この作品が支持された SC INBRE 付与から国立科学研究所の一般医療 - NIH によって (r. g. に P20GM103499) し、国立がん研究所から P.H.H. に CA555536 ・ CA154664 を付与このプログラム部分で支えられましたチャールストン大学に就学及び学部科学教育プログラムによってハワード ヒューズ医学研究所からの助成金によって、センターからの助成金によって研究資源 (5 P20 RR016461)国立科学研究所の一般医療 (8 P20 GM103499) 国立衛生研究所から。

1 文化および代謝ラベリング
<ol><li>適切な通気を許可するように 18 g 針で滅菌 1.5 mL マイクロ遠心チューブのキャップの中心を突く一度。補われた滅菌 7 h 9 500 μ L 接種液 5 μ L M. smegmatisのスターターからの文化成長一晩12。 注: 7 H 9 の 1 リットルのレシピ スープは: 4.7 g 商業 7 H 9 粉、2 mL、グリセリン 1 mL Tween 80、0.85 g 塩化ナトリウム 5 g、アルブミン 2 g、ブドウ糖 H2O (容量は 1 L にさせる)。<ol>
<li>
(注意)次の標準的な放射線防護の実践 [32P] Na2HPO420 µCi/mL と培養基をスパイクします。9 mm 厚のアクリル盾の後ろに置かれたシェーカー インキュベーターの 37 ° C および 1,200 の rpm の撹拌でバクテリアします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 mL スクリュー キャップ チューブ midlog 段階 (O.D.600 nm 〜 0.5)、転送全体の文化と 10,000 x g に 2 分を収集の上清含む未採用放射性オルトリン酸の遠心分離によって室温で放射性細菌をペレット適切な廃棄容器。</li>
</ol>2. 総 Rna の準備
注: 総 Rna (ため、フェノールおよびクロロホルムを含む)、商業 RNA 抽出試薬を用いた細菌のペレットから抽出する製造元のプロトコルに続きます。
<ol><li>商業の RNA 抽出試薬 1 mL とペレットにガラスビーズの約 200 μ L を追加します。しっかりとチューブをキャップし、最大の動揺の下で 2 分間ホモジナイザーで細菌を混乱させる (選ばれた器械の数 5 を設定 (材料の表を参照))。</li>
	<li>4 ° C で 10 分間、12,000 × g で遠心分離機サンプル上清を新しい 2 mL チューブに転送、ビーズを適切に廃棄します。0.2 mL のクロロホルムを追加、4 ° C で 15 分間 12,000 × g で遠心する 15 s. の手でチューブを積極的に振る</li>
	<li>45 ° で管釣りで新しいチューブにサンプルの水相を収集します。界面の有機層を描画しないでください。2 色鉛塩法の μ L と 100% イソプロパノールの 0.5 mL 追加します。4 ° C で 10 分間 12,000 × g で遠心する 5 s. の手でチューブを積極的に振る</li>
	<li>チューブから上澄みを除去し、適切に破棄と液体成分分率は放射能の痕跡を含む場合があります。5 分間乾燥ペレットの空気、クエン酸塩ナトリウム (SSC) 0.1% (w/v) ナトリウム dodecyl 硫酸塩 (SDS) 最終的な X 2 の 200 μ L で再懸濁します。 注: 組成株式 20 X SSC の 3.0 M NaCl、0.3 M クエン酸ナトリウム、pH 7.0 です。</li>
</ol>3. 96 よくプリンター プレートの準備
注: tRNA のマイクロ アレイ手動で 40 2 70 mer DNA オリゴヌクレオチド 8 ピン arrayer を使用して (ターミナル CCA を除く) 各のM. smegmatis tRNA の 3' 末端に相補的な印刷されます。ウェル プレートとアレイのプローブのレイアウトと同様、DNA のオリゴヌクレオチド プローブのシーケンスを提供 (補足ファイル 1 ● シート 1 に 3 それぞれ)。
<ol><li>デザイン DNA は最初取得する tRNA シーケンスや tRNA 遺伝子ゲノムの tRNA など tRNA データベースから、データベース13をプローブします。トリム保存 3' 末端の CCA エンコードされている場合。逆の補数結果のシーケンス。最初 70 ヌクレオチドに基づいて順序プローブ。</li>
	<li>水で乾燥 DNA プローブを再懸濁します。100 μ M のプローブの濃度を調整します。96 ウェル プレート、3 X SSC、0.01% (w/v) SDS ファイナル (希薄 60 μ L 個人の株式のプローブの 6 X SSC、0.01% (w/v) SDS の 60 μ L で 50 μ M oligos の 120 μ L を準備します。</li>
	<li>蒸発や汚染を防ぐため、すぐに凍結し、-20 ° c まで必要な維持するスズ箔と板をカバーしてください。</li>
</ol>4. 配列印刷
<ol><li>常温 (約 20 分所要) 96 ウェル プレートを解凍します。</li>
	<li>ダイヤモンド ペンでアミン コーテッド ガラス スライドにラベルを付けます。インデックス ユニットにスライドを配置します。グリッド配置をに従って、次のようにです。<ol>
<li>井戸のレプリケーター ピンを慎重に浸しなさい。</li>
		<li>優しく (小さな抵抗を感じるが) 最小限の圧力を使用してスライド ガラスに配列を印刷します。ブロック A と完了するまで arrayer を洗浄することがなく印刷を続行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>次のブロックに移動する準備ができたら、以下の洗濯手順に従います。<ol>
<li>5% の漂白剤のレプリケーターを浸し、軽く振る。</li>
		<li>吸収性の紙にレプリケーターを押し込みます。</li>
		<li>蒸留水でレプリケーターを浸し、軽く振るし、紙に押します。この手順をもう一度繰り返します。</li>
		<li>イソプロパノールにレプリケーターを浸し、軽く振るし、紙に押します。</li>
		<li>約 20 のためファンのレプリケーターを乾燥 s 96 ウェル プレートの次のブロック移動する前に。必要なプリント枚数を続けます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>乾燥し、架橋 254 nm UV 架橋剤を使用してスライドに oligos のスライドを許可します。<ol>
<li>エネルギー レベルを 999,990 μ J/cm2に設定します。</li>
		<li>スライドの顔を架橋剤できれいな表面に設置します。「スタート」を押してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>磁性攪拌器、常温と低速攪拌法の解決を妨げるの 450 mL で一晩配列をブロックします。収集し、最大 4 倍のブロッキング液を再利用します。 注: ブロックのソリューションのためのレシピは: 125 mM リン酸緩衝 (NaH2PO4/Na2HPO4-) pH 7.2, 2.25 %sds (w/v)、0.5 ミリメートルの EDTA、0.5 X SSC、1 %bsa (w/v)。</li>
	<li>500 mL の蒸留水に室温で 5 分間 2 回スライドを洗います。10 遠心分離によってスライドを乾燥室温マイクロ アレイ遠心分離機で s。最大 6 ヶ月のための乾燥した、暗い場所にストア配列。</li>
</ol>5. アレイ ハイブリダイゼーション
<ol><li>交配する前に、水を沸騰のスライドをすすいで (4.6) のように遠心分離によって乾燥します。</li>
	<li>ハイブリダイゼーション カセット内部配列を置き、標識 RNA サンプルをロードします。</li>
	<li>最大再現性の自動ハイブリダイゼーション洗濯駅を実行します。<ol>
<li>プログラムのステップ次のよう。75 ° C で 2 分間条件ガスケット60 ° C でプローブをご紹介します。 プローブと 90 ° C で 5 分間のサンプルを変化させなさい。60 ° C で 3 時間サンプルを交配させる<ol>
<li>2 × SSC、0.1% (w/v) SDS 流 10 秒 2 回 50 ° C でスライドを洗うし、20 s の 0.1 0.1% SDS X SSC フロー 10 s で 2 回 42 ° C で洗浄スライドと 0.1 で二回 42 ° C で 20 s. 洗浄スライドを保持する保持 X SSC、フロー 10 s とホールド 20 s。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>(4.6) のように遠心分離によってスライドを乾燥します。</li>
</ol>6. 配列の定量化
<ol><li>薄いプラスチック フィルムを使用してスライドをラップします。その最も敏感な設定のガイガー カウンターを使用した放射性の信号用のスライドを確認します。信号の強さに応じて 10 に 90 時間室温で露出カセット ストレージ蛍光体スクリーンにスライドを公開します。 注: ガイガー カウンターの感度は、別の 1 つの楽器によって異なります、露光時間する必要があります最適化する経験的。</li>
	<li>50 μ m 解像度を phosphorimager を使用してスライドをスキャンします。バック グラウンド減算マイクロ アレイのプロファイラーを使用してアップグレード無料画像 J ソフトウェアを使用しての各プローブ スポットで放射能強度を定量化します。</li>
	<li>整理および電子スプレッドシートを使用してデータを処理します。条件付き書式設定ツールを使用してヒート マップを生成します。たとえば各プローブ信号として表現 (‰ 単位) 分数合計プローブ信号の。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Emilsson, V., Kurland, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate+dependence+of+transfer+RNA+abundance+in+Escherichia+coli.">Growth rate dependence of transfer RNA abundance in Escherichia coli.</a> EMBO J. 9 (13), 4359-4366 (1990).</li><li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression.">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2 (12), e221 (2006).</li><li>Pavon-Eternod, M., Gomes, S., Geslain, R., Dai, Q., Rosner, M. 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M., Vinogradova, E., Salinas, T., Remacle, C., Mar&#233;chal-Drouard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+evolution+and+expression+of+Chlamydomonas+reinhardtii+nucleus-encoded+transfer+RNA+genes.">On the evolution and expression of Chlamydomonas reinhardtii nucleus-encoded transfer RNA genes.</a> Genetics. 179 (1), 113-123 (2008).</li><li>Zheng, G., Qin, Y., Clark, W. C., Dai, Q., Yi, C., He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+quantitative+high-throughput+tRNA+sequencing.">Efficient and quantitative high-throughput tRNA sequencing.</a> Nat Methods. 12 (9), 835-837 (2015).</li><li>Grelet, S., McShane, A., Hok, E., Tomberlin, J., Howe, P. H., Geslain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOt:+A+novel+and+streamlined+microarray+platform+for+observing+cellular+tRNA+levels.">SPOt: A novel and streamlined microarray platform for observing cellular tRNA levels.</a> PLoS One. 12 (5), e0177939 (2017).</li><li>Eriani, G., Karam, J., Jacinto, J., Morris Richard, E., Geslain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIST,+a+Novel+Approach+to+Reveal+Hidden+Substrate+Specificity+in+Aminoacyl-tRNA+Synthetases.">MIST, a Novel Approach to Reveal Hidden Substrate Specificity in Aminoacyl-tRNA Synthetases.</a> PLoS One. 10 (6), e0130042 (2015).</li><li>Grelet, S., McShane, A., Geslain, R., Howe, P. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GtRNAdb:+A+database+of+transfer+RNA+genes+detected+in+genomic+sequence.">GtRNAdb: A database of transfer RNA genes detected in genomic sequence.</a> Nucl. Acids Res. 37 (Database issue), D93-D97 (2009).</li><li>Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Radioactive+Phosphorus+upon+a+Suspension+of+Escherichia+coli.">The Effect of Radioactive Phosphorus upon a Suspension of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 55 (5), 705-710 (1948).</li></ol>

利害の対立が宣言されていません。

ベータ粒子の放出は、テストの範囲に放射セル フィットネスにも大きな影響を与えるしかし静菌と殺菌剤14、知られています。シンチレーションを示した放射能が全細胞抽出液の 25%、その後、浄化された総 Rna の 1% に組み込まれています。
プローブの同一サイズ、同等の溶解温度と GC コンテンツ、macroarray のスポッティング、統一プロトコル交配および定量化のスポット信号から直接レベルの tRNA の公平な測定できます。
スポットは、再現性と特定です。その広いダイナミック レンジと簡単に調整可能なしきい値により、配列露出度9を延長することにより単にポリソームに関連付けられている Trna などの低豊富な種をプロファイリングします。必要な設備の初期投資後の消耗品を含むサンプル当たりのランニング コスト サンプルあたり 15 ドルの平均値します。
スポットは、あらゆる有機体のゲノムはプローブ設計のために適用されます。試験管内で栽培されているモデル生物は、代謝ラベリングを理想的な候補です。哺乳類のゲノムはしばしば多くの isodecoders (Trna と同じ anticodons を共有するものの、彼らのボディのシーケンスの小さい相違を表示) をエンコード、プローブは閉じる tRNA 種の同種交配を維持するために部分的に退化した必要があります。最後に、付着性の哺乳類セルは通常低い文化を大幅にスケール アップする必要があるので、 M. smegmatisなどペンションで成長した有機体と比較して総 RNA 量を得られます。

セルの種類・環境・ ストレス1,2,3などの条件によると携帯電話の tRNA のレベルが変動します。スポット、tRNA を観察するための合理化されたプラットフォームは、元、信頼性の高い研究所成長生物の転移 RNA レベルの高速高精度の定量化ができる簡単なテクニックです。
Trna は、非常に安定した二次および第三構造4を持っています。また、多数の転写後変更5を表示します。これらの機能は、重要な構造とシーケンス障害バイアスまたは防止 tRNA プロファイル標準ベンチマーク RNA 定量技術6を使用して直接かつ再現性を表します。世界中の研究グループは、細胞の tRNA のレベルを評価するために創造的な多くの場合複雑な技術の開発を余儀なくされました。これらのメソッドのいくつかを含める: 代謝ラベルの付いた Trna (1) 二次元電気泳動分離は北のしみ1整然としたスポット割り当てと組み合わせる(北に 2) 個々 の定量化のしみを使用して慎重に標準化された放射性 DNA プローブ7;(続いて 3) ポスト抽出ラベリング シアニン螢マイクロ アレイ解析3と (4)の in vitro遺伝子組換え demodification 酵素逆のトランスクリプションと組み合わせるとそれ以降を使用して tRNA 変更のストリップ高スループット シーケンス8。
スポットは 2 つのスタンダードでシンプルなアプローチのシンプルで元の組み合わせ: (1) RNA の体ラベリング、合成は、成長する生物、放射性の総 Rna や tRNA (2) macroarrays、体系的かつ小型化されたゲノムのツールで構成されていますtRNA の分離のために最適化されています。
サンプルは、生物から定量化プラットフォームに合理化します。彼らは抽出後直接分析し、さらにポスト抽出増幅または酵素治療を必要とする技術と比較してバイアスが大幅に制限されるに処理されません。スポットは多目的、リボソームの翻訳に物理的に関連付けられている tRNA サブポピュレーションの定量化ポリソーム分別に簡単に組み合わせることができます。
ここで提示されたプロトコルがアラビノースイソメラーゼ、最適化され、大腸菌9、酵母10マウスとヒトの細胞培養11 でプロファイル Trna にも正常に使っていました.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass slide indexing system</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide arrayer replicator</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplate indexing system</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash and blot station</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replicator pin dryer</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine coated slides</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>K2615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridizer / Automated hybridization and washing station</td>
			<td>Digilab</td>
			<td>Hyb10022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker incubator</td>
			<td>Eppendorf Themomixer</td>
			<td>05-400-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap 2 ml tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21-403-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[32P] Na2HPO4</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEX011001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm glass beads</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>9831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini bead mill</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage phosphore screen</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>BAS-IP SR 0813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Typhoon FLA7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>Spectroline</td>
			<td>Select series 254 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray centrifuge</td>
			<td>Arrayit Corporation</td>
			<td>MHC110V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium smegmatis</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>700084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use needles</td>
			<td>BD (Becton Dickinson)</td>
			<td>305185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml centrifuge tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-666-317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precipitant (GlucoBlue)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9 broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A451-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 X SSC</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridisation cassette</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>63-0035-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M126-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>A3611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid)</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2482-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Phosphate buffer pH 7.2</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ63974AP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic labeling and profiling of transfer rnas using macroarrays

トランスファー Rna (tRNA) が豊富な短い非コード RNA 種通常 76 に 90 のヌクレオチド長であります。Trna は mRNA のコドンをアミノ酸配列に翻訳することによってタンパク質合成を直接担当です。Trna は長い規制機能に欠けていた家は維持分子として考慮されました。ただし、証拠の成長するボディは、セル型、環境、ストレスなどさまざまな条件に対応携帯電話の tRNA のレベルが変動することを示します。TRNA 表現の揺らぎは、優遇または特定蛋白質の発現を抑制遺伝子翻訳を直接影響します。最終的にタンパク質合成の動的を理解と、高品質の tRNA のプロファイルを提供することができる方法の開発が必要です。ここで紹介する方法は、スポット観測 tRNA の合理化されたプラットフォームの略という名前です。スポットは、放射性の総 Rna のためチオシアン酸-フェノール-クロロホルム抽出が続く放射性の正燐酸塩と培養細胞の代謝ラベリングで始まる 3 つの手順で構成されています、最後に社内で交配の印刷macroarrays。tRNA のレベルを推定するには、プローブの各スポットで放射能強度の定量化します。ここで提示されたプロトコルアラビノースイソメラーゼmc2155、結核を研究するモデル生物としてよく使用されます非病原性細菌の Trna をプロファイルします。

3 つの独立した生物は、すべてM. smegmatis Trna テスト成長条件下で、バック グラウンド レベル (図 1) の上に表現されているショーをレプリケートします。この実験では、各プローブの観測の標準偏差は 2% (Arg (TCT)) と、5% (図 1) で中央値 22% (Cys (GCA)) との間で構成されています。複製間で虚偽の変更はアレイの準備および交配などの要因によって大きく影響されました。高い再現性はサンプルの交配を自動化し同様、慎重かつ一貫性のある配列印刷によって実現されます。TRNA の 5-fold 違いがあるイル (GAT) と tRNA (ヴァル (TAC)、最高と最低豊富な種それぞれ。スポットは、tRNA isoacceptors の発現は一様でないことを示しています。Isoacceptors は、同じアミノ酸を保持するが、異なるアンチコドン シーケンスを表示およびデコード Mrna のコドンを別の種です。一方、たとえば、すべてアラニン isoacceptors を表現し、似たようなレベルで受け入れる Trna が 3 倍異なる最高と最低のアルギニン。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56898/56898fig1.jpg"> 図 1: 代表的な tRNA macroarray 結果。(A)スキャンした細菌、マウスおよび人間 macroarrays。M. smegmatis配列は、マウスおよびヒトの 48 ではなくのみ 43 プローブを使用します。結果として、細菌の配列には、背景とブレンド 40 の空スポット (プローブ アレイごとに 8 回にレプリケートされます) が表示されます。それらのほとんどは左上隅にクラスター化します。M. smegmatisの最適な成長条件下に tRNA のプロフィールの(B)のヒストグラムとヒートマップ表現。プローブ信号 (細菌の増殖、新陳代謝、抽出およびアレイ交配を含む) 3 つの独立実験の平均および合計 Trna の千の値に従って表現されます。3 つのレプリケートの標準偏差はそれぞれ誤差範囲とヒストグラムとヒートマップにオレンジの色合いとして示されます。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56898/56898fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

スポット (tRNA を観察するための合理化されたプラットフォーム) の名前、元のトランスファー RNA 解析プラットフォームについて述べる。スポットは、生体試料中唯一の 3 つの手順で、24 時間以内にすべての tRNAs の細胞レベルを同時に測定します。

代謝ラベリングと Macroarrays を使用して転移 Rna のプロファイリング

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

metabolic-labeling-and-profiling-of-transfer-rnas-using-macroarrays

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

5.8K ビュー.  College of Charleston. スポット (tRNA を観察するための合理化されたプラットフォーム) の名前、元のトランスファー RNA 解析プラットフォームについて述べる。スポットは、生体試料中唯一の 3 つの手順で、24 時間以内にすべての tRNAs の細胞レベルを同時に測定します。

ビデオ: Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.

We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.

内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

遺伝学

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands for the recognition of RNA sequence and structure. Chemically modified Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers have been recently developed that can recognize RNA duplexes in a sequence-specific manner. PNAs are chemically stable with a neutral peptide-like backbone. PNAs can be synthesized relatively easily by the manual Boc-chemistry solid-phase peptide synthesis method. PNAs are purified by reverse-phase HPLC, followed by molecular weight characterization by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF). Non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) technique facilitates the imaging of the triplex formation, because carefully designed free RNA duplex constructs and PNA bound triplexes often show different migration rates. Non-denaturing PAGE with ethidium bromide post staining is often an easy and informative technique for characterizing the binding affinities and specificities of PNA oligomers. Typically, multiple RNA hairpins or duplexes with single base pair mutations can be used to characterize PNA binding properties, such as binding affinities and specificities. 2-Aminopurine is an isomer of adenine (6-aminopurine); the 2-aminopurine fluorescence intensity is sensitive to local structural environment changes, and is suitable for the monitoring of triplex formation with the 2-aminopurine residue incorporated near the PNA binding site. 2-Aminopurine fluorescence titration can also be used to confirm the binding selectivity of modified PNAs towards targeted double-stranded RNAs (dsRNAs) over single-stranded RNAs (ssRNAs). UV-absorbance-detected thermal melting experiments allow the measurement of the thermal stability of PNA-RNA duplexes and PNA&#183;RNA2 triplexes. Here, we describe the synthesis and purification of PNA oligomers incorporating modified residues, and describe biochemical and biophysical methods for characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs.

We report the protocols for the synthesis and purification of Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers incorporating modified residues. The biochemical and biophysical methods for the characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs are described.

一本鎖 Rna の二重鎖 Rna の特定のシーケンスで選択的な認識化学修飾ペプチド核酸

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

In Vivoモデル システムとしてゼブラフィッシュを用いた DNA 複製タイミングのプロファイリング

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

ミトコンドリア DNA のメチル化の正確な検出のための方法論

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To date, miRNAs have been implicated in a large number of biological and disease processes, which has signified the need for the reliable detection methods of miRNA transcripts. Here, we describe a detailed protocol for digoxigenin-labeled (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) probe-based miRNA detection, combined with protein immunostaining on mouse heart sections. First, we performed an in situ hybridization technique using the probe to identify miRNA-182 expression in heart sections from control and cardiac hypertrophy mice. Next, we performed immunostaining for cardiac Troponin T (cTnT) protein, on the same sections, to co-localize miRNA-182 with the cardiomyocyte cells. Using this protocol, we were able to detect miRNA-182 through an alkaline phosphatase based colorimetric assay, and cTnT through fluorescent staining. This protocol can be used to detect the expression of any miRNA of interest through DIG-labeled LNA probes, and relevant protein expression on mouse heart tissue sections.

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are short and highly homologous RNA sequences, serving as post-transcriptional regulators of messenger RNAs (mRNAs). Current miRNA detection methods vary in sensitivity and specificity. We describe a protocol that combines in situ hybridization and immunostaining for concurrent detection of miRNA and protein molecules on mouse heart tissue sections.

マウス心臓のセクションを使用してその場で交配で発現組織固有の miRNA

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. Here, we present a method to selectively up-regulate protein expression of desired genes in cultured cells by means of synthetic antisense non-coding RNAs known as SINEUPs. This positive control of gene expression is at the post-transcriptional level and exerted by an inverted short interspersed nuclear element (SINE) repeat at the 3&#697; end of SINEUPs that comprises its effector domain (ED). SINEUPs can specifically bind to any protein-coding mRNA of choice through its binding domain (BD), a region designed to complement the sequence within the 5&#697; untranslated region (5&#697; UTR) and around the start codon of the mRNA. Target-specific SINEUPs designed in this manner are transfected to cultured cells, and protein and RNA are extracted for downstream analyses, generally 24-48 h post-transfection. SINEUP-induced protein up-regulation is detected by Western-blot analysis and RNA expression is measured using real-time quantitative reverse transcription PCR. We have observed that BD design is critical for achieving optimum SINEUP activity and that testing different BD sizes and positions with respect to the start codon of the target mRNA is recommended. Therefore, we describe here a semi-automated high-throughput imaging method based on fluorescence detection that can be implemented to target mRNA fused with green fluorescent protein (GFP). SINEUPs specifically enhance translation within normal physiological range of the cell, without altering the target transcript level. This method has been successfully employed against a range of endogenous and exogenous targets, in a wide variety of human, mouse, and insect cell lines along with in vivo systems. Moreover, SINEUPs have been reported to increase antibody production and work as an RNA therapeutic against haploinsufficient genes. The versatile and modular nature of SINEUPs makes them a suitable tool for gene-specific translational control.

SINEUPs are synthetic antisense non-coding RNAs, which contain a binding domain (BD) and an effector domain (ED) and up-regulate translation of target mRNA. Here, we describe detection methods for SINEUPs in cultured cell lines, analysis of their translation-promoting activity by Western-blot and a semi-automated high throughput imaging system.

セルベースのアッセイ SINEUP 非コード Rna mRNA の翻訳を特に高めることができるの

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since 2007. These studies have confirmed that lncRNAs are altered in almost all diseases. However, studying the functional roles for lncRNAs in the context of disease remains difficult due to the lack of protein products, tissue-specific expression, low expression levels, complexities in splice forms, and lack of conservation among species. Given the species-specific expression, lncRNA studies are often restricted to human research contexts when studying disease processes. Since lncRNAs function at the molecular level, one way to dissect lncRNA biology is to either remove the lncRNA or overexpress the lncRNA and measure cellular effects. In this article, a written and visualized protocol to overexpress lncRNAs in vitro is presented. As a representative experiment, an lncRNA associated with inflammatory bowel disease, Interferon Gamma Antisense 1 (IFNG-AS1), is shown to be overexpressed in a Jurkat T-cell model. To accomplish this, the activating clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) technique is used to enable overexpression at the endogenous genomic loci. The activating CRISPR technique targets a set of transcription factors to the transcriptional start site of a gene, enabling a robust overexpression of multiple lncRNA splice forms. This procedure will be broken down into three steps, namely (i) guide RNA (gRNA) design and vector construction, (ii) virus generation and transduction, and (iii) colony screening for overexpression. For this representative experiment, a greater than 20-fold enhancement in IFNG-AS1 in Jurkat T cells was observed.

Traditional cDNA-based overexpression techniques have a limited applicability for the overexpression of long noncoding RNAs due to their multiple splice forms with potential functionality. This review reports a protocol using CRISPR technology to overexpress multiple splice variants of a long noncoding RNA.

CRISPR の遺伝子活性化を使用して長い Rna を過剰発現

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein interactions, and regulation of parental gene transcription. In classical next generation RNA sequencing (RNA-seq), circRNAs are typically overlooked as a result of poly-A selection during construction of mRNA libraries, or are found at very low abundance, and are therefore difficult to isolate and detect. Here, a circRNA library construction protocol was optimized by comparing library preparation kits, pre-treatment options and various total RNA input amounts. Two commercially available whole transcriptome library preparation kits, with and without RNase R pre-treatment, and using variable amounts of total RNA input (1 to 4 &#181;g), were tested. Lastly, multiple tissue types; including liver, lung, lymph node, and pancreas; as well as multiple brain regions; including the cerebellum, inferior parietal lobe, middle temporal gyrus, occipital cortex, and superior frontal gyrus; were compared to evaluate circRNA abundance across tissue types. Analysis of the generated RNA-seq data using six different circRNA detection tools (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC, and CIRCexplorer) revealed that a stranded total RNA library preparation kit with RNase R pre-treatment and 4 &#181;g RNA input is the optimal method for identifying the highest relative number of circRNAs. Consistent with previous findings, the highest enrichment of circRNAs was observed in brain tissues compared to other tissue types.

Circular RNAs (circRNAs) are non-coding RNAs that may have roles in transcriptional regulation and mediating interactions between proteins. Following assessment of different parameters for construction of circRNA sequencing libraries, a protocol was compiled utilizing stranded total RNA library preparation with RNase R pre-treatment and is presented here.

RNA シーケンシングを使用した円形 RNA の同定

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as plant microRNAs (miRNAs) carry a 2&#39;-O-methyl (2&#39;-OMe) modification at their 3&#39;&#160;terminal nucleotide. This modification adds another difficulty as it inhibits 3&#39;&#160;adapter ligation. We previously demonstrated that modified versions of the &#39;TruSeq (TS)&#39;&#160;protocol have less bias and an improved detection of 2&#39;-OMe RNAs. Here we describe in detail protocol &#39;TS5&#39;, which showed the best overall performance. TS5 can be followed either using homemade reagents or reagents from the TS kit, with equal performance.

We present a detailed small RNA library reparation protocol with less bias than standard methods and an increased sensitivity for 2&#39;-O-methyl RNAs. This protocol can be followed using homemade reagents to save cost or using kits for convenience.

小型RNA-seqの改善:バイアスの減少と2'-O-メチルRNAの検出の改善

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...

代謝ラベリングと Macroarrays を使用して転移 Rna のプロファイリング

要約

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内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

一本鎖 Rna の二重鎖 Rna の特定のシーケンスで選択的な認識化学修飾ペプチド核酸

In Vivoモデルシステムとしてゼブラフィッシュを用いた DNA 複製タイミングのプロファイリング

ミトコンドリア DNA のメチル化の正確な検出のための方法論

マウス心臓のセクションを使用してその場で交配で発現組織固有の miRNA

酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして

セルベースのアッセイ SINEUP 非コード Rna mRNA の翻訳を特に高めることができるの

CRISPR の遺伝子活性化を使用して長い Rna を過剰発現

RNA シーケンシングを使用した円形 RNA の同定

小型RNA-seqの改善:バイアスの減少と2'-O-メチルRNAの検出の改善

代謝ラベリングと Macroarrays を使用して転移 Rna のプロファイリング

要約

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内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

一本鎖 Rna の二重鎖 Rna の特定のシーケンスで選択的な認識化学修飾ペプチド核酸

In Vivoモデル システムとしてゼブラフィッシュを用いた DNA 複製タイミングのプロファイリング

ミトコンドリア DNA のメチル化の正確な検出のための方法論

マウス心臓のセクションを使用してその場で交配で発現組織固有の miRNA

酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして

セルベースのアッセイ SINEUP 非コード Rna mRNA の翻訳を特に高めることができるの

CRISPR の遺伝子活性化を使用して長い Rna を過剰発現

RNA シーケンシングを使用した円形 RNA の同定

小型RNA-seqの改善:バイアスの減少と2'-O-メチルRNAの検出の改善

In Vivoモデルシステムとしてゼブラフィッシュを用いた DNA 複製タイミングのプロファイリング