hSOD1G93A rat model.

ラットアストロサイトおよびミクログリアの初代培養と筋萎縮性側索硬化症の研究におけるそれらの使用

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). Microglia can be divided into resting state and activated state and can rapidly change state in response to the microenvironment of the brain. Microglia will be activated under different pathological conditions and exhibit different phenotypes. In addition, there are many different subgroups of activated microglia and great heterogeneity between different subgroups. The heterogeneity mainly depends on the molecular specificity of microglia. Studies have revealed that microglia will be activated and play an important role in the pathological process of inflammatory demyelination. To better understand the characteristics of microglia in inflammatory demyelinating diseases such as multiple sclerosis and neuromyelitis optica spectrum disorder, we propose a perilesional primary microglial sorting protocol. This protocol utilizes columnar magnetic-activated cell sorting (MACS) to obtain highly purified primary microglia and preserve the molecular characteristics of microglia to investigate the potential effects of microglia in inflammatory demyelinating diseases.

Here, we present a protocol to isolate and purify primary microglia in animal models of demyelinating diseases, utilizing columnar magnetic-activated cell sorting.

脱髄の動物モデルにおける磁気活性化細胞選別によるマウス原発性ミクログリアの単離

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid enzymatic dissociation of skin. Primary keratinocytes, fibroblasts, and Schwann cells are all harvested from the human newborn foreskin, which is available following standard of care procedures. The removed skin is disinfected, and the subcutaneous fat and muscle are removed using a scalpel. The method consists of enzymatic and mechanical separation of epidermal and dermal layers, followed by additional enzymatic digestion to obtain single-cell suspensions from each of these skin layers. Finally, single cells are grown in appropriate cell culture media following standard cell culture protocols to maintain growth and viability over weeks. Together, this simple protocol allows isolation, culturing, and characterization of all three cell types from a single piece of skin for in vitro evaluation of skin-nerve models. Additionally, these cells can be used together in co-cultures to gauge their effects on each other and their responses to in vitro trauma in the form of scratches performed robotically in the culture associated with wound healing.

The study of wound healing associated with musculoskeletal injury often requires the assessment of in vitro interactions between Schwann cells (SCs), keratinocytes, and fibroblasts. This protocol describes the isolation, culturing, and characterization of these primary cells from the human foreskin.

ヒト包皮からの初代シュワン細胞、ケラチノサイト、および線維芽細胞の単離、培養、および特性評価

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリミクログリアの分離