DNAとRNAマイクロアレイは、核酸とタンパク質の相互作用を研究するのに非常に有用ですが、配列ライブラリの調製にも便利な方法です。フォトリソグラフィは、数十万のユニークな配列を並列に合成することを可能にし、現在マイクロアレイ上のRNA合成のための唯一の直接的な方法です。マイクロアレイのin in 光リソグラフィー合成は、例えばペプチド核酸の2つの素数フルオロを用いて、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドに拡張することもできる。
マイクロアレイの製造と取り扱いのプロセスを見ることは、この複雑な機械がよく知られている標準的な固相DNA合成からどのように開発されたかを理解するのに役立ちます。テキスト プロトコルで説明されているように、マイクロアレイの設計とスライドの機能化からこの手順を開始します。DNAシンセサイザUV LEDとその冷却ファンをオンにします。
UV 光の焦点に UV 強度メーターを取り付け、オンにします。コンピュータで、WiCell コントローラ ソフトウェアを起動します。マイクロメアデバイスの電源を入れ、初期化します。
DMD を右クリックし、ロード イメージを選択して、すべての白いマスク ファイルを読み込みます。UVS アイコンを右クリックし、[UV シャッターを開く]を選択します。強度計の電源値を読み取り、60 秒をカウントします。
60 秒後、電源の値をもう一度読み取り、開始値と終了値をメモします。UVシャッターを閉じると、近くにUVシャッターを選択し、強度計をオフにします。平均 UV 強度値をミリメートルあたり平方メートルのミリワットで計算します。
WiCell ソフトウェアで、ジョブ、シーケンス、およびプロトコル ファイルをそれぞれのサブウィンドウに読み込み、[送信] をクリックしてシーケンス ファイルとプロトコル ファイルを DNA シンセサイザに送信します。合成細胞を組み立てるために、細胞の石英ブロック上に厚いパーフルオロエラストマーガスケットを置く。次に、最初のガスケットの上にドリルされた機能的な顕微鏡スライドを置き、スライド上の穴が合成セルの入口と出口チューブと接続することを確認します。
2つの穴を囲む、掘削されたスライドの上に2番目の薄いポリテトラフルオロエチレンガスケットを置きます。最後に、2番目のガスケットの上に、機能化された未掘削スライドを2つ目のスライドに置きます。今組み立てられた二重基質セルの上に4スクリューの金属フレームを置くトルクドライバーを使用して同じクランプ力にスクリューを締めます。
入口と出口チューブをDNAシンセサイザーに取り付けます。アセトニトリル洗浄ラインをプライムし、基材を通るアセトニトリルの適切な流れを確認します。アセトニトリルプライミングの7サイクルを経た後、廃棄物ラインでアセトニトリルの体積を測定します。
このボリュームは2ミリリットルでなければなりません.着信UV光の焦点面に合成セルを取り付けます。ライブラリ調製の場合、余分な入口と出口線を細胞の背面に取り付け、バックチャンバに2ミリリットルのベタカロテン溶液を充填します。
最初に WiCell ソフトウェアで実行をクリックして合成を開始します。ジョブファイルの最初の待機コマンドで、DNAシンセサイザーの start を押します。通常のマイクロアレイを合成した後、セルをシンセサイザーから切り離し、セルを分解します。
ダイヤモンドペンを使用して、合成番号をガラススライドにエッチングします。各スライドの非合成面に番号をエッチングします。スライドを50ミリリットルの遠心管に移し、さらに使用するまで乾燥した領域に保管します。
ライブラリーマイクロアレイの合成後、まずベタカロテン溶液をチャンバーから排出し、次いで、5ミリリットルの塩化メチレンを流してチャンバーを2回洗浄してから水切りします。DNAマイクロアーリー脱保護のために、染色ガラス瓶に20ミリリットルのエタノールと20ミリリットルのEDAを充填します。DNAのみのマイクロアレイを瓶の中に縦に入れ、蓋を閉め、スライドを残して室温で2時間保護を解除します。
2時間後、ピンセットを使用してスライドを取り出し、二重蒸留水で十分に洗い流します。スライドを乾燥剤に保存する前に、マイクロアレイ遠心分離機で数秒乾かします。RNAマイクロアレイ脱保護のために、50ミリリットル遠心分離管に20ミリリットルトリエチルアミンと30ミリリットルのアセトニトリルの乾燥溶液を調製する。
1つのRNAマイクロアレイスライドを遠心管に移し、蓋を閉じ、プラスチックシールフィルムで包みます。軌道シェーカーの遠心管を室温で1時間30分静かに振ります。次に、スライドを取り外し、20ミリリットルの乾燥アセトニトリルで2回洗浄してから、マイクロアレイ遠心分離機で数秒間乾燥させます。
最初の脱保護ステップに続いて、RNAスライドをヒドラジン水和物溶液に移し、蓋を閉じ、プラスチックシールフィルムで包みます。軌道シェーカーで2時間静かに揺れた後、スライドを取り外し、20ミリリットルの乾燥アセトニトリルで2回洗います。その後、マイクロアレイ遠心分離機で数秒間乾燥します。
RNAマイクロアレイにもDNAヌクレオチドが含まれている場合は、第3の脱保護工程を進める。1対1のEDAエタノール溶液を含む50ミリリットルチューブにDNA/RNAマイクロアレイを加え、室温で5分後にスライドを取り除き、20ミリリットルの滅菌水でマイクロアレイを2回洗浄します。マイクロアレイ遠心分離機でスライドを乾燥させ、デシケータに保管します。
1.5ミリリットルの無菌マイクロ遠心チューブで、テキストプロトコルに記載されているように、Cy3標識DNAを含むハイブリダイゼーションバッファーを調製する。溶液を混ぜて渦を出します。自己接着性300マイクロリットルハイブリタイズチャンバーを、ハイブリダイゼーション液の各スライドおよびピペットの合成領域に慎重に配置します。
粘着ドットでチャンバーの穴を覆い、スライド全体をアルミホイルで包みます。マイクロアレイスライドをハイブリダイゼーションオーブンに入れ、蓋をして、選択したハイブリダイゼーション温度で2時間静かに回転させます。2時間後、スライドを取り外し、アルミホイルを取り出し、ハイブリダイゼーション溶液をピペットアウトし、ハイブリダイゼーションチャンバーを慎重に引き裂きます。
30ミリリットルの非ストリンジェントウォッシュバッファーを含む遠心分離管にスライドを移します。室温で2分間激しく振ります。30ミリリットルのストリンジェントウォッシュバッファーを含む遠心分離管にスライドを移し、1分間激しく振ります。
最後に、スライドを30ミリリットルの最終洗浄バッファーを含む遠心分離管に移します。数秒間振ります。マイクロアレイ遠心分離機でスライドを乾燥させます。
さて、マイクロアレイスキャナーのスライドホルダーに、ドライマイクロアレイ、合成領域を下向きに置きます。DNAライブラリーを脱保護および切断するには、スライドを切断溶液に浸し、50ミリリットルの遠心分離チューブに入れる。チューブを閉じ、プラスチック製のシーリングフィルムで包み、軌道シェーカーで室温で2時間静かに回転させます。
2時間後、スライドを取り外し、乾燥したアセトニトリルを20ミリリットルで2回洗ってから空気を乾燥させます。ピペットを使用して、100マイクロリットルの滅菌水を現在識別可能な合成領域に塗布します。1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移す前に、溶液を数回上下にピペトします。
プロセスを繰り返し、マイクロアレイ溶出を同じチューブに結合します。チップを蒸発させて乾燥し、ヌクレアーゼを含まないH2Oの10マイクロリットルに再溶解します。ここに示されているのは、25mer配列のDNAおよびRNAバージョンを含むマイクロアレイに対して行われるハイブリダイゼーションアッセイの結果である。
スキャンインは、励起に対応するグリーンスケール形式で表示され、Cy3蛍光の発光スペクトルは、任意の単位で記録された蛍光強度を有する。実験の間の絶対蛍光値には有意な変動がある。同じ製造パラメータと同じ合成後処理を使用した3つの独立した合成の結果が示されている。
25mer DNAは、その相補的なCy3標識DNA鎖にハイブリダイズすると、20,000から30,000の範囲の蛍光シグナルを生み出します。25mer RNAは、同じCy3標識DNA補体にハイブリダイズした場合、15,000から20,000までの対応する特徴に蛍光強度を与える。しかし、RNA/DNA二重鎖の蛍光強度は、対応するDNA/DNA二重が20,000〜30,000の範囲内で蛍光を発する場合、時折8,000を下回ります。
このような場合、RNAの結果は最適ではないとみなすことができます。他のRNAベースの実験と同様に、RNAマイクロアレイは分解に敏感であり、滅菌条件下で処理する必要があることを覚えておくことが重要です。マイクロアレイから収集された核酸ライブラリーは、DNAまたはRNAシーケンシング、およびDNAに関するデジタル情報のコード化に使用できます。
NEDは、直接見るべきではない強烈なUV光を生成します。このため、楽器が使用中の間は保護ゴーグルを着用することをお勧めします。
