Aşağıdaki yordamlar Monash Üniversitesi'nde hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmış olması. Sağlıklı tedavi edilmezse kardiyolojik C57Bl6/J P3-6 fareler temsilcisi sonuçları oluşturmak için kullanılan.
1. Enzimatik sindirim
Not: Yalıtma ve Primer hücre kültürü çalışmalarının kısırlık dikkate almak önemlidir. Çevre olarak steril olduğunu kontrol ettikten iken ilk diseksiyon ve fare beyni hasat laminal akışı başlık dışında bir laminar akış başlık içinde gerçekleştirilen sonraki tüm adımlar ile tamamlanabilir.
<ol><li>Steril aletler kullanarak, fare tarafından servikal çıkığı ötenazi, hayvan başını kesmek ve % 100 etanol ile durulayın. Küçük steril makas kullanırken, başın sağ ve sol kenarlarında küçük kesiler olun. Bu yaşta, Cilt kolayca uzağa soyar. Kıvrımlı pensler ipuçlarını kullanarak, doku Bregma de dahil olmak üzere kafatası, ortaya çıkarmak için Kürsü doğru yavaşça kaydırın.</li>
	<li>Spinal kanal açılış makas ucunu takın ve doğrudan kulak kanalınıza yanal bir kesi yapmak. Bir kesik sagittal dikiş boyunca hafifçe yukarı doğru beyin zarar önlemek için makas ucu işaret Bregma için yapmak. Makas ucu Bregma takın ve koronal sütür boyunca baş sağ ve sol tarafı için yanal insizyon olun.</li>
	<li>Forseps kullanarak, yavaşça kafatası beyin ortaya çıkarmak için peel away. Bunu yapmak için yan kesi tarafından maruz kafatası kenarları tutun ve hafifçe kafatası kenara çek. Kafatası peel away kolayca. Eğri forseps kullanarak, yavaşça kaldırmak için altında beyin Kepçe.</li>
	<li>Beyin bir 5 mL steril kapsayıcısına getirin, 2 - 3 kez yaklaşık 5 mL medya yıkama kan kaldırmak için ücret ile buz gibi yıkama medya (düşük glikoz Dulbecco'nın modifiye kartal orta (%1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş DMEM)), yıka.</li>
	<li>Bir laminar hava akımı başlık, buz üstünde dinlenme küçük petri kabına (35 mm), 5 mL kapsayıcısında içeriğini yerleştirin. Steril neşter bıçak veya steril makas kullanılarak, beyincik ve olfaktör ampul kaldırın. Bir orta hat iki hemisferlerin ayırmak için kesim yapmak.</li>
	<li>Dikkatle meninjeal katman cortices zarar vermemeye dikkat çekici iyi Forseps ile peel away. Meninjeal katman görünür kan damarları ile beyin yüzeyinde kırmızı bir belirti hücreleri çok ince bir tabaka tanımlar. Beynini soğuk tutmak için uygun meninkslerde kaldırılması esastır. Meninjeal katman tatili, tamamen kaldırılana kadar yırtık parçaları uzak kabuk soyma devam.</li>
	<li>Yeni küçük petri kabına (buzda) ve doldurma ile yıkama kitle iletişim araçları hemisferlerin aktarın. Beyin steril neşter bıçak/makas ile küçük parçalar halinde doğrayın. Not: Bunlar ~ 1 mm2 boyutunda olmalıdır ve bu verim azaltabilir gibi onları çok küçük parçalar halinde kesilmiş değil için özen gösterilmelidir.</li>
	<li>100 µL papain (17 U/mg hisse senedi) ve 150 µL ekleyin Dnaz ben medya içine ve 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya</li>
	<li>Sindirim P1000 pipet kullanarak doku triturate. Doku parçaları pipet girmeniz için fazla büyüktür, pipet ucu genişletmek için bir çift veya steril makas kullanarak göz önünde bulundurun. Bu işlem sırasında bu hücre canlılığı azaltabilir kabarcıklar medya içine tanıtmadım için dikkat ediniz.</li>
</ol>2. miyelin enkaz kaldırma
<ol><li>Laminar akış başlığı altında steril ekipman kullan, 50 mL konik tüp her beyin için bir 100 µm hücre süzgeç ile hazır olun. Petri dish, Özet orta ve beyin parçaları üzerine bir süzgeç içeren içeriğini dökün. Beyin parçaları kadar görünür hiçbir daha fazla doku bileme çekimde bir steril 3 mL şırınga pistonu kullanarak itin. Sindirim, beyin dokusu dışında kolayca düşmek gerekir.</li>
	<li>Sürekli yıkama medya filtresiyle bu süreci boyunca hücre süzgeç kadar topping yıkayın. Bu süzgeç tuzağa hücreler aracılığıyla temizler. Not: tüp yaklaşık ~ 15 mL kadar yapılması gerekir. Bu süzgeç aracılığıyla yeterince yıkanır, toplanan hücre miktarını en üst düzeye çıkarmak üzere.</li>
	<li>
Tek hücre süspansiyon vasıl 500 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi Bu süre boyunca, yoğunluk gradient orta açıklandığı şekilde hazırlayın.
	<ol>
<li>Kullanılacak yoğunluğu Degrade aracını olan hisse senedi izotonik percoll (SIP), hazır olun. Bu steril Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBSS) x 10 9:1 oranı yoğunluk gradient orta ekleyerek yaparsınız.</li>
		<li>Degradeler 30 olarak hazırlamak % 70 ve % DMEM YUDUM YUDUM 1 x HBSS. Örneğin, 10 mL 30 hazırlamak için % YUDUM YUDUM 3 mL 7 mL DMEM ekle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Süpernatant 8 mL % 30 ile hücre Pelet YUDUM DMEM içinde konik boru ve resuspend Aspire edin. Tam birim taze 15 mL konik tüp aktarın.</li>
	<li>% 70 SIP çözüm altına koymak. Bunu yapmak için bir transfer pipet %70 SIP ve dikkatli bir şekilde konik tüp altına transfer pipet ile itme ile doldurun. İpucu alt yakın olduğunda, transfer pipet içeriği ile yavaşça itin. Not: Bunu yavaş yavaş 30/70 arabirimi kesintiye uğratmak değil için. İki katmanı ayıran net bir çizgi olması gerekir.</li>
	<li>650 x g 25 dakika oda sıcaklığında 4, hızlanma ve fren 0 ile de hücreleri de dahil olmak üzere SIP katmanları santrifüj kapasitesi. Not: Fren OFF spin tamamlamak ve santrifüj fren uygulanmasına Interphase bozabilir ve hücre toplama SIP katmanlar arasında önemli ölçüde azaltmak olarak durdurmak için yavaş yavaş gelmek izin vermek için önemlidir.</li>
	<li>Tüp üstündeki hücresel enkaz Aspire edin ve yaklaşık 4 mL medya en baştan çıkarmak. Bu aşağıdaki adımı mononükleer hücrelerde çıkarılması kolay olmayacaktır. P1000 pipet kullanarak, dikkatle pipet ucu Interphase doğru indirin. 30/70 yoğunluk gradient orta arayüzü mononükleer hücreler yalıtmak. Yaklaşık 3 mL bulutlu arabirimi ve transfer için yeni 15 mL konik tüp toplamak. Bu karışımı ile yoğunluk gradient orta kaldırılmasını yardım etmek için HBSS 9 mL seyreltik.</li>
	<li>Santrifüj kapasitesi sulandırılmış yoğunluk gradient orta interfaz, mononükleer hücreler içeren 5 dakika süreyle 500 x g de süpernatant Aspire edin ve 1 mL büyüme orta (% 10 fetal sığır serum ve % 1 antibiyotik ile desteklenmiş DMEM) ile resuspend. Bunu takiben trypan resuspended hücrelerle mavi leke ve bir haemocytometer kullanan bir hücre sayısı gerçekleştirin.</li>
</ol>3. manyetik aktif hücre sıralama
Not: Aşağıdaki adımları üreticilerin iletişim kuralından değiştirilir.
<ol><li>Kendine hakim mononükleer hücre vasıl 300 x g 4 ° C'de bu manyetik yalıtım ile müdahale edecek gibi büyüme orta kaldırmak için 10 dakika santrifüj kapasitesi. Adım 2.8 elde edilen aynı hücre sayısı kullanarak, resuspend 1 x 108 hücre/mL PBS (++ Ca ve Mg++ ücretsiz) parçalanmayabilir %2 0,1-2.5 tonluk bir birim içindeki FBS ve 1 mM EDTA içeren mL.</li>
	<li>Çekirdekli hücre tam birim PBS içinde bir taze 5 mL (12 x 75 mm) polistren yuvarlak alt tüp önceki adımda ekleyin. 50 ekleyin µL CD11b PE etiketleme reaktif 1 mL örnek başına. Oda sıcaklığında ışıktan korunan 15dk için kuluçkaya.</li>
	<li>70 µL seçimin kokteyl (PBS CD11b karşı Monoklonal antikor birleşimi) 1 mL örnek başına ekleyin. Oda sıcaklığında ışıktan korunan 15dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Manyetik parçacıklar aşağı yukarı 5 katından fazla pipetting tarafından karıştırın. 50 µL/mL örnek için ekleyin. 10 dk ışıktan korunan için oda sıcaklığında kuluçkaya. Not: Bu parçacıklar daha sonra antikorlar ile tetrameric bir kompleks oluştururlar ve manyetik sütuna bağlı olsun.</li>
	<li>Hücre karışımı hacmi az 2.5 mL ise, bu birimin PBS (++ Ca ve Mg++ ücretsiz) ile üst % 2 FBS ve 1 mM EDTA içeren ve hafifçe 2 - 3 kez pipetting tarafından karıştırın. (Kapak) olmadan tüp mıknatıs yerleştirin ve 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>Bir sürekli çekimde tam olarak 2-3 s, süpernatant dökme için tüp içeren mıknatıs tersine çevirin. Mıknatıs bir dik konuma getirin ve tüp mıknatıs kaldırın. Sütundan kalan hücreleri yıkamak için hazır olun. Not: Süpernatant hala içinde iken mıknatıs tüp ters çevirme tarafından kaldırılır etiketsiz ve istenmeyen hücreler içeriyor. Ekli Cd11b tüp içerir+ hücreleri.</li>
	<li>Hücreleri 3.5 ve 3.6 iki kez daha fazla adımları tekrar ederek yıkayın. Örnek 1 mL büyükse, daha fazla yineleme adımları 3.5 ve 3.6 önerilir.</li>
	<li>İstenen büyüme orta hücrelerde resuspend. Koleksiyon gemi de tarafında durulama (e.g. 15 mL tüp) tüp iki tarafından hücreleri toplamak ve verimi en üst düzeye çıkarmak için.</li>
</ol>4. Microglia saflık doğrulanması
Not: birincil microglia 3 L izole (n = 5 hayvanlar toplam) yolu ile floresan aktif hücre (FACS) temsilcisi sonuçları için saflık belirlemek için sıralama doğrulandı.
<ol><li>Kültür hücreleri içeren FBS gecede, 1-2 x şişe başına 106 hücre yoğunluğu, tohum % 10 büyüme orta bir T-25 şişesi.</li>
	<li>PBS 3 ile T-25 şişeler hücrelerde yıkama x trypsinization ile etkileşebilir kalan herhangi bir büyüme medya kaldırmak 5 min için.</li>
	<li>2 mL % 0.25 tripsin şişeler hücrelerden ayırmak için ekleyin. Tripsin hacmi şişeye tüm yüzeyine karşılamak için yeterli olduğundan emin olun. Nazik tripsin Tekdüzen kapsama sağlamak için balonun ardından dönen, 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya</li>
	<li>2 mL % 10 içeren büyüme ortamının ekleyerek trypsinization işlemi gidermek FBS balonun içine.</li>
	<li>Trypsinized hücreleri ve 4 ° C'de hücreleri toplamak için 5 min için 500 x g, santrifüj içeren süpernatant toplamak.</li>
	<li>Büyüme orta ve tripsin içeren süpernatant kaldırmak ve Pelet 500 μL FACS arabellekte resuspend. Trypan mavi kullanan hücre sayısı gerçekleştirin.</li>
	<li>4 ° C'de 5 min için 500 x g, santrifüj FC reseptör blok ekleme 50 μL FACS tampon + 1 μL FcR engelleyici 5 x 106 hücre başına yerine getirilir. 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya Not: Fc reseptör blok boyama yordamdaki non-spesifik bağlama immünglobulin bağışıklık hücre popülasyonlarının Fc reseptörleri engellemek için kritik bir adımdır. Bu abluka aşağı akım bağlama diğer antikorların etkilemez.</li>
	<li>Engelleme işlemi ile 500 μL FACS tampon sulandrarak sonlandırmak. Bunu, 500 x g 4 ° C'de 5 min için de hücreleri içeren karışım santrifüj kapasitesi</li>
	<li>500 taze μL FACS arabellekte resuspend.</li>
	<li>Hücreleri (FACS arabelleği, kullanım 400 μL 500 μL hücrelerde resuspending Eğerörneğin ) çoğunluğu bir örnek tüp içine yerleştirin. Kalan hücreleri kontrol tüpleri arasında dağıtmak ve denetim tüp başına 100 μL top (örneğin 6 kontrol tüpleri için 16.67 μL her denetim tüp ve üst ile 83.33 μL FACS tampon koymak). Gruplar (kalın kontrol tüpleri) Unstained, lekeli tek (CD45, CD11b), tek canlı/ölü leke, FMOs ve örnek tüpleri yapmak.</li>
	<li>500 x g 4 ° C'de 5 min için de centrifuging tarafından tüm tüpler hücrelerde cips</li>
	<li>5 x 106 hücre başına 100 μL FACS arabellek başına 1 μL antikor ile tüp hücrelerde leke. 4 ° C'de 20 dk için kuluçkaya Not: 2 x 10 daha az6 hücreler kullanılır 50 μL antikor kokteyl kullanın.</li>
	<li>500 μL FACS arabellek hücrelerle yıkayın. 500 x g 4 ° C'de 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi</li>
	<li>300 μL FACS arabellek hücrelerde resuspend. Not: hücre sayısı az 2 x 106~ 100 μl kullanın.</li>
	<li>Akış Sitometresi Analizi kullanarak, CD45düşük ve CD11b boyama için pozitif hücreler ölçmek. Bu yüzde izole birincil microglia karşılık gelir.</li>
</ol>5. immunohistokimyasal birincil Microglia boyama
<ol><li>1 x 105 hücre yoğunluğu bir 96-şey plaka hücrelerde büyüme orta ile plaka ve gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve 3 kez PBS ile yıkayın.</li>
	<li>15 dk. Kaldır PFA P1000 pipet ile PBS içinde %4 paraformaldehyde ile hücreleri saptamak, sonra onları 3 kere yıkamak PBS + % 0.1 ile Triton-X.</li>
	<li>Non-spesifik bağlama için blok ile % 3 sığır serum albümin oda sıcaklığında 1 h için.</li>
	<li>Tavşan Iba-1 (1: 100) 4 ° C'de 24 h için kuluçkaya Bunu takiben birincil antikor karışımı çıkarın ve 3 kez PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 1 h için ikincil Anti-tavşan GFP eşlenik (1: 200) ile kuluçkaya. Bunu takiben ikincil antikor karışımı çıkarın ve 3 kez PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Slaytlar floresan mikroskop kullanarak orta ve yakalama görüntüleri montaj bir floresan ile bağlayın.</li>
</ol>6. miktar Microglia kullanarak pHrodo tahlil
Not: PHrodo tahlil fagositoz kültürlü hücrelerdeki düzeyde tanımlanması için izin verir. Endositoz ile alımı içselleştirilmesi daha asidik ortamı içine floresan bioparticle conjugates bir düzeyde artar. Floresans düzeyleri sonra FACS tarafından sayısal. Aşağıdaki adımları üreticilerin iletişim kuralından değiştirilir.
<ol><li>1-2 x şişe başına 106 hücre yoğunluğu, tohum büyüme orta bir T-25 şişesi hücrelerde bir gecede, kültür. T-25 şişeler 5 min için PBS 3 kez ile hücrelerde yıkayın.</li>
	<li>2 mL % 0.25 tripsin kullanarak hücre bağlantısını kesin. 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya</li>
	<li>2 mL % 10 içeren büyüme ortamının ekleyerek trypsinisation işlemi gidermek FBS balonun içine.</li>
	<li>500 x g 4 ° C'de hücreler cips için 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve kültür orta 106 hücre/mL, birincil microglia içeren Pelet resuspend. Not: Alternatif olarak, plaka bir 96-şey tabak içinde en az bir gün önce hücreleri ve 1 x 105 hücrelerin iyi ücret için tahlil gerçekleştirilecek olan günde nişan al.</li>
	<li>1 x 105 hücreleri/iyi 96-şey plaka, iyi başına 100 μL plaka hücrelere. Denetimleri ve deneysel wells nüsha plaka ve her bir no-hücre kontrol arka plan çıkarma için olumlu denetim bir boş şey bırakın.</li>
	<li>Hayır-hücre arka plan çıkarma için boş bıraktı wells için büyüme ortamının 100 μL ekleyin. Not: diğer vitro tahlil gibi uygun kontrollerin dökümanları doğruluk için hayati önem taşımaktadır. Hayır hücrenin yanında denetim (arka plan) okuma, ayrıca negatif kontrol de içerir (pHrodo eşlenik ekledim, ancak buz üzerinde yerleştirilir).</li>
	<li>Plaka kapak ve bir kuluçka 37 ° C'de % 5 CO2 1 h için kuluçkaya</li>
	<li>Deneysel wells uyarıcı ve tedavi ekleyerek hazırlayın. Araç denetimleri (yalnızca büyüme medya) tedavi edilmeyen kuyular için ekleyin. Not: Lipopolysaccharide 1 µg/mL [uyarıcı] ve insan amnion epitel hücre (hAEC)-klimalı ortam [tedavi] temsilcisi sonuçlar üretmek için kullanılmıştır.</li>
	<li>Konjuge boya bir şişe çözülme, 2 mL alımını arabellek ve kısaca girdap ekleyin. Temiz cam tüp içine tüp içeriğini aktarmadan ve parçacıklar eşit dağınık emin olmak için 5 min için solüsyon içeren temizleyicide.</li>
	<li>Mikroplaka wells kültür ortamından Aspire edin ve hemen boya süspansiyon 100 μL ile değiştirin. Kapak ve 1 h için 37 ° C'de kuluçkaya. Not: kontrol tüpleri de leke unutmayın.</li>
	<li>Akış Sitometresi Analizi kullanarak, konjuge pHrodo boncuk için olumlu boyama hücreleri ölçmek ve aktif microglia phagocytosing, bir yüzdesi (üst) olarak mevcut.</li>
</ol>7. Microglia inflamatuar hakaret takip Apoptosis miktar
<ol><li>1-7 "microglia saflık doğrulama" bölümündeki adımları yineleyin.</li>
	<li>Hücreleri (FACS arabelleği, kullanım 400 μL 500 μL hücrelerde resuspended Eğerörneğin ) çoğunluğu bir örnek tüp içine yerleştirin. Kalan hücreleri kontrol tüpleri arasında dağıtmak ve denetim tüp (örneğin 6 kontrol tüpleri, her denetim tüp ve üst 83.33 μL FACS önbellekle 16.67 μL katlanmak için) başına 100 μL top. Gruplar (kontrol tüpleri kalın harflerle gösterilmiştir): günahı, tek lekeleri (AnnexinV, Propidium iyodür), tek canlı/ölü leke, FMOs, örnek tüpler.</li>
	<li>Tüpler hücrelerde 500 x g 5 min için de centrifuging tarafından cips.</li>
	<li>İle 1 μL antikor/100 μL FACS arabellek/5 x 106 hücreler 4 ° C'de 20 dk için kuluçkaya Not: Eğer daha az 50 μL kullanın 2 x 106 hücreler.</li>
	<li>Hücreleri 500 x g 5 min için de 500 μL FACS arabellek ve santrifüj ekleyerek yıkayın.</li>
	<li>Hücre Pelet 300 μL FACS arabellekte resuspend. Not: Eğer hücre sayısı az 2 x 106~ 100 μL.</li>
	<li>Her çeyrek daire içindeki hücreleri ölçmek (Q1: nekrotik, Q2: geç apoptotik, Q3: uygun, Q4: erken apoptotik).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+injury+in+premature+infants:+a+complex+amalgam+of+destructive+and+developmental+disturbances+(Report).">Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report).</a> Lancet Neurology. 8 (1), 110 (2009).</li><li>Saliba, E., Henrot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Mediators+and+Neonatal+Brain+Damage.">Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage.</a> Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).</li><li>Uwe-Karsten, H., Helmut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain.">Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1387 (2007).</li><li>Cherry, J. D., Olschowka, J. A., O'Banion, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+and+M2+microglia:+the+good,+the+bad,+and+the+inflamed.">Neuroinflammation and M2 microglia: the good, the bad, and the inflamed.</a> Journal of neuroinflammation. 11, 98 (2014).</li><li>Michell-Robinson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+microglia+in+brain+development,+tissue+maintenance+and+repair.">Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair.</a> Brain. 138 (5), 1138-1159 (2015).</li><li>Guohua, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/macrophage+polarization+dynamics+in+white+matter+after+traumatic+brain+injury.">Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (12), 1864 (2013).</li><li>Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Debris+clearance+by+microglia:+an+essential+link+between+degeneration+and+regeneration.">Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration.</a> Brain. 132 (2), 288-295 (2009).</li><li>Veronique, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M2+microglia+and+macrophages+drive+oligodendrocyte+differentiation+during+CNS+remyelination.">M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination.</a> Nature Neuroscience. 16 (9), 1211 (2013).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/macrophage+polarization+dynamics+reveal+novel+mechanism+of+injury+expansion+after+focal+cerebral+ischemia.">Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia.</a> Stroke. 43 (11), 3063 (2012).</li><li>Kigerl, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+effects+causing+either+neurotoxicity+or+regeneration+in+the+injured+mouse+spinal+cord.">Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord.</a> The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (43), 13435 (2009).</li><li>Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+&#945;7+nicotinic+acetylcholine+receptors+drive+a+phospholipase+C/IP3+pathway+and+modulate+the+cell+activation+toward+a+neuroprotective+role.">Microglial &#945;7 nicotinic acetylcholine receptors drive a phospholipase C/IP3 pathway and modulate the cell activation toward a neuroprotective role.</a> Journal of neuroscience research. 83, (2006).</li><li>Bedi, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+multipotent+adult+progenitor+cell+therapy+attenuates+activated+microglial/macrophage+response+and+improves+spatial+learning+after+traumatic+brain+injury.">Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury.</a> Stem cells translational medicine. 2, (2013).</li><li>Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthetic+triterpenoid+CDDO-methyl+ester+modulates+microglial+activities,+inhibits+TNF+production,+and+provides+dopaminergic+neuroprotection.">The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection.</a> Journal of neuroinflammation. 5, 14 (2008).</li><li>Gr&#252;tzkau, A., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+but+mighty:+How+the+MACS&#174;-technology+based+on+nanosized+superparamagnetic+particles+has+helped+to+analyze+the+immune+system+within+the+last+20+years.">Small but mighty: How the MACS&#174;-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years.</a> Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 147-147 (2012).</li><li>Holt, L. M., Olsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Applications+of+Magnetic+Cell+Sorting+to+Analyze+Cell-Type+Specific+Gene+and+Protein+Expression+in+the+Central+Nervous+System.">Novel Applications of Magnetic Cell Sorting to Analyze Cell-Type Specific Gene and Protein Expression in the Central Nervous System.</a> PLOS ONE. 11 (2), e0150290 (2016).</li><li>Leaw, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amnion+epithelial+cells+rescue+cell+death+via+immunomodulation+of+microglia+in+a+mouse+model+of+perinatal+brain+injury.">Human amnion epithelial cells rescue cell death via immunomodulation of microglia in a mouse model of perinatal brain injury.</a> Stem cell research &amp; therapy. 8 (1), 46 (2017).</li><li>Moujalled, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+mutations+causing+amyotrophic+lateral+sclerosis+are+associated+with+altered+expression+of+RNA-binding+protein+hnRNP+K+and+affect+the+Nrf2+antioxidant+pathway.">TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway.</a> Human Molecular Genetics. 26 (9), 1732-1746 (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Microglia çevre uyaranlara tarafından değiştirilmiş hem pro - ve anti-inflamatuar, yeteneği vardır. Önceki çalışmalar microglia harekete geçirmek modülasyon neuroprotection görüşmek göstermiştir. Yeteneklerini nöronlar koruma sağlamak ve hasarı onarmak için bu karmaşık hücrelerin geçerli anlayışı ilerletmek için daha fazla araştırma gerektirir. Böylece, yüksek saflıkta birincil microglia işlemleri olan bir önemli ve yararlı bir tekniktir. Bu son derece saf birincil microglia 2 gün içinde vitro deneyler için hazır almak için nispeten hızlı bir yöntemdir.
Fare beyni gelen birincil microglia yalıtım için literatürde açıklanan protokoller bir dizi vardır. Asıl sorun verimli bir şekilde üretmek yeterli örnek, canlılık ve saflık yüksek etmektir. Bu iletişim kuralı en büyük avantajı son derece saf bir örnek kültür zamanında gerek kalmadan verimidir. Böylece, yöntem 2 hafta 2 gün olarak kısaltılır, bu hızlı sonuçlar kolaylaştırır. Karakterizasyonu adımları sağlam işlevsel veri microglia, bu karmaşık hücrelerinin şimdiki anlayış geliştirme hakkında verim. Protokol iki güncel yaklaşımlar - yoğunluk gradient Santrifüjü ve manyetik ayırma birleştirir. Manyetik Ayırma de edebiyat microglia yalıtım için diğer yalıtım teknikleri14,15,-16ile karşılaştırıldığında nispeten yumuşak bir şekilde doğrulandı. Hiç şüphesiz onların yerli devlet in vivokarşılaştırıldığında izole birincil microglia fonksiyonel özellikleri yapılan değişiklikler yaparken herhangi bir değişiklik üzerinde geliştirilen deneyleri içinde gözlemlediği gibi microglia özellikleri üzerinden hesaplanır bir sonrası sindirim taban çizgisi, bu bağışıklık alt doğrudan modülasyon yansıtıcı edilmeliler.
Iken nispeten basit bir protokoldür, bakım kritik adımları sırasında iyi bir verim sağlamak için yardımcı olacaktır. İlk olarak, gliyal büyümeyi desteklemek için düşük glikoz medya kullanımı için çok önemlidir. Ayrıca, fare beyni buz soğuk, her zaman sırasında yalıtım tutulması gerekir. Böylece, tüm Orta yanı sıra aletleri mümkünse önceden soğuk ve buza yordamı uygulamanız önerilir. Önemlisi, uzun süreli yalıtım kez yoksul hücre sağlık için kurşun ve verim, böylece hızlı bir şekilde çalışması için önemlidir. Ayrıca, meninjeal katmanı uygun kaldırılması, Yetişkin fare ile aksi takdirde fibroblastlar çalışma gliyal hücreler büyüme açısından kul ne zaman önemli bir adımdır. Enzimatik sindirim beyin sırasında beyin bu çok küçük parçalar halinde kesmek için hücre ölümü artırabilir önemli değil, ideal için doku 1 mm2 adet nişan al. Doku hücre süzgeç aracılığıyla taşlama iyice durulayın medya ile tüm hücreleri emin olmak için birkaç dakikada ile yıkanır ve süzgeç tuzağa değil, ayrıca bir 100 mikron hücre süzgeç kullanmak için tavsiye edilir, daha küçük filtreleri neden olup bir Düşük verim. Başka bir kritik adım bu adımı dikkatle performans % 70 yoğunluğu degrade orta katman underlaying ve yavaş yavaş böylece net bir interfaz görülür sağlamak için çok önemlidir, Pasteur pipet kullanılması önerilir. Ayrıca, ne zaman 50 mL konik borular kullanılmıştır hücreleri ayrılması daha az etkili olduğu kadar 15 mL konik boru kullanılması önerilir. Son olarak, sıcaklık yoğunluk gradient etkileyebilir gibi yoğunluk gradient Santrifüjü oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir.
Bu iletişim kuralı CD45 yüksek ifadesi ve Cd11b olumlu ifade (karşılaştırıldığında düşük CD45 ifade periferik monosit görülen) tarafından gösterildiği gibi son derece saf birincil microglia hücreleri üreten güvenilir bir yöntem açıklanır. Hücreler de nispeten hızlı bir şekilde izole olabilir, böylece önemli ölçüde artmış anlayış bu glia hücreleri kapsama sahiptir. Hasta/yaralı ve sağlıklı hayvanlardan izole microglia arasındaki farklar ortaya çıkarabilir çalışmaları için izin farklı microglia nüfus farklı alanlardan tanımlamak için kullanılabilir. Yalıtım saf microglia nüfusun Bu bağışıklık hücre nüfusunun tedavi modülasyon tespit edilebilir. Örneğin, hAEC klimalı ortam fagositoz, hem de microglia hayatta kalma böylece terapötik yararları17saglayan bir enflamatuar uyarıcı sırasında geliştirilmiş bulundu. Bu için korelasyon apoptotik enkaz azalır ve böylece bu enkaz temizleme nöroprotektif etkileri olabilir göstermektedir.
Protokol ancak büyük fareler bir düşük verim üretecek yenidoğan veya yetişkin fareler için uygulanabilir. Ayrıca, birincil astrocytes yenidoğan veya yetişkin fareler gelen yalıtmak için adapte olabilir, daha büyük fareler bir azalan verim neden olur. Buna ek olarak, daha büyük gözenek boyutu 100 mikron hücre süzgeç karşı olan özel yapım naylon fileli mekanik ayrışma adım değişiklik daha fazla geliştirmek hücre verim18.
Bu protokol sınırlamaları daha düşük verim ve bu iletişim kuralı için gereken süreyi içerir. Yaklaşık 150.000-200.000 hücre, hücre kültürü hafta boyunca elde edilebilir milyonlarca karşı altı hayvanların itlaf başına verimidir. Ayrıca, hücreleri iki gün içinde elde edilebilir iken, ilk gün bu işlem oldukça zaman alıcı, yaklaşık altı saat alarak demek.
Yine de, bu yöntem microglia hastalığında, yalıtma ve hücreleri iki gün içinde karakterize yeteneğine sahip rolünün anlaşılması son derece yararlı bir araç olduğunu. Yüksek saflıkta birincil microglia hücreleri, doğru ve verimli araştırma kolaylaştırmak üretir.

İnflamasyon, hipoksik iskemisi ve kanaması perinatal dönemde edinilen hasar uzun vadeli sekel bir dizi olabilir. Perinatal beyin hasarı karmaşık Patofizyoloji inflamasyon ve ardından gelen nöronal ve aksonal ölüm1iskemi dahil etmek teorisini. Doğuştan gelen bağışıklık yanıtı olaylar yaralanma2' ye çağlayan önemli bir rol oynar.
Microglia, merkezi sinir sistemi (MSS), içinde yerleşik bağışıklık hücreleri yaralanma3ilk yardım ekipleri vardır. Microglia plastik hücre türü kapasiteli çevre4koruyucu veya toksik, bağımlı olmak vardır. Onlar Kemotaksis, fagositoz, antijen sunumu ve üretim sitokinler ve Reaktif oksijen türleri4,5yer alırlar. Senescent microglia sürekli çevre anket ve bir yabancı veya zararlı madde4varlığı ile aktif hale gelir. Harekete geçirmek bir pro-inflamatuar yanıt, CNS koruma4' te kritik yol açar. Bu M1 "pro-inflamatuar" fenotip microglia öncelikle antijen sunumu ve patojenler4ölüm söz konusu. Neuroprotection inflamatuvar yanıtta önemli rol rağmen zararlı ve nöronal hasar4kurşun kontrolsüz veya uzun süreli iltihap olabilir. Ancak, bazı çevresel uyaranlara maruz kaldığında, microglia bir anti-inflamatuar fenotip sergi. Bu pro-onarıcı M2 microglia iyileşmesi ve sitokinler bir dizi bırakmadan6, onarım kritik bir rol var ve diğer çözünür arabulucu tümleyici inflamasyon, fagositoz artırmak ve teşvik4, tamir 7. microglia roller çeşitlidir ve sürüş oligodendrocyte farklılaşma sırasında oksijen ve glikoz tükenmesi kontur modelleri9 sırasında nöronlar korunması ve neurite yapılan teşvik re-myelination8, dahil Medulla Spinalis Yaralanmalarında10modelleri.
Bu gliyal hücreler çalışma anlamakta ve neuroinflammation cevaben işleme önemli bir yönü temsil eder. Daha fazla araştırma yapılması tedavi potansiyel bir microglia modülasyon neuroinflammatory hastalıkları için açıklanan Protokolü sağlar.
Mikroglial etkinleştirme nöroprotektif rolü doğru modülasyon koşulları11,12,13aralıkta gözlenmiştir. Böylece, şimdiki anlayış ve daha fazla eğitim modülasyon mikroglial etkinleştirme içinde in vitro ve in vivode dahil olmak üzere çeşitli modellerinin kullanımı gerektiren kritik geliştirmektedir. Vitro çalışmalar nedeniyle daha fazla etkinlik, daha düşük maliyet ve yeteneği bir izole hücre nüfus araştırmak için önemli bir araç temsil eder.
Edebiyat microglia fare beyni, kimden verimli bir şekilde iyi canlılığı ve yüksek saflıkta ile yüksek verim örnek üretmeye meydan yalıtım için açıklanan protokoller bir dizi vardır. Manyetik Ayırma ve uzun süreli karma gliyal kültürleri sallayarak tarafından birincil microglia yalıtım sık kullanılan yöntemlerdir. Kişisel deneyim sayesinde, manyetik sütun tıkalı hücresel enkaz yüksek derecede oldu bulundu. Böylece, aşağıdaki iletişim kuralı, hangi CD11b manyetik ayırma tarafından takip bir ilk yoğunluk gradient Santrifüjü adım içermektedir kullanılmıştır. Aşağıda açıklanan protokol son derece saf bir örnek yeterli miktarda üretmek için optimize edilmiştir. Yüksek saflığı ve kısa sürede nedeniyle avantajlıdır — bir gerçekleştirebilir deneyleri 2 gün içinde 2-3 hafta kültür için gerek kalmadan. Bu iletişim kuralı potansiyel olarak birincil fare astrocytes yalıtım için adapte edilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="929">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td style="width:133px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">11885084</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">DNaseI grade II from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3125-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18770</td>
			<td>EasySep magnet variant</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">EasySep magnet</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">EasySep Buffer</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>20144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Dulbecco&#39;s Phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Trypsin (2.5%) (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block&#8482;)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">175cm&#178; Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Paraformaldehyde (powder, 95%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Triton-X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Rabbit Anti-Iba1</td>
			<td>Wako</td>
			<td>01919741&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">FACS Antibodies</td>
			<td style="width:133px;">Company</td>
			<td style="width:344px;">Catalog Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO</td>
			<td style="width:133px;">BD Biosciences</td>
			<td>560501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">PerCP-Cy5.5 CD11b&#160;</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>45-0112-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">ZombieNIR</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P35361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Annexin.V_FITC</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Propodium Iodide solution</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-233</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization and isolation of mouse primary microglia by density gradient centrifugation

Microglia, beyin, yerleşik bağışıklık hücreleri iltihap veya Merkezi sinir sistemine yaralanmaya ilk yardım ekipleri vardır. Son araştırma dinamik, pro-inflamatuar ve anti-inflamatuar fenotipleri varsayarak kabil olmak microglia ortaya koymuştur. Hem (pro-inflamatuar) M1 ve M2 (pro-onarıcı) fenotipleri oyun neuroinflammatory koşulları perinatal beyin hasarı ve sergi farklı gibi önemli bir rol belirli çevresel uyaranlara yanıt olarak işlev görür. Mikroglial harekete geçirmek modülasyon böylece microglia tedavi edici potansiyeli beyin hasarı olabilir düşündüren neuroprotection görüşmek için Not edildi. Ancak, daha fazla araştırma microglia hastalığında rolünün daha iyi anlamak için gereklidir ve bu iletişim kuralı bu kolaylaştırır. Protokol altında birleştiren son derece saf bir örnek içinde vitro deneyler için olmadan kullanılabilir birincil mikroglial hücre üreten manyetik ayırma ile hücresel enkaz azaltmak için bir yoğunluk degrade Santrifüjü işlemi açıklanmıştır. 2-3 hafta kültür gerek. Ayrıca, karakterizasyonu adımları rejeneratif tıp alanında güçlü etkileri vardır polarizasyon anlayışımızı geliştirmek için çalışmalar yardım ve bu hücrelerin priming microglia hakkında sağlam işlevsel veri verim.

Burada açıklanan yöntemleri kullanarak, saf microglia nüfusa ayrılmış olabilir ve vitro ve FACS çözümlemesi kullanarak karakterizasyonu için hazır olabilir. İlk olarak, kadar 18 hayvan itlaf, beklenen bir verim yaklaşık 450.000-600.000 mikroglial hücre ile başına kullanılabilir. İlk izole hücreler saflığı onaylamak çok önemlidir ve microglia tarafından ifade edilen birçok işaretleri de tarafından ifade edilir gibi FACS analiz için iki işaretleri CD45 ve CD11b. microglia tanımlaması boyama tarafından gerçekleştirilen yapmak zahmetli, ispat makrofajlar ve bu iki işaretleri kullanımı doğru ve güvenilir miktar sağlar. Özellikle, microglia CD45 CNS ve periferik makrofajlar, görülen yüksek ifadesine göre düşük bir ifade ve ayrıca CD11b için pozitif (Resim 1). Bu özel izolasyonu %89,3 saflığı bildirildi. CD11b için boyama sonra biz unutmayın bizim birincil microglia (ile daha küçük, daha fazla ramified için benzer Morfolojik özellikleri, türleri Morfoloji vücuttan belirgin unramified (büyük küresel hücre az veya hiç genişletilmiş süreçleri ile) bir dizi ile paylaşmak Oval somata ve genellikle en fazla ikincil sipariş işlemleri) etkinleştirme Birleşik, bir dizi için in vivo (Şekil 2) görmek için beklendiği gibi birleştiriliyor.
Bunu, microglia fonksiyonu ve hayatta kalmak için iki karakterizasyonu deneyleri işletilmiştir. Microglia MSS büyük fagositik hücrede, ve pHrodo tahlil miktar bu belirli işlevsel özellik sağlar. Floresan pHrodo parçacıklar miktar tarafından ölçülen sonra 24-h ortak kültür hAEC ile orta (şekil 3) şartına fagositik işlevi bir çevre 3 kat artış belirtilmişti. Son olarak, bir AnnexinV-PI boyama aşağıdaki ortak kültür inflamatuar hakaret takip microglia yaşama tanımlamak için gerçekleştirildi. Bir azalma şartına orta (şekil 4) ile tedavi gözlenmiştir sonra microglia apoptosis. Bu bulgular bu şartına hAEC orta microglia korur ve perinatal beyin hasarı ve neuroinflammatory bozukluklarında tedavi olabilir onların fagositik aktivite geliştirir öneririz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57065/57065fig1.jpg"> Resim 1 : CD45 ve microglia tarafından CD11b ifade. Her nokta etiketli bir hücreyi temsil eden ve FACS analiz ayrı hücre popülasyonlarının aydınlatma sağlar. Microglia periferik monosit kaynaklı makrofajlar karşılaştırıldığında CD45 antijen daha düşük bir ifade var ve sayıları CD11b. antikor etiketinin altında Geçitli hücreler üst nüfus yüzdesi cinsinden ifade edilen oranda olduğunu gösterir için olumludur. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57065/57065fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57065/57065fig2.jpg"> Resim 2 : Morfoloji izole birincil microglia. Bu şekilde görüldüğü gibi korumak microglia onların küresel hücre vücut ve farklı ramified yapısı. Ölçek çubuğu 20 µm =.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57065/57065fig3.jpg"> Şekil 3 : Miktar fagositik fonksiyonunu kullanabilirsiniz izole birincil microglia. pHrodo etiketli parçacıklar asidik ortamlarda zaman, hücresel endosomes fagositoz aşağıdaki gibi sadece belli. Burada, pHrodo parçacık anlamazdın şartına hAEC orta ile tedavi microglia bir artış görülmektedir. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57065/57065fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57065/57065fig4.jpg"> Şekil 4 : Analiz inflamatuar hakaret sonra microglia yaşama. (A) temsilcisi FACS araziler izole microglia. AnnexinV ve propidium iyodür kombine boyama stimülasyon LPS ile sonra apoptotik, çürümüş, veya canlı hücre içine sınıflandırma sağlar. (B) hAEC denetimleri, düşündüren bir form koruma bu hücre türüne göre orta önemli ölçüde azaltılmış microglia apoptosis şartına. * p ettiğinizi < 0,05, Öğrenci t-testi. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57065/57065fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Yıkama orta</td>
		</tr>
<tr>
<td>Düşük glikoz Dulbecco kartal orta değiştiren'ın</td>
		</tr>
<tr>
<td>% 1 v/v penisilin-streptomisin</td>
		</tr>
<tr>
<td>Orta (beyin) başına sindirmek</td>
		</tr>
<tr>
<td>150 µL Dnaz ben</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 µL papain (17U/mg stok)</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 ml yıkama orta</td>
		</tr>
<tr>
<td>Büyüme orta</td>
		</tr>
<tr>
<td>Düşük glikoz Dulbecco kartal orta değiştiren'ın</td>
		</tr>
<tr>
<td>% 10 fetal sığır serum</td>
		</tr>
<tr>
<td>% 1 v/v penisilin-streptomisin</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Tablo Çözümleri.

Watch this Scientific Journal Video about Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation at JoVE.com

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Bir iletişim kuralı üzerinden fare beyni birincil microglia yalıtım için sunulmaktadır. Bu teknik nörolojik koşullar geçerli anlayışı sürdürmek yardımcı olur. Yoğunluk gradient Santrifüjü ve manyetik ayırma son derece saf bir örnek yeterli verim üretmek için birleştirilmiştir. Ayrıca, biz microglia karakterizasyonu için adımlar verilmiştir.

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

characterization-isolation-mouse-primary-microglia-density-gradient

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.1K Görüntüleme.  Hudson Institute of Medical Research. Bir iletişim kuralı üzerinden fare beyni birincil microglia yalıtım için sunulmaktadır. Bu teknik nörolojik koşullar geçerli anlayışı sürdürmek yardımcı olur. Yoğunluk gradient Santrifüjü ve manyetik ayırma son derece saf bir örnek yeterli verim üretmek için birleştirilmiştir. Ayrıca, biz microglia karakterizasyonu için adımlar verilmiştir.

Video: Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

Süreksiz Percoll Sakkaroz Yoğunluk Gradient kullanarak Fare Cortex Synaptoneurosomes hazırlanması

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Nörobilim

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in the late 1960&#8217;s, proteins associated with the synaptic plasma membrane can be isolated by ultracentrifugation on a sucrose density gradient. Once synaptic membranes are isolated, the macromolecular complex known as the post-synaptic density can be subsequently isolated due to its detergent insolubility. The techniques used to isolate synaptic plasma membranes and post-synaptic density proteins remain essentially the same after 40 years, and are widely used in current neuroscience research. This article details the fractionation of proteins associated with the synaptic plasma membrane and post-synaptic density using a discontinuous sucrose gradient. Resulting protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

This article details the enrichment of proteins associated with the synaptic plasma membrane by ultracentrifugation on a discontinuous sucrose gradient. The subsequent preparation of post-synaptic density proteins is also described. Protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

Süreksiz Sukroz Degrade&#39;yi kullanma Sinaptik Plazma Membran ve postsinaptik Yoğunluk Proteinlerin Hazırlanması

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Düşük Yoğunluk İlköğretim Hipokampal Nöron Kültürü

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. Microglia are mesodermal cells that function similarly to macrophages in surveying inflammatory stress. The classical (M1-type) and alternative (M2-type) activations of macrophages have also been extended to microglia in an effort to better understand the underlying interplay these phenotypes have in neuroinflammatory conditions such as Parkinson&#39;s, Alzheimer&#39;s, and Huntington&#39;s Diseases. In vitro experimentation utilizing primary microglia offers rapid and reliable results that may be extended to the in vivo environment. Although this is a clear advantage over in vivo experimentation, isolating microglia while achieving adequate yields of optimal purity has been a challenge. Common methods currently in use either suffer from low recovery, low purity, or both. Herein, we demonstrate a refinement of the column-free CD11b magnetic separation method that achieves a high cell recovery and enhanced purity in half the amount of time. We propose this optimized method as a highly useful model of primary microglial isolation for the purposes of studying neuroinflammation and neurodegeneration.

Here, we present a protocol to isolate microglia from postnatal mouse pups (day 1) for in vitro experimentation. This improvised method of isolation generates both high yield and purity, a significant advantage over alternate methods that allows broad range experimentation for the purposes of elucidating microglial biology.

Geliştirilmiş Saflık ve Çok Yönlü İlköğretim mikroglia hızlı ve Rafine CD11 Manyetik İzolasyon

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Yalıtım ve RNA çıkarma larva Zebra balığı beyin sinir hücreleri, makrofajlar ve Microglia

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of oligodendroglia as well as the biology of demyelinating diseases such as multiple sclerosis and Pelizaeus-Merzbacher-like disease (PMLD). Here, we present a simple and efficient selection method for the immunomagnetic isolation of stage three O4+ preoligodendrocytes cells from neonatal mice pups. Since immature OL constitute more than 80% of the rodent-brain white matter at postnatal day 7 (P7) this isolation method not only ensures high cellular yield, but also the specific isolation of OLs already committed to the oligodendroglial lineage, decreasing the possibility of isolating contaminating cells such as astrocytes and other cells from the mouse brain. This method is a modification of the techniques reported previously, and provides oligodendrocyte preparation purity above 80% in about 4 h.

We describe the immunomagnetic isolation of primary mouse oligodendrocytes, which allows the rapid and specific isolation of the cells for in vitro culture.

Fare birincil Oligodendrocytes hızlı ve spesifik Immunomagnetic izolasyonu

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.

Birincil Hücre Kültürleri için Yenidoğan Fareden Mikroglial Hücrelerin Manyetik İzolasyonu

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to use these cells for the purpose of studying the pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) in the rat hSOD1G93A model. First, the protocol shows how to isolate and culture astrocytes and microglia from postnatal rat cortices, and then how to characterize and test these cultures for purity by immunocytochemistry using the glial fibrillary acidic protein (GFAP) marker of astrocytes and the ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba1) microglial marker. In the next stage, methods are described for dye-loading (calcium-sensitive Fluo 4-AM) of cultured cells and the recordings of Ca2+ changes in video imaging experiments on live cells.
The examples of video recordings consist of: (1) cases of Ca2+ imaging of cultured astrocytes acutely exposed to immunoglobulin G (IgG) isolated from ALS patients, showing a characteristic and specific response compared to the response to ATP as demonstrated in the same experiment. Examples also show a more pronounced transient rise in intracellular calcium concentration evoked by ALS IgG in hSOD1G93A astrocytes compared to non-transgenic controls; (2) Ca2+ imaging of cultured astrocytes during a depletion of calcium stores by thapsigargin (Thg), a non-competitive inhibitor of the endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase, followed by store-operated calcium entry elicited by the addition of calcium in the recording solution, which demonstrates the difference between Ca2+ store operation in hSOD1G93A and in non-transgenic astrocytes; (3) Ca2+ imaging of the cultured microglia showing predominantly a lack of response to ALS IgG, whereas ATP application elicited a Ca2+ change. This paper also emphasizes possible caveats and cautions regarding critical cell density and purity of cultures, choosing the correct concentration of the Ca2+ dye and dye-loading techniques.

We present here a protocol on how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from rat cortices for time-lapse video imaging of intracellular Ca2+ for research on pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis in the hSOD1G93A rat model.

Sıçan Astrositleri ve Mikroglia'nın Birincil Kültürleri ve Amiyotrofik Lateral Skleroz Çalışmalarında Kullanımları

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). Microglia can be divided into resting state and activated state and can rapidly change state in response to the microenvironment of the brain. Microglia will be activated under different pathological conditions and exhibit different phenotypes. In addition, there are many different subgroups of activated microglia and great heterogeneity between different subgroups. The heterogeneity mainly depends on the molecular specificity of microglia. Studies have revealed that microglia will be activated and play an important role in the pathological process of inflammatory demyelination. To better understand the characteristics of microglia in inflammatory demyelinating diseases such as multiple sclerosis and neuromyelitis optica spectrum disorder, we propose a perilesional primary microglial sorting protocol. This protocol utilizes columnar magnetic-activated cell sorting (MACS) to obtain highly purified primary microglia and preserve the molecular characteristics of microglia to investigate the potential effects of microglia in inflammatory demyelinating diseases.

Here, we present a protocol to isolate and purify primary microglia in animal models of demyelinating diseases, utilizing columnar magnetic-activated cell sorting.

Fare Primer Mikroglia'sının Hayvan Demiyelinasyon Modellerinde Manyetik-Aktif Hücre Sıralama ile İzolasyonu

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid enzymatic dissociation of skin. Primary keratinocytes, fibroblasts, and Schwann cells are all harvested from the human newborn foreskin, which is available following standard of care procedures. The removed skin is disinfected, and the subcutaneous fat and muscle are removed using a scalpel. The method consists of enzymatic and mechanical separation of epidermal and dermal layers, followed by additional enzymatic digestion to obtain single-cell suspensions from each of these skin layers. Finally, single cells are grown in appropriate cell culture media following standard cell culture protocols to maintain growth and viability over weeks. Together, this simple protocol allows isolation, culturing, and characterization of all three cell types from a single piece of skin for in vitro evaluation of skin-nerve models. Additionally, these cells can be used together in co-cultures to gauge their effects on each other and their responses to in vitro trauma in the form of scratches performed robotically in the culture associated with wound healing.

The study of wound healing associated with musculoskeletal injury often requires the assessment of in vitro interactions between Schwann cells (SCs), keratinocytes, and fibroblasts. This protocol describes the isolation, culturing, and characterization of these primary cells from the human foreskin.

İnsan Sünnet Derisinden Primer Schwann Hücrelerinin, Keratinositlerin ve Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...