Questo lavoro è stato supportato da un grant SC INBRE dal National Institute of General Medical Science - NIH (P20GM103499 di R.G.) e concede CA555536 & CA154664 dal National Cancer Institute a P.H.H. Questo programma è stato sostenuto in parte da una sovvenzione per il College of Charleston l'Howard Hughes Medical Institute attraverso il pre-college & programma di educazione scientifica dello studente non laureato e da sovvenzioni dal centro nazionale per ricerca risorse (5 P20 RR016461) e il National Institute of General Medical Sciences (P20 8 GM103499) da istituti nazionali di salute.

1. la cultura e l'etichettatura metabolica
<ol><li>Una volta colpire il centro del tappo di un tubi micro-centrifuga sterili da 1,5 mL con un ago calibro 18 per consentire adeguata aerazione. Inoculare 500 µ l di completati sterile 7h 9 brodo con 5 µ l di M. smegmatis da un antipasto cultura cresciuti durante la notte12. Nota: La ricetta per un litro di 7h 9 brodo è: 4,7 g commerciale 7h 9 polvere, 2 mL di glicerolo, 1 mL di Tween 80, 0,85 g NaCl, 5 g di albumina, 2 g di destrosio, H2O (per portare il volume totale di 1 L).<ol>
<li>
(Attenzione) In seguito le pratiche standard di radioprotezione, spike i terreni di coltura con 20 µ ci/mL di [32P] Na2HPO4. Crescere i batteri a 37 ° C e 1.200 giri/min agitazione, in un incubatore agitatore posizionato dietro uno scudo di acrilico spesso 9 mm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fase di midlog (O.D.600 nm ~ 0,5), trasferire tutta la cultura in una provetta da 2 mL con tappo a vite e pellet radioattivi batteri a temperatura ambiente mediante centrifugazione per 2 min a 10.000 x g. raccogliere il surnatante contenente ortofosfato radioattivo non incorporata nel apposito contenitore per rifiuti.</li>
</ol>2. preparazione di RNA totale
Nota: Il RNA totale è estratte dal pellet batterica utilizzando un reagente di estrazione RNA commerciale (contenente tiocianato di guanidinium, fenolo e cloroformio) seguendo il protocollo del produttore.
<ol><li>Aggiungere 1 mL di reagente di estrazione RNA commerciali e circa 200 µ l di perline di vetro sul pellet. Tappare bene il tubo e perturbare il batterico in un omogeneizzatore per 2 min sotto massima agitazione, (impostazione numero cinque su strumento prescelto (Vedi la Tabella materiali)).</li>
	<li>Campione di centrifuga a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C. Trasferire il surnatante in una provetta 2 mL nuova e scartare le perline in modo appropriato. Aggiungere 0,2 mL di cloroformio e agitare vigorosamente tubo per 15 s. Centrifugare a 12.000 x g per 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Raccogliere la fase acquosa del campione in una provetta nuova di pesca il tubo a 45°. Evitare di trarre qualsiasi interfase o strato organico. Aggiungere 2 µ l di precipitante colorate e 0,5 mL di isopropanolo 100%. Agitare vigorosamente la provetta per 5 s. Centrifugare a 12.000 x g per 10 min a 4° C.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante dal tubo e scartare in modo appropriato come la frazione liquida può contenere tracce di radioattività. Aria secca pellet per 5 min poi risospendere in 200 µ l di soluzione salina-sodio citrato (SSC), 0,1% (p/v) sodio dodecil solfato (SDS) finale: 2x. Nota: La composizione dello stock 20 X SSC è 3,0 M di NaCl, citrato di sodio 0,3 M, pH 7.0.</li>
</ol>3. preparazione delle piastre di stampante ben 96
Nota: tRNA microarrays manualmente vengono stampati con quaranta due 70-mer oligonucleotides del DNA complementare all'estremità 3' di ogni tRNA M. smegmatis (CCA terminal esclusi) utilizzando un arrayer otto poli. Sono disponibili le sequenze delle sonde del oligonucleotide di DNA così come il layout di sonda nel pozzo-piastra e la matrice (File supplementari 1 - foglio 1 di 3 rispettivamente).
<ol><li>Sonde di DNA di progettazione di primo recupero tRNA sequenze o geni codificanti tRNA dal database di tRNA quali il tRNA Genomic Database13. Trim conservato 3' estremità CCA se codificato. Complemento inverso la sequenza risultante. Sonda di ordine basato sui primi 70 nucleotidi.</li>
	<li>Risospendere le che sonde di DNA secco in acqua. Regolare la concentrazione di sonde a 100 µM. A 96 pozzetti, preparare 120 µ l di 50 µM oligos in 3 X SSC, finale di 0,01% (p/v) SDS (diluire 60 µ l di sonde stock in singoli bene con 60 µ l di 6 X SSC, 0,01% (p/v) SDS.</li>
	<li>Coprire la piastra con carta stagnola per evitare evaporazione o contaminazione, congelare immediatamente e conservare a-20 ° C fino a quando necessario.</li>
</ol>4. stampa array
<ol><li>Scongelare la piastra a 96 pozzetti a temperatura ambiente (dura circa 20 min).</li>
	<li>Etichettare i vetrini di vetro rivestite con ammina con una penna di diamante. Mettere i vetrini in unità di indicizzazione. Segui i posizionamenti di griglia e procedere come segue.<ol>
<li>Attentamente e immergere i perni replicator nei pozzetti.</li>
		<li>Stampare delicatamente la matrice sulle lastre di vetro, utilizzando una pressione minima (vi sentirete una piccola resistenza). Continuare a stampare senza pulizia arrayer fino al termine con blocco A.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quando si è pronti per passare al blocco successivo, seguire la procedura di lavaggio descritta di seguito.<ol>
<li>Immergere replicator in 5% candeggina e agitare delicatamente.</li>
		<li>Replicatore di stampa in carta assorbente.</li>
		<li>Immergere replicator in acqua distillata, agitare delicatamente e premere in carta. Ripetere questo passaggio una volta.</li>
		<li>Immergere replicator in isopropanolo, agitare delicatamente e premere nella carta.</li>
		<li>Asciugare il replicatore sulla ventola per circa 20 s prima di passare al blocco successivo della piastra 96 pozzetti. Proseguire fino al numero desiderato di stampe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lasciare i vetrini asciugare quindi crosslink oligos alla diapositiva utilizzando un reticolante UV 254 nm.<ol>
<li>Impostare il livello di energia a 999.990 µ j/cm2.</li>
		<li>Mettere il volto di diapositive su una superficie pulita nel reticolante. Premere il tasto "start".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bloccare le matrici pernottamento in 450 mL di soluzione su un agitatore magnetico, a temperatura ambiente e sotto lenta agitazione di blocco. Raccogliere e riutilizzare la soluzione bloccante fino a quattro volte. Nota: La ricetta per la soluzione bloccante è: 125 mM di tampone fosfato (NaH2PO4/Na2HPO4-) pH 7.2, 2,25% SDS (w/v), 0,5 mM EDTA, 0,5 X SSC, BSA 1% (p/v).</li>
	<li>Lavare i vetrini 2 volte per 5 min a temperatura ambiente in 500 mL di acqua distillata. Asciugare i vetrini mediante centrifugazione per 10 s a temperatura ambiente in una centrifuga di microarray. Archivio matrici in un luogo asciutto e buio fino a 6 mesi.</li>
</ol>5. ibridazione
<ol><li>Prima di ibridazione sciacquare i vetrini in acqua bollente e asciugare mediante centrifugazione (come in 4,6).</li>
	<li>Inserire la matrice all'interno di una cassetta di ibridazione e caricare un esempio di RNA radioattivo.</li>
	<li>Eseguire la stazione di ibridazione-lavaggio automatica per la massima riproducibilità.<ol>
<li>Passi di programma come segue. Guarnizioni di condizione per 2 min a 75 ° C. Introdurre la sonda a 60 ° C. Denaturare sonde e campioni 5 min a 90 ° C. Ibridare campioni per 3 h a 60 ° C.<ol>
<li>Lavare i vetrini a 50 ° C due volte con 2 X SSC, 0,1% (p/v) SDS, flusso 10 s e tenere 20 s. lavare a 42 ° C due volte con 0.1 X SSC, 0.1% SDS, flusso 10 s e tenere 20 s. lavaggio vetrini a 42 ° C due volte con 0,1 X SSC , portata 10 s e tenere premuto 20 s.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>A secco di diapositive mediante centrifugazione (come in 4,6).</li>
</ol>6. quantificazione di matrice
<ol><li>Avvolgere le diapositive utilizzando una sottile pellicola di plastica. Verifica diapositive per segnale radioattivo utilizzando un contatore di Geiger sulla sua impostazione più sensibile. Esporre le diapositive su uno schermo al fosforo di deposito in una cassetta di esposizione a temperatura ambiente per 10 a 90 h a seconda della potenza del segnale. Nota: Come sensibilità di contatori Geiger variano da uno strumento a altro, tempi di esposizione devono essere ottimizzati empiricamente.</li>
	<li>Scansione di diapositive a 50 µm risoluzione utilizzando un phosphorimager. Quantificare e sfondo-sottrarre intensità di radioattività ad ogni spot della sonda utilizzando il software gratuito Image J aggiornato con un profiler di microarray.</li>
	<li>Organizzare ed elaborare i dati utilizzando un foglio di calcolo elettronico. Generare mappe di calore utilizzando lo strumento di formattazione condizionale. Ad esempio rappresentare ogni segnale di sonda come una frazione (espressa in ‰) del segnale sonda totale.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Emilsson, V., Kurland, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate+dependence+of+transfer+RNA+abundance+in+Escherichia+coli.">Growth rate dependence of transfer RNA abundance in Escherichia coli.</a> EMBO J. 9 (13), 4359-4366 (1990).</li><li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression.">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2 (12), e221 (2006).</li><li>Pavon-Eternod, M., Gomes, S., Geslain, R., Dai, Q., Rosner, M. R., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA+over-expression+in+breast+cancer+and+functional+consequences.">tRNA over-expression in breast cancer and functional consequences.</a> Nucleic Acids Res. 37 (21), 7268-7280 (2009).</li><li>Gieg&#233;, R., J&#252;hling, F., P&#252;tz, J., Stadler, P., Sauter, C., Florentz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+transfer+RNAs:+similarity+and+variability.">Structure of transfer RNAs: similarity and variability.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 3 (1), 37-61 (2012).</li><li>Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+frequencies+of+post-transcriptional+modifications+in+tRNAs.">Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs.</a> RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).</li><li>Torres, A. G., Pi&#241;eyro, D., Rodr&#237;guez-Escrib&#224;, M., Camacho, N., Reina, O., Saint-L&#233;ger, A., Filonava, L., Batlle, E., Ribas de Pouplana, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inosine+modifications+in+human+tRNAs+are+incorporated+at+the+precursor+tRNA+level.">Inosine modifications in human tRNAs are incorporated at the precursor tRNA level.</a> Nucleic Acids Res. 43 (10), 5145-5157 (2015).</li><li>Cognat, V., Deragon, J. M., Vinogradova, E., Salinas, T., Remacle, C., Mar&#233;chal-Drouard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+evolution+and+expression+of+Chlamydomonas+reinhardtii+nucleus-encoded+transfer+RNA+genes.">On the evolution and expression of Chlamydomonas reinhardtii nucleus-encoded transfer RNA genes.</a> Genetics. 179 (1), 113-123 (2008).</li><li>Zheng, G., Qin, Y., Clark, W. C., Dai, Q., Yi, C., He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+quantitative+high-throughput+tRNA+sequencing.">Efficient and quantitative high-throughput tRNA sequencing.</a> Nat Methods. 12 (9), 835-837 (2015).</li><li>Grelet, S., McShane, A., Hok, E., Tomberlin, J., Howe, P. H., Geslain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOt:+A+novel+and+streamlined+microarray+platform+for+observing+cellular+tRNA+levels.">SPOt: A novel and streamlined microarray platform for observing cellular tRNA levels.</a> PLoS One. 12 (5), e0177939 (2017).</li><li>Eriani, G., Karam, J., Jacinto, J., Morris Richard, E., Geslain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIST,+a+Novel+Approach+to+Reveal+Hidden+Substrate+Specificity+in+Aminoacyl-tRNA+Synthetases.">MIST, a Novel Approach to Reveal Hidden Substrate Specificity in Aminoacyl-tRNA Synthetases.</a> PLoS One. 10 (6), e0130042 (2015).</li><li>Grelet, S., McShane, A., Geslain, R., Howe, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+Roles+of+Non-Coding+RNAs+in+TGF-&#946;-Mediated+Epithelial-Mesenchymal+Transition+and+Their+Functions+in+Tumor+Progression.">Pleiotropic Roles of Non-Coding RNAs in TGF-&#946;-Mediated Epithelial-Mesenchymal Transition and Their Functions in Tumor Progression.</a> Cancers. 9 (7), (2017).</li><li>Belanger, A. E., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exponential-phase+glycogen+recycling+is+essential+for+growth+of+Mycobacterium+smegmatis.">Exponential-phase glycogen recycling is essential for growth of Mycobacterium smegmatis.</a> J Bacteriol. 181 (21), 6670-6678 (1999).</li><li>Chan, P. P., Lowe, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GtRNAdb:+A+database+of+transfer+RNA+genes+detected+in+genomic+sequence.">GtRNAdb: A database of transfer RNA genes detected in genomic sequence.</a> Nucl. Acids Res. 37 (Database issue), D93-D97 (2009).</li><li>Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Radioactive+Phosphorus+upon+a+Suspension+of+Escherichia+coli.">The Effect of Radioactive Phosphorus upon a Suspension of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 55 (5), 705-710 (1948).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Le emissioni di particelle beta sono noti agenti batteriostatici e battericidi14, tuttavia radiazioni nella gamma testata non hanno alcun impatto significativo sull'adeguatezza della cella. Conteggio delle scintillazioni ha mostrato che la radioattività è incorporata nel 25% del totale-cella estratti e successivamente, l'1% di RNA totale purificato.
Delle sonde identiche dimensioni, temperatura di fusione comparabile e contenuto di GC, insieme a un protocollo uniforme per macroarray spotting, ibridazione e quantificazione permette imparziale misura dei livelli di tRNA direttamente dai segnali spot.
SPOt è riproducibile e specifici. Sua grande gamma dinamica e la soglia facilmente regolabile permette di profilatura basso specie abbondanti, come tRNAs associato polisomi, semplicemente prolungando la matrice esposizione volte9. Dopo l'investimento iniziale per l'attrezzatura necessaria, il costo per campione, compresi materiali di consumo, di funzionamento media $15 a campioni.
SPOt è applicabile a qualsiasi organismo cui genoma è disponibile per il design della sonda. Organismi di modello che vengono coltivati in vitro sono candidati ideali per l'etichettatura metabolica. Come il genoma di mammiferi spesso codifica molti isodecoders (tRNAs che condividono identici anticodoni ma visualizzare piccole differenze nelle loro sequenze di corpo) sonde devono essere parzialmente degenerati per mantenere omogenea ibridazione delle specie di tRNA stretta. Infine, le cellule di mammiferi aderente producono in genere minori quantità di RNA totale rispetto agli organismi coltivati in sospensione come M. smegmatis, quindi le colture devono essere sostanzialmente scalato.

I livelli cellulari di tRNA fluttuano secondo condizioni come tipo di cella, ambiente e stress1,2,3. SPOt, snella piattaforma per l'osservazione di tRNA, è un originale, affidabile e semplice tecnica che permette la rapida e precisa quantificazione dei livelli di RNA di trasferimento negli organismi coltivate in laboratorio.
tRNAs hanno notevolmente stabili strutture secondarie e terziarie4. Essi mostrano anche numerose modificazioni post-trascrizionali5. Queste caratteristiche rappresentano strutturali significativi e blocchi stradali di sequenza polarizzazione o a volte impedire diretto e riproducibile tRNA profilatura mediante benchmark standard RNA quantificazione tecniche6. Gruppi di ricerca nel mondo sono stati costretti a sviluppare tecniche creative ma spesso contorte per valutare i livelli cellulari di tRNA. Alcuni di questi metodi includono: (1) separazione elettroforetica bidimensionale di metabolicamente con etichetta tRNAs combinato con assegnazione posto metodico di Northern blot1; (2) i singoli quantificazione mediante Northern blot utilizzando sonde DNA radioattivo accuratamente standardizzate7; (3) post-estrazione etichettatura con fluorocromi cianina seguita da microarray analysis3e (4) in vitro stripping di modifiche di tRNA utilizzando enzimi ricombinanti demodification combinati con trascrizione d'inversione e successivi sequenziamento High8.
SPOt è una combinazione semplice e originale di due approcci standard e semplice: corpo (1) RNA etichettatura, che consiste nella sintesi, nella coltivazione di organismi, di RNA totale radioattivo e (2) tRNA macroarrays, strumento di genomico sistematico e miniaturizzato ottimizzato per la segregazione di tRNA.
I campioni sono semplificati da organismi viventi per la piattaforma di quantificazione. Essi sono analizzati direttamente dopo l'estrazione e non elaborato qualsiasi ulteriore che limita notevolmente le distorsioni rispetto alle tecniche che richiedono l'amplificazione dell'alberino-estrazione o trattamenti enzimatici. SPOt è versatile e può essere facilmente combinato al frazionamento polisoma per identificare e quantificare le sottopopolazioni di tRNA che sono fisicamente associate con la traduzione di ribosomi.
Il protocollo presentato qui è ottimizzato per Mycobacterium smegmatis, ed è stato usato con successo anche per profilo tRNAs9 Escherichia coli,10 Saccharomyces cerevisiae, mouse e colture di cellule umane11 .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass slide indexing system</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide arrayer replicator</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplate indexing system</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash and blot station</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replicator pin dryer</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine coated slides</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>K2615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridizer / Automated hybridization and washing station</td>
			<td>Digilab</td>
			<td>Hyb10022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker incubator</td>
			<td>Eppendorf Themomixer</td>
			<td>05-400-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap 2 ml tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21-403-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[32P] Na2HPO4</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEX011001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm glass beads</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>9831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini bead mill</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage phosphore screen</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>BAS-IP SR 0813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Typhoon FLA7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>Spectroline</td>
			<td>Select series 254 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray centrifuge</td>
			<td>Arrayit Corporation</td>
			<td>MHC110V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium smegmatis</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>700084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use needles</td>
			<td>BD (Becton Dickinson)</td>
			<td>305185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml centrifuge tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-666-317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precipitant (GlucoBlue)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9 broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A451-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 X SSC</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridisation cassette</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>63-0035-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M126-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>A3611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid)</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2482-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Phosphate buffer pH 7.2</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ63974AP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic labeling and profiling of transfer rnas using macroarrays

RNA transfer (tRNA) sono abbondanti breve non codificanti RNA specie che sono in genere da 76 a 90 nucleotidi di lunghezza. tRNAs sono direttamente responsabili per la sintesi proteica, traducendo i codoni del mRNA in sequenze dell'amminoacido. tRNAs lungo sono stati considerati come molecole di mantenimento della casa che mancava funzioni di regolamentazione. Tuttavia, un corpo crescente di prova indica che i livelli cellulari di tRNA fluttuano in corrispondenza di condizioni variabili come il tipo di cella, l'ambiente e lo stress. La fluttuazione dell'espressione di tRNA condiziona direttamente la traduzione genica, favorendo o reprimere l'espressione delle proteine particolari. In ultima analisi, comprendere la dinamica della sintesi proteica richiede lo sviluppo di metodi in grado di fornire profili di tRNA di alta qualità. Il metodo che presentiamo qui è denominato SPOt, che sta per piattaforma semplificata per Observing tRNA. SPOt è costituito da tre passaggi a partire con l'etichettatura metabolica delle colture cellulari con ortofosfato radioattivo, seguita da guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio estrazione di RNA totale radioattivo e infine l'ibridazione su in-House stampati macroarrays. livelli di tRNA sono stimati di quantificare l'intensità di radioattività ad ogni spot di sonda. In protocollo presentato qui noi profilo tRNAs Mycobacterium smegmatis mc2155, un batterio non patogeno, spesso usato come organismo modello per studiare la tubercolosi.

Tre biologico indipendente replica spettacolo che, sotto le condizioni di crescita testati, tutte le M. smegmatis tRNAs sono espressi sul livello sfondo (Figura 1). In questo particolare esperimento, la deviazione standard osservata per ogni sonda è compreso tra il 2% (Arg (TCT)) e il 22% (Cys (GCA)) con una mediana al 5% (Figura 1). False le modifiche tra repliche sono significativamente influenzate da fattori quali la preparazione della matrice e l'ibridazione. Alta riproducibilità è raggiunto attraverso la stampa di matrice accurato e coerente così come automatizzato l'ibridazione del campione. C'è una differenza di 5 volte tra il tRNA Ile (GAT) e tRNA (Val (TAC), la specie più alta e più basso abbondante rispettivamente. SPOt Mostra che l'espressione di tRNA isoacceptors non è uniforme. Isoacceptors sono specie che tenere lo stesso amminoacido ma visualizzare sequenze anticodone diverso e quindi decodificare diversi codoni su mRNA. Per esempio, tutti i isoacceptors di alanina sono espressi a livelli simili, considerando che l'arginina più alto e più basso accettante tRNAs differiscono per 3 volte.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56898/56898fig1.jpg"> Figura 1: risultati macroarray rappresentante tRNA. (A) Scanned batterico, mouse e macroarrays umano. M. smegmatis matrici utilizzano soltanto 43 sonde anziché 48 per mouse e umani. Di conseguenza, la matrice batterica Visualizza 40 punti vuoti (sonde vengono replicati otto volte su ogni matrice) che si fondono con lo sfondo. La maggior parte di loro sono raggruppata in alto a sinistra. (B) istogramma e heatmap Rappresentanze di profili di tRNA in M. smegmatis sotto condizioni di crescita ottimali. Segnali sonda sono la media di tre esperimenti indipendenti (tra cui la crescita batterica, etichettatura metabolica, ibridazione estrazione e matrice) e sono espressi secondo mille valori di tRNAs totale. Deviazioni standard per le tre repliche sono indicate, rispettivamente, come barre di errore e tonalità di arancio sull'istogramma e heatmap. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56898/56898fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Descriviamo un'originale piattaforma di analisi del RNA di trasferimento denominata SPOt (snella piattaforma per l'osservazione del tRNA). Punto misura contemporaneamente i livelli cellulari di tutti i tRNAs nei campioni biologici, in solo tre passi e in meno di 24 ore.

Etichettatura metabolica e profilatura di RNA di trasferimento utilizzando Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

5.8K Views.  College of Charleston. Descriviamo un'originale piattaforma di analisi del RNA di trasferimento denominata SPOt (snella piattaforma per l'osservazione del tRNA). Punto misura contemporaneamente i livelli cellulari di tutti i tRNAs nei campioni biologici, in solo tre passi e in meno di 24 ore.

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Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.

We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.

Unicellulare profili di espressione genica Utilizzando FACS e qPCR con standard interni

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Ricerca

Genetica

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands for the recognition of RNA sequence and structure. Chemically modified Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers have been recently developed that can recognize RNA duplexes in a sequence-specific manner. PNAs are chemically stable with a neutral peptide-like backbone. PNAs can be synthesized relatively easily by the manual Boc-chemistry solid-phase peptide synthesis method. PNAs are purified by reverse-phase HPLC, followed by molecular weight characterization by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF). Non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) technique facilitates the imaging of the triplex formation, because carefully designed free RNA duplex constructs and PNA bound triplexes often show different migration rates. Non-denaturing PAGE with ethidium bromide post staining is often an easy and informative technique for characterizing the binding affinities and specificities of PNA oligomers. Typically, multiple RNA hairpins or duplexes with single base pair mutations can be used to characterize PNA binding properties, such as binding affinities and specificities. 2-Aminopurine is an isomer of adenine (6-aminopurine); the 2-aminopurine fluorescence intensity is sensitive to local structural environment changes, and is suitable for the monitoring of triplex formation with the 2-aminopurine residue incorporated near the PNA binding site. 2-Aminopurine fluorescence titration can also be used to confirm the binding selectivity of modified PNAs towards targeted double-stranded RNAs (dsRNAs) over single-stranded RNAs (ssRNAs). UV-absorbance-detected thermal melting experiments allow the measurement of the thermal stability of PNA-RNA duplexes and PNA&#183;RNA2 triplexes. Here, we describe the synthesis and purification of PNA oligomers incorporating modified residues, and describe biochemical and biophysical methods for characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs.

We report the protocols for the synthesis and purification of Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers incorporating modified residues. The biochemical and biophysical methods for the characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs are described.

Riconoscimento di sequenza-specifico e selettivo di Double-stranded RNA sopra Single-stranded RNA da modificati chimicamente acidi peptido nucleici

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

Tempo di replicazione del DNA utilizzando Zebrafish come un sistema di modello In Vivo di profilatura

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

Metodologia per la rilevazione accurata di metilazione del DNA mitocondriale

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To date, miRNAs have been implicated in a large number of biological and disease processes, which has signified the need for the reliable detection methods of miRNA transcripts. Here, we describe a detailed protocol for digoxigenin-labeled (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) probe-based miRNA detection, combined with protein immunostaining on mouse heart sections. First, we performed an in situ hybridization technique using the probe to identify miRNA-182 expression in heart sections from control and cardiac hypertrophy mice. Next, we performed immunostaining for cardiac Troponin T (cTnT) protein, on the same sections, to co-localize miRNA-182 with the cardiomyocyte cells. Using this protocol, we were able to detect miRNA-182 through an alkaline phosphatase based colorimetric assay, and cTnT through fluorescent staining. This protocol can be used to detect the expression of any miRNA of interest through DIG-labeled LNA probes, and relevant protein expression on mouse heart tissue sections.

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are short and highly homologous RNA sequences, serving as post-transcriptional regulators of messenger RNAs (mRNAs). Current miRNA detection methods vary in sensitivity and specificity. We describe a protocol that combines in situ hybridization and immunostaining for concurrent detection of miRNA and protein molecules on mouse heart tissue sections.

Tessuto-specifici miRNA Expression Profiling in Mouse cuore sezioni mediante ibridazione In Situ

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae Metabolica etichettatura con 4-tiouracile e la quantificazione di nuova sintesi mRNA come Proxy per attività di RNA polimerasi II

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. Here, we present a method to selectively up-regulate protein expression of desired genes in cultured cells by means of synthetic antisense non-coding RNAs known as SINEUPs. This positive control of gene expression is at the post-transcriptional level and exerted by an inverted short interspersed nuclear element (SINE) repeat at the 3&#697; end of SINEUPs that comprises its effector domain (ED). SINEUPs can specifically bind to any protein-coding mRNA of choice through its binding domain (BD), a region designed to complement the sequence within the 5&#697; untranslated region (5&#697; UTR) and around the start codon of the mRNA. Target-specific SINEUPs designed in this manner are transfected to cultured cells, and protein and RNA are extracted for downstream analyses, generally 24-48 h post-transfection. SINEUP-induced protein up-regulation is detected by Western-blot analysis and RNA expression is measured using real-time quantitative reverse transcription PCR. We have observed that BD design is critical for achieving optimum SINEUP activity and that testing different BD sizes and positions with respect to the start codon of the target mRNA is recommended. Therefore, we describe here a semi-automated high-throughput imaging method based on fluorescence detection that can be implemented to target mRNA fused with green fluorescent protein (GFP). SINEUPs specifically enhance translation within normal physiological range of the cell, without altering the target transcript level. This method has been successfully employed against a range of endogenous and exogenous targets, in a wide variety of human, mouse, and insect cell lines along with in vivo systems. Moreover, SINEUPs have been reported to increase antibody production and work as an RNA therapeutic against haploinsufficient genes. The versatile and modular nature of SINEUPs makes them a suitable tool for gene-specific translational control.

SINEUPs are synthetic antisense non-coding RNAs, which contain a binding domain (BD) and an effector domain (ED) and up-regulate translation of target mRNA. Here, we describe detection methods for SINEUPs in cultured cell lines, analysis of their translation-promoting activity by Western-blot and a semi-automated high throughput imaging system.

Cell Based Assays di Non-codificazione RNAs che specificamente può migliorare la traduzione degli mRNA aumentandone

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since 2007. These studies have confirmed that lncRNAs are altered in almost all diseases. However, studying the functional roles for lncRNAs in the context of disease remains difficult due to the lack of protein products, tissue-specific expression, low expression levels, complexities in splice forms, and lack of conservation among species. Given the species-specific expression, lncRNA studies are often restricted to human research contexts when studying disease processes. Since lncRNAs function at the molecular level, one way to dissect lncRNA biology is to either remove the lncRNA or overexpress the lncRNA and measure cellular effects. In this article, a written and visualized protocol to overexpress lncRNAs in vitro is presented. As a representative experiment, an lncRNA associated with inflammatory bowel disease, Interferon Gamma Antisense 1 (IFNG-AS1), is shown to be overexpressed in a Jurkat T-cell model. To accomplish this, the activating clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) technique is used to enable overexpression at the endogenous genomic loci. The activating CRISPR technique targets a set of transcription factors to the transcriptional start site of a gene, enabling a robust overexpression of multiple lncRNA splice forms. This procedure will be broken down into three steps, namely (i) guide RNA (gRNA) design and vector construction, (ii) virus generation and transduction, and (iii) colony screening for overexpression. For this representative experiment, a greater than 20-fold enhancement in IFNG-AS1 in Jurkat T cells was observed.

Traditional cDNA-based overexpression techniques have a limited applicability for the overexpression of long noncoding RNAs due to their multiple splice forms with potential functionality. This review reports a protocol using CRISPR technology to overexpress multiple splice variants of a long noncoding RNA.

Che overexpressing lunghi non codificanti RNA utilizzando CRISPR Gene-attivante

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein interactions, and regulation of parental gene transcription. In classical next generation RNA sequencing (RNA-seq), circRNAs are typically overlooked as a result of poly-A selection during construction of mRNA libraries, or are found at very low abundance, and are therefore difficult to isolate and detect. Here, a circRNA library construction protocol was optimized by comparing library preparation kits, pre-treatment options and various total RNA input amounts. Two commercially available whole transcriptome library preparation kits, with and without RNase R pre-treatment, and using variable amounts of total RNA input (1 to 4 &#181;g), were tested. Lastly, multiple tissue types; including liver, lung, lymph node, and pancreas; as well as multiple brain regions; including the cerebellum, inferior parietal lobe, middle temporal gyrus, occipital cortex, and superior frontal gyrus; were compared to evaluate circRNA abundance across tissue types. Analysis of the generated RNA-seq data using six different circRNA detection tools (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC, and CIRCexplorer) revealed that a stranded total RNA library preparation kit with RNase R pre-treatment and 4 &#181;g RNA input is the optimal method for identifying the highest relative number of circRNAs. Consistent with previous findings, the highest enrichment of circRNAs was observed in brain tissues compared to other tissue types.

Circular RNAs (circRNAs) are non-coding RNAs that may have roles in transcriptional regulation and mediating interactions between proteins. Following assessment of different parameters for construction of circRNA sequencing libraries, a protocol was compiled utilizing stranded total RNA library preparation with RNase R pre-treatment and is presented here.

Identificazione di RNA circolari mediante il sequenziamento dell'RNA

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as plant microRNAs (miRNAs) carry a 2&#39;-O-methyl (2&#39;-OMe) modification at their 3&#39;&#160;terminal nucleotide. This modification adds another difficulty as it inhibits 3&#39;&#160;adapter ligation. We previously demonstrated that modified versions of the &#39;TruSeq (TS)&#39;&#160;protocol have less bias and an improved detection of 2&#39;-OMe RNAs. Here we describe in detail protocol &#39;TS5&#39;, which showed the best overall performance. TS5 can be followed either using homemade reagents or reagents from the TS kit, with equal performance.

We present a detailed small RNA library reparation protocol with less bias than standard methods and an increased sensitivity for 2&#39;-O-methyl RNAs. This protocol can be followed using homemade reagents to save cost or using kits for convenience.

Migliorare il piccolo RNA-seq: meno Bias e migliore rilevamento di 2'-O-Methyl RNA

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...