עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק R35 GM118177 PND.

<ol>
	<li>Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+chemotaxis:+a+network+of+signaling+pathways+controls+motility,+directional+sensing,+and+polarity.">Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity.</a> Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).</li><li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K,+cell+polarity,+and+directional+cell+movement.">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).</li><li>Jeon, T. J., Lee, D. -. J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+controls+cell+adhesion+and+cell+motility+through+the+regulation+of+myosin+II.">Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II.</a> J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).</li><li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein+Signaling+Events+Are+Activated+at+the+Leading+Edge+of+Chemotactic+Cells.">G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells.</a> Cell. 95 (1), 81-91 (1998).</li><li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Regulation+of+3-Phosphoinositides+by+PI+3-Kinase+and+PTEN+Mediates+Chemotaxis.">Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis.</a> Cell. 109 (5), 611-623 (2002).</li><li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Suppressor+PTEN+Mediates+Sensing+of+Chemoattractant+Gradients.">Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients.</a> Cell. 109 (5), 599-610 (2002).</li><li>Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RasC+is+required+for+optimal+activation+of+adenylyl+cyclase+and+Akt/PKB+during+aggregation.">RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation.</a> EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).</li><li>Kamimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP3-Independent+Activation+of+TorC2+and+PKB+at+the+Cell's+Leading+Edge+Mediates+Chemotaxis.">PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis.</a> Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).</li><li>Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C+Regulation+of+Phosphatidylinositol+3,4,5-trisphosphate-mediated+Chemotaxis.">Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).</li><li>Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+excitable+signal+integrator+couples+to+an+idling+cytoskeletal+oscillator+to+drive+cell+migration.">An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration.</a> Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).</li><li>Nishikawa, M., H&#246;rning, M., Ueda, M., Shibata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitable+Signal+Transduction+Induces+Both+Spontaneous+and+Directional+Cell+Asymmetries+in+the+Phosphatidylinositol+Lipid+Signaling+System+for+Eukaryotic+Chemotaxis.">Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis.</a> Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).</li><li>Gerisch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+Actin+Clusters+and+Traveling+Waves+in+Cells+Recovering+from+Actin+Depolymerization.">Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization.</a> Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).</li><li>Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+modes+of+state+transitions+determine+pattern+in+the+Phosphatidylinositide-Actin+system.">Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system.</a> BMC Cell Biol. 12 (1), 42 (2011).</li><li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Three-Dimensional+Dynamics+of+Actin+Waves,+a+Model+of+Cytoskeletal+Self-Organization.">The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization.</a> Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).</li><li>Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Actin-Based+Wave+Generator+Organizes+Cell+Motility.">An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility.</a> PLOS Biol. 5 (9), e221 (2007).</li><li>Devreotes, P., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+Networks+that+Regulate+Cell+Migration.">Signaling Networks that Regulate Cell Migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).</li><li>Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+towards+a+paradigm:+common+mechanisms+of+chemotactic+signaling+in+Dictyostelium+and+mammalian+leukocytes.">Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).</li><li>Dalous, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+cell+polarity+and+actin-myosin+cytoskeleton+reorganization+under+mechanical+and+chemical+stimulation.">Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation.</a> Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).</li><li>Sato, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switching+direction+in+electric-signal-induced+cell+migration+by+cyclic+guanosine+monophosphate+and+phosphatidylinositol+signaling.">Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).</li><li>Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+lipids,+EGF+receptors,+and+intracellular+signals+colocalize+and+are+polarized+in+epithelial+cells+moving+directionally+in+a+physiological+electric+field.">Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field.</a> Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).</li><li>Decave, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+flow-induced+motility+of+Dictyostelium+discoideum+cells+on+solid+substrate.">Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate.</a> J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).</li><li>Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+mechanical+stimuli+act+on+common+signal+transduction+and+cytoskeletal+networks.">Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).</li><li>Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+development+and+chemotaxis+in+Dictyostelium+discoideum+mutants.">Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants.</a> Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).</li><li>Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Dictyostelium+discoideum+with+plasmid+DNA.">Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).</li><li>Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP3-dependent+macropinocytosis+is+incompatible+with+chemotaxis.">PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis.</a> J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).</li><li>Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+chemotaxis+in+Dictyostelium.">Analysis of chemotaxis in Dictyostelium.</a> Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Brenner, M., Thoms, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+blocks+activation+of+cyclic+AMP+synthesis+in+Dictyostelium+discoideum.">Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum.</a> Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).</li><li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Actin+Patterns+and+Arp2/3+Assembly+at+the+Substrate-Attached+Surface+of+Motile+Cells.">Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells.</a> Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).</li><li>Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+protein+Callipygian+defines+the+back+of+migrating+cells.">Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).</li><li>Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Akt/PKB-related+kinase+is+essential+for+morphogenesis+in+Dictyostelium.">A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium.</a> Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).</li><li>Westendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cytoskeleton+of+chemotactic+amoebae+operates+close+to+the+onset+of+oscillations.">Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

השיטות המתוארות כאן מציעים דרך נוחה כדי להעריך את האוכלוסייה והן תא בודד התנהגות בתגובה להטיה זרימה. חשוב, ואילו מחקרים קודמים ניתח לוקליזציה של המוביל, משתרך סמני קצה במהלך ההעברה, הגישה הנוכחית מאפשרת חקירת תופעות מיידית על-ידי החלת זרימת הטיה בחריפות. בשיטה זו אנו הוכיח כי, למעשה, התגובה הראשונית של תאים להטיית הזרימה אינה דורשת נדידת תאים. במקום זאת, התגובה המהירה וחולף הגירוי זרימה הטיה הראשונית מקדים כיווניות ההעברה ראיתי עם חשיפה ממושכת להטיית זרימה, בדומה התגובה הכללית הראשונית עם מעבר צבע chemoattractant.
הגישות הביוכימי, מיקרוסקופיים תשואות נתונים משלימים למרות לכל שיטה יש יתרונות וחסרונות. גירוי ואחריו פירוק התא, immunoblotting של PKBs, KrsB, טיפשה, לדוגמה, מנתח אוכלוסיה שלמה של תאים, ובכך ממוצעים וריאציה מתא לתא, בניגוד וזמינותו זה בוחן את התנהגות תא בודד. עם זאת, האוכלוסייה המבוססת על מבחני נוטים מסכת שינויים עדינים בהתנהגות התא זה יכול להיות שנצפו בקלות על-ידי ניתוח תאים בודדים. בנוסף, וזמינותו הביוכימי המתוארים כאן יעיל רק עם תאי מצבור המוסמכים, מסיבות נדון בהמשך. לעומת זאת, וזמינותו מבוסס מיקרוסקופיה של relocalization של RBD, RalGDS, PH-Crac, לייםΔcoilPTEN, לדוגמה, בין קליפת המוח לבין ציטוזול יעיל עבור תאים הן וגטטיבי לבין צבירת-מוסמך, ובכך מאפשר תצפיות זה ישימות בהרחבה על תאים עם דרגות שונות של קיטוב. מה שהופך את שתי הגישות משלימים היא העובדה כי הם בוחנים קבוצות שונות של סמני קצה מובילים/לקרטע זמין, ובכך להרחיב את הכיסוי של האות התמרה חושית ואני אקטין שלד התא הרשתות שנבדקו עם הטיה זרימה וזמינותו.
זה עדיין לא ברור מדוע אינם מגיבים תאים וגטטיבי, אשר מגיבות מאוד robustly מבחני מבוסס מיקרוסקופיה, גירוי ואחריו פירוק התא, immunoblotting. אפשרות אחת היא כי הסכום בכוח גזירה המוחלים על תאים כאשר מסובבים את הצלחת אינו תואם הכוח מנוסים על ידי התאים בתוך תא זרימה. תאים מפותחת, לעומת זאת, אולי יש סף נמוך יותר עבור ההפעלה, ולהגיב, לפיכך, בתנאי גם. אין זה סביר כי ביולוגיים שפעילותם נמדד על ידי וזמינותו ביוכימיים אינם מבוטאים או לא מופעלים בתאי צמח, מאז גירוי של תאים וגטטיבי עם חומצה פולית מוביל הפעלה חזקה של PKBR1/PKBA ו- ERK2 (נתונים לא מוצג). יתר על כן, תאי צמח מראים ברור גיוס של PH-Crac, המשקף הצטברות PIP3, מבוסס מיקרוסקופיה וזמינותו. מאז הגיוס PKBA תלויה גם PIP3, זה נראה לא סביר כי PKBA אינם מגיבים גירוי מכני חריפה, אלא אם תנאי וזמינותו ביוכימיים אינם מיטביים כאמור לעיל. . זה נותר שטח של חקירה פעילה
ניתוח הביוכימי של הרגולטורים כימוטקסיס נדרשת הנוכחות של קפאין לאורך כל הניסוי. במקור קפאין נוספה כדי למנוע לתא איתות עקב הפרשת מחנה. עם זאת, נראה כי קפאין יש תפקיד נוסף מלבד עיכוב של adenylyl cyclase (ACA) מאז תאים ריקים ACA עדיין נדרש קפאין זירחון של PKBR1 בתגובה חריפה גירוי מכני. קפאין הוכח בעבר כדי לחסום את פעילות TorC226. זה אפשרי כי עיכוב של TorC2 חסמו כמה תנועתיות התאים הבזליים, ובכך הורידה את ההפעלה הבזליים של PKBR1 ורכיבים אחרים של האות התמרה חושית ורשתות שלד התא אקטין. פעילות הבסיס נמוך היה הכרחי להבחנה התגובה להטיית זרימה. למעשה, כאשר התאים שנאספו בנקודות זמן מוקדם יותר במהלך הפיתוח, להציגם פעילות מוגברת הבזליים ו לתגובה מופחתת הטיה-flow המושרה. מעניין, זה ידוע כי תאי צמח יש פעילות PKBA באופן פרופורציונלי יותר, פחות PKBR1 בהשוואה פיתחו תאים31. זה אפשרי המדינה הבזליים מוסדר באופן שונה במקצת בתאי צמח, צבירת-המוסמכת, לתרום יותר חוסר תגובה של תאים וגטטיבי וזמינותו הביוכימי. בסקרנות, כאשר התאים שנאספו בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות, הם היו גם לתגובה מופחתת, כנראה עקב השפעה חזקה של קוטביות לוקליזציה והפעלה של הרגולטורים כימוטקסיס שונים שנבדקו זה וזמינותו.
גירוי של תאים בתוך תא מיקרוסקופ חשף כי גם הכוח וגם משך הזמן של גירוי לתרום תגובה מקסימלי22. במילים אחרות, תגובה מקסימלי יכולה להיות מושגת גם עם כוח גזירה נמוכה אם הוא מוחל לתקופה ממושכת של זמן (10 s לעומת 2 s). התבוננות זו מסבירה מדוע תאים יש תשובה הגלובלית הראשונית כאשר הם נחשפים לראשונה גירוי מתמשך, אבל חלש, שמובילה להטיית העברת זרימה-induced. עם המנגנון הנוכחי, היינו אין אפשרות ליצור זרימה הטיה נמוכה מספיק כדי לחקור את הקצה התחתון של הטווח.
אולי החשוב ביותר של מחקרים נערך באמצעות גירוי מכני חריפה שהרמיזה גירויים מכניים וכימיים מופיעים להאכיל לתוך נפוצות אותות ורשתות שלד התא אקטין. למרות הראינו כי שני הגירויים לשלב שימוש בצובר מאגר תוספת גירוי מכני, מחקרים עתידיים ינהל לפתח מערכת איפה chemoattractant יכול להישלח במהירות זרימה דרך הערוץ, אשר יהיה הרבה יותר תכליתי דרך עוצמה להערכת שילוב של גירויים מכניים וכימיים. למרבה הצער, בנוסף chemoattractant באמצעות הכיוונון הנוכחי שתי שורות מזוהה עם גירוי זרימת הטיה השניה כי chemoattractant חייב להימסר בנוכחות זרימה. אלטרנטיבה מעשית עשוי להיות מגורה-לייזר שחרורו של chemoattractant מן הקדמה בכלובים כפי הוצגה בהצלחה למחנה מאת Westendorf et al. 32. בעתיד, זה גם יהיה מעניין לבחון שילוב של גירויים אחרים, לדוגמה, להטות את זרימת ואת שדות חשמליים משתנים או להטות את זרימת וקשיחות המצע משתנה. הדוגמה השנייה אמנם מעניין כי היא כוללת שני סוגים של גירוי מכני, הקבלה אות הראשונית עשויים להיות שונים ביניהם. המאשר כי כל שנוצרים זירוז ההעברה מכוונת לחלוק באותה האות התמרה חושית רשת, להשתנות רק איך הגירוי נתפס יסביר כיצד תאים באפשרותך לנווט בתוך סביבות מורכבות. בסופו של דבר, אנחנו כבר הוכיחה כי גירוי חריף בתזרים הטיה מוביל התפשטות של תאים אנושיים כמו נויטרופילים22. בעבודתה העתידית נבחן נוסף לוקליזציה והפעלה של רכיבים שונים של האות התמרה חושית ואני אקטין שלד התא הרשתות עם גירויים מכניים בתאי יונקים.

ההעברה של התאים האיקריוטים מוטה על ידי רמזים כימיים מגוונים בסביבה, לרבות מעברי צבע של chemoattractants מסיסים או מאוגד המצע, נוקשות משתנה של מצעים, שדות חשמליים או הטיה זרימה. אמנם היו הרבה התקדמות בהבנתנו המנגנונים המולקולריים נהיגה כימוטקסיס, פחות ידוע על סוגים אחרים של ההעברה מכוונת, כמה אותות אלה מגוונים משולבים ברמה התאית לייצר מאוחדת נודדות תגובה.
ביים ההעברה לכיוון הגדלת ריכוז chemoattractant כוללת שלושה מרכיבים התנהגותיים: תנועתיות כיוונית חישה, קטביות1. תנועתיות מתייחס לתנועה אקראית של תאים מושגת על ידי בליטה pseudopod. כיוונים חישה היא היכולת של תא כדי לזהות את מקור chemoattractant, אשר יכול להתרחש אפילו באופן מתאושש תאים. קוטביות מתייחס ההתפלגות סימטרית יציבה יותר של רכיבים תאיים בין המוביל לבין לקרטע קצה תא, מה שמוביל התמדה מוגברת בתנועה.
תגובה תאית chemoattractant תלוי הפעילות של ארבע רשתות בקרה רגולטריות שהוגדר מושגית: קולטן / גרם חלבון, אותות, שלד התא אקטין, קוטביות1. Chemoattractant מחייב לקולטן G-חלבון בשילוב משדר את האות דרך heterotrimeric גרם חלבונים α וβγ לרשת התמרה חושית האות במורד הזרם, אשר מגביר את האות כיוונית. משעולים מרובות בתוך הרשת התמרה חושית אות לפעול במקביל, להאכיל לתוך הרשת שלד התא אקטין פלמור אקטין הסטייה ולאחר חדירת pseudopod הסוגר, בכיוון של מעבר הצבע. חשוב סמביוזה כימוטקסיס נמנים GTPase בראס, TorC2, phosphoinositide 3-קינאז (PI3K) homolog פוספטאז ו- tensin (PTEN), guanylyl cyclase. מנגנוני משוב בתוך הרשת התמרה חושית אות ובין אותות לבין אקטין שלד התא רשתות נוספות להגביר את התגובה. בסופו של דבר, הרשת קוטביות מוגדרת היטב מקבל קלט שלד התא אקטין, בהמשך biases האות התמרה חושית הרשת כדי לקדם את ההעברה מתמיד בכיוון של מעבר הצבע.
הרבה הבנתנו מכניסטית כימוטקסיס התאפשרה בשל התפתחות מתויג fluorescently ביולוגיים עבור רכיבים שונים של רשתות רגולטוריות. הרגולטורים כימוטקסיס רבים יש של התפלגות סימטרית של המולקולה הרגולציה עצמה או הפעילות שלה. לדוגמה, ביולוגיים מזהה הופעלה גרסאות GTPases ראס קטן ולא Rap1 – ראס מחייב תחומים של Raf1 (המכונה "rbd" כאן), RalGDS, בהתאמה – בתרגום כדי בחוד החנית של2,תא chemotaxing3. באופן דומה, PI3K ו phosphatidylinositol המוצר שלה (3,4,5)-טריפוספט (PIP3), המוכר על ידי תחום הומולוגיה (PH) pleckstrin, גם להראות לוקליזציה בחזית תא4,5. לעומת זאת, PTEN 3-פוספטאז, אשר ממירה PIP3 בחזרה אל phosphatidylinositol (4.5)-bisphosphate, רגישה לקצה לקרטע תא6. חשוב, ביולוגיים אלה לשנות שלהם לוקליזציה בתגובה גירוי גלובלית עם chemoattractant. הקצה המוביל סמנים, אשר cytosolic או על קצות בליטות בתא resting, relocalize אל קליפת המוח, ואילו מפגרות סמני קצה, אשר לוקליזציה קורטיקלית נעדרים מכל קצות בליטות בתא resting, הופכים cytosolic לאחר גירוי. ניתוח של התפלגות ביוסנסור בתגובה גירוי גלובלית עם chemoattractant ממזער את התרומה של תנועתיות, קוטביות, אשר פעמים רבות וחיסול התצפיות. גירוי גלובלי או אחיד של השעיה תא עם chemoattractant משמש גם ככלי להערכת שינויים ברמת האוכלוסייה בהפעלת חלבון, לעיתים קרובות זוהה על ידי חלבון זרחון7,8,9 . Assay הביוכימי זה משמש בעיקר כדי להשיג מידע זמני, ואילו מיקרוסקופ משמש לאיסוף מידע זמני והן מרחבי על התנהגותם של רכיבים שונים של רשתות רגולטוריות.
התמרה חושית אות הרשת משלבת תכונות של מערכת טמפרמנט10,11. תגובות לגירויים chemotactic העל-סף "all-or-none", להציג תקופות עקשן. תגובות מופעלות גם stochastically, יכול להראות התנהגות מתנדנדות. האות התמרה חושית אירועים הם נקודתיים לאזורים של קליפת המופצות גלים12,13,14,15. קדימה או אחורה, סמני את הנישה, או מביצועם מתוך, האזורים הפעילים של הגלים כציוד. בשל האזור עקשן נגררים אזור פעיל, הגלים מכוון הפוך להשמיד כאשר הם נפגשים. הגלים התמרה חושית אות כציוד ביסוד בליטות הסלולר המתווכות תא העברה10.
חלק גדול מהמידע הנ על כימוטקסיס הופיע במחקרים אמבה חברתית Dictyostelium discoideum, למרות מנגנונים רגולטוריים דומים חלים גם נויטרופילים, אחרים בתרבית של תאים סוגים16 . Dictyostelium הוא אורגניזם מודל ומבוססת שיש תגובה chemotactic חזקים במהלך רעב, כאשר אלפי תאים בודדים נודדים לכיוון מרכז צבירה, בסופו של דבר יוצרים גוף fruiting multicellular המכיל נבגי. כימוטקסיס חיוני גם בשלב הצמיחה תא בודד של האורגניזם לאיתור מקורות המזון חיידקי. חשוב, נדידה של תאים בודדים Dictyostelium דומה להפליא ההעברה. בתרבית של נויטרופילים או תאי סרטן גרורתי, אשר כולם עוברים העברה מסוג amoeboid מהירה מאוד. למעשה, שני הטופולוגיה הכוללת של רשתות רגולטוריות, כמו גם רבים מן המסלולים התמרה חושית אות בודדת מעורב כימוטקסיס נשמרים בין Dictyostelium בתרבית של לויקוציטים17. יתר על כן, תאים אחרים, כגון fibroblasts, להשתמש קולטן טירוזין kinases (RTK) במקום GPCRs; עם זאת, RTKs עשויים להאכיל לתוך רשתות דומות.
בניגוד כימוטקסיס, הבנה מעמיקה של המנגנונים איתות כי הכונן מצבי שונים של הגירה מכוון לוקה בחסר. בדומה לתאים בהעברה של מעבר הדרגתי chemoattractant מספר מחקרים דיווחו על הפעלה ו/או לוקליזציה של סמנים הקצה המוביל טיפוסי, כולל פלמור אקטין, PIP3 ו/או חוץ-תאית מוסדר אות קינאז (טיפשה) 1/2, ב הקדמי של תאים שעברו ביים ההעברה בתגובה להטיה זרימה או שינוי שדות חשמליים18,19,20,21. עם זאת, במחקרים אלה חשיפה מתמשכת הגירוי הביאה גם נדידת תאים, להשאיר פתוחה את השאלה אם, לדוגמה, הסימונים הקצה המוביל לשפה במיוחד בתגובה לגירוי, או אם הם פשוט להתאים לשפה בחוד בשל עלייה במספר pseudopods בחזית תא נודדים.
פיתחנו מבחני ומאפשרים לנו להתבונן התגובה של התאים חריפה ההפרעות מכני נמסר הטיה זרימה הן ברמת האוכלוסייה וכן תאים בודדים22. דומה גירוי גלובלית עם chemoattractant, stimula חריפהtion בתזרים הטיה מאפשר חקר תגובה תאית גירוי מכני ללא התרומה מבלבלים תנועתיות או קוטביות. שילוב של מבחני הביוכימי, מיקרוסקופית אלו עם לפליטת גנטית או תרופתי מאפשר לנו ללמוד על גירויים מכניים איך נתפסים משודר. יתר על כן, גישה זו מספק גם שיטה עבור הקשה לתוך המערכת במורד הזרם של הקולטן chemoattractant בהיעדר chemoattractant, ובכך לבודד את האות התמרה חושית אקטין שלד התא ורשתות מ הקולטן/G רשת חלבון.
תוך שימוש בטכניקות המתוארות להלן אנו לאחרונה הפגינו שגזירה חריפה הזה מוביל הפעלה של רכיבים מרובים של chemotactic האות התמרה חושית ואני אקטין שלד התא רשתות22. על-ידי החלת את הגירוי המכני חריפה במרווחי זמן שונים, להדגים, באופן דומה כדי chemoattractants, תגובה לגירויים מכני מפגין גם תכונות של מערכת טמפרמנט, כולל ההתנהגות all-or-none של התגובה תחת קולח תנאים ואת נוכחותם של תקופה עקשן. בסופו של דבר, על ידי שילוב של גירוי מכאני וכימי הראינו כי שני הגירויים לשתף האות התמרה חושית אקטין שלד התא ורשתות, המאפשרים סביר לשילוב של גירויים מרובים כדי נדידת תאים הסטייה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-1</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose peptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0120-17-6</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media (step 1.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-550-445</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S373-500</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P386-500</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN10040525</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media (step 1.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone (Bacto)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0118-17-0</td>
			<td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-100</td>
			<td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M65-500</td>
			<td>Use to prepare DB Buffer (step 1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td>Use to prepare DB Buffer (step 1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O1728-500</td>
			<td>Use to prepare caffeine (step 1.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-680-1100MG</td>
			<td>Use to prepare cAMP (step 1.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7876</td>
			<td>Use to prepare folic acid (step 1.7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610610</td>
			<td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610404</td>
			<td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S299-100</td>
			<td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-994-911</td>
			<td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyrophosphate decahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S390-500</td>
			<td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latrunculin A</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-T119-0100</td>
			<td>Use to prepare Latrunculin A (step 1.9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>3450029</td>
			<td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene fluoride membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620177</td>
			<td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2060</td>
			<td>Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4370</td>
			<td>Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA934-100UL</td>
			<td>Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1705060</td>
			<td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>PI46430</td>
			<td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PI20278</td>
			<td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K. aerogenes strain (non-pathogenic)</td>
			<td>Dicty Stock Center (dictybase.org)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772A</td>
			<td>Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene cup (5 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13915-985</td>
			<td>Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic unit with pump (ibidi Pump System)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td>Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide with a channel (&#956;-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80316</td>
			<td>Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10978</td>
			<td>Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10964</td>
			<td>Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Line for the drain (1.6 mm ID tubing)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10842</td>
			<td>Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40&#215;/1.25&#8211;0.75 oil objective (or a comparable alternative)</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>DM 16000</td>
			<td>An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5252000021D and 5192000027</td>
			<td>Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (Femtotip; 1 &#956;m outside diameter, 0.5 &#956;m inside diameter )</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930000035</td>
			<td>Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956.003</td>
			<td>Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-472</td>
			<td>Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-338</td>
			<td>Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software (Fiji)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td>Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Migration analysis software (Tracking Tool PRO)</td>
			<td>Gradientech</td>
			<td>http://gradientech.se/tracking-tool-pro/</td>
			<td>Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of dictyostelium discoideum response to acute mechanical stimulation

כימוטקסיס, או העברה את הדרגה של chemoattractant, הוא מצב הבין בצורה הטובה ביותר של ההעברה מכוונת. מחקרים באמצעות אמבה חברתית Dictyostelium discoideum גילה כי מורכבות האות התמרה חושית רשת של מסלולים מקבילים מגביר את התגובה chemoattractants, מוביל פלמור אקטין משוחד בליטה של פסאודופוד ב הכיוון של מעבר צבע. לעומת זאת, המנגנונים המולקולריים נהיגה סוגים אחרים של ההעברה מכוונת, לדוגמה, עקב חשיפה להטיית זרימה או שדות חשמליים, לא ידועים. הרגולטורים רבים כימוטקסיס התערוכה לוקליזציה המובילים או לקרטע קצה תא נודדים, כמו גם להציג שינויים חולף לוקליזציה או הפעלת בעקבות גירוי גלובלית עם chemoattractant. כדי להבין את המנגנונים המולקולריים של סוגים אחרים של ההעברה מכוונת פיתחנו שיטה המאפשרת בחינת הסלולר בתגובה חריפה גירוי מכני המבוסס על חשיפה קצר (2-5 s) להטיית זרימה. יכול להיות מועברת לגירוי הזה בערוץ תוך הדמיה תאים המבטאים שכותרתו fluorescently ביולוגיים לבחון התנהגות תא בודד. בנוסף, האוכלוסייה התא יכול להיות מגורה צלחת, lysed, ו immunoblotted באמצעות נוגדנים לזהות גירסאות פעיל של חלבונים עניין. על ידי שילוב שני מבחני, ניתן לבחון מגוון רחב של מולקולות מופעל על ידי שינויים לוקליזציה subcellular ו/או זירחון. בשיטה זו אנו נקבע כי גירוי מכני חריפה מפעיל הפעלה של התמרה חושית האות chemotactic ורשתות שלד התא אקטין. היכולת לבחון תגובות תאית חריפה גירוי מכני חשוב להבנת האירועים ייזום הכרחי עבור גזירה זרימה-induced תנועתיות. גישה זו מספקת גם כלי לימוד chemotactic האות התמרה חושית הרשת ללא השפעת מבלבלים הקולטן chemoattractant.

זמני תגובה של הרגולטורים כימוטקסיס גירוי מכני חריפה
כדי להעריך את התגובה של תאי discoideum ד כדי גירוי מכני, תאים מצבור המוסמכים חסיד נחשפו דופק קצרה של זרימה הטיה. צבירת-כשיר ד discoideum תאים מפרישים מחנה, אשר יכול להיות חש על ידי תאים שכנים. כדי להתגבר על התרומה של איתות התא-התא, תאים טופלו קפאין, אשר מעכב cyclase adenylyl ב discoideum ד , וכך מונע את הפרשת המחנה28. אכן, תאים טרום טיפול עם קפאין הייתה פעילות הבזליים מאוד נמוכה של PKBR1, ERK2, הראו עלייה חזקה זירחון של משקעי מפתח אלה kinases בעקבות גירוי s 5 בתזרים הטיה (איור 1 א'). ההיענות היתה ארעית, חולה סביב 10-15 s עבור PKBR1, וליד 30 s עבור ERK2, באופן דומה כדי בעבר לאור הממצאים לצורך הפעלה של חלבונים אלה עם chemoattractant7.
למרות שקשה להעריך את היעילות של התגובה בהתחשב לרמת הבסיס נמוך, מחקרים ראשוניים שהובילו התפתחות זו assay, בהשוואה גירוי בתזרים הטיה לבד (או עם רכב) כדי להטות את זרימת רכוש מחנה chemoattractant (איור 1B). ניתוח זה לא הראה עלייה בתגובה עם המחנה, רומז כי התגובה של הרשת התמרה חושית אות להטיית זרימה רוויה. למרות ב assay זה מחנה לא להגביר זירחון של PKBR1, יכול להיות שנצפו תאי בתגובה chemoattractant באמצעות פרוטוקול גירוי רגיל שבו תאים מצבור המוסמכים שמרו על ההשעיה, גירוי עם המחנה, lysed שונים בעקבות גירוי נקודות זמן. כפי שמוצג באיור 1C, תחת תנאים אלה יש עלייה PKBR1 זרחון בתגובה chemoattractant, אבל לא רכב חולף. התגובה שיא נצפית 30 s ב- assay הזה כי הטמפרטורה של התליה תא במהלך וזמינותו היא ~ 9 ° C, בהשוואה ל ~ 22 ° C עבור assay גירוי מכני שתוארו לעיל26.
ייתכן התגובה של המוביל, משתרך סמני קצה כדי גירוי מכני חריפה
מאז וזמינותו האוכלוסייה הנ ל רק מספק מידע זמני על ההתנהגות של הרגולטורים כימוטקסיס, תאים נחשפו גם לגירוי מכני קצר בזמן הנצפה עם מיקרוסקופ. Assay זה יכול להתבצע עם צבירת-המוסמכת או וגטטיבי לבטא ביולוגיים שונים עם התווית fluorescently, לוקליזציה אשר הוגדר בתאים מגורה עם chemoattractant תאים discoideum ד . שני הקצה המוביל סמנים, תחום ה-PH של Crac וסידΔcoil, אשר גייסו ידי PIP3 או אקטין polymerized החדש, שניהם הראו בעיקר cytosolic לוקליזציה בתאים resting כפי שדווחה בעבר (איור 2 א, משלימה סרט 1 )4,29. התאים היו פעילים basally, ביולוגיים אלה גם ניתן היה לראות על קצות pseudopods. בעקבות גירוי בתזרים הטיה 2 s, את ביולוגיים relocalized במהירות אל קליפת המוח עם שיא ב ~ 6 עד 10 s, וחזר אל ציטוזול מאת ~ 30 s. לעומת זאת, סמן קצה לקרטע PTEN מקומי-קליפת לפני גירוי (איור 2 א). לאחר דופק קצרה עם הטיה זרימה, עוצמת PTEN cytosolic גדל, אמנם עם דינמיקה איטי יותר מאשר עבור ביולוגיים הקצה המוביל. שינוי ביוסנסור לוקליזציה של ציטוזול קליפת המוח, ולהיפך, הוא ראה בבירור כמו שינוי בעוצמת cytosolic המאפשר כימות פשוטה של התגובה.
התנהלות ביולוגיים בתגובה חריפה גירוי מכני שנצפה הוא עקבי עם מובילים, משתרך קצה dynamics לוקליזציה בתגובה לגירוי עם chemoattractant אחיד. התנהגות זו איננה ייחודית ביולוגיים שלוש המוצגים. כפי שפורסמו בעבר, בדומה לשינויים לוקליזציה נצפו גם עבור סמני החדשנית "rbd" ו RalGDS, אשר מזהה מופעל Ras ו- Rap1, בהתאמה, כמו גם באשר פיגר אחריו עוד קצה סמן22,CynA30.
Assay דומים ניתן להעריך את ההשפעות של מעכבי שונים על-ידי שינוי פשוט של ההתקנה ניסיוני מקו קלט אחד אחד כפול. באמצעות שיטה זו, התאים יכולים להיות נחשפה לראשונה לתנאי בקרה, ואחר כך הוא החליף את המאגר המכיל את הסוכן המבחן הרצוי. לדוגמה, תוספת של תרופה depolymerizing-אקטין LatA חסם את התגובה של RBD, כמו גם לייםΔcoil, כדי גירוי מכני חריפה (איור 2B).
התגובה הכללית מקדים נדידת תאים תחת גירוי ממושך עם הטיה זרימה
הגישה המתוארת כאן גם יכול להיות מותאם כדי לחקור את ההשפעות של זרימה הטיה על הגירה discoideum ד . למעשה, אם הזרם היה לא כבה לאחר 2 s אבל נשארו על משך זמן הניסוי, תאי צמח הראה ביים ההעברה נגד הזרם (איור 32 הסרט משלים). יצוין, כי הזרם הטיה צורך מביאות לתגובה הנדידה היה נמוך יותר מאשר הלחץ בו בדרך כלל כדי להשיג מענה עם גירוי אקוטי בתאי צמח (לדוגמה, כפי שניתן לראות להבין 2B). עם זאת, אפילו בלחץ נמוך, תאים מוצגים תגובה אחידה חזקים, כפי שהיא נמדדת על ידי שינוי בלוקליזציהΔcoil ליים, שקדמה לכל שינוי בעמדה של התא עצמו. לפיכך, הניסויים הראו בבירור כי 1) התגובה הכללית אינה תלויה על תנועת התא, 2) התגובה הכללית מקדם ההעברה מכוונת.
גישות חלופיות של בדיקות בתגובה חריפה גירוי מכני
למרות השימוש תא זרימה דרך יש יתרונות משמעותיים עבור חקר בתגובה חריפה גירוי מכני, אנחנו גם תוקף שני מבחני נוספים לבדיקת התגובה של תאים בודדים גירוי מכני חריפה. כפי שמוצג באיור4, לייםΔcoil במהירות, transiently מחדש מקומית מ ציטוזול קליפת המוח כאשר התאים היו מגורה על ידי תוספת בולוס של מאגר נמסרות או על ידי micropipette (איור 4A) או באופן ידני באמצעות בצובר בנוסף המאגר עם פיפטה (איור 4B). יצוין, כי בעמדת נחיתות ברורה של שני מבחני אלה הוא כי הסכום המדויק בכוח גזירה להעביר את התא אינו ידוע, לא יכול להיות מגוון בקלות. עם זאת, עבור מצבים בו מעבר בין גירויים מכניים וכימיים היא הרצויה, בצובר מאגר תוספת מציע אלטרנטיבה מוצק הגירוי במכשיר זרימה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56411/56411fig1.jpg"> 
איור 1: נציג תוצאות עבור הערכה הביוכימי של התגובה של התאים discoideum ד כדי גירוי כימי מכניים או חריפה. צבירת-המוסמכת תאים נחשפו לגירויים כימי או מכני, lysed בנקודות זמן המצוין, ואת immunoblotted באמצעות נוגדנים מזהה phosphorylated PKBR1 או ERK2. (א) דוגל התאים היו מגורה על תפקודי לב / 5 s. הקרום היה מוכתם עם Coomassie מבריק כחול (CBB) כדי להראות שווה חלבון טעינה. (B) תאים חסיד היו מגורה על ידי תנועה ידני של הצלחת באופן cross-wise עבור הבאים s כ 5 גירוי כימי בשל תוספת של 1 מיקרומטר למחנה או מאגר (הרכב), או ללא כל גירוי כימי (-). Immunoblots שני הצג את היקף וריאציה הפעלת הבזליים PKBR1 ראיתי בזמן 0. לעיתים, הפעלת PKBA יכול גם יזוהו על-ידי טכניקה זו, כפי שמוצג בחלונית התחתונה. (ג) השעיה התאים היו מגורה עם 1 מיקרומטר למחנה או מאגר (הרכב). (א) חלק איור זה השתנה מ Artemenko et al. (2016) 22. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56411/56411fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56411/56411fig2.jpg"> 
איור 2: נציג תוצאות עבור גירוי מכני חריפה והדימות בשידור חי של תאים בודדים על המיקרוסקופ. (א) צבירת-כשיר discoideum ד תאים ליים מתויג RFP לביטויΔcoil, או מתויג GFP PH-Crac או PTEN היו מגורה עם כיווני זרימה שכבתית-15 רמות דינ/cm2 עבור 2 עד 5 תמונות ס' היו נאספים כל 3 s . נציג תאים מציג טרנסלוקציה של ביולוגיים בתגובה גירוי מכני מוצגים. הצטברות של כל ביוסנסור-קליפת הייתה לכמת כמו ההופכי של עוצמת cytoplasmic רשע מנורמל בפעם 0. התגובה הממוצע של 18 (סידΔcoil), 20 (PH-Crac) או 6 תאים (PTEN) מוצג. ערכים הם מתכוון ± SE. (B) תאי צמח ביטוי מתויג RFP סידΔcoil- RFP ו מתויג GFP RBD טופלו עם הרכב או 5 מיקרומטר LatA למשך 15 דקות לפחות, ו מגורה ואז עם כיווני זרימה שכבתית-רמות דינ/cm 412 2 ס תמונות נאספו כל 3 ס' RBD-GFP, סידΔcoil- RFP הצטברות-קליפת הייתה לכמת כמו (A). ערכים הם זאת אומרת ± SE. מספר התאים ניתח מסומן לצד כל תנאי. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. דמות זו שונתה מ. Artemenko et al. (2016) 22. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56411/56411fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56411/56411fig3.jpg"> 
איור 3: נציג תוצאות עבור התגובה של התאים discoideum ד כדי גירוי ממושך עם זרימה. (א) תאי צמח ביטוי מתויג RFP לייםΔcoil נחשפו רציפה חד כיווני זרימה שכבתית-15 רמות דינ/cm2 , עם תמונה כל 3 מסלולים ס' 11 תאים מוצגות באיור (B). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. דמות זו שונתה מ. Artemenko et al. (2016) 22. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56411/56411fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56411/56411fig4.jpg"> 
איור 4: נציג תוצאות עבור גישות אלטרנטיביות בדיקות בתגובה חריפה גירוי מכני. (א) צמח discoideum ד תאים לביטוי מתויג RFP לייםΔcoil נחשפו micropipette (*) basally שחרור assay מאגר בקצב איטי. עלייה קצרה קצב הזרימה הושג על-ידי אספקה מהירה של סיילין assay מאגר בזמן 0. תמונות שנאספו באמצעות תאים 3 כל צמח discoideum ד ס (B) ביטוי מתויג RFP לייםΔcoil מצופה כמו ירידה קטנה בתוך תא מיקרוסקופ היו מגורה באופן מכני על ידי תוספת של נפח גדול של המאגר . תא תמונות שנאספו כל 3 ס' סולם בר = 10 מיקרומטר. (א) חלק דמות זו שונתה מ. Artemenko et al. (2016) 22. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56411/56411fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
משלימה סרט 1: גירוי מכני חריפה מפעיל מהירה וחולף טרנסלוקציה של סידΔcoil- RFP או PH-Crac-GFP מן ציטוזול אל קליפת המוח בצבירת-כשיר discoideum ד תאים המבטאים ביולוגיים אלה. זרימה שכבתית חד כיווני היה מופעל עבור 5 s בזמן 0 ותאים היו עם תמונה במרווחי s 3. מהירות ההפעלה הוא 5 מסגרות/s. שתי דוגמאות עבור כל קו תא מוצגים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. הסרט הזה מקביל איור 2A , שונתה מ. Artemenko et al. (2016) 22. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56411/Suppl_Mov_1_060417.avi">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
הסרט משלים 2: גירוי מכני רציפה מפעיל מהירה וחולף טרנסלוקציה של סידΔcoil- RFP מ ציטוזול אל קליפת המוח לפני ההעברה של תאים נגד כיוון הזרימה. התאים וגטטיבי לבטא סידΔcoil- RFP היו חשופים גזירה רציפה-15 רמות דינ/cm2 מתחיל בזמן 0, עם תמונה במרווחי s 3. מהירות ההפעלה הוא 10 מסגרות/ס סולם בר = 10 מיקרומטר. הסרט הזה המתאים באיור 3 , שפורסם בעבר ב- Artemenko. et al. (2016) 22. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56411/Suppl_Mov_2_060417.avi">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation at JoVE.com

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

הערכה של Dictyostelium discoideum בתגובה חריפה גירוי מכני

כאן נתאר שיטות להערכת הסלולר בתגובה חריפה גירוי מכני. ב וזמינותו מבוסס מיקרוסקופיה, אנו בוחנים לוקליזציה של ביולוגיים שכותרתו fluorescently בעקבות גירוי קצרה עם הטיה זרימה. אנחנו גם בדיקת ההפעלה של חלבונים שונים עניין בתגובה חריפה גירוי מכני מבחינה ביוכימית.

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

assessment-dictyostelium-discoideum-response-to-acute-mechanical

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

6.9K Views.  SUNY Oswego. כאן נתאר שיטות להערכת הסלולר בתגובה חריפה גירוי מכני. ב וזמינותו מבוסס מיקרוסקופיה, אנו בוחנים לוקליזציה של ביולוגיים שכותרתו fluorescently בעקבות גירוי קצרה עם הטיה זרימה. אנחנו גם בדיקת ההפעלה של חלבונים שונים עניין בתגובה חריפה גירוי מכני מבחינה ביוכימית.

Video: Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Mechanical Stimulation of Stem Cells Using Cyclic Uniaxial Strain

The role of mechanical forces in the development and maintenance of biological tissues is well documented, including several mechanically regulated phenomena such as bone remodeling, muscular hypertrophy, and smooth muscle cell plasticity. However, the forces involved are often extremely complex and difficult to monitor and control in vivo. To better investigate the effects of mechanical forces on cells, we have developed an in vitro method for applying uniaxial cyclic tensile strain to adherent cells cultured on elastic membranes. This method utilizes a custom-designed bioreactor with a motorized cam-rotor system to apply the desired force. Here we present a step-by-step video protocol demonstrating how to assemble the various components of each "stretch chamber", including, in this case, a silicone membrane with micropatterned topography to orient the cells with the direction of the strain. We also describe procedures for sterilizing the chambers, seeding cells onto the membrane, latching the chamber into the bioreactor, and adjusting the mechanical parameters (i.e. magnitude and rate of strain). The procedures outlined in this particular protocol are specific for seeding human mesenchymal stem cells onto silicone membranes with 10 &micro;m wide channels oriented parallel to the direction of strain. However, the methods and materials presented in this system are flexible enough to accommodate a number of variations on this theme: strain rate, magnitude, duration, cell type, membrane topography, membrane coating, etc. can all be tailored to the desired application or outcome. This is a robust method for investigating the effects of uniaxial tensile strain applied to cells in vitro.

It is widely understood that mechanical forces in the body can influence cell differentiation and proliferation. Here we present a video protocol demonstrating the use of a custom-built bioreactor for delivering uniaxial cyclic tensile strain to stem cells cultured on flexible micropatterned substrates.

גירוי מכני של גזע תאים באמצעות מסננים uniaxial מחזורי

The role of mechanical forces in the development and maintenance of biological tissues is well documented, including several mechanically regulated ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

שימוש בתגובה optokinetic ללמוד לתפקד החזותי של דג הזברה

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to investigate cells behavior at sub-cellular level with high spatial and temporal resolution was developed. Thus, an atomic force microscope (AFM) was integrated with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy and fast-spinning disk (FSD) confocal microscopy. The integrated system is broadly applicable across a wide range of molecular dynamic studies in any adherent live cells, allowing direct optical imaging of cell responses to mechanical stimulation in real-time. Significant rearrangement of the actin filaments and focal adhesions was shown due to local mechanical stimulation at the apical cell surface that induced changes into the cellular structure throughout the cell body. These innovative techniques will provide new information for understanding live cell restructuring and dynamics in response to mechanical force. A detailed protocol and a representative data set that show live cell response to mechanical stimulation are presented.

This paper aims to instruct the reader in the operation of an integrated atomic force-optical imaging microscope for mechanical stimulation of live cells in culture. A step-by-step protocol is presented. A representative data set that shows live cell response to mechanical stimulation is presented.

תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microinjections תוך ורידי של הזחלים דג הזברה לחקר פגיעה כליות חריפה

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

קולטן הדמיה G-חלבון יחד (GPCR) בתיווך אירועים איתות כי הפיקוח של Chemotaxis Discoideum Dictyostelium</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy this deficiency, several medical interventions have been developed. One such method is to resurface the damaged area with tissue-engineered cartilage; however, the engineered tissue typically lacks the biochemical properties and durability of native cartilage, questioning its long-term survivability. This limits the application of cartilage tissue engineering to the repair of small focal defects, relying on the surrounding tissue to protect the implanted material. To improve the properties of the developed tissue, mechanical stimulation is a popular method utilized to enhance the synthesis of cartilaginous extracellular matrix as well as the resultant mechanical properties of the engineered tissue. Mechanical stimulation applies forces to the tissue constructs analogous to those experienced in vivo. This is based on the premise that the mechanical environment, in part, regulates the development and maintenance of native tissue1,2. The most commonly applied form of mechanical stimulation in cartilage tissue engineering is dynamic compression at physiologic strains of approximately 5-20% at a frequency of 1 Hz1,3. Several studies have investigated the effects of dynamic compression and have shown it to have a positive effect on chondrocyte metabolism and biosynthesis, ultimately affecting the functional properties of the developed tissue4-8. In this paper, we illustrate the method to mechanically stimulate chondrocyte-agarose hydrogel constructs under dynamic compression and analyze changes in biosynthesis through biochemical and radioisotope assays. This method can also be readily modified to assess any potentially induced changes in cellular response as a result of mechanical stimuli.

The biosynthesis of cartilaginous extracellular matrix by chondrocytes can be affected by application of mechanical stimuli. This method describes the technique of applying dynamic compressive strains to chondrocytes encapsulated in 3D constructs and the evaluation of induced changes in chondrocyte metabolism.

גירוי מכאני של הידרוג Chondrocyte-agarose

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the brain, liver, retina, cochlea and vasculature. In experimental settings, intercellular Ca2+-waves can be elicited by applying a mechanical stimulus to a single cell. This leads to the release of the intracellular signaling molecules IP3 and Ca2+ that initiate the propagation of the Ca2+-wave concentrically from the mechanically stimulated cell to the neighboring cells. The main molecular pathways that control intercellular Ca2+-wave propagation are provided by gap junction channels through the direct transfer of IP3 and by hemichannels through the release of ATP. Identification and characterization of the properties and regulation of different connexin and pannexin isoforms as gap junction channels and hemichannels are allowed by the quantification of the spread of the intercellular Ca2+-wave, siRNA, and the use of inhibitors of gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-wave in monolayers of primary corneal endothelial cells loaded with Fluo4-AM in response to a controlled and localized mechanical stimulus provoked by an acute, short-lasting deformation of the cell as a result of touching the cell membrane with a micromanipulator-controlled glass micropipette with a tip diameter of less than 1 &mu;m. We also describe the isolation of primary bovine corneal endothelial cells and its use as model system to assess Cx43-hemichannel activity as the driven force for intercellular Ca2+-waves through the release of ATP. Finally, we discuss the use, advantages, limitations and alternatives of this method in the context of gap junction channel and hemichannel research.

Intercellular Ca2+-waves are driven by gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-waves in cell monolayers in response to a local single-cell mechanical stimulus and its application to investigate the properties and regulation of gap junction channels and hemichannels.

הרבייה מכאנית מושרה גירוי סיד גל בmonolayers הסלולרי: דוגמה לתאי אנדותל קרני שור

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular development program, during which single cells chemotax towards aggregation centers1-4. This process is dependent on the release of cyclic adenosine monophosphate (cAMP)5. cAMP is produced in waves through the concerted action of adenylate cyclase and phosphodiesterases, and binds to G protein-coupled cAMP receptors6,7. A widely used assay to analyze the mechanisms involved in the developmental cycle of the lower eukaryote Dictyostelium discoideum is based on the observation of cell aggregation in submerged conditions8,9. This protocol describes the analysis of the role of coronin A in the developmental cycle by starvation in tissue-culture plates submerged in balanced salt solution (BSS)10. Coronin A is a member of the widely conserved protein family of coronins that have been implicated in a wide variety of activities11,12. Dictyostelium cells lacking coronin A are unable to form multicellular aggregates, and this defect can be rescued by supplying pulses of cAMP, suggesting that coronin A acts upstream of the cAMP cascade10. The techniques described in these studies provide robust tools to investigate functions of proteins during the initial stages of the developmental cycle of Dictyostelium discoideum upstream of the cAMP cascade. Therefore, utilizing this aggregation assay may allow the further study of coronin A function and advance our understanding of coronin biology.

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.

חקירת הפונקציה של Coronin במענה הרעב מוקדם של<em&gt; Discoideum Dictyostelium</em&gt; באמצעות אגרגציה מבחנים

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

ניתוח Cell Surface שיפוץ הדבקה בתגובה מתח מכני באמצעות חרוזים מגנטיים

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...