彼女の優れたテクニカル サポートの Clemire Cimper にお世話になっております。H.L. の研究室での仕事は、パスツール研究所、凝った科学センターの注ぐラ ・ アジャンス ナシオナル デ ラ凝った (フランス d'Excellence リバイブ、Investissement d'Avenir; によって賄われていたANR-10-LABX-73)、アジャンス ナシオナル デ ラ抜き (ANR-16-CE13-0017-01) および財団アーク (PJA 20161205028)。C. c. と交流は、博士・復活のコンソーシアムからドクターによって賄われています。

欧州共同体ガイドラインとの Institut パスツール (CETEA) 承認プロトコルの倫理委員会に従って処理された動物。
 1。 在庫ソリューションの準備 <ol><li>筋サンプル固定のための材料を準備します。筋固定のため凍結埋め込み媒体に RT で 20 mL の水で tragacanth ガムの 0.5 g を溶解します</li>。
	<li>SA β Gal の汚損のためのソリューションを準備します。
	<ol><li>溶液 K 3 Fe(CN) 6 (100 mM)、K 4 Fe(CN) 6 (100 mM)、MgCl 2 (1 M) 蒸留水でそれぞれの粉末を溶解することにより準備します</li>。
		<li>0.2% C 20 H 6 Br 4 Na 2 O 5 (エオジン) の原液を水で希釈して準備します</li>。
		<li>ない (ジメチルホルムアミド、DMF) C 3 H 7 X gal 粉末を溶解することにより原液 C 14 H 15 BrClNO 6 (X-gal) (50 mg/mL) を準備します</li>。
		<li>ストア K 3 Fe(CN) 6 と 4 ° c、K 4 Fe(CN) 6 ソリューションと室温 MgCl 2 
		注: X gal に格納できる因数-20 ° C で最大 6 ヶ月。エオシン ソリューションは常温保管し、必要に応じてフィルター処理後に再利用できます。K 3 Fe(CN) 6 K 4 Fe(CN) 6 ソリューションは、protectedfromthe ライト。光から保護するため、耐水性ではない X gal ソリューションです</li>。
	</ol></li> <li>Nanog 染色溶液の調製: 透過ソリューションを含む 0.1% Na 3 C 6 H 5 O 7 (クエン酸ナトリウム)、0.1% C 14 H 22 O (C 2 H 4 O) n (n = 9 10) (トリトン X-100) 蒸留水 4 で貯えられるべき ° C は、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、右に格納する必要がありますでブロッキング溶液 5% ウシ胎児血清 (FBS) を準備</li>
</ol> 2。TA 筋部の凍結に SA β Gal 染色 <ol><li>コルクのスライスにガム、tragacanth の少量を置くことによって脛骨筋の固定材料を準備します</li>。
	<li>負傷マウス雌雄 (2 ヶ C57/B6) の負傷した cardiotoxin (CDX) と 10 日前に 13 を前述のよう。負の制御として同じマウスから非負傷した (PBS インジェクション) TA を使用します。生体内で 書き換えが必要な場合治療 Dox (1 mg/mL) と各マウス水を飲んで (光から保護)、同じ日に CTX 損傷直後後 。
	注: Dox ソリューション 3 日総治療日数を 7 日に変更する必要があります。
	<ol><li>は、( 図 1 a) 13 を前述のマウスから両方の TA 筋肉 (負傷および制御) を分離します。横断切片を確保、tragacanth ガムに TA 筋の遠位腱を挿入し、( 図 1 b) 外筋の約 ¾ 一部を残して、液体窒素にて凍結する冷却のイソペンタン &#60; 1分 
		注: 脛骨筋が垂直な位置で、コルクの中心部にされていることを確認します。-80 ° C または直接 10 μ m のセクションで cryosectioned でサンプルを格納できます</li>。
	</ol></li> <li> 図 1 b のように TA 筋肉を処理します。
	各スライドの上部の左位置に 10 の異なるスライドに正しい順序で <ol><li>配布、1 st-10 th セクション。11 番目 のセクションを配置するには、1 st セクションに隣接して最初のスライド12 番目 のセクション、2 番目のスライドの 2 nd セクション以外にも右を配置する同じ順序に従います。10 セクション/スライドが 10 スライド (合計で 100 セクション) の最初のセクションと前のセクション間の最小 1 mm を確実に得られるまでこのプロセスを繰り返します</li>。
	</ol></li> <li>1% パラホルムアルデヒドと 0.2% グルタルアルデヒドを含む PBS では 4 分のセクションを修正します。2 x 10 分、PBS で洗浄します。次に、PBS でセクションを孵化させなさい (pH 5.5 を =) 30 分室温のすべての手順を実行します 。
	注: 固定は、酵素活性を維持するために軽度でなければなりません。この手順では、フードの下で。PBS の pH が重要であり X gal ソリューションは光から保護する必要があります</li>。
	<li>X gal のソリューションを含む加温セクション: pbs は、400 μ g/mL X Gal MgCl2、2 mM、4 mM K4Fe(CN) 6 4 mM K3Fe(CN) 6 pH 5.5 を =。孵化 24 時間洗浄の最小値の 37 ° C で暗闇の中、pbs 室温の 3 × 10 分のスライド 
	注: 孵化 24 時間の最小値を必要とし、SA β Gal 信号を最大にする 48 時間の最後のことができます。ソリューションは培養 24 時間後に変更する必要があります。スライドは、光から保護する必要があります。SA β Gal の染色が必要な場合にのみは、2.5 の手順に進みます。Nanog 染色が必要な場合してくださいにスキップ ステップ 3.1</li>。
	30 分洗浄 PBS の <li>修正スライド 1% パラホルムアルデヒドの 3 × 10 分 0.2% エオシン対比染色、pbs スライドします。エオシン溶液 1 分間のスライドを浸すし、簡単に蒸溜水でそれらをすすいでください。最後に、非蛍光剤取り付けの水溶液でのスライドをマウント (材料の表 を参照してください). 
	注: それはポストの固定を行うために不可欠です。この手順では、フードの下で。ルートですべての手順を実行</li>
</ol> 3。免疫組織化学を使用して反 Nanog 抗体 <ol><li>、スライドに直接透過液の 2 x 10 分追加 200 μ L の PBS で 10 分洗浄 4% パラホルムアルデヒドを含む PBS でスライドを固定し、5 分間インキュベートします。 <ol><li>洗浄スライド PBS、2 x 5 分と最後の洗浄、使用 200 μ L の PBS のスライドで直接 0.25 %bsa を含みます。室温のすべてのこれらの手順を実行します 
		注意: は、フードの下で固定の手順を実行します</li>。
	</ol></li> <li>主アンチ Nanog 抗体 加温スライド (最終濃度: 1.25 μ G/ml) 4 ° c 5% を含む PBS で一晩 FBS。PBS、2 x 10 分でスライドを洗って最後の洗浄で 5 分実行 0.25 %bsa を含む使用 200 μ L の PBS をすべての洗浄を室温ステップ 
	注: インキュベート蒸発を防ぐために湿らせたペーパー タオルをボックスのスライドです</li>。
	使用する準備ができてから rAb HRP 二次抗体の 100 μ L で <li>加温スライド キット (材料の表 を参照してください) に PBS、3 x 5 分付き 45 分洗浄用スライドの二次抗体を削除します。光から保護と RT ですべての手順を実行します</li>。
	<li>可視化 <ol><li>最初に、希釈、3, 3 &#39;-ジアミノベンジジン (C 12 H 14 N 4 C 12 H 18 Cl 4 N 4 (4 HCl) 軽くたたく) 基板バッファー内キット (基板バッファー溶液 1 mL のために軽打の 20 μ L) を使用する準備ができてによって提供されます。各スライドに直接 DAB 溶液 100 μ L を追加し、最大室温 10 分間インキュベート 
		注意: DAB 薄めたたて準備する必要があります、4 ° C で最大一週間保存することができます。インキュベーション時間バック グラウンド信号を最小限に抑えるために調整することができますが、すべてのスライドの同じを保持する必要があります</li>。
		<li>は、水ですすいで DAB ソリューションを削除します。Counterstain 速い赤ソリューション (準備 材料の表 を参照) を持つスライド 20 分洗浄水スライド再度簡潔にします</li>。
		<li>は 95% のエタノール 5 m のによってそれらを脱水します。100% エタノール, 2 x 5 分後に。最後に、迅速な硬化取付中のスライドをマウント (材料の表 を参照してください).</li>
		<li>は、バック グラウンドを避けるために 20 X に明視野顕微鏡でスライドを観察 。
		注: 高速赤色溶液常温保管して再使用できるフィルタ リングの後</li>。
	</ol></li></ol> 4。分析と定量化 <ol><li>SA β Gal 定量化 <ol><li>スライドをスキャンし、取得した画像に基づく各スライドのベスト セクションを選択します。定量化のため少なくとも 2 セクション/TA を使用します。セクションを判断 &#39; s 質組織の整合性、染色、counterstaining の品質に基づいています。定量化, 全体の TA 筋を通して SA β Gal 定量化のより豊かな表現を可能にするサンプル間に最大可能距離と 2 つの最高品質のセクションを選択します</li>。
		<li>SA β Gal 陽性細胞 ( 図 2) の定量化。
		<ol><li>の最小と最大の肯定的な SA β Gal セルを手動で選択してピクセルのサイズ ランクを決定します。
			<ol><li>ImageJ ソフトウェアを使用してスキャンしたスライドのデジタル画像を開きます</li>。
				<li>インターフェイスでは、をクリックして &#39; 分析 &#39; &#62; &#39; ツール &#39; &#62; &#39; ROI マネージャー &#39; &#62; &#39; 分析 &#39; &#62; &#39; 測定を設定 &#39; &#62; &#39; 領域を選択 &#39;。選択ツールを使用し、サラウンド、最小および最大正 SA-β-Gal 携帯しをクリックして ROI マネージャーに追加 &#39; 追加 &#39;。使用してサイズを測定、&#39; 測定 &#39; ボタンをクリックし、後で使用する値を保存します</li>。
			</ol></li> <li>すべての表示されている肯定的なセルが選択されてを確認するしきい値パラメーターを調整します。
			<ol><li>変換をクリックしてグレースケール画像 &#39; 画像 &#39; &#62; &#39; タイプ &#39; &#62; &#39; 8 ビット &#39; ( 図 2 a)。次へ &#39; 画像 &#39; &#62; &#39; 調整 &#39; &#62; &#39; しきい値 &#39;、すべての肯定的な SA β Gal のセルは赤 ( 図 2 b) で覆われるまで 2 番目のカーソルを移動し、クリックして &#39; 適用 &#39;.</li>
				<li>をクリックして分析粒子 &#39; 分析 &#39; &#62; &#39; 粒子の分析 &#39; &#62; &#39; サイズ (ピクセル ^2) &#39;、4.1.2.1 のステップで定義された値を適用して、入力 &#39; 循環 &#39;: &#39; 0.00 1.00 &#39;、クリックして &#39; ok &#39;; すべての概要が、カウント粒子が ROI マネージャー ( 図 2 D) で表示されます</li>。
			</ol></li> <li>元の画像を選択したすべての粒子を転送します。定量の正確さを確認する手動で選択範囲を調整します。陽性細胞 (緑色の矢印、 図 2 e) を追加および偽陽性細胞 (赤矢印、 図 2 e) を削除します。最後に、アウトラインのセクション ( 図 2 D) 使用によって区域を測定、&#39; 選択ツール &#39;。クリックして &#39; ROI マネージャー &#39; &#62; &#39; 追加 &#39; &#62; &#39; メジャー &#39;.</li>
			<li>重要なは、断面の面積によって陽性細胞数を正規化します</li>。
		</ol></li></ol></li> <li>Nanog 定量化 <ol><li>20 倍の倍率で手動で明視野顕微鏡 Nanog 陽性細胞をカウントします 。
		注: 高速赤 counterstaining TA 筋の形態の良い評価が可能します。ただし、染色は非常に軽い、セクションの明確な輪郭を欠いています。スキャナーは、しばしばセクションの境界を識別するために失敗し、フォーカスを正しくことはできません。マーカーを使用して、スキャンする前に、断面図のエッジを円またはセクションを検出するより敏感なスキャナーを使用することが可能です。現在のプロトコルの Nanog 陽性細胞を手動でカウントする効率的です</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

ここでは、リプログラマブル マウスの骨格筋の老化の両方を検出する方法と、多能性幹細胞を提示します。このメソッドは、評価、両方老化を定量化し体内細胞の可塑性、誘発して組織の修復・再生老化の役割を調べるに使用可能性があります。
現在のプロトコル老化関連 β ガラクトシダーゼ (SA β Gal) 試金を使用して、骨格筋における体内老化細胞を検出します。この試金は、この酵素の活性は通常酸性 pH 4.516,17で測定しながら老化細胞に具体的に関連付けられている値を受け渡す pH (6.0 あるいは 5.5) で増加ライソゾーム β-ガラクトシダーゼ活性を検出します。したがって、pH を調整することが重要だ (pH = 6 または 5.5) 老化関連アクティビティの特定の検出を確保するため。さらに、カウンター エオシンで染色が弱いと拡散反射光の信号をカウントされません SA β Gal+セルの自動定量化のため不可欠です。潜在的な変動を避けるためには、同じ人が数えるプロシージャ全体を実行することが望ましいです。
SA β Gal 試金は最も広く使用され、老化細胞のバイオ マーカーを受け入れ、老化の排他的なマーカーではありません。それは過剰合流培養細胞が SA β Gal18偽陽性を引き起こす可能性が示唆されています。アッセイの感度は、電池の種類をすることができ、組織が依存して生体内で19を入力します。したがって、それはさらに確認し、特徴付ける増殖、老化メディエーター (p16、ARF、p53、p21、p27) の発現増加と SASP 因子の分泌の不足などの他の独立した標準的なマーカーを使用する必要老化の生体。また、適切な否定的なコントロールは、特に生体内で研究結果を解釈するために不可欠ではありません。
完璧な SA β Gal 試金ではないという事実にもかかわらず、生体内での研究の特に貴重な情報を提供それは。それはそのまま組織アーキテクチャでは、生理学的および病理組織学的に異なる老化細胞の役割のさらなる理解を促進する重要な情報を提供する居住環境の老化細胞の検出が可能します。コンテキストです。老化細胞の細胞のアイデンティティを決定する細胞表面マーカーなど、他のマーカーの免疫染色の結合されたさらに、または未分化マーカー老化再生と癌の潜在的な関与を調べる。以前、Nanog 同じセクションまたは近接の老化及び生体内で8をリプログラミングの潜在的なリンクを調査するための免疫組織化学的染色を持つ SA β Gal アッセイを行った。このプロトコルは骨格筋に焦点を当ては、他の組織に確かに拡張できます。
最近では、細胞の老化は、組織の修復と再生、SASPs7,8,9を介して可能性が最も高いに関与しています。老化が組織の修復と再生に貢献する方法のメカニズムを理解することは確かに、途方もない影響再生医療。この試金は、識別を容易にするために重要かつ貴重なツールを提供し、体内細胞の老化の定量化。

細胞の老化は、安定した細胞周期の阻止によって特徴付けられるストレス反応の形式です。研究は過去 10 年間で、老化が萌芽期の開発、線維化、生物1,2の高齢化などさまざまな生物学的および病理学的プロセスに関連付けられていることをしっかりと確立しています。細胞の老化は、テロメアの短縮3によって引き起こされる彼らの分裂寿命の終わりに線維芽細胞で初めて確認されました。複製ストレスのほか、DNA 損傷、酸化ストレス、がん化シグナル ゲノム ・ エピゲノムの変化、うちのどれかが最終的に p21/p53 および pRB の細道を起動などの老化を引き起こすことができる他の多くの刺激があります。確立し、永続的な成長逮捕1を強化します。老化細胞の重要な特性の 1 つは、彼らは代謝活性が維持され老化関連の分泌形質 (SASP) を力強く表現: 多くの炎症性サイトカイン、増殖因子、細胞外マトリックスの分泌要因4。SASP の要因は、媒介と増幅老化作用、免疫細胞を集め、ローカルおよび全身の組織調査1を変更することで、強力な効果のために重要な役割を果たすに提案されている.興味深いことに、老化が最近組織修復と再生5,6の重要であると提案されています。さらに、我々 を含む、いくつかのラボからのデータは組織損傷が誘導する老化が再生7-9を促進するために、SASPs による細胞の可塑性を高める可能性を示唆しています。したがって、すべての新たなデータは、老化で生体を調査する重要性を強調表示します。
細胞の可塑性は、ポスト誘導多能性幹細胞 (iPSC) 時代文化とin vivoの10の異なる刺激にさらされると代替運命を採用する新しい id を取得するセルの能力です。におけるリプログラミング達成体内11,12, をすることができます知られている場所の表現、山中 4 因子を含むカセット: Oct4、 Sox2、 Klf4、C-myc (OSKM) が誘導体内の複数の臓器の奇形の形成を促進することができます。したがって、重要な規制当局と細胞の可塑性11にとって重要な経路を識別するために、強力なシステムとして再マウス モデル (i4F) を使用できます。
適切かつ敏感な体内システムがどのように細胞老化の理解に不可欠な組織再生における細胞の可塑性が調節します。ここでは、堅牢なシステムと老化と組織再生における細胞の可塑性の間のリンクを評価する詳細なプロトコルを提案します。(TA) 脛骨前方筋群、組織再生や i4F マウス モデルを研究する万全の体制で cardiotoxin (CTX) の組み合わせによる筋肉の損傷により細胞老化のin vivo検出筋再生中にプログラムし直します。
老化と細胞の可塑性の間のリンクを評価するには、i4F マウスは急性の筋肉の損傷を誘発する CTX と負傷、生体内でリプログラミングを誘発するドキシサイクリン (0.2 mg/mL) 7 日間で治療します。CTX 誘発急性筋肉の損傷、再生プロトコルは、倫理的な理由の最近公開された13をされている、現在のプロトコルでこの手順が省略されます。老化細胞のピークが以前14を観察されているとき、10 日間のポスト傷害13TA 筋サンプルが収集されます。ここでは、この詳細なプロトコルは、(SA β Gal) を経由して老化のレベルと (IHC 染色 Nanog) 経由でリプログラミングを評価するために必要なすべての手順を説明します。
老化関連 β ガラクトシダーゼ (SA β Gal) アッセイは、文化とin vivoの15の両方老化細胞を検出する最も一般的に使用される試金です。その他の試金に比べると、SA β Gal 試金はそのまま組織アーキテクチャでは、生体内で調査のため特に重要です彼らのネイティブ環境における老化細胞の同定をことができます。また、カップルは IHC を使用して他のマーカーと SA β Gal 試金することが可能です。ただし、SA β Gal 試金は、主な制限のまま新鮮なまたは冷凍のサンプルを必要は。新鮮なまたは冷凍の組織は TA 筋サンプルを冷凍など、日常的に使用できるが、SA β Gal は明らかに老化細胞を検出する最も適切な試金です。Nanog は 2 つの理由 reprogramed の細胞を検出するために使用されるマーカー: 1); 多能性の重要なマーカーは2) もっと重要なは、その表現はないドキシサイクリン (dox) によって駆動される、山中カセットの強制発現ではなく誘導多能性を検出するため。
本論文で示したプロトコルを汚す定量化手順を簡素化する個別に行うことができるが、また老化の両方を可視化する共同染色手順と同じセクションを多能性幹細胞で行うことができます注意してくださいが重要です。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>K3Fe(CN)6</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>13746-66-2</td>
			<td>For SA-&#946; Gal staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K4Fe(CN)6</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14459-95-1</td>
			<td>For SA-&#946; Gal staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td>For SA-&#946; Gal staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4252</td>
			<td>For SA-&#946; Gal staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3447</td>
			<td>For inducing in vivo reprogramming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiotoxin</td>
			<td>Lotaxan Valence, France</td>
			<td>L8102</td>
			<td>For muscle injury</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>111-30-8</td>
			<td>For Fixation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>50-980-487</td>
			<td>For Fixation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCitrate : Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>18996-35-5</td>
			<td>For permeabilization solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td>For permeabilization solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3608</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti- Nanog</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>8822S</td>
			<td>Rabbit monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K4010</td>
			<td>For Nanog revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin 1%</td>
			<td>Leica</td>
			<td>380159EOF</td>
			<td>Counterstainning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast red</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3403</td>
			<td>Counterstainning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Shandon Immu-Mount</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>9990402</td>
			<td>Mounting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt&#174;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>25608-33-7</td>
			<td>Mounting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td>Microscope for Nanog quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: i4F-A</td>
			<td>Abad et al., 2013</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Reprogrammable mouse model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal muscle, Tibialis Anterior</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Scanner</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Scan Z1</td>
			<td>slides scanning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of injury-induced senescence and in vivo reprogramming in the skeletal muscle

細胞の老化は、がんや高齢化など多くの生理学的および病理学的プロセスのために重要である安定した細胞増殖停止によって特徴付けられるストレス反応です。最近では、老化は組織の修復と再生にも関与しています。したがって、それは体内老化細胞を識別するますます重要になっています。老化関連 β ガラクトシダーゼ (SA β Gal) アッセイは、老化細胞の文化とin vivoの両方を検出する最も広く使われている試金です。この試金は、ライソゾームの β-ガラクトシダーゼ活性の組織化学的検出 (6 または 5.5) 以下の pH でことができます老化細胞のライソゾーム含量の増加に基づいています。これにより形態, 組織アーキテクチャに関する場所など貴重な情報を提供しています彼らの居住環境における老化細胞の同定、フローサイトメトリーなど、他の試金と比較して、免疫組織染色 (IHC) を介して他のマーカーとの結合の可能性。SA β Gal 試金の主要な制限は、新鮮なまたは冷凍サンプルの要件です。
ここで、どのように細胞老化を理解するための詳しいプロトコルは提示細胞の可塑性と組織再生の生体を促進します。怪我の組織再生を研究するのに確立されたシステムに骨格筋の老化細胞を検出するのに SA β Gal を使用します。さらに、トランスジェニック マウス モデルの Nanog、多能性幹細胞のマーカーを検出するのに IHC を使用します。このプロトコルを調べるし、細胞の老化誘導細胞の可塑性と生体内でリプログラミングのコンテキストでを定量化することが出来ます。

筋肉傷害による細胞老化の検出
最近では筋損傷が細胞の老化が過渡14を誘導すること示されています。10 日後に損傷 (DPI)、損傷した筋線維の大部分は、中心部にある核、再生、筋線維の特徴と再生を受けているし、筋のアーキテクチャが再確立されました。浸潤炎症細胞が特定の地域で表示を維持しながら大幅に減少します。10 DPI 少ない壊死と炎症性細胞は染色を妨害する筋の存在があるので、SA β Gal が老化細胞を検出する良い時間点であります。染色の特異性を決定するには、同じマウス (図 1 a) から PBS を注入した TA は重要なネガティブ コントロールとして使用されます。
SA β Gal 陽性細胞のより良いより正確な評価を確保するため、TA 筋肉の別の平面からのセクションは、同じスライド (図 1 b) に配置されます。エオシン染色カウンターは、ImageJ ソフトウェアによって SA β Gal 陽性細胞の自動定量化のため重要です。エオシン カウンター染色により、正しいフォーカスを持つセクションを検出するデジタル スキャナー] セクションをについて説明します。慎重に範囲と (図 2 a-d) 検出のしきい値を定義することが重要です。さらに、手動で精選されたプロセスのより正確な検出と定量化 (図 2 e) を許可することが欠かせません。
細胞の老化促進体内筋におけるリプログラミング
リプログラマブル マウス モデル (i4F) は、細胞の可塑性と再生に関する老化の影響を評価する理想的なシステムを提供します。筋肉の損傷、時に i4F マウスは、リプログラミング体内誘導する dox と扱われます。7 日 dox (1 mg/mL) 治療は、まだマウス (図 3 a)、忍容性、細胞のレベルでは、リプログラミングを誘導するために十分です。したがって、我々 は dox を 7 日間投与した i4F マウスから 10 Dpi で負傷した筋肉を収穫します。
Nanog の SA β Gal の共同染色を行うことは、潜在的な干渉染色による定量化のためそれはお勧めしません。前述のようはカウンター染色デジタル検出にとって欠かせないものです。染色 Nanog とともに SA β Gal の最高のカウンターが速い赤 orhematoxylin です。ただし、SA β Gal または Nanog の信号をカウンターを汚す可能性がありますマスク。したがってより正確な定量化する連続したスライド (図 3 b) 上で個別に実行することをお勧めします。SA β Gal 陽性と隣接するスライドから Nanog 陽性細胞を定量化することで細胞の可塑性と再生に関する老化の潜在的な関与を示唆している (図 3)、それらの間の正の相関関係を確立しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56201/56201fig1.jpg"> 
図 1: 筋損傷後の老化度を評価します。(A)老化を誘導するために使用される筋肉傷害戦略の概略図。(B)筋セクション準備の模式図。(C) SAβGal counterstained エオシンで染色の代表的なイメージ。矢印は、SA β Gal+のセルをポイントします。スケール バー = 50 μ m。 SA β Gal+の(D)の定量化は負傷者や非負傷した TA 筋細胞。各ドットは、個々 の動物に対応します。統計的有意性は、2 尾 Student´s t-テストによって評価された: * * * p &#60; 0.001。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56201/56201fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56201/56201fig2.jpg"> 
図 2: ImageJ ソフトウェアによる SA β Gal+細胞の数量。ソフトウェア インターフェイスで ImageJ 筋部(A ~ D)スクリーン ショット。グレースケール(A)に筋断面画像の変換のスクリーン ショットすべての SA を選択する-β-Gal + (B)セクションのセルの(C)選択した粒子の分析ROI マネージャー (D)ですべてのカウント particals の概要です。(E)手動キュレーションのプロセスの設定画面します。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56201/56201fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56201/56201fig3.jpg"> 
図 3:生体内でリプログラミング筋損傷後の評価。 (A)模式図筋損傷後体内のリプログラミングや老化のレベルを評価します。(B) SA β Gal、Nanog は破損した骨格筋の凍結切片の染色の代表的なイメージ。(左); エオシン染色 counterstained SAβGal免疫組織化学的染色 Nanog 高速赤 (右) と counterstained。非負傷した筋肉は、トップと負傷者筋の下に表示されます。スケール バー = 50 μ m。 (C)定量化および SA β Gal +と連続したセクションの Nanog+セルの相関 (n = 9 マウス値はマウスごとの 2 つのセクションの平均を表します)。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56201/56201fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>50 mL の体積</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM K3Fe(CN)6原液</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM 在庫 K4Fe(CN)6ソリューション</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>100 Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mg/mL X ギャル</td>
			<td>400 Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 5.5)</td>
			<td>45.50 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1:50 mL X gal ソリューションの成分。

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Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

傷害による老化と生体内での骨格筋におけるリプログラミングの評価

ここで生体内でリプログラミングを誘導しながら傷害時に骨格筋の老化の両方を検出するための詳しいプロトコルおよび多能性幹細胞を提示します。このメソッドは、組織の再生中に細胞の老化の役割を評価し、生体内リプログラミングに適しています。

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

evaluation-injury-induced-senescence-vivo-reprogramming-skeletal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

9.5K ビュー.  Institut Pasteur. ここで生体内でリプログラミングを誘導しながら傷害時に骨格筋の老化の両方を検出するための詳しいプロトコルおよび多能性幹細胞を提示します。このメソッドは、組織の再生中に細胞の老化の役割を評価し、生体内リプログラミングに適しています。

ビデオ: Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

発生生物学

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.

The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

心臓毒注入による急性骨格筋再生の誘導

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To investigate the underlying mechanisms that bring about various muscle adaptations, a number of exercise protocols such as treadmill, wheel running, and swimming exercise have been used in the animal studies. However, these exercise models require a long period of time to achieve muscle adaptations, which may be also regulated by humoral or neurological factors, thus limiting their applications in studying the muscle-specific contraction-induced adaptations. Indirect low frequency stimulation (10 Hz) to induce chronic contractile activity (CCA) has been used as an alternative model for exercise training, as it can successfully lead to muscle mitochondrial adaptations within 7 days, independent of systemic factors. This paper details the surgical techniques required to apply the treatment of CCA to the skeletal muscle of rats, for widespread application in future studies.

This protocol describes the use of the chronic contractile activity model of exercise to observe stimulation-induced skeletal muscle adaptations in the rat hindlimb.

慢性的な刺激の収縮活動に伴うラット骨格筋の表現型適応を研究への応用

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Pax7 とラミニン抗体抗体法による骨格筋衛星細胞の同定

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

生体内でショウジョウバエの蛹の筋腱の形態形成の観察

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a hallmark of various pathophysiological conditions including tumor suppression, tissue remodeling and aging. The inducers of cellular senescence in vivo are still poorly characterized. However, a number of stimuli can be used to promote cellular senescence ex vivo. Among them, most common senescence-inducers are replicative exhaustion, ionizing and non-ionizing radiation, genotoxic drugs, oxidative stress, and demethylating and acetylating agents. Here, we will provide detailed instructions on how to use these stimuli to induce fibroblasts into senescence. This protocol can easily be adapted for different types of primary cells and cell lines, including cancer cells. We also describe different methods for the validation of senescence induction. In particular, we focus on measuring the activity of the lysosomal enzyme Senescence-Associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the rate of DNA synthesis using 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) incorporation assay, the levels of expression of the cell cycle inhibitors p16 and p21, and the expression and secretion of members of the Senescence-Associated Secretory Phenotype (SASP). Finally, we provide example results and discuss further applications of these protocols.

Here, we discuss a series of protocols for induction and validation of cellular senescence in cultured cells. We focus on different senescence-inducing stimuli and describe the quantification of common senescence-associated markers. We provide technical details using fibroblasts as a model, but the protocols can be adapted to various cellular models.

ひと初代細胞における細胞老化の誘導性

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. Recent studies have extended the role of cellular senescence to various physiological processes, including development, wound healing, immune surveillance, and age-related tissue dysfunction. Although cell cycle arrest is a critical hallmark of cellular senescence, an increased intracellular reactive oxygen species (ROS) production has also been demonstrated to play an important role in the induction of cellular senescence. In addition, recent studies revealed that senescent cells exhibit potent paracrine activities on neighboring cells and tissues through a senescence-associated secretory phenotype (SASP). The sharp increase in interest regarding therapeutic strategies against cellular senescence emphasizes the need for a precise understanding of senescence mechanisms, including intracellular ROS and the SASP. Here, we describe protocols for quantitatively assessing intracellular ROS levels during H-Ras-induced cellular senescence using ROS-sensitive fluorescent dye and flow cytometry. In addition, we introduce sensitive techniques for the analysis of the induction of mRNA expression and secretion of SASP factors. These protocols can be applied to various cellular senescence models.

Intracellular ROS has been shown to play an important role in the induction of cellular senescence. Here, we describe a sensitive assay for quantifying ROS levels during cellular senescence. We also provide protocols for assessing the senescence-associated secretory phenotype, which reportedly contributes to various age-related dysfunctions.

癌遺伝子が誘導する老化の中に活性酸素種および分泌老化関連の表現型正常ひと線維芽細胞の定量測定

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...