この作品は、国立衛生研究所健康付与 R35 GM118177 PND によって支えられました。

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ここで説明する方法は、人口とせん断流れに対する個々 のセル動作の両方を評価するために便利な方法を提供しています。重要なは、以前の研究は、導くおよび移行中にエッジ マーカーをラギングの局在解析、現在のアプローチは鋭くせん断流を適用することによって即時の効果の調査をできます。このメソッドを使用して、実際には、せん断流れに細胞の初期応答必要がないこと細胞の移動を行った。代わりに、初期せん断流刺激に対する迅速かつ過渡応答せん断流れ、走化性因子のグラデーションを見て初期グローバル応答と同様に、長時間見られる方向の移行の前に。
各メソッドは異なる長所と短所を持っているにもかかわらず、生化学的およびミクロ的アプローチは補完的なデータを生成します。続いてセル換散、PKBs、KrsB、および、ERK のイムノブロット刺激はたとえば、菌の全人口を分析し、こうして個々 のセルの動作を検査するアッセイとは異なり、細胞間変動の平均値します。ただし、人口に基づく試金は個々 の細胞を分析することによって簡単に観察できる細胞行動の微妙な変化をマスクする傾向があります。さらに、ここで説明した生化学的アッセイのみ理由は後ほど集計有能なセルに有効です。対照的に、RBD、モデル、PH Crac、石灰ΔcoilPTEN の染色体の顕微鏡を用いた測定はたとえば、皮質と細胞質の間は栄養生長と集計有能な細胞の効果的なしたがっての観測が可能偏光の度合いと細胞に広く適用されます。異なるせん断流れの試金のテスト シグナル伝達とアクチン細胞骨格ネットワークのカバレッジを拡大使用可能なリード/遅れエッジ マーカーのセットを調査する事実である相補的な 2 つのアプローチを作るもの。
顕微鏡観察に基づく試金の非常にしっかり対応、栄養細胞がセル換散および続く刺激に応答しない理由は不明のまま。1 つの可能性は、せん断プレートが回転したときにセルに適用される量が流れ区域のセルによって経験される力を一致しないことです。開発した細胞は、対照的に、可能性があります活性化の下限しきい値を持つ、したがって、いずれかの条件の下で対応します。その活性の測定は生化学的な試金でバイオ センサーが表されないまたは葉酸栄養細胞の刺激 PKBR1/PKBA と ERK2 の堅牢な活性化につながるので、ない栄養細胞で活性化されてそうだ (データないです。図)。また、栄養細胞は顕微鏡を用いた測定で PH-クラック、PIP3 の蓄積を反映して、明確な募集を表示します。PKBA 募集 PIP3 にも依存しているので考えにくい PKBA が急性の機械的刺激に対する応答は生化学的な試金の条件が上記のように最適でない限り。これは活発な調査の区域のまま。
走化性調節物質の生化学的解析は実験を通してカフェインの存在を必要です。もともとカフェインがキャンプの分泌によるシグナル伝達細胞を防ぐために追加されました。ただし、カフェインは、アデニル酸シクラーゼ (ACA) の抑制以外にも別の役割 ACA null のセルはまだ応答の PKBR1 のリン酸化のためカフェインを必要なので急性の機械的刺激するようであります。カフェインは、以前 TorC2 活動26ブロックに示されています。TorC2 の抑制細胞のいくつかの基底の運動をブロックされ、従って PKBR1 の基底の活性化とシグナル伝達とアクチン細胞骨格ネットワークの他のコンポーネントを下げることは可能です。基底少ないせん断流れへの応答を観察するために不可欠だった。実際には、細胞は、開発中に以前の時点で収集された、彼らは基底活動の増加と減少せん断流応答を表示しました。興味深いことに、栄養細胞は比例してより多くの PKBA 活性を持つと比較すると少ない PKBR1 開発細胞31も知られています。生化学的な試金で栄養細胞の応答の欠如に貢献するさらに基底状態が栄養と集計有能なセルに幾分別様に規制されて可能です。不思議なことに、開発の後で、細胞を集めとき、減らされた応答、ローカリゼーションに極性の強い影響とこのアッセイで検討した様々 な走化性調節物質の活性化のため可能性がありますもいた。
顕微鏡室で細胞の刺激強度と刺激の持続時間が最大応答22に貢献することを明らかにしました。つまり、最大応答できますでも達成できる低剪断力それが時間の長時間にわたって適用される場合 (10 対 2 s s)。この観測は、なぜ細胞初期グローバル応答がある最初せん断流動誘起移行につながる継続的なしかし弱い刺激にさらされる場合について説明します。現在の装置の範囲の低い方の端のための十分に低いせん断流を生成することができませんでした。
おそらく、急性の機械的刺激による調査の最も重要な意義は、機械的、化学的刺激が共通のシグナル伝達と細胞骨格のアクチン ネットワークに供給する現れることです。今後の研究、走化性因子ははるかに汎用性になる流れをチャネルで急速に配信できるシステムを開発することを目指す、2 つの刺激を統合して機械的刺激のため一括バッファー追加を使用して示したが機械的、化学的刺激の統合を評価するために強力な方法です。残念ながら、現在 2 回線セットアップを使用して走化性因子の添加は、フローの存在下で配信されるように、走化性因子を持っているので 2 番目のせん断流れ刺激に関連付けられます。ヴェステンドルフらによってキャンプのため正常に示された代替ケージ前駆体から、走化性因子のレーザー刺激リリース可能性があります。32。 将来、それも興味深いだろうせん断流れと変数の電界やせん断流と可変基板剛性などの他の刺激の統合を検討します。後者の例はそれらの間初期の電波受信状態が異なる場合がありますがそれは機械的刺激の 2 つのタイプを含むので興味深いです。監督の遊走を誘導するすべての刺激が同じシグナル伝達ネットワークを共有し、異なるだけで刺激を知覚する方法を確認することは、細胞が複雑な環境で移動できる方法について説明します。最後に、我々 はすでにシアー流を含む急性刺激はひと好中球のような細胞22の広がりにつながることを実証しました。今後の作業はさらに哺乳類細胞における機械的刺激のシグナル伝達とアクチン細胞骨格ネットワークのさまざまなコンポーネントのローカライゼーションやアクティベーションを検討します。

真核細胞の移行は水溶性または基質結合塩基のグラデーション、基板、電気フィールド、またはせん断流の可変剛性を含む環境の多様な化学と物理の合図によってバイアスされています。走化性を運転する分子機構の理解に多くの進歩をされているが、以下は指示移行と統合を生成する細胞レベルでこれらの多様な信号を統合する方法の他の種類について知られている渡り鳥応答。
監督、走化性因子の集積が進む方向への移動には行動の 3 つのコンポーネントが含まれます: 運動方向検出、極性1。運動は、仮足突起により細胞のランダムな動きを指します。方向性、走化性因子の原因を検出する細胞の能力は、センシングでも発生することができます細胞を固定化しました。極性は、リーディング エッジと運動の増加の永続につながる細胞の遅行エッジ間細胞内コンポーネントのより安定した非対称的な配分を指します。
4 つの概念上定義された制御ネットワークの活動に依存する、走化性因子への細胞応答: 受容体/極性1アクチン細胞骨格、シグナル伝達蛋白質 G。G タンパク質共役型受容体への走化性因子のバインドは、ヘテロ三量体 G タンパク質 α と βγ 方向信号を増幅する下流のシグナル伝達ネットワークを経由で信号を送信します。シグナル伝達ネットワーク内の複数経路並行行為し、アクチン細胞骨格ネットワーク バイアス アクチン重合とグラデーションの方向に、結果として仮足突起にフィードします。走化性の重要な規制当局の間では、しますグアニル酸シクラーゼ、ホスファターゼとは、テンシンの相同物 (PTEN) ホスホイノシチド 3-キナーゼ (PI3K) Ras GTPase、TorC2。シグナル伝達ネットワークの内で、およびシグナル伝達とアクチン細胞骨格のネットワークをさらにフィードバック機構は、応答を増幅します。最後に、定義が不十分な極性ネットワークはアクチン細胞骨格から入力を受け、さらにグラデーションの方向で永続的な移行を促進するシグナル伝達ネットワーク バイアスがかかります。
走化性のメカニズム理解の多くは、制御ネットワークのさまざまなコンポーネントのタグ付きの蛍光バイオ センサーの開発のために可能になった。多くの走化性規制規制分子自体またはその活動の非対称的な配分があります。たとえば、認識バイオ アクティブ バージョンの小さな低分子量 g 蛋白質 Ras や Rap1-Ras 結合ドメイン (称します RBD) Raf1 のモデル、それぞれ-chemotaxing 携帯2,3のリーディング エッジにローカライズします。同様に、PI3K およびその製品ホスファチジルイノシトール (3,4,5)-三リン酸 (PIP3)、プレクストリン相同性 (PH) ドメインで認識もセル4、5の前面にローカリゼーションを表示します。対照的に、3 ホスファターゼ PTEN 変換 PIP3 ホスファチジルイノシトール (4, 5) に戻る-ビスリン酸、ローカライズ セル6のラギングの端に。重要なは、これらのバイオ センサーは、走化性因子とグローバルの刺激への応答への局在を変更します。ゾル性細胞質または皮質局在と欠席しているエッジ マーカーの遅れをとっているに対し、皮質に戻して静止細胞の突起の先端にリーディング エッジ マーカー静止細胞の突起の先端からなる後ゾル性細胞質刺激。バイオ センサー、走化性因子とグローバルの刺激への応答分布の解析は、運動と極性、観測をしばしば混同の貢献を最小化します。走化性因子、細胞懸濁液のグローバルまたは一様刺激はしばしばタンパク質リン酸化7,8,9によって検出される蛋白質のアクティブ化人口全体の変更を評価するツールとして使用も.顕微鏡制御ネットワークのさまざまなコンポーネントの動作に関する時間的・空間的情報を収集するために使用に対し主、この生化学的な試金は時間情報を取得する使用されます。
シグナル伝達ネットワークには、興奮性システム10,11の機能が組み込まれています。スープラしきい値走化性刺激に対する応答は「全か無か」であり、不応期が表示されます。応答が確率的に発生しても、振動現象を示すことができます。シグナル伝達イベント波12,13,14,15として伝播する大脳皮質の領域に局在しています。前面、または背面、マーカー、募集または伝播する波のアクティブ ・ ゾーンから切り離します。末尾のアクティブなゾーン ・難治性地域のため逆方向の波を彼らを満たして全滅させます。伝搬波の信号伝達細胞移行10を仲介する細胞の突起の根底にあります。
同じような調節機構が好中球とその他哺乳類の細胞の種類16 に該当するも、走化性については前述の多くはキイロタマホコリカビ、社会的なアメーバの研究から来た.細胞性粘菌単一細胞の何千もを最終的に胞子を含む多細胞の子実体を形成集計センターへ移行と飢餓では、堅牢な走化性応答のある確立されたモデル有機体をあります。走化性は、この生物の細菌の食料源を検索するための単一細胞の成長段階も重要です。重要なは、単一の細胞性粘菌の移行は、哺乳類の好中球または非常に急速なアメーバ型移行を受けるすべての転移性癌細胞の移行に似ています。実際には、両方全体的な制御ネットワークのトポロジと同様、走化性に関与する個々 のシグナル伝達経路の多くは、細胞性粘菌と哺乳類白血球17の間保存されます。さらに、線維芽細胞など、他のセルは、Gpcr; 代わりに受容器のチロシンのキナーゼ (RTK) を使用します。ただし、RTKs は同じようなネットワークにフィード可能性があります。
走化性と対照をなして指示移行の他の各種のモードを駆動する信号メカニズムの理解が欠けています。同様に細胞走化性因子のグラデーションで移行するいくつか報告されている活性化および/または局在アクチン重合、PIP3 および/または細胞外シグナル調節キナーゼ (ERK) 1/2 を含む典型的なリーディング エッジ マーカーで、経るセルの前面は、作用するせん断流れまたは電界18,19,20,21の変更への応答で移行を指示しました。しかし、これらの研究の刺激に連続暴露も結果細胞遊走と疑問が残ったかどうか、具体的には、刺激に対する反応のリーディング エッジ マーカーのローカライズなど、または彼らは単にリーディング エッジにローカライズために移行するセルの前面に仮足数の増加。
人口レベルで両方のせん断流れと個々 のセル22として配信される急性の力学的摂動に対する細胞の反応を観察することができるアッセイを開発しました。走化性因子、急性 stimula グローバル刺激に似ていますせん断流のグローバリゼ-ションは、運動または極性から交絡の貢献をせず機械的刺激に対する細胞応答の研究をことができます。遺伝的または薬理学的摂動とこれらの生化学的および顕微鏡的アッセイを組み合わせることにより、私たちはどのように力学的刺激については、認識されて学ぶことして転送します。また、このアプローチはまた走化性因子、受容体/G からシグナル伝達とアクチン細胞骨格のネットワーク分離のない状態で走化性因子の受容体の下流のシステムへのタッピング法を提供しますタンパク質ネットワーク。
最近我々 は以下の方法を使用して、走化性シグナル伝達とアクチン細胞骨格ネットワーク22の複数のコンポーネントの活性化につながるその急性のせん断応力を示した。さまざまな間隔で急性の機械的刺激により、我々 は、同様にする走化性因子、力学的刺激に対する応答も展示下応答の全か無かの動作を含む、興奮性システムの機能実証飽和条件と不応期の存在。最後に、機械的、化学的刺激を組み合わせることによって示したシグナル伝達とアクチン細胞骨格ネットワーク、可能性があります複数バイアス細胞遊走刺激の統合を可能にする、2 つの刺激を共有します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-1</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose peptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0120-17-6</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media (step 1.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-550-445</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S373-500</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P386-500</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN10040525</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media (step 1.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone (Bacto)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0118-17-0</td>
			<td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-100</td>
			<td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M65-500</td>
			<td>Use to prepare DB Buffer (step 1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td>Use to prepare DB Buffer (step 1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O1728-500</td>
			<td>Use to prepare caffeine (step 1.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-680-1100MG</td>
			<td>Use to prepare cAMP (step 1.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7876</td>
			<td>Use to prepare folic acid (step 1.7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610610</td>
			<td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610404</td>
			<td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S299-100</td>
			<td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-994-911</td>
			<td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyrophosphate decahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S390-500</td>
			<td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latrunculin A</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-T119-0100</td>
			<td>Use to prepare Latrunculin A (step 1.9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>3450029</td>
			<td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene fluoride membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620177</td>
			<td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2060</td>
			<td>Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4370</td>
			<td>Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA934-100UL</td>
			<td>Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1705060</td>
			<td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>PI46430</td>
			<td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PI20278</td>
			<td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K. aerogenes strain (non-pathogenic)</td>
			<td>Dicty Stock Center (dictybase.org)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772A</td>
			<td>Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene cup (5 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13915-985</td>
			<td>Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic unit with pump (ibidi Pump System)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td>Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide with a channel (&#956;-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80316</td>
			<td>Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10978</td>
			<td>Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10964</td>
			<td>Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Line for the drain (1.6 mm ID tubing)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10842</td>
			<td>Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40&#215;/1.25&#8211;0.75 oil objective (or a comparable alternative)</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>DM 16000</td>
			<td>An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5252000021D and 5192000027</td>
			<td>Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (Femtotip; 1 &#956;m outside diameter, 0.5 &#956;m inside diameter )</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930000035</td>
			<td>Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956.003</td>
			<td>Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-472</td>
			<td>Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-338</td>
			<td>Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software (Fiji)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td>Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Migration analysis software (Tracking Tool PRO)</td>
			<td>Gradientech</td>
			<td>http://gradientech.se/tracking-tool-pro/</td>
			<td>Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of dictyostelium discoideum response to acute mechanical stimulation

走化性、または、走化性因子のグラデーションを移行は、指示移行の最高の理解できるモードです。社会的なアメーバを用いた研究キイロタマホコリカビは並列経路の複雑なシグナル伝達ネットワーク走化性因子への応答を増幅し、偏ったアクチンの重合との仮足の突起が生じることを明らかにした、グラデーションの方向。対照的に、作用するせん断流れまたは電界への暴露による指示の移行などの他の種類の運転機構は知られていません。走化性の多くのレギュレータはローカリゼーションまたはグローバル刺激、走化性因子の活性化に一時的な変更を表示し同様、リーディング エッジまたは遅れエッジ移行細胞の局在を示します。指示移行の他の種類の分子機構を理解するには、せん断流れに (2-5 s) の簡単な露出に基づく急性の機械的刺激に対する細胞応答の検討を可能にする方法を開発しました。この刺激は、個々 のセルの動作を調べるバイオ センサーの蛍光標識を発現する細胞をイメージしながら、チャネルで配信できます。さらに、溶解し, プレートとエスディーエス興味の蛋白質のアクティブなバージョンを認識する抗体を使用してセル人口を刺激できます。両測定法を組み合わせることによって 1 つは変化細胞内局在および/またはリン酸化によって活性化分子の広い配列を調べることができます。このメソッドを使用して急性の機械的刺激が走化性シグナル伝達とアクチン細胞骨格ネットワークの活性化を引き起こすことを求めました。急性の機械的刺激に対する細胞応答を調べる機能せん断流動誘起運動に必要な開始のイベントを理解するために重要です。このアプローチは、走化性因子受容体の交絡影響なし走化性シグナル伝達ネットワークを勉強するためのツールを提供します。

急性の機械的刺激に対する走化性の規制当局の時間応答
D. キイロタマホコリカビ細胞の機械的刺激に対する反応を評価するために付着凝集有能なセルはせん断流れの短いパルスにさらされました。集計主務+ キイロタマホコリカビ細胞分泌するキャンプは、隣接する細胞で感知することができます。細胞シグナリングの貢献を克服するために細胞は、カフェイン、 d. 菌のアデニル酸シクラーゼを抑制し、キャンプ分泌28を防止することと扱われました。確かに、セルと前処理をカフェイン PKBR1 および ERK2 の非常に低い基底活性を持っていた、これらのキナーゼ (図 1 a) せん断流 5 秒刺激の重要な残基のリン酸化の強力な増加を示した。応答一時的なされ、ピークの周り 10-15 s、PKBR1 と 30 前後、ERK2 の s 同様に以前に調査結果を発表7走化性因子とこれらの蛋白質の活性化のため。
低レベル、このアッセイの開発につながった予備の研究を考慮した応答の効率を評価することは困難だが (または車) せん断流の刺激を比較してせん断流れの存在下で、走化性因子のキャンプ (図 1 b)。この分析は、せん断流れにシグナル伝達ネットワークの応答が飽和していることを示唆、キャンプの応答の増加を示しませんでした。懸濁液の凝集有能なセルが保管される標準刺激プロトコルを使用してキャンプ、刺激し、さまざまな分離このアッセイでのキャンプは PKBR1 のリン酸化を増加しなかったが細胞の走化性因子応答が観察できます。タイム ポイント刺激します。図 1に示すように、これらの条件の下である PKBR1 リン酸化、走化性因子がない車両に応答の一時的な増加。30 でピーク応答が観察されるこの試験で s アッセイ中に細胞懸濁液の温度が 〜 9 ° C に比べて26上記機械的刺激試金のための ~ 22 ° C。
導くおよび急性の機械的刺激に対するエッジ マーカーをラギングの時空間的応答
上記人口アッセイは、走化性のレギュレータの動作の時間についてのみを提供するので細胞いた顕微鏡で観察しながら簡単な機械的刺激にさらされています。この試金は集計主務や栄養のいずれか行うことがローカリゼーションは、走化性因子刺激で定義されたさまざまな蛍光標識したバイオ センサーを発現するD. キイロタマホコリカビ細胞。2 リーディング エッジ マーカー、クラックとライムのΔcoilの PH ドメイン PIP3 または新しく重合のアクチンを募集して、両方示したゾル性細胞質局在主静止期細胞の以前に報告した (図 2 a、補足の映画 1)4,29。基肥にアクティブだったセルにこれらのバイオ センサーは、仮足の先端にも見ることができます。2 せん断流刺激 s、~ 6 に 10 をピークと皮質に急速に relocalized バイオ センサー s 〜 30 から細胞質へ返されると s。対照的に、遅れてエッジ マーカー PTEN は刺激 (図 2 a) 前に、皮質に局在しました。シアー流を含む、短いパルスの後最先端バイオ センサーのより遅いダイナミクスを伴いゾル性細胞質の PTEN 輝度が上昇。バイオ センサー、細胞質から局在の変化、皮質と逆に示されている変更として応答の簡易定量化を可能にするゾル性細胞質の強度。
急性の機械的刺激に対する応答にバイオ センサーの動作、導くおよび均一な走化性因子の刺激によるエッジ局在化ダイナミクスをラギングと一致。この現象は、示されている 3 つのバイオ センサーへユニークなでした。ローカライゼーションの以前に発行された、同じような変更は、リーディング エッジ マーカー RBD とモデルにも認められた、認識を活性化 Ras や Rap1、だけでなく、それぞれ別の遅行エッジ マーカー サイナ、17 歳22,30に関しては。
似たようなアッセイは、二重 1 つに単一の入力行から実験のセットアップの簡単な修正によって様々 な阻害剤の効果を評価するために使用できます。このメソッドを使用して、セル最初制御条件にさらされてでき、目的のテスト エージェントを含むバッファーに切り替えた。たとえば、アクチン脱重合剤コンジロームの RBD の応答はブロックだけでなくライムのΔcoil、急性機械的刺激 (図 2 b)。
グローバルな対応の前にシアー流を含む長期にわたる刺激下での細胞移動
ここで説明したアプローチはD. キイロタマホコリカビ移行に及ぼすせん断流を研究に適応できます。実際、流れだった 2 の後シャット ダウンしない場合に s に実験の持続期間のために残った、栄養細胞を示した (図 3、補足の映画 2) 流れに逆らって移行を監督します。せん断流の渡り鳥の応答を引き出すために必要だった (たとえば、図 2 bに見られる)、栄養細胞の急性刺激とグローバル応答を達成するために使用された通常の圧力よりも低いことに注意してください。ただし、低圧でもセルはセル自体の位置の変更に先行するライムΔcoil局在の変化によって測定された堅牢な均一な応答を表示されます。したがって、これらの実験は、1) グローバル応答は細胞の運動に依存しない、2) グローバル応答指示移行の前に明確に示した。
急性の機械的刺激に対する応答をテストの代替的なアプローチ
フロースルー区域の使用には、急性の機械的刺激に対する応答の調査のための明確な利点がありますが、また急性の機械的刺激に対する細胞の応答をテストするための 2 つの追加アッセイを検証しました。図 4に示すとおり、ライムΔcoil急速かつ一過性再にローカライズされて細胞質から皮質細胞がいずれか (図 4 a) マイクロ ピペットを配信または一括を使用して手動でバッファーの追加により食塊によって刺激されたときピペット (図 4 b) とさらにバッファー。セルに配信されるせん断力の正確な量は不明と簡単に変更できないことこれらのアッセイの両方の明確な欠点があることに注意してください。しかし、機械的、化学的刺激の切り替えが必要な場合、一括バッファー追加はフロー デバイスで刺激する固体の代替を提供します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56411/56411fig1.jpg"> 
図 1: 急性機械的又は化学的刺激にD. キイロタマホコリカビ細胞の反応の生化学的評価結果を代表します。集計有能なセルは、機械的又は化学的刺激にさらされました。、指定された時点で分離、エスディーエスを認識する抗体を使用して PKBR1 または ERK2 をリン酸化します。(A) 付着性のセルが 5 の軌道シェーカーで刺激された s。膜と Coomassie ブリリアント ブルー (CBB) 等しい蛋白質をロードを表示するに染まりました。(B) 付着性のセルが約 5 秒以下の cross-wise 方法でプレートの手動運動によって刺激されたバッファー (車)、または 1 μ M のキャンプのまたは任意の化学的刺激 (-) なしの添加による化学刺激。2 つの immunoblots は時間 0 で見られる PKBR1 の基底の活性化で変化の範囲を示します。時折、下部のパネルに示すように、PKBA の活性化をこの手法により検出でした。(C) 懸濁液 1 μ M のキャンプまたはバッファー (車) と細胞が刺激されました。この図の (A) の部分は、Artemenkoらから変更されています。(2016)22.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56411/56411fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56411/56411fig2.jpg"> 
図 2: 代表結果急性機械的刺激と顕微鏡の単一セルのライブ イメージングします。(A) 集計-主務D. キイロタマホコリカビ細胞表現する RFP タグ ライムΔcoil、または GFP 付けられた PH クラックまたは PTEN 15 dyn/cm2で一方向流と刺激された 2 に 5 s. の画像が収集されたすべての 3 s.機械的刺激に対する応答で、バイオ センサーの転座を示す代表的なセルが表示されます。皮質における各バイオ センサーの蓄積の時間 0 に正規化された平均細胞質強度の逆数として定量化を行った。18 (ライムΔcoil)、20 (PH Crac)、または 6 (PTEN) セルの平均の応答が表示されます。値が意味 ± RFP タグ ライムΔcoilを発現する SE (B) 植物細胞 RFP、GFP タグ RBD は車または 5 μ m と扱われたコンジローム、少なくとも 15 分間と、2 の 41 の dyn/cm2で一方向流と刺激。s. 画像が収集されたすべての 3 s の RBD GFP と皮質における石灰ΔcoilRFP の蓄積が (A) のように定量化されました。値は、平均 ± SE です。分析のセルの数は、それぞれの条件の横に示されます。スケール バー = 10 μ m。この図は、Artemenkoらから変更されています。(2016)22.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56411/56411fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56411/56411fig3.jpg"> 
図 3: 代表結果D. キイロタマホコリカビ細胞の応答フローの長期刺激にします。(A) 植物細胞 RFP タグ ライムΔcoil 15 dyn/cm2で連続的な一方向流にさらされ、11 セルのすべての 3 の s. トラックのイメージを表現する、(B) に示すように。スケール バー = 10 μ m。この図は、Artemenkoらから変更されています。(2016)22.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56411/56411fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56411/56411fig4.jpg"> 
図 4: 代表が急性の機械的刺激に対する応答をテストする代替的なアプローチの結果します。(A) 栄養D. キイロタマホコリカビ細胞表現する RFP タグ ライムΔcoilマイクロ ピペット (*) 基肥アッセイバッファー遅い速度でを解放にさらされていた。流量の一時的な上昇は、0 時にアッセイバッファーのボーラスの迅速な配達によって達成されました。画像が収集されたすべて 3 s. (B) 栄養D. キイロタマホコリカビ細胞 RFP タグ ライムΔcoil顕微鏡室に小さなドロップとしてメッキを表現する機械的に大量にバッファーの添加によって刺激された、商工会議所。画像が収集されたすべての 3 s のスケール バー = 10 μ m この図の (A) 部分から変更されている Artemenko et al. 。(2016)22.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56411/56411fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
補足映画 1: 急性の機械的刺激がトリガー ライムΔcoilの迅速かつ一時的な転流 - RFP または PH-クラック-GFP 集計主務D. キイロタマホコリカビにおける皮質細胞質から細胞のこれらのバイオ センサーを表現します。一方向流がになっていたため 5 時 0 s とセルを 3 秒間隔でイメージしました。再生速度は 5 フレーム/秒です。セルの行ごとに 2 つの例のとおりです。スケール バー = 10 μ m。この映画は、図 2 aに対応し、Artemenkoらから変更されています。(2016)22.<a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56411/Suppl_Mov_1_060417.avi">ファイルのダウンロードは、こちらをご覧ください</a>。
補足映画 2: 継続的な機械的刺激トリガー ライムΔcoilの迅速かつ一時的な転流 - 流れの方向に対して細胞の移行前に皮質細胞質から RFP 。ライムΔcoilを発現する植物細胞 RFP 15 dyn/cm2時間 0 から始まる連続せん断応力にさらされる、3 秒間隔でイメージします。再生速度は 10 フレーム/秒スケール バー = 10 μ m。この映画は図 3に対応し、Artemenkoらに以前掲載されています(2016)22.<a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56411/Suppl_Mov_2_060417.avi">ファイルのダウンロードは、こちらをご覧ください</a>。

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Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

キイロタマホコリカビ急性の機械的刺激に対する応答の評価

ここで我々 は急性の機械的刺激に対する細胞応答を評価するための方法を説明します。顕微鏡ベースのアッセイでは、蛍光標識したバイオ センサー シアー流を含む簡単な刺激の局在を調べる。我々 はまた、生化学的急性の機械的刺激に対する応答の興味の様々 な蛋白質の活性化をテストします。

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

6.9K ビュー.  SUNY Oswego. ここで我々 は急性の機械的刺激に対する細胞応答を評価するための方法を説明します。顕微鏡ベースのアッセイでは、蛍光標識したバイオ センサー シアー流を含む簡単な刺激の局在を調べる。我々 はまた、生化学的急性の機械的刺激に対する応答の興味の様々 な蛋白質の活性化をテストします。

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Mechanical Stimulation of Stem Cells Using Cyclic Uniaxial Strain

The role of mechanical forces in the development and maintenance of biological tissues is well documented, including several mechanically regulated phenomena such as bone remodeling, muscular hypertrophy, and smooth muscle cell plasticity. However, the forces involved are often extremely complex and difficult to monitor and control in vivo. To better investigate the effects of mechanical forces on cells, we have developed an in vitro method for applying uniaxial cyclic tensile strain to adherent cells cultured on elastic membranes. This method utilizes a custom-designed bioreactor with a motorized cam-rotor system to apply the desired force. Here we present a step-by-step video protocol demonstrating how to assemble the various components of each "stretch chamber", including, in this case, a silicone membrane with micropatterned topography to orient the cells with the direction of the strain. We also describe procedures for sterilizing the chambers, seeding cells onto the membrane, latching the chamber into the bioreactor, and adjusting the mechanical parameters (i.e. magnitude and rate of strain). The procedures outlined in this particular protocol are specific for seeding human mesenchymal stem cells onto silicone membranes with 10 &micro;m wide channels oriented parallel to the direction of strain. However, the methods and materials presented in this system are flexible enough to accommodate a number of variations on this theme: strain rate, magnitude, duration, cell type, membrane topography, membrane coating, etc. can all be tailored to the desired application or outcome. This is a robust method for investigating the effects of uniaxial tensile strain applied to cells in vitro.

It is widely understood that mechanical forces in the body can influence cell differentiation and proliferation. Here we present a video protocol demonstrating the use of a custom-built bioreactor for delivering uniaxial cyclic tensile strain to stem cells cultured on flexible micropatterned substrates.

繰返し一軸性歪みを用いた幹細胞の機械的刺激

The role of mechanical forces in the development and maintenance of biological tissues is well documented, including several mechanically regulated ...

生物学

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

ゼブラフィッシュの視覚機能を研究するために視運動性応答を使用して

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

電離放射線への応答でγH2AX病巣の定量化

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to investigate cells behavior at sub-cellular level with high spatial and temporal resolution was developed. Thus, an atomic force microscope (AFM) was integrated with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy and fast-spinning disk (FSD) confocal microscopy. The integrated system is broadly applicable across a wide range of molecular dynamic studies in any adherent live cells, allowing direct optical imaging of cell responses to mechanical stimulation in real-time. Significant rearrangement of the actin filaments and focal adhesions was shown due to local mechanical stimulation at the apical cell surface that induced changes into the cellular structure throughout the cell body. These innovative techniques will provide new information for understanding live cell restructuring and dynamics in response to mechanical force. A detailed protocol and a representative data set that show live cell response to mechanical stimulation are presented.

This paper aims to instruct the reader in the operation of an integrated atomic force-optical imaging microscope for mechanical stimulation of live cells in culture. A step-by-step protocol is presented. A representative data set that shows live cell response to mechanical stimulation is presented.

集積光と原子間力顕微鏡による研究機械的刺激に対する細胞応答を生きる

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

急性腎障害を研究するためにゼブラフィッシュ幼生の静脈内Microinjections

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

イメージングG -タンパク質共役受容体（GPCR）を介するシグナル伝達事象その制御走キイロタマホコリカビ</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy this deficiency, several medical interventions have been developed. One such method is to resurface the damaged area with tissue-engineered cartilage; however, the engineered tissue typically lacks the biochemical properties and durability of native cartilage, questioning its long-term survivability. This limits the application of cartilage tissue engineering to the repair of small focal defects, relying on the surrounding tissue to protect the implanted material. To improve the properties of the developed tissue, mechanical stimulation is a popular method utilized to enhance the synthesis of cartilaginous extracellular matrix as well as the resultant mechanical properties of the engineered tissue. Mechanical stimulation applies forces to the tissue constructs analogous to those experienced in vivo. This is based on the premise that the mechanical environment, in part, regulates the development and maintenance of native tissue1,2. The most commonly applied form of mechanical stimulation in cartilage tissue engineering is dynamic compression at physiologic strains of approximately 5-20% at a frequency of 1 Hz1,3. Several studies have investigated the effects of dynamic compression and have shown it to have a positive effect on chondrocyte metabolism and biosynthesis, ultimately affecting the functional properties of the developed tissue4-8. In this paper, we illustrate the method to mechanically stimulate chondrocyte-agarose hydrogel constructs under dynamic compression and analyze changes in biosynthesis through biochemical and radioisotope assays. This method can also be readily modified to assess any potentially induced changes in cellular response as a result of mechanical stimuli.

The biosynthesis of cartilaginous extracellular matrix by chondrocytes can be affected by application of mechanical stimuli. This method describes the technique of applying dynamic compressive strains to chondrocytes encapsulated in 3D constructs and the evaluation of induced changes in chondrocyte metabolism.

軟骨アガロースゲルの機械的刺激

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the brain, liver, retina, cochlea and vasculature. In experimental settings, intercellular Ca2+-waves can be elicited by applying a mechanical stimulus to a single cell. This leads to the release of the intracellular signaling molecules IP3 and Ca2+ that initiate the propagation of the Ca2+-wave concentrically from the mechanically stimulated cell to the neighboring cells. The main molecular pathways that control intercellular Ca2+-wave propagation are provided by gap junction channels through the direct transfer of IP3 and by hemichannels through the release of ATP. Identification and characterization of the properties and regulation of different connexin and pannexin isoforms as gap junction channels and hemichannels are allowed by the quantification of the spread of the intercellular Ca2+-wave, siRNA, and the use of inhibitors of gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-wave in monolayers of primary corneal endothelial cells loaded with Fluo4-AM in response to a controlled and localized mechanical stimulus provoked by an acute, short-lasting deformation of the cell as a result of touching the cell membrane with a micromanipulator-controlled glass micropipette with a tip diameter of less than 1 &mu;m. We also describe the isolation of primary bovine corneal endothelial cells and its use as model system to assess Cx43-hemichannel activity as the driven force for intercellular Ca2+-waves through the release of ATP. Finally, we discuss the use, advantages, limitations and alternatives of this method in the context of gap junction channel and hemichannel research.

Intercellular Ca2+-waves are driven by gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-waves in cell monolayers in response to a local single-cell mechanical stimulus and its application to investigate the properties and regulation of gap junction channels and hemichannels.

細胞単層に機械的刺激によって誘発されるカルシウム波の伝播：ウシ角膜内皮細胞の例

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular development program, during which single cells chemotax towards aggregation centers1-4. This process is dependent on the release of cyclic adenosine monophosphate (cAMP)5. cAMP is produced in waves through the concerted action of adenylate cyclase and phosphodiesterases, and binds to G protein-coupled cAMP receptors6,7. A widely used assay to analyze the mechanisms involved in the developmental cycle of the lower eukaryote Dictyostelium discoideum is based on the observation of cell aggregation in submerged conditions8,9. This protocol describes the analysis of the role of coronin A in the developmental cycle by starvation in tissue-culture plates submerged in balanced salt solution (BSS)10. Coronin A is a member of the widely conserved protein family of coronins that have been implicated in a wide variety of activities11,12. Dictyostelium cells lacking coronin A are unable to form multicellular aggregates, and this defect can be rescued by supplying pulses of cAMP, suggesting that coronin A acts upstream of the cAMP cascade10. The techniques described in these studies provide robust tools to investigate functions of proteins during the initial stages of the developmental cycle of Dictyostelium discoideum upstream of the cAMP cascade. Therefore, utilizing this aggregation assay may allow the further study of coronin A function and advance our understanding of coronin biology.

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.

初期の飢餓応答でCoronin Aの機能を調査<em&gt;細胞性粘菌</em&gt;凝集アッセイによって

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

磁気ビーズを使用した機械的張力に応答して細胞表面接着リフォームの分析

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...