原稿の彼の専門の読書のリアム フォートタイロンに感謝しております。この作品は、D. A. フードに自然科学と工学研究審議会のカナダ (レベル) からの資金によって支えられました。D. また、A. フード、細胞生理学のカナダの研究の椅子の保持者です。

すべての動物関連のプロシージャはレビューされ、ニューヨーク大学動物ケア委員会によって承認されました。ヨーク大学の動物実験施設に到着すると、すべてのラットは食品提供広告自由で、手術前に自分の環境に順応する 5 日間の最小値を与えられました。他種15,17,22にこのプロトコルが以前適用されている現在の紙 Pette と同僚の23の先駆的な仕事の上に構築、特にラット モデルに焦点を当ています。
1. 慢性収縮活動ユニットの準備
<ol><li>電圧計を使用して、コイン リチウム電池の可能性を確認してください。 注: 各電池の可能性は、3.0 ± 0.10 V をする必要があります。</li>
	<li>合計可能性が 6-9 V、ユニットのスロットに 2 つまたは 3 つの電池を挿入します。 注: この実験中 (6 または 9 V) 維持するためにどのように多くの潜在性を考慮する研究者の裁量次第です。研究デザイン、刺激の目的の強度に応じて 2 または 3 電池を使用できます。</li>
	<li>ユニットがきちんと働いているパルス指標経由ポータブル赤外線ストロボの光によって放射される 1 のパルス ユニットを公開することによってを確認します。</li>
</ol>2. 慢性の収縮活動の手術
注: は、手術前にすべての手術器具を滅菌します。中および手術後すぐに、ラットの体温は、加熱パッドによって維持されます。手術用覆布に手術の手順を実行することをお勧めします。外科医は、滅菌手術用手袋として清潔な白衣を着用ください。必要な場合は、使い捨ての防毒マスクを着用することをお勧めします。
<ol><li>麻酔ラット 1 3% 未満イソフルラン吸入酸素は、ガスの気化器システムが運営しております。後肢のつま先ピンチをチェックすることによって、呼吸の深さそして率を観察することによって、動物が鎮静完全に確認してください。乾燥を避けるために目に眼の潤滑剤を適用します。メロキシカム (0.5 mg/mL) の 2 mg/kg の皮下注射を適用します。 注: またお勧め中や手術後の痛みを最小限に抑えるため鎮痛 (例えば、メロキシカム プラス リドカイン) のマルチ モーダル アプリケーションを持っています。</li>
	<li>優しく剃る、首の後ろから胴体周りのストリップと同様、左後肢周りの後ろに前肢の前胸部全体。ヨードとアルコール消毒する剃毛エリアを軽く拭きます。</li>
	<li>動物の胃の上に敷設、剃毛地域 (肩甲骨の間明白な領域) の中央に首の後ろに小さな切開 (~0.5 cm) を作るメス (第 10 刃) を使用します。</li>
	<li>一般的な腓骨神経を探します。<ol>
<li>その右側に動物をロールし、2 〜 3 cm-長い左後肢の皮膚にカットします。膝関節のディンプルと尾の原点の近くに戻ると landmarked が大腿筋群周囲切開領域をターゲットします。 注: 本体の位置を変更するとき最初の切開領域を汚さないように気をつけてください。</li>
		<li>外科はさみを湾曲した鈍い先端を使用して、皮下のエリアを広く分析 ~3.5 - 4 cm、開いた肌と基になる筋肉の間のポケットを作るために基になる筋肉から皮膚を分離します。全周切開 (~1.5 cm2) の基になる組織から皮膚を開きます。</li>
		<li>外科はさみ、はさみの先端が筋肉を介して直接ダウン切っている確保と大腿二頭筋筋小切開 (0.5 cm 未満) を作る。</li>
		<li>内部の筋肉と、総腓骨神経が表示されるまで優しくカット領域を開く (外部の筋肉組織 (すなわち、大腿二頭筋) の深さの ~0.5 cm あたりです)。鉗子を使用して、優しくタッチ/目に見える神経とピンチ ターゲット筋群 (例えばTA 筋) とつま先 (目に見える屈)、総腓骨神経が分離されたことを確認するための応答を観察します。 注: この手順は、切断または神経の損傷を避けるために細心の注意されるべきであります。</li>
		<li>ウィンドウのサイズがウィンドウの中央に横たわっている腓骨神経と ~1.5 cm2金属リトラクターで開く引いてウィンドウを修正します。ストラップやテーブルの表面 (または手術ボード) に留まり、ゴムバンドに接続されている小さな金属製のフックを使用して (図 2 a)。</li>
	</ol></li>
	<li>神経の両側にワイヤーを取り付けます。<ol>
<li>ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) の 50 〜 60 cm を準備-ステンレス鋼細線をコーティングし、半分に折る。 注: 手術前に紫外線の下で PTFA めっきなしワイヤを公開すると便利場合があります。</li>
		<li>30 cm ステンレス鋼棒のスリットにワイヤーの折れ曲がった部分をフックします。足と背中の中心に沿って L 字型パターンで一緒に、首の後ろの小さな切開領域に向かって後肢のオープン ポケットから皮下、ワイヤー、ロッドを渡します。</li>
		<li>後肢でワイヤの 2 つの端を見つけます。すべてのワイヤ PTFE 絶縁電線をストリップします。~1.5 cm ワイヤーの両端を取り除くメスを使用して、慎重に。ワイヤーは擦り切れた様になって、それらをカットし、再ストリップします。(5 回)、鈍化 21 G 針の周り裸ワイヤの両端をラップ コイルを作るします。コイルが正しく行われると、そこから針をリリースします。</li>
		<li>サイズ 6-0 外科シルクを使用して、それぞれ、総腓骨神経 (図 2 a) のどちら側にコイルの固定します。<ol>
<li>コイルの非常に端に結び目を作るし、左側にある神経の縫合します。コイルが、神経から 1.5 〜 2.5 mm であることを確認します。</li>
			<li>コイルを固定するには、コイルに沿って 2 つまたは 3 つの追加縫合を適用します。</li>
			<li>神経の右側にこれらの手順を繰り返します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>抗生物質溶液 (生理食塩水でアンピシリン; 132 mg/mL) の 2 〜 3 滴を適用し、サイズ 5-0 絹糸を使用してウィンドウ (つまり、大腿二頭筋筋肉組織) を慎重に縫合します。</li>
	</ol></li>
	<li>(約人差し指の直径) 線・ (ヒップ) 上記約大腿二頭筋筋肉の切開部を縫合上皮下ポケットにプッシュの残りの余裕が緩く風します。</li>
	<li>抗生物質溶液再び (生理食塩水でアンピシリン; 132 mg/mL) 2 〜 3 滴を適用します。ホチキス止めして開かれた皮膚を閉じます。</li>
	<li>(首の切開部から出てくる) ワイヤーを CCA 刺激装置に接続します。<ol>
<li>ワイヤーとピンのソケットに接続します。<ol>
<li>切開 2 ワイヤー エンド (腓骨神経のいずれかの側に縫合コイルにこれらの鉛) を作成する首の上部に出てくるワイヤー ループをカットします。</li>
			<li>メスで ~0.5 cm カット擦り切れているワイヤーをワイヤーの端を離れてストリップを使用してください。</li>
			<li>ゆっくりピン ソケットの穴にワイヤの裸の部分を押すし、ピンのソケットの電線をはんだ付け、はんだごてを使用して。</li>
		</ol>
</li>
		<li>必要に応じて、線の接続を確認します。<ol>
<li>ワニ口クリップを介して大規模なベンチトップ型刺激装置ユニットにピンを接続します。</li>
			<li>単一のパルス 9 V (0.1 ms、10 Hz) TA 筋契約および左の足の dorsiflexes を確認するを提供します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>〜 4 cm × 4 cm は、滅菌ガーゼのパッドを介してピン接続ワイヤの両端を渡します。</li>
		<li>ピンを CCA の刺激装置に接続します。<ol>
<li>刺激装置ボックスのベースの穴に通してワイヤーを渡します。 注: このボックスは、CCA の刺激装置の自家製チャンバーは 3.5 cm × 3.5 cm × 2.5 cm13。</li>
			<li>CCA ユニットの接続ソケットにピンを挿入します。CCA ユニットを商工会議所にそっと入れます。粘着タックを使用して、チャンバーの下部に CCA ユニットに固定します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>アスレチック テープまたは多孔質のサージカル テープを使用して、坊主の胴体周りのテープでチャンバーを固定します。テーピングの 3 つの層の部屋の上部を閉じます、ボックス (図 2 b) をセキュリティで保護する刺激装置ボックスの側面にテープをラップすることによって完了します。</li>
	</ol></li>
	<li>CCA が赤外光の単一パルス ユニットを公開することによって動作しているを確認 (波長スペクトル > 770 nm) ポータブル赤外線ストロボの光から放出します。 注: CCA が正しく動作している場合、研究者が後肢筋 (すなわちTA) の近赤外光応答の契約先を見ることができるします。</li>
	<li>ラットを観察し、それは完全に意識を取り戻したまでその温度を監視します。他の動物からの害を防ぐために単一乗員ケージの家および刺激装置の損傷や動物への損傷のリスクを軽減する研究の残りの部分の檻の中、トンネル、またはプラスチック製のオブジェクトを放置しないでください。アモキシシリン含まれて水ボトル (0.5 mg/mL) を提供します。</li>
	<li>次の手術は、少なくとも 72 時間続くすべての 24 h 皮下メロキシカムの 1 mg/kg の投与量を適用します。</li>
</ol>3. 慢性の収縮活動
<ol><li>手術後切開と縫合周辺で/骨格筋の完全復旧のため、少なくとも 5-7 日を許可します。 注: 中と CCA の手順後、(例えば、食べて、飲んで、や移動) 彼らの行動を観察することによってそれぞれの動物の状態を徹底的にチェックします。さらに、CCA の手順の前後に体重の変化をチェックすることによって、重度のストレスや有害効果を決定します。</li>
	<li>赤外光の単一パルス刺激装置ユニットを公開することによって CCA をオンに CCA 刺激の日 (波長範囲 > 770 nm) ポータブル赤外線ストロボの光で。</li>
	<li>10 Hz CCA 刺激の 3 または 6 h を適用します。 注: 刺激のための時間枠は、研究者までです。これらの実験で刺激の周波数は変更されて決して、私たちの経験では、6 h/日に 3 からの刺激を拡張することによってミトコンドリアの適応にのみ非常に控えめな拡張が観察されています。30-60 分毎、刺激と動物を確認可能であれば。</li>
	<li>目的 CCA 期間が過ぎると、赤外光照射 (ユニットの電源を入れると同じプロシージャ) を介して CCA ユニットの電源を切ります。</li>
	<li>複数の日を適用する場合は、3.2 の手順を繰り返します。3.4 を.</li>
	<li>組織の採取のタイミングを決定します。たとえば、cca (すなわち、6 h の最後の CCA 刺激後 18 h)、CCA の手術の手順の間に実行される、麻酔下で行われる最後の試合の発症後 24 時間の組織を収集します。すべての組織を収集、直後後、中動物は麻酔に心臓を切除動物を安楽死します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Holloszy, J. O., Coyle, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptations+of+skeletal+muscle+to+endurance+exercise+and+their+metabolic+consequences.">Adaptations of skeletal muscle to endurance exercise and their metabolic consequences.</a> J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 56 (4), 831-838 (1984).</li><li>Hood, D. 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著者が明らかに何もありません。

運動、低周波筋刺激を通じて生体内の慢性的な収縮活動 (CCA) モデルは13,24,25を行使する筋肉表現型適応を研究するためのエクセレント モデル,26. 以前研究20,27に示すように、CCA は、研究者がトレーニング ボリュームと周波数 (すなわち時間、日) を制御し、様々 な生化学的、分子を調査の効果的なツール度重なる収縮活動のコース上イベント。このモデルの最高の機能の 1 つは動物間のばらつきを最小限に抑えの内部統制として対側後肢の筋肉を使用することです。また、10 年以上、多数の実験によると外部 CCA ユニットが動物の普通の行動パターン (例えば、ローミング、食べ、そして眠る) は制限されませんし、このような追加実験的治療の使用のためできること薬物注射。したがって、研究者は実験の修正トレーニング学で CCA プロトコルを適用できます。
この CCA プロトコルは、すべてのステップは、サバイバル術の性質上、高度な濃度を求めることができるがいくつかの重要な手順を持っています。特に一貫性のある位置には、配線を接続することが重要だし、強く重要なイ神経縫合線から同じ距離の同じ場所での一貫性を維持するために手術を行う、同じ熟練した研究者にお勧め、神経など。さらに、それはゆるみや磨耗のテープは、プロシージャの失敗につながる可能性がありますので、テーピングの前に、と CCA アプリケーション間のセキュリティを確認する必要。
この CCA モデルには、いくつかのマイナーな制限があります。CCA の刺激装置はテーピングで固定されている、いくつかの動物はテーピング周辺のマイナーな皮膚のかぶれを展示します。これがテーピングなし CCA チャンバーに代わるウェアラブル ジャケットを使用して将来の研究で改善できれば、しかし、ないようなジャケットで成功を収めています。また、この手順はより侵襲的な刺激テーピング手順28を避けるために腹腔内のスペースに埋め込むことができます。さらに、説明の外部刺激ユニットは、赤外光にさらすことによって制御される設計です。ただし、単位が赤外光に応答する場合は、可能性があります変更耐久性やユニットの感度で長時間使用後。マイクロ チップの実装は赤外光の使用を避けることがあります最終的に、CCA パラメーターはすべてプログラムおよび保存できるようになるより制御され、正確な方法で適用される CCA を有効にします。すべての研究デザインはまた対側肢偽外科手術自体から生じるすべての可能な結果を除外する使用を検討してください。
CCA が筋を調節することがどのように調査を継続する価値がある量と期間の慢性的な筋肉の廃用、またはその他の筋疾患のコンテキストでの次の表現型。最近臨床29,30に示すように、CCA は、高齢化における同化のシグナル機構の有効性を確認するも適用できます。結論としては、研究者という彼らは慢性運動骨格筋の表現型適応の基礎となる様々 な細胞および分子メカニズムを調べることができます彼らの研究でこの CCA プロトコルを使用する利点を取ることをお勧めします。

骨格筋は、その生体エネルギーと物理構造1の変化を通じてトレーニングに適応できます。持久性トレーニングによってもたらされる主な変更の 1 つはミトコンドリア生合成、ミトコンドリア コンポーネント (例えばチトクローム c 酸化酵素 [シクロオキシゲナーゼ] サブユニット) 発現の増加によって評価することができますの式転写コアクチベーター、pgc-1 α2。研究の増加は、ミトコンドリア代謝と mitophagy を含む、他の多くの要因は筋肉の適応の重要なも示されています。ただし、急性または慢性的な運動によって機構がこれらを調節する骨格筋内のプロセスはまだ明確ではないです。
運動誘発性筋適応を規制する経路を記述するには、様々 な運動モデルはトレッドミル、ホイールを実行して、水泳運動を含む、齧歯類での試験でよく使用されています。ただし、これらのプロトコルは 4 〜 12 週間はこれらの表現型の変化3,4、5の観察に必要な制約があります。実験方法として低周波刺激誘発性慢性収縮活動 (CCA) 効果的として使用されている、それは大幅に短い期間で筋肉の適応をもたらす (すなわち、 7 日前まで) その効果と匹敵する、または他の運動のプロトコルよりもあります。さらに、ホルモン6温度7、および神経学的な効果8の存在は、慢性運動に対する筋特異応答を理解することは困難することができるのです。たとえば、甲状腺ホルモン9,10インスリン様成長因子 (IGF)-111は、トレーニングによる筋肉の適応、また骨格その他のシグナル伝達経路を調節することがありますを仲介に同定されています。筋肉。特に、CCA 誘発効果は、全身的要因、骨格筋の収縮活性への直接反応に配置するフォーカスを許可によって規制されて最小限。
CCA の外部ユニットはタイラーとライト12、初し、変更12で開発されています。一言で言えば、単位は 3 つの主要部分から成る: パルス インジケーター (図 1)、パルス発生器、赤外光への暴露によってオン/オフにすることができます赤外線検出器。刺激装置の詳細な回路設計がされている13で説明しました。CCA の詳細と特定の機能は、大きい数のレビューの深さの記事14,15,16,17。低周波で、総腓骨神経をアクティブにする刺激プロトコルを設計する簡単に言えば、(すなわち、 10 Hz)、神経筋肉 (前脛骨筋前部 [TA] および [EDL] 長趾伸筋) が契約を締結させると、所定の時間 (例えば、3 〜 6 時間) の長さ。時間をかけて、これは毛細血管密度18とミトコンドリア コンテンツ19,20,21の増加によって示されるより好気性表現型に前述の筋肉をシフトします。したがって、このメソッドは、いくつかのラット骨格筋内の主要な持久力トレーニング適応を模倣する実績のあるモデルです。
研究者は、彼らの運動の研究で、このモデルを適用できますので、CCA を誘発する電極注入手術の詳細な手順について述べる。CCA は、したがって運動トレーニングの開始に続く両方の序盤とそれ以降の時間ポイントで様々 な分子とシグナル伝達イベントの調査のための効果的なツールを提供する筋適応の時間的経過を研究するための優れたモデルです。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley Rat</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chronic contractile activity unit</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCA unit protective box (3.5 x 3.5 x 2.5 cm)</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Box should be made of opaque material or covered in an opague tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coin lithium ion batteries (3V)</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>CR2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medwire</td>
			<td>Leico Industries</td>
			<td>316SS7/44T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder pin (socket)</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>ED6218-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zonas porous tape</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td>5104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture silk (Size 5)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture silk (Size 6)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>706G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved blunt scissor (11.5 cm Length)</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14075-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved blunt scissor (15 cm Length)</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14111-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate haemostatic forceps (16 cm Length)</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>06-0230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless-steel rod (30 cm; 7mm diameter)</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Rod should have 5 mm slit in one end to hold the wire for tunneling under the skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clip applying forceps</td>
			<td>KLS Martin</td>
			<td>20-916-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staples (clips)</td>
			<td>Bbraun</td>
			<td>BN507R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal hooks/retractor</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine (500 mL)</td>
			<td>Rougier</td>
			<td>#NPN00172944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>Novopharm</td>
			<td>#DIN00872644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metacam</td>
			<td>Boehringer</td>
			<td>#DIN02240463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital multimeter (voltmeter)</td>
			<td>Soar Corporation</td>
			<td>ME-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED digital stroboscope</td>
			<td>Lutron Electronic Enterprise</td>
			<td>DT-2269</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of chronic stimulation to study contractile activity-induced rat skeletal muscle phenotypic adaptations

骨格筋は、その生化学的・生理学的特性が大幅に慢性運動に応えて変更適応性の高い組織です。筋肉の様々 な適応をもたらすメカニズムを調べるためには、トレッドミル、ホイール ランニング、水泳など運動プロトコルの数は、動物実験で使用されています。ただし、これら運動のモデル特定の筋肉収縮による適応の研究に応用が少なくて、体液や神経の要因によっても規制が筋の適応を達成するために時間の長い期間を必要とします。それは正常に全身的要因から独立して、7 日以内、筋肉ミトコンドリア適応につながる可能性としての慢性的な収縮活動 (CCA) を誘発する間接低周波刺激 (10 Hz) は運動トレーニングのための代替モデルとして使用されています。広範なアプリケーションを将来的に研究、ラットの骨格筋に CCA の治療を適用する必要な手術手技の詳細を説明します。

我々 は、慢性的な収縮活動 (CCA) が骨格筋内有利なミトコンドリアの適応を誘発する効果的なツールであることを示しています。CCA (6 h/日) の 7 日間を受けるラットは、非刺激対側 (コントロール) 後肢と比べて刺激を受けた筋肉のミトコンドリア生合成を拡張を表示します。ミトコンドリア生合成の増加が他のキーのミトコンドリア蛋白質コックスの標高とともに、ミトコンドリア生合成のマスター調節因子を考慮 PGC-1 α (図 3 a) の増加蛋白質の表現によって示される-I とコックス-IV電子輸送鎖の重要なコンポーネントであります。また、シトクロム c 酸化酵素 (COX) 酵素活性、ミトコンドリア コンテンツの有用な指標は CCA (図 3 b) の 7 日間、次の約 30% を増加しました。また、ミトコンドリア呼吸能力を測定し、CCA (すなわち状態 3) 呼吸の最大の増加をもたらしたことを発見するグリセリン筋線維を使用してミトコンドリア機能の変化を評価した筋の容量筋肉コントロール (図 3) を基準にして刺激の 7 日間を受けます。さらに、両方のミトコンドリアの集団、subsarcolemmal (SS) といる intermyofibrillar (IMF) 次の CCA (図 4 a と B) の 7 日間を増加し、筋肉の収縮活動を 7 日に受けるから IMF 分数がわかった色よりも際立ってより赤はおそらく他の酸素関連要素 (図 4)、ヘム、ミオグロビンの高いレベルを示す、差動遠心分離を用いたコントロール (コン) 筋に由来します。
オートファジー ・ リソソーム系への適応は、CCA によってももたらすことができます。特に、我々 はトランスクリプション要因 EB (TFEB; の蛋白質量の増加を観察しています。図 5 a) CCA でのリソソーム器官の主レギュレータすべての時にポイント (すなわち1、3、および 7 日) リソソーム膜蛋白質 1 (LAMP1; など他のライソゾーム マーカーだけでなく、図 5 b)。興味深いことに、私たちの研究は、ミトコンドリア生合成前にオートファジー ・ mitophagy ・ ライソゾーム システムに変更が発生することを示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56827/56827fig1.jpg"> 図 1。模式図は、ポータブル CCA 刺激の主要なコンポーネントを示していますユニットこの図は、高橋らから変更されています。13。 IR、赤外線。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56827/56827fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56827/56827fig2.jpg"> 図 2。電極と刺激装置注入。(A)総腓骨神経の両側に電線を接続するためのウィンドウです。(B) CCA ユニットのアセンブリを示すための模範的な画像。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56827/56827fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56827/56827fig3.jpg"> 図 3。PGC-1 α、ミトコンドリア呼吸、CCA を用いて酵素活動。(A) CCA は、pgc-1 α の蛋白の増加によって示すように、骨格筋におけるミトコンドリアの適応を誘発します。代表的なしみのイメージは、ロード コントロールとして β-アクチンとともに表示されます。コンは、コントロール、すなわちCCA に服従しない対側後肢と倍変更データが 1 日でコンと比較して結果を正規化することで得られました。(B)コックス活動および(C)グリセリン筋呼吸も CCA の増加次の 7 日間。すべてのデータは、平均 ± SEM で示されている (N = 6 8)。†P < 0.05、CCA と時刻との間の相互作用の効果§P < CCA; の 0.05 の主な効果P < 日 1 制御対 0.05、有意差。図 3A3 bは、キムとフード19から変更されています。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56827/56827fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56827/56827fig4.jpg"> 図 4。CCA と筋肉のミトコンドリア生合成の証拠です。(A と B)電子顕微鏡画像は、subsarcolemmal (SS) と 7 日間 CCA に暴露したラットの骨格筋のため intermyofibrillar (IMF) ミトコンドリアの拡大のボリュームを示します。この画像は、リュビチッチらから変更されています。21、およびスケール バーは、CCA 刺激の 7 日後 1 μ m ( C) 筋ミトコンドリア分別コントロール (コン) と (CCA) 筋肉の刺激間の比較を示します。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56827/56827fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56827/56827fig5.jpg"> 図 5。ライソゾーム システムは、CCA の 7 日誘導します。これは TFEB (A)と(B) LAMP1 の蛋白質組成の増加によって示されます。日 1 コンを基準にしてデータを正規化することで変更を折る結果が表示されます。(C)代表的なしみの画像のとおり、GAPDH は読み込みコントロールです。§P < 0.05、CCA の主な効果。すべてのデータは、平均 ± SEM で示されている (N = 8);¶P < 0.05、時間の主な効果P < 0.05、対コントロール (CON) 1 日で有意差。この図は、キムとフード19から変更されています。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56827/56827fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

このプロトコルでは、ラット後肢筋の刺激による骨格筋適応を観察する運動の慢性収縮活動モデルの使用について説明します。

慢性的な刺激の収縮活動に伴うラット骨格筋の表現型適応を研究への応用

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

application-chronic-stimulation-to-study-contractile-activity-induced

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.7K ビュー.  York University. このプロトコルでは、ラット後肢筋の刺激による骨格筋適応を観察する運動の慢性収縮活動モデルの使用について説明します。

ビデオ: Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

咽頭アーチのex vivo培養は、ハートと筋前駆細胞とそのニッチを研究します

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

発生生物学

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

心臓毒注入による急性骨格筋再生の誘導

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

成人および高齢人間の骨格筋から筋原性前駆細胞/一次筋芽細胞の調製と文化

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

傷害による老化と生体内での骨格筋におけるリプログラミングの評価

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Pax7 とラミニン抗体抗体法による骨格筋衛星細胞の同定

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal muscle. Mouse skeletal muscle has been shown to produce high quality X-ray diffraction patterns on third generation synchrotron beamlines providing an opportunity to link changes at the level of the genotype to functional phenotypes in health and disease by determining the structural consequences of genetic changes. We present detailed protocols for preparation of specimens, collecting the X-ray patterns and extracting relevant structural parameters from the X-ray patterns that may help guide experimenters wishing to perform such experiments for themselves.

We present detailed protocols for performing small-angle X-ray diffraction experiments using intact mouse skeletal muscles. With the wide availability of transgenic mouse models for human diseases, this experimental platform can form a useful test bed for elucidating the structural basis of genetic muscle diseases

筋肉疾患の構造的基礎を研究するためのツールとしての無傷のマウス骨格筋のX線回折

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle regenerative process. There are recognized challenges to working with human primary adult stem cells, particularly human muscle progenitor cells (hMPCs) derived from skeletal muscle biopsies, including low cell yield from collected tissue and a large degree of donor heterogeneity of growth and death parameters among cultures. While incorporating heterogeneity into experimental design requires a larger sample size to detect significant effects, it also allows us to identify mechanisms that underlie variability in hMPC&#160;expansion capacity, and thus allows us to better understand heterogeneity in skeletal muscle regeneration. Novel mechanisms that distinguish the expansion capacity of cultures have the potential to lead to the development of therapies to improve skeletal muscle regeneration.

We present techniques for isolating, culturing, characterizing, and differentiating human primary muscle progenitor cells (hMPCs) obtained from skeletal muscle biopsy tissue. hMPCs obtained and characterized through these methods can be used to subsequently address research questions related to human myogenesis and skeletal muscle regeneration.

骨格筋生検手順からのヒト筋前駆細胞の単離、培養、特徴付け、分化

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

免疫不全マウスにおけるヒト骨格筋異種移植片の実行

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...