この作品は、Plaxgen 研究で賄われていた SM (plx 社-1008) に与えられる補助金。IRB の承認の下で動脈硬化科目から血清試料を採取、パロ ・ アルト医療研究財団研究所に感謝します

1 準備の蛍光ラベル コレステロールと脂質低下薬 注: 私たちの以前の記事で説明したように蛍光コレステロール集計とスタチン系薬剤が準備された。 21 します詳細については本研究で使用されるデータ解析ソフトウェア、化学分析装置、フローサイト イメージング試薬の 材料表 を参照してください。。
<ol><li>凍結乾燥コレステロールの蛍光標識を可溶化 (1 mg Ex/Em = 495 nm/507 nm) を 1 mL 100% アルコールの粉末</li>。
	<li>2,040 × g で 3 分のサンプルを遠心し、プラークアッセイ配列の水溶性蛍光標識コレステロール骨材を含む上清を使用します</li>。
	<li>薬の準備のため個別に可溶化粉末 (2 mg) を 1 ml 100% アルコールのオメガ 3 脂肪酸、エゼチミブ、アトルバスタチン ロバスタチン シンバスタチン</li>。
	<li>2,040 × g で 3 分間遠心分離した後薬剤アッセイを含む上清を使用します</li>。
	<li>同様に、可溶化個別に粉末 (2 mg) フルバスタチン、ロスバスタチン、ナイアシン、2 mg/mL の原液を作るために脱イオン水 1 mL に fibrate と</li>。
	<li>2,040 × g で 3 分間遠心分離後プラークアッセイ配列で薬を含む上清を使用します</li>。
</ol> 2。審査 体外 コレステロール粒子形成配列プラークアッセイ <ol><li>使用化学アナライザー-1 (材料の表を参照) コレステロール粒子形成のプラークアッセイ配列を設定します。丸底、セクション 1 で調製試薬を用いる低蛋白結合 96 ウェル プレートでアッセイを実行します。各 200 μ L でも最終反応体積を維持し、3 通すべてのアッセイを行う。
	<ol><li>まず、リン酸の負荷 194.5 μ L 緩衝生理食塩水 (PBS) 各ウェルにします</li>。
		各も各脂質低下薬ソリューションの 2.5 μ L (5 μ g) を追加し、30 の板を振る <li>ソリューションに薬剤を均一に混合する化学アナライザー 1 リアクション プレート上に置くことで s。薬は陰性対照サンプルに追加されません</li>。
		<li>最後に、各ウェルに 2 μ L (2 μ g) 蛍光コレステロール集計ソリューションを追加し、30 の板を振る化学アナライザー 1 リアクション プレート上に置くことによって s.</li>
		<li>37 ° C、200 rpm で設定 2 h のラボ シェーカーでプレートをインキュベートします</li>。
		<li>インキュベーション後、フローサイトメトリーによる粒子の画像を取得します</li>。
	</ol></li></ol> 3。キャプチャ画像のコレステロール粒子を用いたイメージング フローサイトメトリー <ol><li>オープン データ収集テンプレート正しい計測器設定を読み込めません。クリックして &#34; ファイル &#34; を選択、&#34; テンプレートを開く &#8230; &#34; テンプレート ファイルを選択</li>。
	<li>をクリックして &#34; フラッシュ、ロック、負荷 &#34; サンプル読み込み用計測器を準備する</li>。
	<li>時、&#34; を読み込むサンプル &#34; 対話ボックスが開き、をクリックして &#34; OK &#34; イメージングの流れの cytometer にセクション 2 でも作成から 50 μ L のサンプルをロードする</li>。
	<li>をクリックして &#34; を実行 |セットアップ &#34; リアルタイムでイメージング領域にパーティクルを表示する</li>。
	<li>イメージングの領域に粒子が良いフォーカスをクリックして &#34; を実行 |取得 &#34; 黄色蛍光、蛍光グリーン、明るいフィールド (BF) 暗視野 (側散布/SSC) の高スループット方法で各オブジェクトの画像を同時に取得する</li>。
	<li>3.2 3.5 各サンプルから 5,000-10,000 の粒子を取得する手順を繰り返します</li>。
	<li>画像解析ソフトを使用してオブジェクトの蛍光強度と形態学的変化を決定するすべての raw 画像ファイルを分析します。
	<ol><li>をクリックして、&#34; ツール &#34; 画像解析ソフトの上部にあるボタンをクリックし、[&#34; バッチ データ ファイル &#34; が開かれるドロップ ダウン メニューから、&#34; バッチ &#34; ウィンドウ</li>。
		<li>で、&#34; バッチ &#34; ウィンドウ、クリックして、&#34; 追加バッチ &#34; ボタンを開いて、&#34; バッチを定義 &#34; ウィンドウ</li>。
		<li>で、&#34; バッチを定義 &#34; ウィンドウ、クリックして、&#34; ファイルの追加 &#34; ボタンし raw イメージ ファイルを選択し、[、&#34; テンプレート &#34; 適切なデータ分析テンプレート ファイルを選択し、選択ボタンをクリックして &#34; [ok] &#34; と &#34; 送信バッチ &#34;raw 画像ファイルの処理、分析を開始します</li>。
	</ol></li></ol> 4。プラーク配列分析による評価の脂質低下薬コレステロール粒子の精製及ぼす <ol><li>ステップ 2.1 で説明したよう実行精製 VLDL、LDL、HDL リポタンパク質/粒子を用いたコレステロール粒子形成アッセイ。96 ウェル プレートでプラークの配列分析を実行します。
	<ol><li>、PBS のすべての井戸を読み込む; 各ウェルに 200 μ L の最終巻を使用します</li>。
	</ol></li> <li>ネガティブ コントロール追加 4 μ g VLDL、LDL、または HDL 蛋白質/粒子個別に薬なしもし、30 の板を振る s.
	<ol><li>の脂質低下薬の効果を調べると、4 μ g VLDL、LDL を追加または HDL 蛋白質/粒子それぞれ個別にも、30 の板を振る s.</li>
		<li>井戸 4 μ g VLDL や LDL、HDL で追加した、2.5 μ L (5 μ) エゼチミブ、ロバスタチン、シンバスタチン、またはナイアシン ソリューションを追加し、30 の板を振る化学アナライザー-1 に置くことで s.</li>
		<li>最後に、すべてのウェルに 2 μ L (2 μ g) 蛍光標識コレステロール集計ソリューションを追加し、30 の板を振る化学アナライザー 1 リアクション プレート上に置くことによって s.</li>
	</ol></li> <li>37 ° C、200 rpm で設定ラボ シェーカーで 2 h のプレートをインキュベートします</li>。
	<li>次のステップ 3.1 から 3.5 イメージング フローサイトメトリーを使用してサンプルを取得します</li>。
	<li>3.7 の手順で説明されているように画像解析ソフトを使用して raw イメージ ファイルを分析します</li>。
	<li>解析テンプレートでコレステロール粒子集団の同定のため以下のゲーティング スキームを使用します。
	<ol><li>飽和緑チャンネル ピクセル数 (x 軸) と暗視野のチャネルのプロット上飽和画素数 (y 軸)、いずれかのチャネルで 1 つ以上の飽和ピクセル オブジェクトは拒否します</li>。
		<li>飽和ピクセル グリーン チャンネルの強度 (x 軸) と SSC 強度 (y 軸) を使用してせずにオブジェクト/粒子を印刷: オブジェクト、緑のチャネルと SSC 強度に基づいて 3 つの地域 (VLDL、LDL、HDL) のいずれかに分類できます 。
		注: これらのゲートは、蛋白質を使用して精製された VLDL、LDL、HDL 粒子/薬がなければ実施制御実験から生成されたデータに基づいて作成されました</li>。
	</ol></li> <li>各サンプルの脂質低下薬の効果を判断するに記載されている手順 6.5 として総リポ蛋白粒子濃度だけでなく、各サブポピュレーション (VLDL、LDL、HDL) の比率を計算します。
	<ol><li>計算粒子濃度 (粒子/mL) 次の同等化を使用して: <img alt="Equation"src="/files/ftp_upload/56596/56596eq1.jpg"/> 注:、VLDL、LDL、および HDL ゲート蛍光ドット プロット領域検出 〜彼らのそれぞれ球と残りの 80% 〜 粒子の 20% が他ゲート領域とオーバー ラップします</li>。
	</ol></li></ol> 5。血清脂質濃度の測定 <ol><li>化学アナライザー - 2 LDL、HDL、コレステロールおよびトリグリセリドの濃度を決定する、年齢をマッチさせたノーマルと高脂血症被験者から得られた血清を使用します</li>。
	<li>LDL、HDL、コレステロールおよびトリグリセリドの濃度と血清で上限と下限の基準値を超えて識別の異常な濃度を定義します</li>。
	<li>に従って通常の参照値あded 試薬製造元によって: コレステロール (4 200 mg/dL)、HDL (3.0 65 mg/dL)、(4-100 mg/dL)、LDL およびトリグリセリド (9-200 mg/dL).</li>
	<li>血清脂質低下薬の有無のスクリーニングのためにそれらを使用コレステロールとトリグリセリドの値より低い基準値以下またはより高い参照の上と異常値を持つ識別します</li>。
</ol> 6。血清中コレステロール粒子形成に対する薬物の効果を分析 <ol><li>使用化学アナライザー-1 血清中コレステロール粒子形成のプラークアッセイ配列を設定します。丸底、低蛋白結合 96 ウェル プレートでアッセイを実行します。200 μ L/ウェルの最終反応量を使用し、3 通すべてのアッセイを実行します</li>。
	<li>試薬を段階的に読み込むことによって板を準備する。
	<ol><li>コントロール井戸を準備します</li>。
		<li>ロード 193 μ L の PBS を各ウェル</li>。
		<li>2.5% (v/v) 患者血清 (ウェルあたり 1 つだけ血清サンプル) を追加し、30 の板を振る化学アナライザー リアクション プレート上に置くことによって s.</li>
		<li>蛍光標識コレステロールの追加 2 μ L (2 μ g) を各ウェルにソリューションを集約し、30 の板を振る化学アナライザー 1 リアクション プレート上に置くことによって s.</li>
	</ol></li> <li>薬井戸の準備します。
	<ol><li>ロード 191 μ L の PBS を各ウェル</li>。
		<li>2.5% (v/v) 患者血清 (ウェルあたり 1 つだけ血清サンプル) を追加し、30 の板を振る化学アナライザー 1 リアクション プレート上に置くことによって s.</li>
		<li>追加 2 μ L エゼチミブ、ロバスタチン、シンバスタチンまたはナイアシン ソリューション (4 μ g) すべてのウェルには、陰性対照の井戸を除きます。ウェルあたり 1 つだけ薬を追加し、30 の板を振る化学アナライザー 1 リアクション プレート上に置くことによって s.</li>
		<li>蛍光標識コレステロールの追加 2 μ L を各ウェルにソリューション (2 μ g) を集約し、30 の板を振る化学アナライザー 1 リアクション プレート上に置くことによって s.</li>
	</ol></li> <li>すべての井戸の後にのみ薬剤を読み込む (制御および薬物治療)、それぞれ血清サンプルを装填しているし、このステップの終わりに蛍光標識のコレステロールを追加</li>。
	<li>37 ° C、200 rpm で設定ラボ シェーカーで 2 h のプレートをインキュベートします</li>。
	<li>流れの cytometer 次の手順 3.1 3.6 で説明する設定をイメージングによるサンプルを取得します</li>。
	<li>バッチ 3.7 の手順で説明されているように同じテンプレートを使用してすべてのイメージ ファイルを処理のためのソフトウェアの分析画像を使用します。
	<ol><li>4.5 および 4.6 の手順の説明に従って、プロット上ゲートを描画することによってデータの分析を実行します</li>。
	</ol></li> <li>応答を判断する脂質低下薬効果/(低、中、高) の各サンプルに対して、総リポ蛋白粒子濃度だけでなく、HDL、LDL、VLDL を構成する全粒子の割合を計算します。subpopulations</li>。
	<li>プロット オブジェクトのヒストグラムを HDL、LDL、VLDL の集団 &#39; s 明視野像、球状または線形領域の長さ (長さ・幅) とゲートから減算の幅: (長さ・幅) を持つオブジェクト &#8804; に陥る 2 μ m、球状のおよび線形の割合を計算するための球状領域形粒子</li>。
	<li>は、球状と線形形 LDL および HDL コレステロール粒子孵化各薬剤の有無にかかわらず各血清サンプルの特定の割合を比較します。各血清サンプルで得られた値を帳票、間で球状と線形の割合形薬の効果の定量 SD ± 2 の範囲内にある LDL および HDL の粒子を受け入れる</li>。
</ol>

<ol>
	<li>Pahan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-lowering+drugs.">Lipid-lowering drugs.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 1165-1178 (2006).</li><li>Laforest, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+low+high-density+lipoprotein+cholesterol+and+hypertriglyceridaemia+in+patients+treated+with+hypolipidaemic+drugs.">Prevalence of low high-density lipoprotein cholesterol and hypertriglyceridaemia in patients treated with hypolipidaemic drugs.</a> Arch Cardiovasc Dis. 102, 43-50 (2009).</li><li>Roberts, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+and+arresting+coronary+atherosclerosis.">Preventing and arresting coronary atherosclerosis.</a> Am Heart J. 130, 580-600 (1995).</li><li>Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+cholesterol+and+coronaries:+from+plaques+to+genes+to+statins.">A century of cholesterol and coronaries: from plaques to genes to statins.</a> Cell. 16, 161-172 (2015).</li><li>Drexel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins,+fibrates,+nicotinic+acid,+cholesterol+absorption+inhibitors,+anion-exchange+resins,+omega-3+fatty+acids:+which+drugs+for+which+patients?.">Statins, fibrates, nicotinic acid, cholesterol absorption inhibitors, anion-exchange resins, omega-3 fatty acids: which drugs for which patients?.</a> Fundam Clin Pharmacol. 23, 687-692 (2009).</li><li>Camelia, S., Anca, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins:+Mechanism+of+action+and+effects.">Statins: Mechanism of action and effects.</a> J.Cell.Mol.Med. 5, 378-387 (2001).</li><li>Schaefer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+effects+of+statins+(atorvastatin,+fluvastatin,+lovastatin,+pravastatin,+and+simvastatin)+on+fasting+and+postprandial+lipoproteins+in+patients+with+coronary+heart+disease+versus+control+subjects.">Comparisons of effects of statins (atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, and simvastatin) on fasting and postprandial lipoproteins in patients with coronary heart disease versus control subjects.</a> Am J Cardiol. 93, 31-39 (2004).</li><li>Meyers, C. D., Kamanna, V. S., Kashyap, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niacin+therapy+in+atherosclerosis.">Niacin therapy in atherosclerosis.</a> Curr Opin in Lipid. 15, 659-665 (2004).</li><li>Phan, B. A., Dayspringm, T. D., Toth, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ezetimibe+therapy:+mechanism+of+action+and+clinical+update.">Ezetimibe therapy: mechanism of action and clinical update.</a> Vasc Health Risk Mana. 8, 415-427 (2012).</li><li>Leitersdorf, E., Fruchart, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+action+of+fibrates+on+lipid+and+lipoprotein+metabolism.">Mechanism of action of fibrates on lipid and lipoprotein metabolism.</a> Circulation. 98, 2088-2093 (1998).</li><li>Backes, J., Anzalone, D., Hilleman, D., Catini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+relevance+of+omega-3+fatty+acids+in+the+management+of+hypertriglyceridemia.">The clinical relevance of omega-3 fatty acids in the management of hypertriglyceridemia.</a> Lipids Health Dis. 15, 118 (2016).</li><li>Davidson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Significance+of+Statin+Pleiotropic+Effects+Hypotheses+Versus+Evidence.">Clinical Significance of Statin Pleiotropic Effects Hypotheses Versus Evidence.</a> Circulation. 111, 2280-2281 (2005).</li><li>Chinetti-Gbaguidi, G., Fruchart, J. C., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+effects+of+fibrates.">Pleiotropic effects of fibrates.</a> Curr Atheroscler Rep. 7, 396-401 (2005).</li><li>McTaggart, F., Jones, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Statins+on+High-Density+Lipoproteins:+A+Potential+Contribution+to+Cardiovascular+Benefit+Effects+of+Statins+on+High-Density+Lipoproteins:+A+Potential+Contribution+to+Cardiovascular+Benefit.">Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit.</a> CardiovascDrugs Ther. 22, 321-338 (2008).</li><li>Quehenberger, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Plasma+Lipidome.">The Human Plasma Lipidome.</a> N Engl J Med. 365, 1812-1823 (2011).</li><li>Lund-Katz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+responsible+for+the+compositional+heterogeneity+of+nascent+high+density+lipoprotein.">Mechanisms responsible for the compositional heterogeneity of nascent high density lipoprotein.</a> J. Biol Chem. 288, 23150-23160 (2013).</li><li>Krauss, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+subfractions+and+cardiovascular+disease+risk.">Lipoprotein subfractions and cardiovascular disease risk.</a> Curr Opin Lipidol. 21, 305-311 (2010).</li><li>Krauss, R. M., Burke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+subclasses+of+plasma+low+density+lipoproteins+in+normal+humans.">Identification of multiple subclasses of plasma low density lipoproteins in normal humans.</a> J Lipid Res. 23, 97-104 (1982).</li><li>Rosenson, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+measures,+particle+heterogeneity,+proposed+nomenclature,+and+relation+to+atherosclerotic+cardiovascular+Events.">HDL measures, particle heterogeneity, proposed nomenclature, and relation to atherosclerotic cardiovascular Events.</a> Clinic Chemi. 57, 392-410 (2011).</li><li>Madasamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+array+method+and+proteomics-based+identification+of+biomarkers+from+Alzheimer's+disease+serum.">Plaque array method and proteomics-based identification of biomarkers from Alzheimer's disease serum.</a> Clin Chim Acta. 441, 79-85 (2015).</li><li>Madasamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonenzymatic+Mechanism+of+Statins+in+Modulating+Cholesterol+Particles+Formation.">Nonenzymatic Mechanism of Statins in Modulating Cholesterol Particles Formation.</a> Am J Cardiol. 118, 1187-1191 (2016).</li><li>Peter, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+the+biochemical,+metabolic,+and+genetic+factors+that+influence+low-density+lipoprotein+heterogeneity.">Clinical relevance of the biochemical, metabolic, and genetic factors that influence low-density lipoprotein heterogeneity.</a> Am J Cardiol. 90, 30-47 (2002).</li><li>Weissglas-Volkov, D., Pajukanta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+causes+of+high+and+low+serum+HDL-cholesterol.">Genetic causes of high and low serum HDL-cholesterol.</a> J Lipid Res. 51, 2032-2057 (2010).</li><li>Abela, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+statins+on+cholesterol+crystallization+and+atherosclerotic+plaque+stabilization.">Effect of statins on cholesterol crystallization and atherosclerotic plaque stabilization.</a> Am J Cardiol. 107, 1710-1717 (2011).</li><li>Nidorf, S. M., Eikelboom, J. W., Thompson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cholesterol+crystal-induced+inflammation+for+the+secondary+prevention+of+cardiovascular+disease.">Targeting cholesterol crystal-induced inflammation for the secondary prevention of cardiovascular disease.</a> Cardiovasc Pharmacol Ther. 19, 45-52 (2014).</li><li>Thacker, S. G., Zarzour, A., Chen, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+density+lipoprotein+reduces+inflammation+from+cholesterol+crystals+by+inhibiting+inflammasome+activation.">High density lipoprotein reduces inflammation from cholesterol crystals by inhibiting inflammasome activation.</a> Immunol. 149, 306-319 (2016).</li><li>Kim, S. H., Lee, E. S., Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+coherent+anti-stokes+Raman+Spectroscopy+images+intact+atheromatous+lesions+and+concomitantly+identifies+distinct+chemical+profiles+of+atherosclerotic+lipids.">Multiplex coherent anti-stokes Raman Spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids.</a> Circ Res. 106, 1332-1341 (2010).</li><li>Lim, R. S., Suhalim, J. L., Miyazaki-Anzai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cholesterol+crystals+in+plaques+of+atherosclerotic+mice+using+hyperspectral+CARS+imaging.">Identification of cholesterol crystals in plaques of atherosclerotic mice using hyperspectral CARS imaging.</a> J Lipid Res. 52, 2177-2186 (2011).</li><li>Rothblat, G. H., Phillips, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+lipoprotein+heterogeneity+and+function+in+reverse+cholesterol+transport.">High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport.</a> Curr Opin Lipidol. 21, 229-238 (2011).</li><li>Kontush, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+particle+number+and+size+as+predictors+of+cardiovascular+disease.">HDL particle number and size as predictors of cardiovascular disease.</a> Front in Pharmacol. , (2015).</li><li>Karathanasis, S. K., Freeman, L. A., Gordon, S. M., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+face+of+HDL+and+the+best+way+to+measure+it.">The changing face of HDL and the best way to measure it.</a> Clin. Chem. 63, 196-210 (2017).</li></ol>

博士 Madasamy Plaxgen 株式会社から助成を受けたし、競合する金融関心を持っています。他の著者は開示する競合金融興味を持ってないです。

一般に、分布と血液の循環、HDL、LDL、VLDL のコレステロール粒子の機能特性主に代謝、遺伝的、疫学的、携帯と血漿因子22,23によって決定されます。本研究では脂質の変更の影響を調べるバッファー内薬エゼチミブ、ロバスタチンとシンバスタチン、アトルバスタチンなど高脂溶性薬物がコレステロール粒子の形態により高いレベルの複雑さを誘発を明らかにしました。超親水性のロスバスタチン、フルバスタチンの薬で観測された低レベルの効果と比較。これらの結果は、良い契約、バッファーおよび血清サンプル21で LDL と HDL のコレステロール粒子形成を調節する際にスタチン系薬剤の非酵素的方式の効果を説明する私たちの以前の研究でしたがって、本研究の結果は、非酵素的エゼチミブ、fibrate、ナイアシン、コレステロール粒子形成を調節することに直接的な役割を果たす可能性がありますオメガ 3 脂肪酸薬の作用機構を明らかにしました。薬とコレステロール骨材間の相互作用が球状と線形鎖の形態を示す 2-60 μ m2、大型コレステロール粒子のアセンブリをもたらすことが可能です。
精製されたリポ蛋白粒子を使用して得られた結果がコレステロール集計および組成とコレステロールの形態学的性質を変更することが HDL、LDL、VLDL の蛋白質を含むプラズマの要因間の相互作用を提案するほか、粒子。精製リポ蛋白粒子を含む薬物治療の結果には、VLDL 粒子形成に比べて LDL コレステロール粒子形成で観察された効果の高いレベルの薬の効果が示されます。ロバスタチンとシンバスタチン、エゼチミブの薬はプロ薬として使用され、その投与法が生理学的濃度を上回る可能性があります。
興味深いことに、HDL、LDL、VLDL コレステロール粒子形成のプロファイルを変更することで薬の効果の変化を示した血清試料のスクリーニング、線形の形成に及ぼす影響特に LDL および HDL の粒子の形。これらの薬剤は、高脂血症と年齢をマッチさせた正常血清 LDL および HDL のコレステロール粒子形成形線形減少を誘発しました。シンバスタチン、エゼチミブ、ロバスタチン、およびナイアシンの線形形粒子の形成を減らすことで薬の効果が高かった。球状と線形鎖形態通常と高脂血症の血清コレステロール粒子の同定を示唆と同様の形態を有する粒子が生体内での条件のフォームがあります。以前の研究は、ディスクと針のようなコレステロール結晶を来す-/-マウス モデル24,25,26 とアポ-/- 、人間の動脈硬化性プラークの存在を識別しました。、27,28。
血で循環する HDL 粒子存在異種混合物および機能活動と共に小規模および大規模サイズ HDL 粒子のレベルが逆のコレステロールの輸送を介して自分の心臓保護効果を発揮する重要な要因として経路29,30。最近の研究は識別する HDL コレステロール粒子亜分画31 コレステロール排出、抗炎症、抗血栓、抗酸化などの複数の生物学的機能における役割を解明するための重要性を強調しています。.さらに、多くの研究は、昇順にプラズマ1,5,21の HDL のレベルを中程度に低脂質低下療法の効果を報告しています。したがって、本研究の結果は、コレステロール粒子の形態学的特徴に新たな洞察を提供します。特に、高脂血症被験者の血清試料中の線形形 HDL コレステロール粒子のより高いレベルの検出は診断と脂質修飾の影響評価のための信頼性の高いバイオ マーカーこと示唆している患者における薬。しかし、さらに調査が必要なコレステロール粒子の形態と CVD への関連付けを理解する大きな臨床サンプルを用いたします。
プラークアッセイ配列コレステロール粒子のアセンブリに薬の効果を調べるため、我々 使用蛍光ためコレステロール集計と 5 µgof の医薬品をラベルのの 2 μ g: (1) 薬は競争力のある両方の蛍光コレステロールをラベルにバインドと内因性脂質血清サンプル中に存在(大きいサイズと 2 〜 60 μ2に至る形状にまとめられる 5,000、10,000 コレステロール粒子を取得しました 2)、各サンプルから(麻薬 (5 μ g に投与量 300 ng) と高用量コレステロール粒子形成のプロファイルに検出可能な変化は見られなかったと孵化させるそれらの 1 ~ 5%, 血清サンプル中の薬剤応答のワイド バリエーションを観察 3)(4) コレステロール集計と脂質低下薬の相互作用は、非酵素的反応により媒介されます。それ故に、アッセイに使用する試薬の濃度は生理的レベルよりも高い可能性があります。
結論としては、体外イメージング法のコレステロールの形態と組成を調節することで幅広い脂質低下薬の効果を決定するため、この研究で説明した利点を正常に示しました。粒子。可視化と画像解析アルゴリズムの星座を用いた脂質粒子の形態の定量化の方法は、アテローム性動脈硬化と脂質低下療法の成果を評価する両方の診断を助けるかもしれない。

多数の臨床試験は、高密度リポタンパク質 (HDL) コレステロールの増加の中程度のレベルに低密度リポタンパク質 (LDL) コレステロールおよび低の血漿中濃度を減らすことで脂質低下薬の有益な効果を示しているがアテローム性動脈硬化関連心血管イベント1,2,3,4、5のプライマリとセカンダリの両方の発生を防ぎます。Hmg-coa 還元酵素阻害剤のスタチン系薬剤は、内因性コレステロール血6,7で LDL コレステロールのレベルを循環下にリードを回すで肝臓で合成をブロックします。同様に、ナイアシンの効果を低くしている脂質はトリグリセリド合成8に関与する肝酵素アシル 2 ジアシルグリセ ロール肝細胞の直接的および非競合的阻害によって媒介されます。比較的、エゼチミブは9小腸の上皮細胞にあるニーマン ・ ピック C1-Like 1 (NPC1L1) 蛋白質による外因性コレステロールの吸収を制限することによって血漿 LDL のレベルを低減します。フェノフィブラート、別の脂質低下薬トリグリセリドの血中濃度を大幅に低減、また適度ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体経路10LDL コレステロールを減少させます。以外にも、オメガ 3 脂肪酸は、LDL11の血漿中濃度を下げることにより抗動脈硬化の効果があると報告されます。
LDL コレステロールを下げることで、主な効果に加え、脂質低下薬がある HDL レベルを向上、血管内皮機能を改善、炎症を減らす血小板を抑制など多面的効果の数集計12,13,14。ただし、HDL コレステロール粒子の増加とその構造的特徴を変更のこれらの薬剤の基になるメカニズムは完全には理解されていません。以来、これらの薬が心血管疾患のアテローム性動脈硬化関連 (スッテパー) の治療に広く処方されて、さらに形態学的特徴および脂質粒子の分布の決定の役割を調べることが不可欠です。約 600 の脂質および分子 22 種類、様々 なサイズ、形状、密度、および組成15,16,17 に存在するコレステロールの成っているひと血漿 lipidome.超遠心分離、NMR、勾配ゲル電気泳動法などの分析手法は、LDL と HDL の粒子との亜分画18,19を特徴付けるに使用されます。ただし、これらのメソッドのアプリケーションは形態および脂質粒子のアセンブリを調節することで薬の効果を決定するを目的とした研究に限定されます。流れの cytometer ベース プラーク配列は機能生化学アッセイ開発の検出、血清の可視化派生脂質およびアミロイドのプラク粒子20。体外イメージング研究ではこの説明法の利点は、バッファーと血清試料中のコレステロール粒子の形態と分布を変えることで薬剤の効果を脂質変調の識別を有効にします。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>TopFluor fluorescent cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>simvastatin (pro-drug)</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lovastatin (pro-drug)</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rosuvastatin</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>atorvastatin</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluvastatin</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ezetimibe (pro-drug)</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fibrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>omega-3 fatty acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td></td>
			<td>store 100 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified VLDL proteins/particles</td>
			<td>Lee Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified LDL proteins/particles</td>
			<td>Lee Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified HDL proteins/particles</td>
			<td>Lee Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human age-matched serum</td>
			<td>Dx Biosamples</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human atherosclerosis serum</td>
			<td>Bioserve</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human normal serum</td>
			<td>Stanford Blood center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDL measurement reagent pack</td>
			<td>Roche Diangostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDL measurement reagent pack</td>
			<td>Roche Diangostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total cholesterol measurment</td>
			<td>Roche Diangostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtitre plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triglycerides measrument</td>
			<td>Roche Diangostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amnis Imaging Flow cytometer</td>
			<td>Amnis Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEAS image analysing software</td>
			<td>Amnis Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902</td>
			<td>Awarness Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemistry Analyzer-2, Intergra 400</td>
			<td>Roche Diangostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differential effects of lipid-lowering drugs in modulating morphology of cholesterol particles

脂質低下薬高脂血症患者の治療は、低密度リポタンパク質 (LDL) レベルとプラズマの高密度リポタンパク質 (HDL) コレステロールの増加の中程度のレベルに低の大幅な削減につながります。ただし、コレステロール粒子の形態と分布を変えることでこれらの薬の役割はよくわかっていません。ここでは、cytometry 流れのイメージングとの組み合わせでプラークの配列法を用いたコレステロール粒子の形態学的特徴を調節することで脂質低下薬の効果の in vitro評価について述べる.ロスバスタチン、フルバスタチン、fibrates ナイアシンを誘導するのに対し、ロバスタチン、シンバスタチンとエゼチミブ、アトルバスタチンは、球状と線形鎖状粒子の形成を誘導すること示されたコレステロール粒子画像解析、唯一球形状粒子の形成。次、非常に精製された低密度リポタンパク質 (VLDL) とこれらの薬剤を添加して LDL 粒子は粒子集団のコレステロールの形態とイメージのテクスチャの変化を示した。さらに、50 の血清試料のスクリーニングは、高脂血症 (18.3% 平均) 年齢をマッチさせた正常 (平均 11.1% の) サンプルと比較して患者の線形形 HDL コレステロール粒子のより高いレベルの存在を明らかにしました。また血清中の LDL および HDL のコレステロール粒子形成形の線形を減らすことに脂質低下薬の効果にばらつきが観測されました。これらの調査結果を示す細胞による脂質代謝改善効果、脂質低下薬が非酵素作用機序によってコレステロール粒子の形態を変調直接。これらの結果の成果には、動脈硬化の診断に通知し最適な脂質低下療法を予測する可能性があります。

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コレステロール粒子の形態調節における脂質低下薬の異なる効果 | 文献情報 | J-GLOBAL 科学技術総合リンクセンター医学 |ビデオ

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

コレステロール粒子の形態を調節することで脂質低下薬の効果

本研究の目的は、コレステロール粒子の形態を調節することで脂質を低下させる生体外で薬剤効果を評価することでした。脂質低下薬の比較では、コレステロール粒子の形態学的特徴を調節することでその効果の変化を明らかにしました。

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

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14.5K ビュー.  Plaxgen Inc. 本研究の目的は、コレステロール粒子の形態を調節することで脂質を低下させる生体外で薬剤効果を評価することでした。脂質低下薬の比較では、コレステロール粒子の形態学的特徴を調節することでその効果の変化を明らかにしました。

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Cholesterol Efflux Assay

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of cellular membranes, apoptosis and necrosis 1. Cells can source cholesterol from intracellular synthesis and from plasma lipoproteins, both sources are sufficient to fully satisfy cells' requirements for cholesterol. The processes of cholesterol synthesis and uptake are tightly regulated and deficiencies of cholesterol are rare 2. Excessive cholesterol is more common problem 3. With the exception of hepatocytes and to some degree adrenocortical cells, cells are unable to degrade cholesterol. Cells have two options to reduce their cholesterol content: to convert cholesterol into cholesteryl esters, an option with limited capacity as overloading cells with cholesteryl esters is also toxic, and cholesterol efflux, an option with potentially unlimited capacity. Cholesterol efflux is a specific process that is regulated by a number of intracellular transporters, such as ATP binding cassette transporter proteins A1 (ABCA1) and G1 (ABCG1) and scavenger receptor type B1. The natural acceptor of cholesterol in plasma is high density lipoprotein (HDL) and apolipoprotein A-I. 
The cholesterol efflux assay is designed to quantitate the rate of cholesterol efflux from cultured cells. It measures the capacity of cells to maintain cholesterol efflux and/or the capacity of plasma acceptors to accept cholesterol released from cells. The assay consists of the following steps. Step 1: labelling cellular cholesterol by adding labelled cholesterol to serum-containing medium and incubating with cells for 24-48 h. This step may be combined with loading of cells with cholesterol. Step 2: incubation of cells in serum-free medium to equilibrate labelled cholesterol among all intracellular cholesterol pools. This stage may be combined with activation of cellular cholesterol transporters. Step 3: incubation of cells with extracellular acceptor and quantitation of movement of labelled cholesterol from cells to the acceptor. If cholesterol precursors were used to label newly synthesized cholesterol, a fourth step, purification of cholesterol, may be required.
The assay delivers the following information: (i) how a particular treatment (a mutation, a knock-down, an overexpression or a treatment) affects the capacity of cell to efflux cholesterol and (ii) how the capacity of plasma acceptors to accept cholesterol is affected by a disease or a treatment. This method is often used in context of cardiovascular research, metabolic and neurodegenerative disorders, infectious and reproductive diseases.

The cholesterol assay is designed to quantitate the rate of cholesterol efflux from cultured cells and the capacity of plasma acceptors to accept cholesterol released from cells. The assay consists of labelling cells with cholesterol, equilibration of cholesterol among intracellular pools and release of cholesterol to an extracellular acceptor.

コレステロール流出アッセイ

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of ...

医学

A Methodological Approach to Non-invasive Assessments of Vascular Function and Morphology

The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis. Damage to the endothelium may predispose the vessel to atherosclerosis and increase the risk for cardiovascular disease. Assessments of peripheral endothelial function are good indicators of early abnormalities in the vascular wall and correlate well with assessments of coronary endothelial function. The present manuscript details the important methodological steps necessary for the assessment of microvascular endothelial function using laser Doppler imaging with iontophoresis, large vessel endothelial function using flow-mediated dilatation, and carotid atherosclerosis using carotid artery ultrasound. A discussion on the methodological considerations for each of the techniques is also presented, and recommendations are made for future research.

The present article describes the methodological considerations for several non-invasive assessments of vascular function and morphology that are commonly used in medical research to assess different stages of atherosclerosis.

血管機能と形態の非侵襲的なアセスメントに方法論的アプローチ

The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis.  Damage to the endothelium may ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor invasion into surrounding brain parenchyma represents an enduring therapeutic challenge. To develop anti-migration therapies for GBM, model systems that provide a physiologically relevant background for controlled experimentation are essential. Here, we present a protocol for generating slice cultures from human GBM tissue obtained during surgical resection. These cultures allow for ex vivo experimentation without passaging through animal xenografts or single cell cultures. Further, we describe the use of time-lapse laser scanning confocal microscopy in conjunction with cell tracking to quantitatively study the migratory behavior of tumor cells and associated response to therapeutics. Slices are reproducibly generated within 90 min of surgical tissue acquisition. Retrovirally-mediated fluorescent cell labeling, confocal imaging, and tumor cell migration analyses are subsequently completed within two weeks of culture. We have successfully used these slice cultures to uncover genetic factors associated with increased migratory behavior in human GBM. Further, we have validated the model&#39;s ability to detect patient-specific variation in response to anti-migration therapies. Moving forward, human GBM slice cultures are an attractive platform for rapid ex vivo assessment of tumor sensitivity to therapeutic agents, in order to advance personalized neuro-oncologic therapy.

Current ex vivo models of glioblastoma (GBM) are not optimized for physiologically relevant study of human tumor invasion. Here, we present a protocol for generation and maintenance of organotypic slice cultures from fresh human GBM tissue. A description of time-lapse microscopy and quantitative cell migration analysis techniques is provided.

腫瘍細胞移動の研究および抗浸潤性薬物の患者特異的効果の研究のためのヒト神経膠芽腫の器官型スライス培養モデル

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key element is the quantitative determination of a tumor-specific genetic alteration in relation to a universal sequence using a dual-probe digital PCR assay and the subsequent calculation of the proportion of tumor cells. The assay is carried out on a culture containing tumor cells of an established line and spiked-in non-tumor cells. The mixed culture is treated with a test drug at various concentrations. After the treatment, DNA is prepared directly from the survived adhesive cells in wells of 96-well plates using a simple and inexpensive method, and subjected to a dual-probe digital PCR assay for measuring a tumor-specific genetic alteration and a reference universal sequence. In the present demonstration, a heterozygous deletion of the NF1 gene is used as the tumor-specific genetic alteration and a RPP30 gene as the reference gene. Using the ratio NF1/RPP30, the proportion of tumor cells was calculated. Since the dose-dependent change of the proportion of tumor cells provides an in vitro indication for specificity of the drug, this genetic and cell-based in vitro assay will likely have application potential in drug discovery. Furthermore, for personalized cancer-care, this genetic- and cell-based tool may contribute to optimizing adjuvant chemotherapy by means of testing efficacy and specificity of candidate drugs using primary cultures of individual tumors.

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

The goal of this protocol is to assess specificity of anticancer drugs in vitro using mixed cultures containing both tumor and non-tumor cells.

抗がん剤の特異性を評価します<em&gt;インビトロ</em

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

Use of Rabbit Eyes in Pharmacokinetic Studies of Intraocular Drugs

The intraocular route of drug administration enables the delivery of high concentrations of therapeutic drugs, while minimizing their systemic absorption. Several drugs are administered into the anterior chamber or vitreous, and the intraocular injection has been effective in curing various intraocular diseases. Rabbit eyes have been widely used for ophthalmic research, as the animal is easy to handle and economical compared to other mammals, and the size of a rabbit eye is similar to that of a human eye. Using a 30 G needle, drugs can be injected into the intracameral and intravitreal spaces of rabbit eyes. The eyeballs are then frozen until analysis, and can be divided into the aqueous humor, vitreous, and retina/choroid. The vitreous and retina/choroid samples can be homogenized and solubilized before analysis. Then, immunoassays can be performed to measure the concentrations of intraocular drugs in each compartment. Appropriate pharmacokinetic models can be used to calculate several parameters, such as the half-life and maximum concentration of the drug. Rabbit eyes can be a good model for pharmacokinetic studies of intraocular drugs.

Rabbits are widely used to study the pharmacokinetics of intraocular drugs. We describe a method for conducting pharmacokinetic studies of intraocular drugs using rabbit eyes.

眼薬の薬物動態試験でウサギの眼の使用

The intraocular route of drug administration enables the delivery of high concentrations of therapeutic drugs, while minimizing their systemic absorption. ...

Echocardiographic and Histological Examination of Cardiac Morphology in the Mouse

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed in mice is high. Phenotypic characterization of these mouse models also requires the examination of cardiac function and morphology. Echocardiography and magnetic resonance imaging (MRI) are commonly used approaches to characterize cardiac function and morphology in mice. Echocardiographic and MRI equipment specialized for use in small rodents is&#160;expensive and requires a dedicated space. This protocol describes cardiac measurements in mice using a clinical echocardiographic system with a 15 MHz human vascular probe. Measurements are performed on anesthetized adult mice. At least three image sequences are recorded and analyzed for each animal in M-mode in the parasternal short-axis view. Afterwards, cardiac histological examination is performed, and cardiomyocyte diameters are determined on hematoxylin-eosin- or wheat germ agglutinin (WGA)-stained paraffin sections. Vessel density is determined morphometrically after Pecam-1 immunostaining. The protocol has been applied successfully to pharmacological studies and different genetic animal models under baseline conditions, as well as after experimental myocardial infarction by the permanent ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD). In our experience, echocardiographic investigation is limited to anesthetized animals and is feasible in adult mice weighing at least 25 g.

Echocardiographic examination is frequently used in mice. Expensive high-resolution ultrasound devices have been developed for this purpose. This protocol describes an affordable echocardiographic procedure combined with histological morphometric analyses to determine cardiac morphology.

マウスの心臓形態の心エコー検査・組織学的検討

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed ...

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of myosin heavy chain (MyHC) isoforms has emerged as a finer discriminator of fiber-type. Type I, type IIA, type IIX and type IIB fibers can now be identified with precision based on their MyHC profile; however, manual analysis of these data can be slow and down-right tedious. In this regard, rapid, accurate assessment of fiber-type composition and morphology is a very desirable tool. Here, we present a protocol for state-of-the-art immunohistochemical staining of MyHCs in frozen sections obtained from mouse hindlimb muscle in concert with a novel semi-automated algorithm that accelerates analysis of fiber-type and fiber morphology. As expected, the soleus muscle displayed staining for type I and type IIA fibers, but not for type IIX or type IIB fibers. On the other hand, the tibialis anterior muscle was composed predominantly of type IIX and type IIB fibers, a small fraction of type IIA fibers and little or no type I fibers. Several image transformations were used to generate probability maps for the purpose of measuring different aspects of fiber morphology (i.e., cross-sectional area (CSA), maximal and minimal Feret diameter). The values obtained for these parameters were then compared with manually-obtained values. No significant differences were observed between either mode of analysis with regards to CSA, maximal or minimal Feret diameter (all p &#62; 0.05), indicating the accuracy of our method. Thus, our immunostaining analysis protocol may be applied to the investigation of effects on muscle composition in many models of aging and myopathy.

Immunohistochemical staining of myosin heavy chain isoforms has emerged as the state-of-the-art discriminator of skeletal muscle fiber-type (i.e., type I, type IIA, type IIX, type IIB). Here, we present a staining protocol along with a novel semi-automated algorithm that facilitates rapid assessment of fiber-type and fiber morphology.

マウス骨格筋形態と繊維の種類組成の半自動解析

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in atherosclerosis development. However, an important factor in early stages of atheroma plaque formation is cholesterol efflux capacity to HDL (the ability of HDL particles to accept cholesterol from macrophages) in order to avoid foam cell formation. This is a key step in avoiding the accumulation of cholesterol in the endothelium and a part of reverse cholesterol transport (RCT) to eliminate cholesterol through the liver. Cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool that can be used as biomarker for atherosclerosis. Traditionally, [3H]-cholesterol has been used in cholesterol efflux assays. In this study, we aim to develop a safer and faster strategy using fluorescent labelled-cholesterol (NBD-cholesterol) in a cellular assay to trace the cholesterol uptake and efflux process in THP-1-derived macrophages. Finally, we optimize and standardize the NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Measurement of in vitro cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool as a biomarker for atherosclerosis. In the present study, we optimize and standardize a fluorescent NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

高スループット Nitrobenzoxadiazole ラベル コレステロール排出アッセイ

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

Self-Administration of Drugs in Mouse Models of Feeding and Obesity

Preclinical studies in mice often rely on invasive protocols, such as injections or oral gavage, to deliver drugs. These stressful routes of administration have significant effects on important metabolic parameters including food intake and body weight. Although an attractive option to circumvent this is to compound the drug in rodent food or dissolve it in water, these approaches also have limitations as they are affected by drug stability at room temperature for extended periods of time, the drug's solubility in water, and that the dosing is highly dependent on timing of food or water intake. The constant availability of the drug also limits translational relevance on how drugs are administered to patients. To overcome these limitations, drugs can be mixed with highly palatable food, such as peanut butter, allowing mice to self-administer compounds. Mice reliably and reproducibly consume the drug/peanut butter pellet in a short time frame. This approach facilitates a delivery approach with minimal stress compared with an injection or gavage. This protocol demonstrates the approach of drug preparation, animal acclimatization to placebo delivery, and drug delivery. The implications of this approach are discussed in studies related to timing of drug administration and the circadian rhythm.

The overall goal of this procedure is to describe a method for self-administration of drugs that can be used in mouse models of feeding and obesity.

マウスにおける摂食と肥満モデルにおける薬物の自己投与

Preclinical studies in mice often rely on invasive protocols, such as injections or oral gavage, to deliver drugs. These stressful routes of ...

Rectal Organoid Morphology Analysis (ROMA): A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis

Diagnosis of cystic fibrosis (CF) is not always straightforward, especially when sweat chloride concentration is intermediate and/or less than two disease-causing CFTR mutations can be identified. Physiological CFTR assays (nasal potential difference, intestinal current measurement) have been included in the diagnostic algorithm but are not always readily available or feasible (e.g., in infants). Rectal organoids are 3D structures that grow from stem cells isolated from crypts of a rectal biopsy when cultured under specific conditions. Organoids from non-CF subjects have a round shape and a fluid-filled lumen, as CFTR-mediated chloride transport drives water into the lumen. Organoids with defective CFTR function do not swell, retaining an irregular shape and having no visible lumen. Differences in morphology between CF and non-CF organoids are quantified in the &#39;Rectal Organoid Morphology Analysis&#39; (ROMA) as a novel CFTR physiological assay. For the ROMA assay, organoids are plated in 96-well plates, stained with calcein, and imaged in a confocal microscope. Morphological differences are quantified using two indexes: The circularity index (CI) quantifies the roundness of organoids, and the intensity ratio (IR) is a measure of the presence of a central lumen. Non-CF organoids have a high CI and low IR compared to CF organoids. ROMA indexes perfectly discriminated 167 subjects with CF from 22 subjects without CF, making ROMA an appealing physiological CFTR assay to aid in CF diagnosis. Rectal biopsies can be routinely performed at all ages in most hospitals and tissue can be sent to a central lab for organoid culture and ROMA. In the future, ROMA might also be applied to test the efficacy of CFTR modulators in vitro. The aim of the present report is to fully explain the methods used for ROMA, to allow replication in other labs.

Rectal Organoid Morphology Analysis ROMA: A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis

This protocol describes rectal organoid morphology analysis (ROMA), a novel diagnostic assay for cystic fibrosis (CF). Morphological characteristics, namely the roundness (circularity index, CI) and the presence of a lumen (intensity ratio, IR), are a measure of CFTR function. Analysis of 189 subjects showed perfect discrimination between CF and non-CF.