We thank the Animal House and the Integrated Microscopy Facilities of IGB-CNR. This work has benefited from research funding from the European Community's Seventh Framework Programme in the project ENDOSTEM (Activation of vasculature associated stem cells and muscle stem cells for the repair and maintenance of muscle tissue, grant agreement number 241440), the Italian Ministry of Education-University-Research (MIUR-PRIN2 010-2011) to G.M. and S.B. and PON Cluster IRMI to G.M., and the CARIPLO foundation to G.M. and S.B.

すべての実験は動物研究のための施設のガイドラインに厳密に従って行われ、動物実験に関する法律に従って公衆衛生、動物衛生、栄養と健康のイタリア省の食品安全省によって承認されました。頸椎脱臼手順はIACUCまたはそれと同等の要件に基づいて機関から機関に異なる場合があります。 前脛骨筋1.心臓毒注射<ol><li>手順を開始する前に、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中または水中で心臓毒原液を希釈することにより、心臓毒（CTX）の溶液を作業10μMのを準備します。 注：CTXを1mg / mLで水に可溶です。 70μMストック溶液を準備します。 -20℃で小分けし、店舗。 CTXは、このプロトコルのために使用される約7,000ダの分子量を有する心臓毒の混合物です。 注意：着用することが示唆されています二重手袋、衛生マスク、安全メガネは、希釈した場合でも、その溶液との接触を避けるために非常に注意する（あるいは安全メガネには、フードの下で作業することが推奨されます）。 </li><li>ケタミンおよびキシラジン（80 mgの/ kg及び10mgの体重の/ kg）または他の承認された利用可能な麻酔薬の腹腔内注射によってマウスを麻酔。 </li><li>マウス面を上にして、70％エタノールで後肢をスプレー。前脛骨（TA）筋の正確な場所を視覚化するために、メスの助けを借りて、膝の下で、下肢の前方部分に離れて髪を切ります。 注：TA筋が骨に横を下って行くと足首で終わる、脛骨の近位本体から生じます。その長い腱は、（ 図1A参照）足首全体の足の中に延びます。 </li><li>バックゆっくりプランジャーを引くことにより、シリンジへの溶液の〜100μLを描画します。 </li><li>直立シリンジを保持する、気泡を除去（針で上向き）。そっとプランジャーを引くと、チューブの内側部分に接続されているすべての気泡が上向きに来助けるために、注射器の側面をタップします。ゆっくりと、大きな気泡を解放するためにプランジャーを押してください。液体を数滴は、針を出てきます。この時点で、心臓毒の毒性を考慮すると、チューブに再び液体をピックアップし、それを分散しないようにしてください。 </li><li>所望の投与量に達するまで、注射器への溶液を撤回。各TA筋のためのCTX溶液20μLを注入します。 </li><li>膝に向かって腱から、ガイダンスとして脛骨骨の位置を追跡することによって、TAの中心に針を挿入します。 TAは薄い組織であるので、（2/3ミリメートルの深針、約10°〜20°の角度を挿入）深すぎる行かずに注射を行い、筋肉自体（ 図1A）を越えて行くことは避けてください。 </li><li>注射直後に針を引き出したが、2待ってはいけない - 漏れを防ぐために3秒CTXの年齢は筋肉から落下します。 </li><li>マウスは麻酔ので、覚醒され、使用されるエタノールは、体温を低下させるまでの手順の後、（37℃で）加熱されたプレート上にケージを配置します。 </li></ol> 2.前脛骨の分離注：筋肉は、実験の要件に応じて心臓毒注射後の異なる時点で単離することができます。 <ol><li>頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げます。 </li><li> 70％エタノールで後肢をスプレーします。手順の間、動物はそれを保持するために支持体に固定することができます。 </li><li> （足の上）近位腱のレベルで皮膚を切り取り、皮膚の下にはさみの刃の1を挿入して、膝の方向に、上向きに皮膚を切りました。鉗子の助けを借りて、皮膚を引き上げ、完全に筋肉を露出させます。慎重に関心領域から肌や髪のすべてを削除します。 </li><li>ゆっくりと（thとつまんまたは切断することにより、 筋膜を排除チップインピンセットやハサミを解剖細かいマイクロ付き）脛骨（ 図1B）の反対側の筋肉の極端な周囲。一度壊れて、そっと細い先端ピンセットの助けを借りて筋膜を除去します。根本的な筋肉の損傷を防ぎます。 注：他の筋肉および器官と同様に、TAは、 筋膜 （脚の深部筋膜）、深い皮膚の下にあり、それは容易に下にある筋肉を単離するために除去する必要がある結合組織の薄いシートで覆われています。 </li><li>遠位TAの腱と並置されている足、上記の伸筋Digitorum腱を視覚化します。伸筋Digitorum長い（EDL）筋肉の腱はわずかTA腱の下に位置しています。成体マウスの腱は、肉眼で見ることができます。 </li><li> 2次のいずれかの次のTA筋を削除します。 <ol><li>細かいマイクロはさみを解剖して、両方の腱をカットし、近位側に向かって、それらを引く、holdinグラム鉗子で腱。筋肉を分離するために反対方向に優しく、それらを引っ張って、2腱を分離します。 </li><li>薄チップピンセットの助けを借りて、腱自体（ 図1C、上の写真）の下にチップを渡すことによって、伸筋腱Digitorumから遠位TA腱を分離します。ゆっくり基礎となる筋肉（ 図1C、下の写真）からそれを分離するために、TA以下ピンセットをスライドさせます。 </li><li> 、わずかに隆起それを維持TAの腱を切断し、軽くひざ下の領域のみが装着されるまで、上向きにそれを引っ張って筋肉の下でピンセットを持ち（ 図1D、左画像）。はさみ（ 図1D、右の写真）と筋肉のエッジ以下、膝下TAをカットします。 注：筋肉を少し脇に取り付けられたままの場合、それを切り離す助けるためにはさみを解剖細かいマイクロを使用しています。 注：鉗子を簡単にTAの下に収まらない場合は、筋膜が完全に除去されていないことが可能であり、それはまだ、筋肉の上に見えるかもしれません。この場合、完全に進む前筋膜を除去します。 </li></ol></li></ol> 3.新鮮凍結筋肉テクニック<ol><li>トラガカントゴムまたはコルクのスライス上に同様の接着剤、凍結化合物（ 例えば、最適な切削温度（OCT）化合物）の少量を置きます。必要に応じて（ 図2A）、凍結前の逆側のコルクのスライスにラベルを付けます。 </li><li>筋肉の横断面を得るためには、コルクに対して垂直な位置にある筋肉を持って確認しながら、遠位腱を挿入し、外部の約3/4の筋肉のを残すことによって、トラガントガムにTAをシンク（ 図図2（a））。 </li><li>イソペンタンで、アルミ缶（あるいは、金属カップやガラスビーカー）を入力します。 LIQUIを含むデュワー内のイソペンタンの缶を一時停止D窒素は、液体窒素が缶に入力することができません。 注：イソペンタンは、組織の最適な凍結のために（-150から-160℃）適切な温度に到達する必要があります。いくつかの白色の固体粒子は、缶の底部に形成し、イソペンタンがわずかに粘性になったときに、正しい温度に到達します。 注：それは凍結アーチファクトにつながることができますように、固体粒子を形成する前にサンプルを凍結しないでください。それが解凍されるまで一方、イソペンタンが完全に固体になった場合、いくつかの白色粒子が依然として存在していることを確認して、室温でそれを残します。 </li><li> Mixterの鉗子を使用して、急速にイソペンタンに筋肉でコルクを浸し、下方に位置する筋肉を維持し、それが完全に液体に浸漬されたときにコルクを解放するようにしてください。試料が浮いている間このように、コルクの唯一の裏面には、液体中に表示されるはずです。 </li><li> SAを残します1分間のイソペンタンでmple。 </li><li> Mixter鉗子（または類似の鉗子）を使用して、筋肉を取ると、少なくとも2分間、液体窒素の中に浸します。 </li><li>格納-80℃のフリーザー直接標識アルミ箔で個別に試験片をラップし、直ちにドライアイス（-70℃）に配置し、または。 ステップ3.4から3.7に、手順では、正確な温度を維持し、解凍から標本を防ぐために非常に重要です：注意してください （ 例えば 、℃の冷凍庫に-80転送中。）。組織内に存在しており、最終的には人工物の形成または筋線維（繊維の中心にある大きな白い穴として組織切片上で視覚化）の故障の原因となり、水の微結晶の制御されない融解および再凍結中の温度上昇をもたらします。 </li></ol>冷凍筋肉の4クライオスタットセクショニング<ol><li>クライオスタットチャンバ温度tを設定しますO -20〜-22℃です。 </li><li>彼らは、少なくとも30分間平衡化することができ、試料のスタブ、ブレード、クライオスタットチャンバ内の試料を入れてください。 </li><li>試料スタブで凍結化合物（ 例えば、10月化合物）の少量を置き、凍結化合物が固化する前に、検体とコルクを浸します。一方、ブレードホルダーに刃を配置します。 </li><li>ブレードホルダー（ 図2B）で試料ホルダーを方向付けるために付属のネジを使用して試料とブレードの位置を合わせます。 </li><li> 10μmの切片厚を設定します。組織を切断するために進んでください。駆動輪の各ターンのために、試料ホルダーは、ブレードに向かって制御された距離を進みます。 </li><li>偏スライド（スライドあたり8〜10節）（ 図2C）のセクションを配置します。 </li><li>切片後、-80℃でスライドを保存します。 注：試料は、-80℃の冷凍庫に保存し、furtheに再利用することができます適切に処理し、保存されている場合はrを、切片。 </li></ol> 5.ルーチンの組織学的染色（ヘマトキシリン＆エオシン染色） 注：いくつかの組織学的染色は、分析によれば、筋肉切片上で実施することができます。形態学的および形態計測分析のためのルーチンの組織学的染色はヘマトキシリン＆エオシン（H＆E）重クロム染色です。ヘマトキシリンは、深い紫色の核を染色します。核染色は、細胞質内の筋繊維のような好酸球の構造を、染色エオシン（ピンク/赤）、で対比されます。 <ol><li> 10のためのセクションで完全に空気乾燥冷凍スライド - 室温で15分間、染色トレイにスライドを申し立てる、および染色トラフにトレイを置きます。 </li><li>ヘマトキシリンで1分間染色します。 </li><li>ヘマトキシリンを洗い流すために10分間、かなり弱い水道水ジェットの下で染色トラフを置きます。 </li><li>エオシンのアルコール溶液が使用される場合（Tをスキップし、95％エタノール中で5分間、スライドを浸漬水性エオシン溶液の場合では、彼のステップ）。 </li><li>エオシン溶液で1分間対比染色。 </li><li>過度のエオシン液を除去するために水ですすいでください。 注：ヘマトキシリンまたはエオシンのいずれかで染色の最適なタイミングは、各新しいバッチのために定義されるべきです。 </li><li> 50％および70％（数秒ごと）：段階的エタノールシリーズでサンプルを脱水します。急速に100％エタノールで2変化、それぞれ5分、続いて95％エタノールに浸します。 </li><li>キシレンの2の変更、各5分以上でクリア。このステップは、化学フードの下で行わなければなりません。 </li><li>スライド上のメディアをマウントし、カバーガラスで覆い、数滴を適用し、キシレン系封入剤でスライドをマウントします。マウンティング培地はまた、カバーガラススライド上に置き、カバースリップを適用することができます。 <ol><li>スライドとカバーガラスの間に空気の泡を形成することは避けてください。 、気泡を除去する（実装後）縦スライドを維持し、過剰カ月を絞り出すために、優しく鈍鉗子（または類似の鈍ツール）でカバースリップ上で押してuntingメディアや気泡。 </li></ol></li><li>キシレンは、分析に進む前に、完全に蒸発させるために数時間または一晩フードの下のスライドを保管してください。 </li><li>マウスごとに少なくとも1つの全体の筋肉部分の非重複シリアル画像を用いて、H＆E染色された再生筋肉切片の形態学的および形態計測解析を実行します。 20X倍率で、明視野顕微鏡で画像をキャプチャします。 注：5匹のマウスの最小数は、測定値の統計的有意性を得ることが推奨されます。 注：画像解析ソフトウェアは、無料ダウンロードソフトウェアImageJのように、この目的のために利用可能である（http://imagej.nih.gov/ij/）。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

ここでは、骨格筋（ すなわち、CTXの筋肉注射）での急性損傷を誘導するためのプロトコルを記述します。これは、 インビボでの骨格筋再生のダイナミクスを研究するための強力なツールとして広く用いられています。 CTX注入は筋細胞膜の脱分極および繊維12の収縮によって引き起こされる筋線維の変性を誘導し、筋肉の再生につながる事象のカスケードを誘発します。骨格筋は、実験の要件に応じて、注射および損傷後の所望の時点で解剖し、およびその後の組織学的分析のために使用されます。切開し、筋肉のいずれか凍結保護培地中に封入した後、凍結またはパラフィン中に含めることができます。しかしながら、これらの手順は、成果物を生成することができ、最終的にその後の分析に影響を与える可能性がパラホルムアルデヒドで予め固定のステップを必要とします。直接組織を凍結することで、この問題を防ぐことができます。注目すべきは、多くの一次抗体は、この手順は、より信頼性を向上させ、新鮮凍結筋肉切片13、排他的にまたは効率的に作業を行います。形態計測分析は、通常、同じ年齢のマウスのグループ間の再生過程における差異の評価のために、特定の遺伝子変異および/または薬理学的治療で可能時間経過実験で実行されます。 CTX誘発損傷のプロトコルは、それ自体が高度に再現可能であるが、可能な制限は、CTX注射のオペレータ依存の変動によるものです。この制限を克服するために、全体の時間経過実験を同一のオペレータによって実行されることが好ましいです。 筋肉再生の程度は、総面積にわたって健康繊維、壊死領域と炎症、および再生、再生エリアの割合として定量化することができます。このようなジストロフィーMDXマイルのような慢性損傷のイベントを、勉強するときしかし、このアプローチは、主に使用されていますむしろ急性損傷のモデルに比べて、CE、。ジストロフィー筋肉が変性と再生の非同期イベントによって特徴づけられる実際、急性損傷は、明確に定義されたと必然的なイベントが続いています。上記の形態学的特徴の経験的な識別を必要とするこれらの分析の1つの制限は、彼らが完全に公平ではないということです。実験的な結論をサポートするために、形態素解析は、常に実験的な結論をサポートするために、特定の分子マーカーの免疫蛍光分析として、さらなる分析で補完する必要があります。このため、明確な結果を解釈するために平行分析を使用することが好ましいです。例えば、再生筋線維を積極的に新たに形成された筋線維に特異的に発現している胚性ミオシン重鎖（eMyHC）について染色されています。したがって、eMyHC染色された筋線維の定量は、形態素解析と並んで行うことができます。 CSA分析は、より信頼性の高い定量化し、H＆E染色切片上又は筋線維のエッジをマークラミニン、で染色した筋肉切片のいずれかを行うことができます。上記のように定量化は、ImageJの適切なマクロを使用して実行されます。両方の場合において、第一セクションの品質を評価し、変形したりカール見える組織の領域を除外することは常に必要です。 組織の形態学的分析のほかに、H＆E染色切片は、線維症および/または脂肪組織の存在などの他の特定の機能の同定を可能にします。実際、線維症は、いずれかの再生が損なわれた場合、または慢性疾患14で発生する細胞外マトリックスの過剰蓄積に由来します。実際、細胞外マトリックスの蓄積は、H＆E-組織染色で再生筋線維の間に堆積淡い材料として表示されます。 CTXの注射の複数ラウンドをtを使用することができます筋線維は変性と再生および瘢痕組織の波を受けているO模倣慢性疾患が異常に蓄積します。しかし、より信頼性の高いプロトコルは、筋線維15を誘導するために利用可能であり、特定の組織染色は、マッソントリクロームまたはシリウスレッド染色のように、これらの構造を同定し、定量化するために行うことができます。脂肪組織の形成は、オイルレッド染色によって定量化された脂肪組織の存在の重要な指標を与える筋線維間の丸みを帯びた白色の構造、などのH＆E染色切片にはっきりと見えます。最後に、説明したプロトコールに従って得られた骨格筋切片は、特異的抗体およびプロトコルを使用して免疫蛍光分析を実行するために使用することができます。

哺乳類の成体の骨格筋が収縮するために特化して多核筋細胞（筋線維）のfasciculesのグループによって形成されています。各筋線維は、筋細胞膜（原形質膜）に囲まれた、細長い合胞体であり、定期的に繰り返し編成収縮タンパク質（アクチンとミオシンフィラメント）で構成されている筋原繊維を含みます。大人の生活の中で、および休止状態で、骨格筋は、彼らの筋核1の非常に低い離職率を持っています。確かに、筋線維の周囲に位置している筋核は、筋細胞膜の下で、細胞周期のG0期で停止し、1,2を増殖することはできませんされています。 骨格筋は、互いに緊密に関連している組織リモデリングのいくつかのイベントの後ホメオスタシスに達し、次のダメージを再生する独特の能力を有します。急性損傷または外傷後、変性は、誘導される再生過程が続きますすなわち、筋細胞、衛星細胞（SCS）の居住集団を含む異なる細胞集団を含みます。実際、任意の環境刺激の非存在下では、衛星細胞は静止状態にあり、筋細胞膜と基底板3,4の間に特殊なニッチに位置しています。怪我や病気に続いて、SCが、活性化、増殖、損傷領域に移行し、最終的に分化し、新たに筋線維5を形成を生じます。活性化のSCは、異なる細胞集団で外傷6-8のサイトで募集されている主に炎症細胞を、クロストークを確立します。このクロストークは、細胞が分子シグナルが最終的ホメオスタシス9につながる、構造的修飾を駆動することによって調整されたパラダイムに従うことができます。 SC、炎症および間質細胞、血管形成過程、および再神経支配のイベントの他にも、この高度に組織とsを修復するために協調的に作用し、関与していますpecialized構造。 筋肉の生理学を理解するだけでなく、プロセス全体のより深い知識を必要とする治療戦略を改善するだけでなく、骨格筋再生のさまざまな側面を研究することに大きな関心があります。いくつかの実験的アプローチは、現在、異なる細胞集団、シグナル伝達経路、および関与する分子メカニズムのアイデンティティと機能を研究するために利用可能です。急性の傷害のマウスモデルは、このプロセスの多くの側面を研究するための強力なツールを表します。研究者は非常に早い段階からプロセスの最後に、 インビボでの再生プロセスに従うことができるように、急性筋損傷を誘発する別の一般的に使用される技術。このプロトコルは、筋変性を誘導し、組織サンプルの分析まで、再生処理をトリガするヘビ毒由来の心臓毒（CTX）の筋肉内注射からの手順を説明します。 CTXの注射後、MICEは、実験の要件に応じて異なる時点で犠牲にすることができ、骨格筋を解剖し、さらなる分析のために処理することができます。最後に、我々は、形態学的観察結果と基本的な定量分析を行うための組織切片の染色プロトコルを記述する。このプロトコルは、非常に再現性のある方法10のin vivoでの急性骨格筋再生の研究を可能にします。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="957">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Cardiotoxin from&#160;Naja mossambica mossambica</td>
			<td style="width:199px;">SIGMA ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">C9759</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G X 8 mm - Da 0,3 ml</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Tragacanth Gum</td>
			<td style="width:199px;">MP BIOMEDICALS,LLC</td>
			<td style="width:119px;">104792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Methylbutane (Isopentane)</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">78-78-4.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat</td>
			<td>Bio-optica</td>
			<td>&#160;05-9801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Feather Microtome Blade S35</td>
			<td style="width:199px;">Bio-optica</td>
			<td style="width:119px;">&#160;01-S35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Glass Slide Superfrost Plus</td>
			<td style="width:199px;">Menzel-Gl&#228;ser</td>
			<td style="width:119px;">09-OPLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Dumon #5 Mirror Finish Forceps&#160;</td>
			<td style="width:199px;">2BIOLOGICAL INSTRUMENTS</td>
			<td style="width:119px;">11251-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Scissors Straight Sharp/Sharp</td>
			<td style="width:199px;">2BIOLOGICAL INSTRUMENTS</td>
			<td style="width:119px;">15024-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Scissors Noyes Straight</td>
			<td style="width:199px;">2BIOLOGICAL INSTRUMENTS</td>
			<td style="width:119px;">15012-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10,5 Cm</td>
			<td style="width:199px;">2BIOLOGICAL INSTRUMENTS</td>
			<td style="width:119px;">14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Eukitt</td>
			<td style="width:199px;">Bio-optica</td>
			<td style="width:119px;">09-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Slide Coverslip</td>
			<td style="width:199px;">BIOSIGMA</td>
			<td style="width:119px;">VBS651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Xylene</td>
			<td style="width:199px;">SIGMA ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">214736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol 100%</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>02860-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Hematoxyline</td>
			<td style="width:199px;">J.T. BAKER</td>
			<td style="width:119px;">3873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Eosin</td>
			<td style="width:199px;">SIGMA ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">HT110116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Cryostat</td>
			<td style="width:199px;">LEICA</td>
			<td style="width:119px;">CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of acute skeletal muscle regeneration by cardiotoxin injection

骨格筋再生は、損傷または疾患に応じて、成人骨格筋に発生する生理学的プロセスです。急性損傷誘導骨格筋再生は筋肉の再生に関与するイベントだけでなく、メカニズムと異なる選手を研究するために広く使用されている、強力なモデル系です。実際には、このプロセスの詳細な知識は、骨格筋の変性につながる病的状態をより良く理解するために不可欠であり、それは新たな標的治療戦略を同定するのに役立ちます。本研究は、心臓毒の単回筋肉内注射（CTX）を介して、マウスにおける急性骨格筋再生を誘導するための詳細と再現性のプロトコルについて説明します。 CTXは、ヘビ毒毒素のファミリーに属し、最終的には再生イベントをトリガ筋線維の筋変性を引き起こします。骨格筋再生のダイナミクスは、筋肉切片の組織学的分析によって評価されます。また、プロトコル、解剖凍結、および前脛骨筋だけでなく、広くその後の形態学的および形態計測分析のために使用されるルーチンのヘマトキシリン＆エオシン染色を切断するための実験手順を示しています。

H＆E染色は、骨格筋の再生中に特定の時点で再生プロセスの形態の評価が可能になります。 図3は 、野生型マウスの負傷したTA筋肉に行っ時間経過解析を示します。 図3Aに図式として筋肉は、CTXの注射後3、7、15、30日目に単離されています。 H＆E染色した横断面の代表的な写真が（ 図3B-E）は、時間の経過骨格筋修復のダイナミクスを示しています。損傷後3日目に、筋肉の構造的なアーキテクチャは完全に破壊され、両方が筋線維（壊死領域）と単核細胞を縮退される（ 図3B）はっきりと見えます。この細胞の不均一な群は、主に一過性増幅衛星細胞（筋芽細胞）、血液11から募集炎症細胞、およびパルティ間質および内皮細胞で構成されてい損傷部位でトリガされる再生工程、にcipate。この文脈において、新しい再生筋線維の融合および筋芽細胞の分化によって生成されます。再生エリアの主な特徴は、中央に位置する核と暗い染色細胞質（ 図3C）と小好塩基性筋線維の存在です。それは次第に減少するが、この段階では、炎症は、表示されたままです。再生筋線維の大きさは、中央に位置する核（ 図3D、E）によって特徴づけられる好酸球、再生筋線維を生じさせる、時間の経過とともに増加します。再生された筋線維は再生の後の段階で、プロセスが終了するまで表示されます。健康的な筋線維は、ピンクの細胞質とし、筋細胞膜の下で、繊維の周囲に配置された核で、高度に組織化され、お互いに近接しています表示されます。これらの筋線維は、通常、CTX注入及び損傷部位から遠い存在であり、それら複数種の希LY再生が決定的に完了した領域を表します。確かに、再生繊維は、わずか数ヶ月損傷後の周囲に移動し、中央に位置する核の存在によって特徴付けられます。 染色された筋肉切片のデジタル画像を正確に関心のある領域の輪郭を概説することによって関心領域を測定する必要がある空間較正のためのスケールバーを追加することによって捕捉されます。筋線維断面積（CSA）の測定は、広く、マウスの異なるグループ間の再生傾向の差を定量化するために使用される信頼性の形態計測分析です。この分析は、少なくとも500、最大セクション1,000繊維にを含む、一元有核筋線維の面積の測定を必要とします。両方の再生の平均及び再生筋線維の領域とこれらの領域のガウス分布は、再生のprocの指標でありますESS。増加した筋線維CSAは、一般的に改善されたおよび/または加速再生応答に関連付けられています。逆に、適切な再生の失敗は、CSAの減少と関連しています。ここでは、筋線維CSA分析を報告し、異なる時点での平均（ 図3F）と筋線維CSAの分布（ 図3G）の両方として示されています。筋線維領域の分布が再生進行の過程として、より大きなサイズの繊維に向けてCSAシフト時間をかけて、どのようにどのように変化するかを分析のハイライト。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54515/54515fig1.jpg" /> 図1.筋肉内注射および脛骨筋の単離。前脛骨筋における心臓毒のA.筋肉内注射。 B。筋筋膜の除去。白い矢印は目を削除するには、筋肉をピンチ薄ひっくり返したピンセットを示し、電子筋膜 。 C。上の写真は、遠位TA腱の解剖学的位置を示しています。下の写真は、TAを持ち上げ、筋肉の損傷を回避しながら、それを削除する方法を示します。 D。左の写真：TAは上向きの遠位腱を引っ張ることによって持ち上げられます。白い矢印は、遠位EDL腱を示しています。右の写真は：鉗子で腱を保持することによって、TAの上端は、膝から下を切断されます。白い矢印は、切断部位を示します。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54515/54515fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54515/54515fig2.jpg" /> 図2.新鮮凍結筋肉や冷凍筋肉のクライオスタットセクショニング。トラガカントゴム新鮮な筋肉インクルージョンのA.技術 。 TA筋を約3/4外部と、腱からガムに浸漬され、コルクに対して垂直位置に維持。クライオスタット切片のための手順のB.代表的画像。コルクは、試料スタブに化合物を凍結少量の置かれています。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54515/54515fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54515/54515fig3.jpg" /> 骨格筋再生の図3.タイムコース分析。急性骨格筋損傷のA.実験スキーム。 BE。心臓毒のヘマトキシリン＆エオシン染色切片（CTX）の代表的な写真は、損傷後指示された日で筋肉を処置されました。 B。 （写真の左側）黒の実線は、おそらく炎症細胞によって侵入壊死性繊維のカップルを、囲みます。破線（右側絵の）単核細胞浸潤の領域をマークします。中央に位置する核を有するC.単一の未成熟筋線維は、黒丸で示されています。 DE。中央に位置する核を有する大規模な再生成好酸球性筋線維は、黒丸でマークされています。スケールバーは100ミリメートルを表しています。 TA筋切片で一元有核筋線維サイズ値のF.平均。値は平均±SEM、5マウス/群平均値です。 G.筋線維断面積6における（CSA）分布、15、及び30日CTXの注射後。値は平均±SEM、5マウス/群平均値です。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54515/54515fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

この原稿は、成体マウスや、解剖などの筋肉のその後の操作、凍結、切断、ルーチン染色、および筋線維断面積の解析における急性骨格筋再生を誘導するための詳細なプロトコルを記述します。

心臓毒注入による急性骨格筋再生の誘導

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

induction-acute-skeletal-muscle-regeneration-cardiotoxin

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

21.8K ビュー.  Institute of Genetics and Biophysics "A. Buzzati Traverso", CNR. この原稿は、成体マウスや、解剖などの筋肉のその後の操作、凍結、切断、ルーチン染色、および筋線維断面積の解析における急性骨格筋再生を誘導するための詳細なプロトコルを記述します。 

ビデオ: Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

ゲンタマイシン誘発性損傷によって大人ゼブラフィッシュにおける腎再生

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

発生生物学

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be difficult to study, and can lead to confounding results. The protocol described here is a straightforward breeding paradigm to increase and decrease penetrance in lethal zebrafish skeletal mutants. Because lethal mutants cannot be selectively bred directly, the classic selective breeding strategy of progeny testing is employed. This method also includes protocols for Kompetitive Allele Specific PCR (KASP) genotyping zebrafish and staining larval zebrafish cartilage and bone. Applying the husbandry strategy described here can increase the penetrance of an interesting skeletal phenotype enabling more reproducible results in downstream applications. In addition, decreasing the mutant penetrance through this selective breeding strategy can reveal the developmental processes that most crucially require the function of the mutated gene. While the skeleton is specifically considered here, we propose that this methodology will be useful for all zebrafish mutant lines.

The goal of this protocol is to alter the penetrance of lethal skeletal mutant phenotypes in zebrafish by selective breeding. Lethal mutants cannot be grown to adulthood and bred themselves, therefore this protocol describes a method for tracking and selecting penetrance through multiple generations by progeny testing.

テストの子孫によるゼブラフィッシュ致死の骨格変異の浸透度をシフト

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

傷害による老化と生体内での骨格筋におけるリプログラミングの評価

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To investigate the underlying mechanisms that bring about various muscle adaptations, a number of exercise protocols such as treadmill, wheel running, and swimming exercise have been used in the animal studies. However, these exercise models require a long period of time to achieve muscle adaptations, which may be also regulated by humoral or neurological factors, thus limiting their applications in studying the muscle-specific contraction-induced adaptations. Indirect low frequency stimulation (10 Hz) to induce chronic contractile activity (CCA) has been used as an alternative model for exercise training, as it can successfully lead to muscle mitochondrial adaptations within 7 days, independent of systemic factors. This paper details the surgical techniques required to apply the treatment of CCA to the skeletal muscle of rats, for widespread application in future studies.

This protocol describes the use of the chronic contractile activity model of exercise to observe stimulation-induced skeletal muscle adaptations in the rat hindlimb.

慢性的な刺激の収縮活動に伴うラット骨格筋の表現型適応を研究への応用

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Pax7 とラミニン抗体抗体法による骨格筋衛星細胞の同定

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal muscle. Mouse skeletal muscle has been shown to produce high quality X-ray diffraction patterns on third generation synchrotron beamlines providing an opportunity to link changes at the level of the genotype to functional phenotypes in health and disease by determining the structural consequences of genetic changes. We present detailed protocols for preparation of specimens, collecting the X-ray patterns and extracting relevant structural parameters from the X-ray patterns that may help guide experimenters wishing to perform such experiments for themselves.

We present detailed protocols for performing small-angle X-ray diffraction experiments using intact mouse skeletal muscles. With the wide availability of transgenic mouse models for human diseases, this experimental platform can form a useful test bed for elucidating the structural basis of genetic muscle diseases

筋肉疾患の構造的基礎を研究するためのツールとしての無傷のマウス骨格筋のX線回折

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle regenerative process. There are recognized challenges to working with human primary adult stem cells, particularly human muscle progenitor cells (hMPCs) derived from skeletal muscle biopsies, including low cell yield from collected tissue and a large degree of donor heterogeneity of growth and death parameters among cultures. While incorporating heterogeneity into experimental design requires a larger sample size to detect significant effects, it also allows us to identify mechanisms that underlie variability in hMPC&#160;expansion capacity, and thus allows us to better understand heterogeneity in skeletal muscle regeneration. Novel mechanisms that distinguish the expansion capacity of cultures have the potential to lead to the development of therapies to improve skeletal muscle regeneration.

We present techniques for isolating, culturing, characterizing, and differentiating human primary muscle progenitor cells (hMPCs) obtained from skeletal muscle biopsy tissue. hMPCs obtained and characterized through these methods can be used to subsequently address research questions related to human myogenesis and skeletal muscle regeneration.

骨格筋生検手順からのヒト筋前駆細胞の単離、培養、特徴付け、分化

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

免疫不全マウスにおけるヒト骨格筋異種移植片の実行

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...