Os procedimentos a seguir foram aprovados pelo Comitê de ética Animal da Universidade de Monash. Camundongos C57Bl6/J P3-6 de saudável em recém-nascidos não tratados foram usados para gerar os resultados representativos.
1. enzimática digestão
Nota: É importante considerar a esterilidade quando isolar e cultivar as células primárias. Garantindo que o ambiente é tão estéril quanto possível, ao mesmo tempo a dissecção inicial e colheita de cérebros murino podem ser concluídas fora um capuz de fluxo laminais, com todas as etapas realizadas dentro de uma capa de fluxo laminar.
<ol><li>Usando instrumentos esterilizados, eutanásia o mouse por deslocamento cervical, decapitar o animal e enxágue com 100% de etanol. Usando pequenas tesouras estéreis, faça pequenas incisões ao longo dos lados direito e esquerdos da cabeça. Nesta idade, a pele descasca facilmente. Usando as pontas da pinça curvada, deslize suavemente o tecido para a tribuna para expor o crânio, incluindo o Bregma.</li>
	<li>Inserir a ponta da tesoura na abertura do canal medular e fazer uma incisão lateral ao canal auditivo. Fazer uma incisão ao longo da sutura sagital para o Bregma, apontando suavemente a ponta da tesoura para cima para não danificar o cérebro. Introduza a ponta da tesoura em Bregma e fazer incisões laterais para os lados direito e esquerdos da cabeça ao longo da sutura coronal.</li>
	<li>Usando fórceps, delicadamente descasca o crânio para expor o cérebro. Para fazer isso, segure as extremidades da caveira exposta a incisão lateral e puxe cuidadosamente o crânio para o lado. O crânio deve descascar facilmente. Usando a pinça curvada, colher suavemente sob o cérebro para removê-lo.</li>
	<li>Coloque o cérebro num recipiente estéril 5 mL, lavar 2 - 3 vezes com mídia de lavagem gelada (de baixa glicose Dulbecco modificado águia médio (DMEM) suplementado com 1% penicilina-estreptomicina), aproximadamente 5 mL meios de comunicação social por lavagem, para retirar o sangue.</li>
	<li>Numa vizinhança de fluxo de ar laminar, coloca o conteúdo do recipiente em um pequeno prato de petri (35 mm), 5 mL, descansando no gelo. Usando uma lâmina de bisturi estéril ou tesoura esterilizada, retire o cerebelo e o bulbo olfativo. Faça uma linha média corte para separar os dois hemisférios.</li>
	<li>Cuidadosamente descasca afastado a camada meníngea com pinça fina, tendo cuidado para não danificar os córtices. Identifica a camada meníngea como uma camada muito fina de células com uma coloração avermelhada na superfície do cérebro, com visíveis os vasos sanguíneos. Manter o cérebro frio é essencial para a remoção adequada de meninges. Se quebrar a camada meníngea, continue descascando afastado os fragmentos rasgados até que ele seja completamente removido.</li>
	<li>Transferi os hemisférios para um novo pequeno prato de petri (no gelo) e encha-a com a lavagem de mídia. Pique o cérebro em pedaços pequenos com lâmina de bisturi estéril/tesoura. Nota: Estes devem ser mm ~ 12 no tamanho, e deve ter cuidado para não cortá-los em pedaços muito pequenos, como isto pode reduzir o rendimento.</li>
	<li>Adicionar 100 µ l papaína (estoque de 17 U/mg) e 150 µ l DNase eu na mídia e incube por 30 min a 37 ° C</li>
	<li>Após digestão, Triture o tecido usando uma pipeta P1000. Se os pedaços de tecido são grandes demais para entrar a pipeta, considere o uso de um par ou tesoura esterilizada para alargar a ponta da pipeta. Durante este processo, tome cuidado para não introduzir bolhas na mídia como isto pode reduzir a viabilidade celular.</li>
</ol>2. a mielina remoção de entulhos
<ol><li>Sob uma capa de fluxo laminar, usar equipamento estéril, prepare um tubo cónico de 50 mL com um coador de célula de 100 µm, para cada cérebro. Despeje o conteúdo da caixa de Petri, contendo as peças de médio e cérebro digerir em um coador. Empurre com os pedaços de cérebro usando o êmbolo de uma seringa de 3ml estéril em um movimento de moagem até que não há nenhum tecido mais visível. Após a digestão, o tecido cerebral deve desmoronar facilmente.</li>
	<li>Continuamente, lave o filtro com os meios de lavagem, por encher o filtro de célula em todo este processo. Isto vai lavar através de quaisquer células presas no filtro. Nota: Isto deve ser feito até que haja cerca de ~ 15 mL no tubo. Isto é para garantir que o filtro é suficientemente lavado através de e para maximizar a quantidade de células coletadas.</li>
	<li>
Centrifugar a suspensão de célula única 500 x g por 5 min a 4 ° C. Durante este tempo, prepare o suporte de gradiente de densidade conforme descrito.
	<ol>
<li>Prepare o estoque percoll isotônica (SIP), que é o meio de gradiente de densidade utilizado. Faça isso adicionando-se 9:1 relação de médio gradiente de densidade de 10 x solução salina equilibrada do Hanks estéril (HBSS).</li>
		<li>Prepare-se gradientes como 30% SIP em DMEM e 70% SIP em 1 x HBSS. Por exemplo, para preparar 10 mL de 30% SIP, adicionar 3 mL de SIP para 7 mL DMEM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspire o sobrenadante do tubos cónicos e ressuspender o sedimento celular com 8 mL de 30% SIP em DMEM. Transferi todo o volume para um tubo cónico de 15 mL.</li>
	<li>Subjacência a solução SIP de 70%. Para fazer isso, encha uma pipeta de transferência com 70% SIP e cuidadosamente empurrar através da pipeta de transferência para o fundo do tubo cónico. Uma vez que a ponta está perto do fundo, empurre suavemente através do conteúdo da pipeta de transferência. Nota: Faça isto lentamente para não perturbar a interface 30/70. Deve haver uma linha clara separando as duas camadas.</li>
	<li>Centrifugar as camadas SIP, incluindo as células, a 650 x g com freio 0 e 4, a aceleração para 25 min à temperatura ambiente. Nota: É essencial para completar o giro com freio fora e permitir que a centrífuga para lentamente vir a uma parada, como aplicação do freio perturbará a interfase e reduzir drasticamente a coleção de células entre as camadas SIP.</li>
	<li>Aspire os restos celulares na parte superior do tubo e remova aproximadamente de 4 mL mídia do topo. Isto facilitará a remoção das células mononucleares na etapa seguinte. Usando uma pipeta P1000, baixe cuidadosamente a ponta da pipeta para a interfase. Isole as células mononucleares da interface médio gradiente de densidade 30/70. Colete aproximadamente 3 mL da interface nublado e transferência para um novo tubo cônico de 15 mL. Em seguida, dilua a mistura com 9 mL de HBSS para ajudar à remoção do meio de gradiente de densidade.</li>
	<li>Centrifugue a interfase médio gradiente de densidade diluída, que contém as células mononucleares em 500 x g, durante 5 min. aspirar o sobrenadante e ressuspender com 1 mL de meio de crescimento (DMEM suplementado com 10% fetal bovino soro e 1% antibióticos). Em seguida, manchar as ressuspensa células com trypan azul e realizar uma contagem de células usando um haemocytometer.</li>
</ol>3. magnético celular ativado classificação
Nota: Estes passos são modificados de protocolo dos fabricantes.
<ol><li>Centrifugar as células mononucleares coletadas a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C para remover o meio de crescimento, pois isto irá interferir com o isolamento magnético. Usando a mesma contagem de células obtida passo 2.8, Ressuspender a 1 x 108 nucleated células/mL em PBS (++ de Ca e Mg ++ grátis) contendo 2% FBS e 1 mM EDTA, dentro de uma faixa de volume de 0,1 a 2,5 mL.</li>
	<li>Adicione o volume total de células nucleadas em PBS da etapa anterior para um tubo de poliestireno de fundo redondo de 5 mL (12 x 75 mm). Adicionar 50 reagente de rotulagem CD11b PE µ l por 1 mL de amostra. Incube a temperatura ambiente por 15 min, protegido da luz.</li>
	<li>Adicione 70 µ l de seleção cocktail (uma combinação de anticorpos monoclonais contra CD11b em PBS) por 1 mL de amostra. Incube a temperatura ambiente por 15 min, protegido da luz.</li>
	<li>Misture partículas magnéticas pipetando para cima e para baixo mais de 5 vezes. Adicione 50 µ l/mL para a amostra. Incube a temperatura ambiente por 10 min, protegido da luz. Nota: Estas partículas então formam um complexo tetramérica com os anticorpos e vão ficar ligadas a coluna magnética.</li>
	<li>Se o volume total da mistura de célula é inferior a 2,5 mL, top esse volume com PBS (++ de Ca e Mg ++ grátis) contendo 2% FBS e 1 mM de EDTA e misture suavemente pipetando 2 - 3 vezes. Coloque o tubo (sem tampa) para o ímã e incubar a temperatura ambiente por 5 min.</li>
	<li>Em um movimento contínuo, inverta totalmente o ímã que contém o tubo para 2-3 s, decantar o sobrenadante. Retornar o ímã para uma posição vertical e retire o tubo do ímã. Prepare-se para lavar as restantes células da coluna. Nota: O sobrenadante contém células rotuladas e indesejadas, que são removidas por inversão do tubo enquanto ainda no imã. O tubo contém o Cd11b anexado+ células.</li>
	<li>Lave as células, repetindo as etapas 3.5 e 3.6 mais duas vezes. Se a amostra for maior que 1 mL, é recomendado um mais repetição de etapas 3.5 e 3.6.</li>
	<li>Ressuspender as células em um meio de crescimento desejado. Enxágue o lado do navio coleção também (ex. um tubo de 15 mL) para coletar as células dos lados do tubo e maximizar o rendimento.</li>
</ol>4. verificação da pureza da micróglia
Nota: O primário microglia isolada de 3L (n = total de 5 animais) foram verificados através de fluorescente ativado celular classificação (FACS) para determinar a pureza para os resultados representativos.
<ol><li>Células de cultura num balão de T-25 no meio de crescimento, contendo 10% FBS durante a noite, semeadura em uma densidade de 1-2 x 106 células por balão.</li>
	<li>Lavar as células os frascos de T-25 com PBS 3 x por 5 min remover qualquer mídia de crescimento remanescente, que pode interferir com a tripsinização.</li>
	<li>Adicione 2 mL de tripsina 0,25% para separar as células dos frascos. Certifique-se de que o volume de tripsina é suficiente para cobrir toda a superfície do balão. Após agitação suave do frasco para assegurar uma cobertura uniforme de tripsina, incubar durante 5 min a 37 ° C.</li>
	<li>Extinguir o processo tripsinização, adicionando 2 mL de meio de crescimento, contendo 10% FBS para o balão.</li>
	<li>Recolha o sobrenadante contendo as células trypsinized e centrifugar 500 x g por 5 min a 4 ° C para coletar as células.</li>
	<li>Remover o sobrenadante contendo o meio de crescimento e tripsina e resuspenda o pellet em buffer de FACS 500 μL. Realize a contagem de células usando trypan azul.</li>
	<li>Centrifugar a 500 x g por 5 min a 4 ° C. Execute o bloco de receptor Fc adicionando 50 buffer de FACS μL + bloqueador de FcR 1 μL por 5 x 106 células. Incube por 15 min a 4 ° C. Nota: O bloco do receptor Fc é um passo crítico no processo de coloração para evitar inespecificas de imunoglobulinas aos receptores de Fc em populações de células imunes. Este bloqueio não afeta a ligação a jusante de outros anticorpos.</li>
	<li>Finalizar o processo de bloqueio diluindo com buffer de FACS 500 μL. Em seguida, centrifugar a mistura que contém as células a 500 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Resuspenda em fresco buffer de FACS 500 μL.</li>
	<li>Coloque a maioria das células (por exemplo, se resuspending as células em 500 μL de tampão, FACS, uso 400 μL) em um tubo de amostra. Distribuir as células restantes entre os tubos de controle e top até 100 μL por tubo de controle (por exemplo, para 6 tubos de controle, aturar 16.67 μL em cada tubo de controle e top 83.33 buffer de FACS μL). Fazer os grupos (tubos de controle em negrito) como Unstained, single manchado (CD45, CD11b), única mancha ao vivo/morto, FMO e tubos de amostra.</li>
	<li>Pelotas as células em todos os tubos por centrifugação a 500 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Manche as células no tubo com 1 anticorpo μL por buffer de FACS 100 μL por 5 x 106 células. Incubar durante 20 min a 4 ° C. Nota: Use 50 μL anticorpo cocktail se menos de 2 x 106 células são usadas.</li>
	<li>Lave as células com buffer de FACS 500 μL. Centrifugar as células a 500 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Ressuspender as células em buffer de FACS 300 μL. Nota: Use ~ 100 μl, se a contagem de células é de menos de 2 x 106.</li>
	<li>Usando análise de citometria de fluxo, quantificar as células que são positivas para coloração de CD11b e CD45baixa . Esta percentagem corresponde a microglia primário isolado.</li>
</ol>5. coloração imuno-histoquímica de micróglia primária
<ol><li>As células em uma placa de 96 poços, com uma densidade de 1 x 105 células da placa com o meio de crescimento e incubar durante uma noite.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e lavar 3 vezes com PBS.</li>
	<li>Consertar as células com paraformaldeído 4% em PBS por 15 min. remover o PFA com uma pipeta P1000 e, em seguida, lavá-los 3 vezes com PBS + 0,1% Triton-X.</li>
	<li>Bloco de ligação não-específica com 3% albumina de soro bovino por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Incube com coelho Iba-1 (1: 100) por 24 h a 4 ° C. Em seguida, retire a mistura do anticorpo primário e lavar 3 vezes com PBS.</li>
	<li>Incube com secundário conjugado anticoelho GFP (1: 200) por 1h à temperatura ambiente. Em seguida, retire a mistura do anticorpo secundário e lavar 3 vezes com PBS.</li>
	<li>Monte as lâminas com uma fluorescente montagem médio e captura de imagens utilizando um microscópio fluorescente.</li>
</ol>6. quantificação da Microglia usando o pHrodo do ensaio
Nota: O ensaio de pHrodo permite a identificação dos níveis de fagocitose em células cultivadas. Após a captação através de endocitose, internalização no ambiente mais ácido aumenta os níveis de fluorescência de conjugados a bioparticle. Em seguida, níveis de fluorescência podem ser quantificados pela FACS. As etapas a seguir são modificadas de protocolo dos fabricantes.
<ol><li>Cultura de células num balão de T-25 no meio de crescimento durante a noite, semeadura em uma densidade de 1-2 x 106 células por balão. Lave as células em frascos de T-25 com PBS 3 vezes por 5 min.</li>
	<li>Separe as células usando a tripsina 0,25% de 2 mL. Incubar durante 5 min a 37 ° C.</li>
	<li>Extinguir o processo de trypsinisation, adicionando 2 mL de meio de crescimento, contendo 10% FBS para o balão.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 500 x g por 5 min a 4 ° C para células de Pelotas.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado contendo a microglia primário em meio de cultura em 106 células/mL. Nota: Como alternativa, placa de células em uma placa de 96 poços, pelo menos, um dia antes e mire a 1 x 105 células viáveis por bem no dia do ensaio é para ser realizado.</li>
	<li>Células de placa em placa de 96 poços, 1 x 105 células/poço, 100 μL por poço. Placa de controles e experimentais poços em triplicado e deixar um poço vazio por controlo positivo para uma subtração de fundo não-célula de controle.</li>
	<li>Adicione 100 μL de mídia de crescimento nos poços deixados vazios para subtração de fundo não-célula. Nota: Como qualquer outro em vitro ensaio, controles apropriados são vitais para a precisão das leituras. Ao lado da célula não-controle (fundo de leitura), também incluem o controlo negativo (pHrodo conjugado adicionado, mas colocada no gelo).</li>
	<li>Cobrir a placa e incubar por 1h em uma incubadora com 5% CO2 a 37 ° C.</li>
	<li>Prepare experimentais poços, acrescentando estimulante e tratamento. Adicione controles do veículo (apenas mídia de crescimento) para poços não tratados. Nota: Lipopolissacarídeo 1 µ g/mL [estimulantes] e células epiteliais humanas âmnio (hAEC)-condicionada mídia [tratamento] foram usadas para gerar os resultados representativos.</li>
	<li>Descongelar um frasco de corante conjugado, adicionar vórtice e brevemente 2 mL de tampão de captação. Transferir o conteúdo do tubo para um tubo de vidro limpo e proceda à sonicação por 5 min, para garantir que as partículas são uniformemente dispersos.</li>
	<li>Aspire o meio de cultura de poços de microplacas e substituir rapidamente com 100 μL de suspensão de tintura. Cobrir e incubar a 37 ° C, durante 1 h. Nota: Lembre-se de manchar os tubos de controle também.</li>
	<li>Usando análise de citometria de fluxo, quantificar células coloração positiva para as contas pHrodo conjugados e apresentar em percentagem (do pai) de ativamente fagocitose microglia.</li>
</ol>7. quantificação da Microglia apoptose após insulto inflamatório
<ol><li>Repita os passos 1-7 da seção "Verificação de micróglia pureza".</li>
	<li>Coloque a maioria das células (por exemplo, se você resuspended as células em 500 μL de tampão, FACS, uso 400 μL) em um tubo de amostra. Distribuir as células restantes entre os tubos de controle e top até 100 μL pelo tubo controle (por exemplo, para tubos de controle 6, aturar 16.67 μL em cada tubo de controle e top buffer de FACS 83.33 μL). Grupos (tubos de controle em negrito): manchas Unstained, única (AnnexinV, iodeto de Propidium), única mancha ao vivo/morto, FMO, tubos de amostra.</li>
	<li>Granule as células em todos os tubos por centrifugação a 500 x g por 5 min.</li>
	<li>Incube com 1 μL anticorpo/100 μL FACS tampão/5 x 106 células por 20 min a 4 ° C. Nota: Use 50 μL se tiverem menos de 2 x 106 células.</li>
	<li>Lave as células adicionando 500 μL FACS buffer e centrifugar a 500 x g por 5 min.</li>
	<li>Resuspenda o pellet de células no buffer de FACS 300 μL. Nota: ~ 100 μL se a contagem de células é de menos de 2 x 106.</li>
	<li>Quantificar as células dentro de cada quadrante (Q1: necrótico, Q2: tarde apoptotic, Q3: viável, Q4: apoptotic precoce).</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Microglia têm a capacidade de ser pró - e anti-inflamatórias, alterada por estímulos do ambiente. Estudos anteriores mostraram que a modulação da ativação da microglia pode conferir neuroproteção. Sua capacidade de fornecer proteção aos neurônios e reparar lesões necessita de mais pesquisas para promover a compreensão atual dessas células complexas. Assim, o isolamento de alta pureza primária microglia é uma técnica importante e útil. Este é um método relativamente rápido para obtenção de altamente puro microglia primário pronto para experimentação em vitro dentro de 2 dias.
Há uma variedade de protocolos descritos na literatura para o isolamento da microglia primária do cérebro murino. O principal desafio é produzir com eficiência suficiente amostra, alta na viabilidade e pureza. A principal vantagem deste protocolo é o rendimento de uma amostra altamente puro, sem a necessidade do tempo na cultura. Assim, o método é encurtado de 2 semanas, 2 dias, isso facilita resultados rápidos. As etapas de caracterização produzem robustos dados funcionais sobre microglia, reforçar a compreensão atual dessas células complexas. O protocolo combina duas abordagens atuais - centrifugação gradiente de densidade e separação magnética. Separação magnética foi bem validada na literatura para isolamento de micróglia de forma relativamente suave em comparação com outros isolamento técnicas14,15,16. Ao mesmo tempo, sem dúvida, há alterações nas características funcionais da microglia primário isolado em comparação com em seu estado nativo em vivo, quaisquer alterações às propriedades microglia, como observado em ensaios desenvolvidos acima são calculadas a partir uma linha de base após a digestão e como tal são reflexivo de modulação direta desse subconjunto imune.
Enquanto o protocolo é relativamente simples, cuidados durante as etapas críticas vão ajudar a garantir um bom rendimento. Em primeiro lugar, é importante usar mídias de baixa glicose para dar suporte ao crescimento glial. Além disso, o cérebro murino deve ser mantido gelo frio em todos os momentos durante o isolamento. Assim, recomenda-se pre-chill todos médio, bem como instrumentos se possível e realizar o procedimento no gelo. Importante, vezes prolongado isolamento vão levar a pior saúde celular e produzir, assim, é fundamental para trabalhar rapidamente. Além disso, a remoção adequada da camada meníngea é um passo crucial quando trabalhando com ratos adultos, caso contrário os fibroblastos vai outcompete as células gliais em termos de crescimento. Durante a digestão enzimática dos cérebros, é importante não cortar o cérebro em pedaços muito pequenos como isto pode aumentar a morte celular, idealmente aponta para peças de2 1mm de tecido. Quando a moagem do tecido através do filtro de célula, enxaguar com mídia cada poucos minutos para garantir que todas as células são lavados através de e não ficar preso no filtro, além disso é aconselhável usar um filtro de célula de 100 μm, filtros menores resultam em um rendimento reduzido. Outro passo crítico é o subjacentes da camada Médio gradiente de densidade de 70%, executar este passo cuidadosamente e lentamente, a fim de assegurar que uma clara interfase é visto é essencial, é recomendado o uso de uma pipeta Pasteur. Além disso, o uso de tubos cônico de 15 mL é recomendado como a separação das células foi menos eficaz, quando foram utilizados tubos de Erlenmeyer de 50 mL. Por último, a centrifugação gradiente de densidade deve ser executada à temperatura ambiente, como temperatura pode afetar o gradiente de densidade.
Este protocolo descreve um método confiável de produzir células altamente puro microglia primária, conforme mostrado pela alta expressão de CD45 e positiva expressão de Cd11b (em comparação com baixa expressão de CD45 visto em monócitos periféricos). As células também podem ser isoladas relativamente rapidamente, assim tem o escopo a ser significativamente maior compreensão dessas células da glia. Ele pode ser usado para identificar a microglia diferentes populações de diferentes origens, permitindo estudos que podem revelar diferenças entre microglia isoladas de animais doentes/feridos e saudáveis. Através do isolamento de uma população de puro microglia, modulação terapêutica desta população de células imunes pode ser avaliada. Por exemplo, verificou-se que mídia hAEC-condicionado aumentou a fagocitose, assim como melhoradas a microglia sobrevivência durante um estímulo inflamatório, assim, proporcionando benefícios terapêuticos17. Esta correlacionada com reduzida apoptotic restos e assim sugere afastamento destes detritos pode ter efeitos neuroprotective.
O protocolo pode ser aplicado aos ratos neonatais ou adultos, porém mais velhos ratos produzirá um rendimento reduzido. Além disso, pode ser adaptado para isolar primários astrócitos de ratos adultos ou neonatais, novamente mais velhos ratos resultará em uma diminuição da produção. Além disso, a modificação da etapa de dissociação mecânica com uma malha de nylon sob medida com tamanhos de poros maiores em oposição a peneira de célula 100 μm, pode melhorar ainda mais a célula rendimento18.
Limitações do presente protocolo incluem o rendimento mais baixo e o tempo necessário para este protocolo. O rendimento é de cerca de 150.000-200.000 células por abate de seis animais, contra os milhões que podem ser obtidos através de semanas de cultura de células. Além disso, enquanto as células podem ser obtidas no prazo de dois dias, o procedimento no primeiro dia é bastante demorado, tendo aproximadamente seis horas.
No entanto, esse método é uma ferramenta altamente útil em compreender o papel da microglia na doença, capaz de isolar e caracterizam as células dentro de dois dias. Produz células microglia primária de alta pureza, facilitar a investigação precisa e eficiente.

Danos adquiridos durante o período perinatal da inflamação, hipóxia-isquemia e hemorragia podem ter uma matriz de sequelas de longo prazo. Teoriza-se que envolvem inflamação e isquemia com consequente morte neuronal e axonal1complexa fisiopatologia da lesão cerebral perinatal. A resposta imune inata desempenha um papel importante na cascata de eventos levando a lesão2.
Microglia, as células imunes residentes dentro do sistema nervoso central (SNC), estão as socorristas para lesão3. Microglia são tipos de células de plástico com a capacidade de ser protetora ou tóxico, dependente do ambiente4. Eles estão envolvidos na quimiotaxia, fagocitose, apresentação de antigénios e produção de citocinas e de4,de espécies reativas de oxigênio5. Microglia senescente constantemente pesquisa o ambiente e são ativados pela presença de uma substância estrangeira ou prejudiciais4. Ativação leva a uma resposta pró-inflamatória, crítica no CNS proteção4. Estes M1 "pro-inflamatórios" fenótipo microglia são principalmente envolvida na apresentação de antigénios e a morte de patógenos4. Apesar do papel crucial da resposta inflamatória na neuroproteção, inflamação descontrolada ou prolongada pode ser prejudicial e levar a dano neuronal4. No entanto, quando expostos a certos estímulos ambientais, microglia pode apresentar um fenótipo anti-inflamatórios. Estes pro-reparativa M2 microglia têm um papel fundamental na cicatrização de feridas e reparação6, liberando uma variedade de citocinas e outros mediadores solúveis que downregulate inflamação, aumentam a fagocitose e promovem reparo4, 7. os papéis de micróglia são diversos e incluem condução diferenciação oligodendrocyte durante re-mielinização8, protegendo os neurônios durante a depleção de oxigênio e glicose em curso modelos9 e promovendo o axônio consequência em 10modelos de lesão da medula espinhal.
O estudo destas células gliais representa um aspecto importante na compreensão e manipulando a resposta ao neuroinflammation. O protocolo descrito permite ainda mais a investigação sobre o potencial terapêutico de micróglia modulação em desordens MPTP.
A modulação da ativação microglial para um papel neuroprotetor tem sido observada em uma variedade de condições11,12,13. Assim, melhorar o entendimento atual e ainda mais, estudando modulação da ativação microglial é fundamental, exigindo o uso de vários modelos, incluindo tanto em vitro como em vivo. Estudos in vitro representam uma ferramenta importante devido à sua maior eficiência, menor custo e capacidade para investigar uma população de células isoladas.
Há uma variedade de protocolos descritos na literatura para o isolamento da microglia do cérebro murino, o desafio de produzir com eficiência uma amostra de alto rendimento com boa viabilidade e pureza elevada. Métodos comumente utilizados de isolamento primário microglia são por separação magnética e agitação prolongada das culturas gliais mistas. Através da experiência pessoal, verificou-se que havia um alto grau de restos celulares que obstruiu a coluna magnética. Assim, foi utilizado o seguinte protocolo, que incorpora uma etapa de centrifugação gradiente de densidade inicial seguida de CD11b separação magnética. O protocolo descrito abaixo foi otimizado para produzir uma amostra altamente pura em quantidade suficiente. É vantajoso devido à sua alta pureza e o curto período de tempo — um pode realizar ensaios dentro de 2 dias sem a necessidade de cultura para 2-3 semanas. Este protocolo potencialmente pode ser adaptado para o isolamento de astrócitos murino primários.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="929">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td style="width:133px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">11885084</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">DNaseI grade II from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3125-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18770</td>
			<td>EasySep magnet variant</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">EasySep magnet</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">EasySep Buffer</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>20144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Dulbecco&#39;s Phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Trypsin (2.5%) (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block&#8482;)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">175cm&#178; Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Paraformaldehyde (powder, 95%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Triton-X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Rabbit Anti-Iba1</td>
			<td>Wako</td>
			<td>01919741&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">FACS Antibodies</td>
			<td style="width:133px;">Company</td>
			<td style="width:344px;">Catalog Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO</td>
			<td style="width:133px;">BD Biosciences</td>
			<td>560501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">PerCP-Cy5.5 CD11b&#160;</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>45-0112-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">ZombieNIR</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P35361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Annexin.V_FITC</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Propodium Iodide solution</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-233</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization and isolation of mouse primary microglia by density gradient centrifugation

Microglia, as células imunes residentes no cérebro, são as socorristas a inflamação ou lesão no sistema nervoso central. Recente pesquisa revelou microglia ser dinâmico, capaz de assumir fenótipos pró-inflamatórias e anti-inflamatórias. Tanto (pró-inflamatórias) M1 e M2 peça de fenótipos (pro-reparativa) um papel importante em condições de MPTP, tais como lesão cerebral perinatal e exposição de diferentes funções em resposta a certos estímulos ambientais. A modulação da ativação microglial tem sido observada para conferem neuroproteção sugerindo microglia pode ter potencial terapêutico em lesão cerebral. No entanto, mais pesquisa é necessária para compreender melhor o papel da microglia na doença, e este protocolo facilita isso. O protocolo descrito abaixo combina um processo de centrifugação gradiente de densidade para reduzir restos celulares, com a separação magnética, produzindo uma amostra altamente pura das pilhas microglial primário que pode ser usado para a experimentação in vitro , sem a necessidade de 2-3 semanas de cultivo. Além disso, as etapas de caracterização produzem robustos dados funcionais sobre microglia, auxiliando os estudos para melhorar a nossa compreensão da polarização e injeção dessas células, que tem fortes implicações no campo da medicina regenerativa.

Usando os métodos descritos aqui, populações puras de microglia podem ser isoladas e podem estar prontas para a caracterização de uso in vitro e análise de FACS. Para começar, até 18 animais podem ser usados por ser rejeitada, com um rendimento esperado de cerca de 450.000-600.000 células microglial. É crucial confirmar primeiro a pureza das células isoladas, e para isso a análise FACS foi realizada pela coloração para os dois marcadores CD11b. identificação da microglia e CD45 pode provar problemático, como muitos marcadores expressados por microglia também são expressos por macrófagos e o uso destes dois marcadores permite a quantificação precisa e confiável. Especificamente, a microglia têm uma baixa expressão de CD45, em comparação com a alta expressão vista no CNS e macrófagos periféricos e também são positivo para CD11b (Figura 1). Este isolamento particular, foi relatada uma pureza de 89,3%. Depois da coloração para CD11b, notamos que nosso principal microglia compartilham características morfológicas semelhantes, com uma gama de morfologias do distintamente unramified (grande esférica célula corpo com pouca ou nenhuma processos estendidos) para o mais ramificado (com menores, mais somata oval e tipicamente até processos de ordem secundária) correlacionando a uma gama de Estados de ativação, como esperado para ver na vivo (Figura 2).
Em seguida, foram executados dois ensaios de caracterização para a função de micróglia e sobrevivência. Microglia são a célula fagocítica importante no SNC, e o ensaio de pHrodo permite a quantificação dessa propriedade funcional específica. Um 3 vezes de aumento função fagocitária após 24-h co-cultura com hAEC condicionado médio (Figura 3) foi observado, medido pela quantificação das partículas fluorescentes pHrodo. Finalmente, uma AnnexinV-PI coloração seguir co-cultura foi realizada para identificar a sobrevivência da microglia seguindo um insulto inflamatório. Uma redução da apoptose microglia após tratamento com meio condicionado (Figura 4) foi observado. Estes achados sugerem que esse meio de hAEC condicionado protege microglia e aumenta a sua atividade fagocítica, que pode ter terapia em desordens de lesão e MPTP cerebral perinatal.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57065/57065fig1.jpg"> Figura 1 : Expressão de CD45 e CD11b por microglia. Cada ponto representa uma célula rotulada e FACS análise permite a elucidação de populações de células separadas. Microglia têm uma menor expressão do antigénio CD45 comparado aos macrófagos derivados de monócitos periféricos e são positivo para CD11b. números abaixo do rótulo de anticorpos indicam a proporção de células gated, expresso em percentagem da população de pai. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57065/57065fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57065/57065fig2.jpg"> Figura 2 : Morfologia da microglia primária isolada. Como pode ser visto nesta figura, microglia reter seu corpo esférico de célula e estrutura ramificada distinta. Barra de escala = 20 µm.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57065/57065fig3.jpg"> Figura 3 : Quantificação da função fagocitária em isolado primário microglia. partículas pHrodo-rotulados apenas fluorescem quando em ambientes ácidos, como em endossomos celulares após a fagocitose. Aqui, observa-se um aumento na captação de partículas pHrodo em microglia tratado com hAEC condicionado médio. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57065/57065fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57065/57065fig4.jpg"> Figura 4 : Análise de sobrevivência microglia após insulto inflamatório. (A) representante FACS parcelas de micróglia isolada. A coloração combinada de iodeto de AnnexinV e propidium permite a categorização em células vivas ou apoptose, necrose, após estimulação com LPS. (B) hAEC condicionado médio apoptose microglia significativamente reduzida em relação a controles, sugerindo uma forma de proteção neste tipo de célula. * significa p < 0.05, teste t de student. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57065/57065fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Médio de lavagem</td>
		</tr>
<tr>
<td>Baixos de glicose Dulbecco modificada do médio águia</td>
		</tr>
<tr>
<td>1% v/v penicilina-estreptomicina</td>
		</tr>
<tr>
<td>Médio de Digest (por cérebro)</td>
		</tr>
<tr>
<td>150 µ l DNase eu</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 µ l papaína (estoque de 17U/mg)</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 ml de meio de lavagem</td>
		</tr>
<tr>
<td>Meio de crescimento</td>
		</tr>
<tr>
<td>Baixos de glicose Dulbecco modificada do médio águia</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% de soro fetal bovino</td>
		</tr>
<tr>
<td>1% v/v penicilina-estreptomicina</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Tabela de soluções.

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Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

Um protocolo para a isolação de micróglia primária do cérebro murino é apresentado. Esta técnica ajuda a promover o entendimento atual de condições neurológicas. Centrifugação de gradiente de densidade e separação magnética são combinados para produzir rendimento suficiente de uma amostra altamente puro. Além disso, descrevem as etapas para a caracterização da micróglia.

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

characterization-isolation-mouse-primary-microglia-density-gradient

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.1K visualizações.  Hudson Institute of Medical Research. Um protocolo para a isolação de micróglia primária do cérebro murino é apresentado. Esta técnica ajuda a promover o entendimento atual de condições neurológicas. Centrifugação de gradiente de densidade e separação magnética são combinados para produzir rendimento suficiente de uma amostra altamente puro. Além disso, descrevem as etapas para a caracterização da micróglia.

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Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

Preparação de Synaptoneurosomes de rato Cortex usando um gradiente de densidade Percoll descontínuo Sacarose-

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Neurociência

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in the late 1960&#8217;s, proteins associated with the synaptic plasma membrane can be isolated by ultracentrifugation on a sucrose density gradient. Once synaptic membranes are isolated, the macromolecular complex known as the post-synaptic density can be subsequently isolated due to its detergent insolubility. The techniques used to isolate synaptic plasma membranes and post-synaptic density proteins remain essentially the same after 40 years, and are widely used in current neuroscience research. This article details the fractionation of proteins associated with the synaptic plasma membrane and post-synaptic density using a discontinuous sucrose gradient. Resulting protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

This article details the enrichment of proteins associated with the synaptic plasma membrane by ultracentrifugation on a discontinuous sucrose gradient. The subsequent preparation of post-synaptic density proteins is also described. Protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

Preparação do Synaptic Plasma Membrane e Proteínas de densidade pós-sinápticos Usando um gradiente de sacarose descontínuo

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Low-Density hipocampo Cultura Neuron primária

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. Microglia are mesodermal cells that function similarly to macrophages in surveying inflammatory stress. The classical (M1-type) and alternative (M2-type) activations of macrophages have also been extended to microglia in an effort to better understand the underlying interplay these phenotypes have in neuroinflammatory conditions such as Parkinson&#39;s, Alzheimer&#39;s, and Huntington&#39;s Diseases. In vitro experimentation utilizing primary microglia offers rapid and reliable results that may be extended to the in vivo environment. Although this is a clear advantage over in vivo experimentation, isolating microglia while achieving adequate yields of optimal purity has been a challenge. Common methods currently in use either suffer from low recovery, low purity, or both. Herein, we demonstrate a refinement of the column-free CD11b magnetic separation method that achieves a high cell recovery and enhanced purity in half the amount of time. We propose this optimized method as a highly useful model of primary microglial isolation for the purposes of studying neuroinflammation and neurodegeneration.

Here, we present a protocol to isolate microglia from postnatal mouse pups (day 1) for in vitro experimentation. This improvised method of isolation generates both high yield and purity, a significant advantage over alternate methods that allows broad range experimentation for the purposes of elucidating microglial biology.

Isolamento magnético rápido e refinado CD11b da Primária Microglia com pureza e versatilidade

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Isolamento e extração de RNA de neurônios, macrófagos e Microglia de Zebrafish Larval cérebros

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of oligodendroglia as well as the biology of demyelinating diseases such as multiple sclerosis and Pelizaeus-Merzbacher-like disease (PMLD). Here, we present a simple and efficient selection method for the immunomagnetic isolation of stage three O4+ preoligodendrocytes cells from neonatal mice pups. Since immature OL constitute more than 80% of the rodent-brain white matter at postnatal day 7 (P7) this isolation method not only ensures high cellular yield, but also the specific isolation of OLs already committed to the oligodendroglial lineage, decreasing the possibility of isolating contaminating cells such as astrocytes and other cells from the mouse brain. This method is a modification of the techniques reported previously, and provides oligodendrocyte preparation purity above 80% in about 4 h.

We describe the immunomagnetic isolation of primary mouse oligodendrocytes, which allows the rapid and specific isolation of the cells for in vitro culture.

Isolamento de Fima rápida e específica de oligodendrócitos primário de Mouse

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.

Isolamento Magnético de Células Microgliais de Rato Neonato para Culturas Celulares Primárias

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to use these cells for the purpose of studying the pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) in the rat hSOD1G93A model. First, the protocol shows how to isolate and culture astrocytes and microglia from postnatal rat cortices, and then how to characterize and test these cultures for purity by immunocytochemistry using the glial fibrillary acidic protein (GFAP) marker of astrocytes and the ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba1) microglial marker. In the next stage, methods are described for dye-loading (calcium-sensitive Fluo 4-AM) of cultured cells and the recordings of Ca2+ changes in video imaging experiments on live cells.
The examples of video recordings consist of: (1) cases of Ca2+ imaging of cultured astrocytes acutely exposed to immunoglobulin G (IgG) isolated from ALS patients, showing a characteristic and specific response compared to the response to ATP as demonstrated in the same experiment. Examples also show a more pronounced transient rise in intracellular calcium concentration evoked by ALS IgG in hSOD1G93A astrocytes compared to non-transgenic controls; (2) Ca2+ imaging of cultured astrocytes during a depletion of calcium stores by thapsigargin (Thg), a non-competitive inhibitor of the endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase, followed by store-operated calcium entry elicited by the addition of calcium in the recording solution, which demonstrates the difference between Ca2+ store operation in hSOD1G93A and in non-transgenic astrocytes; (3) Ca2+ imaging of the cultured microglia showing predominantly a lack of response to ALS IgG, whereas ATP application elicited a Ca2+ change. This paper also emphasizes possible caveats and cautions regarding critical cell density and purity of cultures, choosing the correct concentration of the Ca2+ dye and dye-loading techniques.

We present here a protocol on how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from rat cortices for time-lapse video imaging of intracellular Ca2+ for research on pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis in the hSOD1G93A rat model.

Culturas Primárias de Astrócitos de Rato e Microglia e Seu Uso no Estudo da Esclerose Lateral Amiotrófica

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). Microglia can be divided into resting state and activated state and can rapidly change state in response to the microenvironment of the brain. Microglia will be activated under different pathological conditions and exhibit different phenotypes. In addition, there are many different subgroups of activated microglia and great heterogeneity between different subgroups. The heterogeneity mainly depends on the molecular specificity of microglia. Studies have revealed that microglia will be activated and play an important role in the pathological process of inflammatory demyelination. To better understand the characteristics of microglia in inflammatory demyelinating diseases such as multiple sclerosis and neuromyelitis optica spectrum disorder, we propose a perilesional primary microglial sorting protocol. This protocol utilizes columnar magnetic-activated cell sorting (MACS) to obtain highly purified primary microglia and preserve the molecular characteristics of microglia to investigate the potential effects of microglia in inflammatory demyelinating diseases.

Here, we present a protocol to isolate and purify primary microglia in animal models of demyelinating diseases, utilizing columnar magnetic-activated cell sorting.

Isolamento da Microglia Primária do Rato por Triagem celular ativada por magnético em modelos animais de desmielinização

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid enzymatic dissociation of skin. Primary keratinocytes, fibroblasts, and Schwann cells are all harvested from the human newborn foreskin, which is available following standard of care procedures. The removed skin is disinfected, and the subcutaneous fat and muscle are removed using a scalpel. The method consists of enzymatic and mechanical separation of epidermal and dermal layers, followed by additional enzymatic digestion to obtain single-cell suspensions from each of these skin layers. Finally, single cells are grown in appropriate cell culture media following standard cell culture protocols to maintain growth and viability over weeks. Together, this simple protocol allows isolation, culturing, and characterization of all three cell types from a single piece of skin for in vitro evaluation of skin-nerve models. Additionally, these cells can be used together in co-cultures to gauge their effects on each other and their responses to in vitro trauma in the form of scratches performed robotically in the culture associated with wound healing.

The study of wound healing associated with musculoskeletal injury often requires the assessment of in vitro interactions between Schwann cells (SCs), keratinocytes, and fibroblasts. This protocol describes the isolation, culturing, and characterization of these primary cells from the human foreskin.

Isolamento, cultura e caracterização de células primárias de schwann, queratinócitos e fibroblastos de Foreskin Humano

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...