이 작품은 싱가포르 교육 (MOE) 계층 1의 (RGT3/13 및 RG42/15 G.C.)와 모에 계층 2 (MOE2013-t 2-2-024 및 MOE2015-t 2-1-028 G.C.에)에 의해 지원 되었다.

여기에서 보고 된 작업에 따라 (팻/179/14/15/PCT) 특허 출원을 제기 했다.

RNA 이중 바인딩 PNA 올리고 (예를 들어, 10 메)는 중간 크기의 분자 그리고 따라서 표시할 수 있습니다 바인딩 시 전기 이동 기동성 교대 RNAs를 비교 또는 약간 더 큰 크기 (예를 들어, 50-메 르 또는 더 작은). RNA PNA 보다 상당히 큰 경우에, 제한 된 젤 기동성 교대 때문 RNA에 PNA의 적정 작동 하지 않을 수 있습니다. 따라서, 비 변성 시키기 페이지 분석 실험에 대 한 큰 RNA는 잘릴 수 있습니다. Fluorophore 표시 된 PNA에 큰 RNA의 적정 감시를 위한 세 겹 형성 비 변성 시키기 agarose 젤에 의해 젤40중간 로드 샘플 수 있습니다.
RNA의 일정 총 농도와 비 변성 시키기 페이지 적정 실험을 위해 우리는 일반적으로 효율적인 게시물 ethidium 평범한 사람에 의해 무료 RNA와 트리플 밴드의 얼룩에 대 한 1 µ M의 레이블이 RNA 농도 사용 합니다. RNA 농도 0.2 µ M로 낮은 RNA 구조31에 따라 충분 한 있을 수 있습니다. 레이블이 없는 RNA의 농도 (0.2 µ M)를 정확 하 게 측정 될 수 있다 Kd 값은 0.2 µ M에 대 한 또는 더 큰 이어야 합니다 결정 합니다. 다른 얼룩 염료 착 효율을 향상 시키기 위해 사용할 수 있습니다. 또는 게시 되지 않은 데이터 Cy3 염료-표시 된 RNAs 꽉 바인딩 이벤트 측정 하 비 변성 시키기 페이지 실험에 사용할 수 있습니다 것이 좋습니다.
사실은 2-aminopurine은 적당히 형광만, 2-aminopurine 형광 적정도 Kd 값 0.2 µ M31이상 가까이 바인딩의 측정에 제한 됩니다. RNA 또는 PNA 측정 형광 적정을 통해 솔루션에 상대적으로 꽉 바인딩 바인딩 변경 형광 신호53,54, 경우에 상대적으로 밝은 염료와 함께 표시 될 수 있습니다. 55.
DsRNA 바인딩 PNAs에 의해 RNA 구조를 대상으로 전략 RNAs의 제한 된 수에 대 한 테스트 되었습니다. 바인딩 속성 따라 달라질 수 있습니다 다른 시퀀스와 자료 쌍 작곡으로 dsRNAs 높습니다. 하나는 항상 TFPNAs의 디자인에 대 한 이중의 퓨 린 부유한 가닥을 선택할 수 있습니다. 어떻게 연속 Q·를 이해 하는 것이 중요 C G 세 배는 삼박자의 안정성에 영향을 수 있습니다. 더 광범위 한 시퀀스 종속 연구 명확 하 게 TFPNAs의 시퀀스 종속 바인딩 속성을 이해 하는 것 필요 합니다.
TFPNAs의 바인딩 선호도 길이 증가 및/또는 추가는 기초 및 백본56,57 TFPNAs의 수정 더 향상 될 수 있습니다. 그러나, 연속 이중 지역 수 있습니다 자주 구성 하지 중단 없이 10 개 이상의 연속 기본적인 쌍의 비 왓슨 크릭 구조에 의해. 하나 비 왓슨 크릭 구조 dsRNA 지역에 인접 한의 인식에 대 한 작은 분자와 TFPNAs 켤레 있습니다. 원칙적으로, TFPNA-작은 분자 공액 바인딩 친 화력과 특이성 TFPNA 또는 작은 분자 혼자에 비해 향상 예정입니다. 그러나,는 활용58,59,60,61,,6263,64에 대 한 링커의 화학 및 물리적 특성 최적화 해야 합니다.
TFPNAs 바인딩할 수 있는 선택적으로 dsRNAs ssRNAs와 dsDNAs는 사실 매우 유용한 화학 프로브 및 RNA 구조 역학 및 상호작용의 규칙을 통해 잠재적인 치료 ligands로 TFPNAs를 개발 하는 것을 제안합니다 단백질 그리고 대사 산물입니다. TFPNAs의 세포질 통풍 관 작은 분자, 펩 티 드, 등 나노 입자, 세포 관통 moieties로 활용 또는 리5,6 같은 supramolecular 구조 complexation을 통해 촉진 될 수 있습니다. ,12,17,25,31,41,,6566. 더 fluorophores 등 radioisotopes bioimaging 태그와 TFPNAs의 기능화 용이 하 게 하는 검색, 이미징, 및 살아있는 유기 체에서 기능 RNA 구조를 대상으로 수 있습니다.

RNAs는 중요 한 생체 및 규칙에서 RNAs의 역할의 발견과 다양 한 생물 학적 과정1,2,3의 촉매의 최근 발전으로 인해 치료 대상으로 등장 하고있다. 전통적으로, 센스 가닥 왓슨 크릭 이중 형성3,,45,6,7,8, ssRNAs 바인딩할 사용 되었습니다. 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. 최근, 펩 티 드 핵 산 세 겹 형성 (TFPNAs) Hoogsteen 수소 결합 (그림 1)3,,2829통해 dsRNAs 바인딩할 설계 되었습니다. dsRNA는 사전 mRNAs와 mRNAs, 사전 또는 pri miRNAs3, 그리고 많은 다른 비 코딩 RNAs1,,2627를 포함 하 여 전통적인 antisense 대상 RNAs의 대부분에 존재. TFPNAs를 사용 하 여 트리플 헬릭스 형성을 통해 dsRNAs 타겟팅의 구조 특이성 때문에 유리한 수 있습니다 고는 dysregulated 질병, 예를 들면 RNAs의 정상적인 기능을 복원에 사용 하기 위해 큰 잠재력입니다.
최근에 출판 된3,,2829,30,31,32,33, Rozners 그 외 여러분, 그리고 우리에 의해 작동 34,35,36,,3738,39,40,41, 개선에 노력을 보고 향상 된 선호도 dsRNAs 향해 수정된 TFPNAs의 선택적 바인딩. Thio-pseudoisocytosine (L) 단위체30 및 guanidine 수정 5-메 틸 시 토 신 (Q) 단위체31를 포함 하 여 합리적으로 설계 된 PNA 단위체 (그림 2)에 대 한 합성 방법을 개발 했습니다. 다양 한 생 화 확 및 생물 특성 방법을 통해 우리는 상대적으로 짧은 PNAs (6-10 잔류물) L과 Q 잔류물 통합 표시 왓슨 크릭 G-C와 C-G 기본적인 쌍의 향상 된 인식 각각 dsRNAs 설명 했다. PNAs L과 Q 잔류물을 포함 하는 또한, ssRNA 이상과 dsDNA dsRNA 향해 더 선택적 바인딩을 표시 수정 되지 않은 PNAs에 비해. Q 자료에 guanidine 기능42 PNAs를 HeLa 세포31입력을 수 있습니다.
우리의 실험실에서 우리는 PNAs 수동 Boc 화학에 의해 합성 (Boc 또는 t-Boc tert-butyloxycarbony에 대 한 서 ( 그림 2참조) 단단한 단계 펩 티 드 합성 방법4. Boc 그룹은 sterically 덜 PNA 모노 머 연결 하는 동안 도움이 될 수 있습니다 그룹을 보호 하는 fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) 아민에 비해 부피가 큰 그룹을 보호 하는 아민으로 Boc와 PNA 단량체의 합성은 편리 합니다 단단한 지원입니다. Boc 그룹 산 정한 이며 제거할 수 있습니다 쉽게 고체 지원에 dichloromethane (DCM)에 20-50 %trifluoroacetic 산 (TFA) PNA 합성 하는 동안. 자동된 펩타이드 합성기 PNA 올리고; 합성 채택 될 수 있다 그러나, 3 5 배 초과 PNA 단위체의 자동된 펩타이드 합성기 필요 합니다. 수동 합성 훨씬 적은 PNA 단위체를 (2-3-배 초과), 각 커플링 쉽게 카이 저 테스트43에 의해 모니터링이 필요 합니다. 또한, 많은 자동된 합성기 호환 되지 않습니다 부식성 TFA의 사용으로 인해 Boc 전략 합성 Boc 제거 단계.
PNA 올리고 역 상 고성능 액체 착 색 인쇄기 (라인란트-HPLC) MALDI TOF에 의해 분자량 특성 뒤에 의해 순화 될 수 있다 (그림 3 및 4)30, 31. 우리 고용 세 겹 형성 모니터링, 인해는 사실 무료 RNA 이중 구성 및 PNA 바인딩된 triplexes 종종 표시 다른 마이그레이션 속도 (그림 5)30,31 페이지 비 변성 시키기 . 효율적인 포스트 얼룩 RNA 이중 및 PNA· 둘 다를 위해 달성 될 수 있다 필요 없는 라벨 RNA2 트리플 밴드입니다. 비교적 적은 양의 샘플 페이지 실험 비 변성 시키기 위해 필요 하다. 그러나, 로드 (부 화) 버퍼 및 실행 버퍼 (pH 8.3) 않을 수 있습니다 같은, 비교적 높은 pH 8.3의 크게는 삼박자를 불안정 수 있습니다 때문에 접착 안정적인 triplexes 제한 되 고 측정 결과.
2 Aminopurine는 아데닌 (6-aminopurine);의 이성질체 2 aminopurine 형광 강도 (약 370에서 방출 피크 nm) 지역 구조 환경 변화에 민감한 이며 적합 한 바인딩 사이트 (PNA 근처 통합 트리 2 aminopurine 잔류물 형성의 모니터링에 대 한 그림 6) 31. 많은 다른 염료를 보이는 범위에서 형광 방출 쇼와 달리 2 aminopurine 표시 된 RNA 노출 될 수 있습니다 방에 빛 사진 표백 하지 않고. 페이지 실험 pH 8.3의 실행 버퍼 자주 필요 하다, 달리 2-aminopurine 기반으로 형광 적정 바인딩 지정된 pH에 1 개의 해결책에서 사용 하 고 따라서 측정 및 탐지의 상대적으로 약한 수 고 평형에 운동 불안정 바인딩입니다.
자외선 흡 광도 감지 열 용융 실험 허용 duplexes (그림 7)31 와 트라이의 열 안정성 측정플렉스30,32,,4445. 길이 시퀀스 구성에 따라 triplexes의 용 해 되거나 명확한 전환 표시 되지 않을 수 있습니다. 가 열 및 냉각 곡선 겹치면 열역학 매개 변수를 얻을 수 있습니다. 등온선 적정 열 량 측정 (ITC)32; 여 정확한 열역학 매개 변수를 얻을 수 있습니다. 그러나, 비교적 많은 양의 샘플은 ITC 일반적으로 필요 합니다.

<table><tbody><tr><td>Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets&amp;nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>87956</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHA&lt;span class=&quot;font6&quot;&gt;&amp;Yuml;&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font0&quot;&gt;HCl)&lt;/span&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>532444</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11801</td><td></td></tr><tr><td>(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP)</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25251</td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhyride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser Test Kit&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06374</td><td></td></tr><tr><td>Unmodified PNA monomers</td><td>ASM Research Chemicals GmbH</td><td>5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td><td></td></tr><tr><td>Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8389 / 47624</td><td></td></tr><tr><td>Thioanisole</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14846</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>Alfa Aesar</td><td>L12865</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoromethanesulfonic acid</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10173</td><td></td></tr><tr><td>LiChrosper&amp;reg; 100 RP-18 endcapped (5 &amp;micro;m) LiChroCART&amp;reg; 250-4</td><td>Merck Millipore</td><td>150838</td><td></td></tr><tr><td>RNA Oligos&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Customized&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39468</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J15694</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8887</td><td></td></tr><tr><td>N.N&#039;-methylenebisacrylamide</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate (APS)</td><td>Bio-rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Bio-rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3</td><td>1st Base</td><td>BUF-3010-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>H5433</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide (10 mg/mL)</td><td>Bio-rad&amp;nbsp;</td><td>161-0433</td><td></td></tr><tr><td>High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm)</td><td>Hellma Analytics&amp;nbsp;</td><td>105.250-QS</td><td></td></tr></tbody></table>

sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids

RNAs 중요 한 바이오 마커 및 치료 대상으로 떠오르고 있다. 따라서, 화학 프로브와 RNA 순서 및 구조의 인식에 대 한 치료 ligands 개발 잠재력이 있다. 화학적 펩 티 드 핵 산 (PNA) 올리고 최근 개발 된 시퀀스 별로 RNA duplexes 인식할 수 있는 수정. PNAs 중립 펩 티 드와 같은 등뼈와 화학적으로 안정 되어 있다. PNAs 수 수 합성 비교적 쉽게 수동 Boc 화학 단단한 단계 펩 티 드 합성 방법에 의해. PNAs 역 상 HPLC, 분자량 특성 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 시간의 비행 (TOF MALDI)에 의해 다음에 의해 정화 된다. 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지) 기술을 용이 하 게 세 겹 형성의 영상 때문에 신중 하 게 설계 된 무료 RNA 이중 구성 및 PNA 바인딩된 triplexes 자주 쇼 다른 마이그레이션 속도. Ethidium 평범한 사람 게시물 얼룩과 비 변성 시키기 페이지 종종 바인딩 친 화력 및 특이성 PNA 올리고의 특성화를 위한 쉽고 유익한 기술입니다. 일반적으로, 여러 개의 동 곳 RNA 또는 단 하나 기본적인 쌍 돌연변이와 duplexes 바인딩 친 화력 및 특이성 등의 PNA 바인딩 속성의 특성을 사용할 수 있습니다. 2 Aminopurine는 아데닌 (6-aminopurine);의 이성질체 2 aminopurine 형광 강도 지역 구조 환경 변화에 민감한 이며 PNA 바인딩 사이트 근처 통합 2 aminopurine 잔류물과 세 겹 형성의 모니터링에 적합. 2-Aminopurine 형광 적정 대상된 더블-좌초 RNAs (dsRNAs)으로 수정된 PNAs 바인딩 선택도 단일 가닥 RNAs (ssRNAs)를 통해 확인 하도 사용할 수 있습니다. 자외선 흡 광도 감지 열 용융 실험 허용 PNA RNA duplexes와 PNA·의 열 안정성 측정 RNA2 triplexes입니다. 여기, 우리는 합성을 설명 하 고 PNA 올리고 통합의 정화 잔류물, 수정 하 고 수정된 PNAs에 의해 RNA duplexes의 인식의 특성에 대 한 생화학 및 생물 방법을 설명.

역 상 HPLC PNA 올리고 정화 수 있습니다. 우리는 순수한 PNA 올리고 HPLC 정화 (그림 3)의 2 라운드와 얻을 수 있습니다. MALDI TOF 분석 (그림 4)는 PNAs의 id는 확인할 수 있습니다.
비 변성 시키기 페이지 바인딩 친 화력 및 특이성 PNA 올리고의 특성화를 위한 쉽고 유익한 기술입니다. 우리 일반적으로 사용 하 여 여러 개의 RNA 헤어핀 또는 duplexes 단 하나 기본적인 쌍 돌연변이와 특성 바인딩 속성 (그림 5). 그림 5 에 표시 된 비 변성 시키기 페이지 데이터 명확 하 게 제안는 Q-및 L-수정 PNA dsRNA 지역 C G 쌍 (그림 5B, 하단 패널)을 인식할 수 없습니다 (그림 5B, 상위 C G 쌍 없이 하나 패널)입니다. T·을 통해이 구체적이 고 향상 된 인식이 이다 A-U, L· G-C, 및 Q· C G PNA· RNA2 기본 트리플 (그림 1A, C, D) 형성. 하나 또는 여러 개의 돌연변이와 다양 한 PNAs 수정된 PNA의 향상 된 바인딩 속성을 보여 주기 위해 사용할 수 있습니다. 우리는 2 mM Mg2 + 외피 버퍼에 추가 영향을 주지 않습니다 바인딩을 나타났습니다 크게31.
우리는 Q L 수정 PNA 타겟된 dsRNA 지역 (그림 6A, 6 C 6 D) 하지만 (그림 6B, 6E 6F) ssRNA 하지 2 aminopurine 형광 적정에 의해 증명 하고있다. PNA P3 Kd 값이 0.8 ± 0.1 µ M 2 aminopurine 표시 된 dsRNA에 바인딩합니다. 370에서 형광 강도 2 aminopurine 라는 ssRNA에 대 한 nm는 ssRNA PNA P3의 바인딩의 부족을 나타내는 다양 한 P3 농도로 비교적 일정 하 게 유지.
PNAs 전환 (그림 7)는 ssRNA에 대 한 바인딩을 제안 녹는 아무 열 Q 잔류물 (P2 및 P3) 쇼를 포함 하. 이것은 입체 충돌 왓슨 크릭에서 Q G 쌍 같은 존재입니다. 수정 되지 않은 PNA P1에 비해, PNAs P4 그리고 P5 포함 수정 L 잔류물 하지만 아무 Q 잔류물, 표시 해당 RNA PNA duplexes 입체 충돌 왓슨 크릭에서 L G 쌍 같은 존재 때문에 용융 온도 감소. 자외선 흡 광도 감지 열 녹는 데이터는 2 aminopurine 형광 적정 데이터, 또한 그 질문 및 L 잔류물을 포함 하는 PNA에 바인딩되지 않기 ssRNA appreciably 표시와 일치 (그림 6B, 6E 6F). Q 자료 (그림 1E 왓슨 크릭 같은 L G 쌍에 비해 왓슨 크릭 같은 Q G 쌍 (그림 1F)의 형성에 더 중요 한 입체 충돌 있다 L 자료 보다 더 불안정은 Q 자료 통합 ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
그림 1 : 안정적인 기본 트리플 하 고 불안정 한 기초 쌍 구조의 화학 구조. (A-D) 주요 홈 PNA· T·의 세 배 RNA2 기본 (A) A U, C+· G-C (B), L· G-C (C), 및 Q· C-G (D)입니다. (E, F) L-G (E)와 Q-G (F)의 PNA RNA 기본적인 쌍 같은 불안정 한 왓슨 크릭. 편지 R RNA의 설탕 인산 염 등뼈를 나타냅니다. 수소 결합은 검은색 파선으로 표시 됩니다. 그림 참조31에서 재현 됩니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
그림 2 : PNA 단위체의 화학 구조. 4 PNA 단위체 (T, C, L, 및 Q) 표시 됩니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
그림 3 : PNA 올리고 머와 RP HPLC에 의해 정화의 화학 구조. (A) PNA 시퀀스 P3의 화학 구조. (B, C) 원유 PNA P3의 RP HPLC 데이터 (B) 다시 정화 PNA P3 (C). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
그림 4 : 정화 PNA P3의 MALDI TOF 스펙트럼. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
그림 5 : RNA 머리 핀 및 PNA 시퀀스와 비 변성 시키기 페이지 바인딩 특성. (A) RNA 헤어핀 (rHP1 및 rHP2), PNA P3, 그리고는 PNA· RNA2 세 겹 PNA P3 및 rHP2 사이 형성. (B) 비 변성 시키기 페이지 (12%) rHP1 및 rHP2 바인딩 PNA P3에 대 한 결과. 인큐베이션 버퍼가 200 m m NaCl, 0.5 m m EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5입니다. 로드 된 RNA 헤어핀 (rHP1 및 rHP2) 20 µ L에 1 µ M에 있다. 오른쪽에서 왼쪽 차선에서 PNA 농도 0, 0.2, 0.4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, 50 µ M. PNA P3 않습니다 하지 바인딩합니다 rHP1 하 고 (위 패널) 하지만 rHP2에 바인딩합니다 (하단 패널). P3 rHP2 바인딩을 위해 (C) Kd 결정. 세 겹 형성 (Y)의 분수는 PNA 농도 대 한 플롯은. 그림은 참조31에서 적응. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
그림 6 : PNA P3 바인딩의 형광 적정 연구2 aminopurine 표시 된 RNAs 하. 2 aminopurine 잔류물 RNA 순서에서 '2'로 지정 됩니다. 인큐베이션 버퍼가 200 m m NaCl, 0.5 m m EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5입니다. (A)는 PNA· RNA2 세 겹 P3 및 2 aminopurine 표시 된 dsRNA (dsRNA2-2AP) 사이 형성. (B) 가상 PNA RNA 이중 P3 및 2 aminopurine 레이블 ssRNA (ssRNA2-2AP) 사이 형성. (C, E) 형광 방출 스펙트럼 2 aminopurine 표시 된 RNA 이중 (1 µ M) 및 ssRNA (1 µ M), 각각,와 P3 농도 pH 7.5에 다양합니다. 약 475에 피크 nm PNA에 L 자료의 약한 형광 방출 예정 이다. (D, F) K d 결정 2 aminopurine 형광 강도 플롯에 따라 (370에서 nm)의 RNA 이중 및 ssRNA, 각각, PNA P3 농도 대. 그림은 참조31에서 적응. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
그림 7 : RNA PNA duplexes에 대 한 결과 용 해 열. 인큐베이션 버퍼 200 m m NaCl, 0.5 m m EDTA, 20 m NaH2포4, pH 7.5 m 이다. 모든 샘플의 단일 가닥 RNA (ssRNA1)와 PNA 130 µ L. (A) 단일 가닥 RNA (ssRNA1)에, PNAs (P1, P2, P3, P4, 및 P5)와 PNA P3 및 평행 방향에 ssRNA1 사이 형성 하는 가상 PNA RNA 이중 5 µ M를 포함. Q-G와 L G 쌍 같은 왓슨 크릭 입체 충돌을 가리킨다. (B) 융해 곡선 다른 PNAs에 대 한 ssRNA1에 바인딩. 녹는 온도 녹는 전환으로 곡선에 대 한 표시 됩니다. 그림은 참조31에서 적응.

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Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

시퀀스 및 선택적 인식 하 여 단일 가닥 RNAs에 더블-좌초 RNAs의 화학적 펩 티 드 핵 산 수정

우리는 합성에 대 한 프로토콜와 펩 티 드 핵 산 (PNA) 올리고 통합의 정화 수정 잔류물. 수정된 PNAs에 의해 RNA duplexes의 인식 특성에 대 한 생화학 및 생물 방법은 설명 합니다.

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

9.4K 조회수.  Nanyang Technological University. 우리는 합성에 대 한 프로토콜와 펩 티 드 핵 산 (PNA) 올리고 통합의 정화 수정 잔류물. 수정된 PNAs에 의해 RNA duplexes의 인식 특성에 대 한 생화학 및 생물 방법은 설명 합니다.

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Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

올리고 뉴클레오티드 지시 용출을 사용하여 세포에서 동족 RNA 단백질 단지의 분리

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

연구

생화학

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

유전학

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트 - 합성에서 생화학 적 특성에

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

화학

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to control gene expression. These regulatory proteins control gene expression either at the level of DNA (transcription) or at the level of RNA (pre-mRNA splicing, polyadenylation, mRNA transport, decay, and translation). Identification of regulatory sequences helps understand not only how a gene is switched on or off, but also which downstream genes are regulated by a particular regulatory protein. Here, we describe a one-step approach that allows saturation mutagenesis of a protein binding site in RNA. It involves doping DNA template with non-wild-type nucleotides within the binding site, synthesis of separate RNAs with each phosphorothioate nucleotide, and isolation of the bound fraction following incubation with protein. Interference from non-wild-type nucleotides results in their preferential exclusion from the protein-bound fraction. This is monitored by gel electrophoresis following selective chemical cleavage with iodine of phosphodiester bonds containing phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis or PTM). This single-step saturation mutagenesis approach is applicable to the characterization of any protein binding site in RNA.

Proteins that bind specific RNA sequences play critical roles in gene expression. Detailed characterization of these binding sites is crucial for our understanding of gene regulation. Here, a single-step approach for saturation mutagenesis of protein-binding sites in RNA is described. This approach is relevant for all protein-binding sites in RNA.

Phosphorothioates를 사용 하 여 RNA에서 사이트 바인딩 규제 단백질의 소설 포화 Mutagenesis 접근: 단일 단계 특성

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational steps are used to regulate specific genes. Sequence-specific nucleic acid-binding proteins target specific sequences to control spatial or temporal gene expression. The binding sites in nucleic acids are typically characterized by mutational analysis. However, numerous proteins of interest have no known binding site for such characterization. Here we describe an approach to identify previously unknown binding sites for RNA-binding proteins. It involves iterative selection and amplification of sequences starting with a randomized sequence pool. Following several rounds of these steps-transcription, binding, and amplification-the enriched sequences are sequenced to identify a preferred binding site(s). Success of this approach is monitored using in vitro binding assays. Subsequently, in vitro and in vivo functional assays can be used to assess the biological relevance of the selected sequences. This approach allows identification and characterization of a previously unknown binding site(s) for any RNA-binding protein for which an assay to separate protein-bound and unbound RNAs exists.

Sequence specificity is critical for gene regulation. Regulatory proteins that recognize specific sequences are important for gene regulation. Defining functional binding sites for such proteins is a challenging biological problem. An iterative approach for identification of a binding site for an RNA-binding protein is described here and is applicable to all RNA-binding proteins.

규제 RNA 결합 단백질에 대한 결합 부위를 식별하기 위한 서열 공간 탐색

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1 Nef, not only retain their biological function, but can also competitively inhibit the function of the full-length protein. A set of 20 Nef scanning peptides, 20 amino acids in length with each overlapping 10 amino acids of its neighbor, were used to identify motifs in Nef responsible for its induction of apoptosis. Peptides containing these apoptotic motifs induced apoptosis at levels comparable to the full-length Nef protein. A second peptide, derived from the Secretion Modification Region (SMR) of Nef, retained the ability to interact with cellular proteins involved in Nef's secretion in exosomes (exNef). This SMRwt peptide was used as the "bait" protein in co-immunoprecipitation experiments to isolate cellular proteins that bind specifically to Nef's SMR motif. Protein transfection and antibody inhibition was used to physically disrupt the interaction between Nef and mortalin, one of the isolated SMR-binding proteins, and the effect was measured with a fluorescent-based exNef secretion assay. The SMRwt peptide's ability to outcompete full-length Nef for cellular proteins that bind the SMR motif, make it the first inhibitor of exNef secretion. Thus, by employing the techniques described here, which utilize the unique properties of specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, one may accelerate the identification of functional motifs in proteins and the development of peptide-based inhibitors of pathogenic functions.

Techniques to dissect the mechanisms underlying the secretion of HIV-1 Nef in exosomes are described. Specific short peptides derived from Nef and protein transfection were exploited to determine the structure, function, and binding partners of Nef&#x2019;s Secretion Modification Region. These procedures have general relevance in many mechanistic studies.

기능 모티브과 바인딩 파트너 펩타이드 기반의 식별

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

면역학 및 감염병학

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome by identifying their molecular partners, DNA, proteins and/or RNAs. The latter can interact with lncRNA through networks involving proteins, but they can also be engaged in direct RNA/RNA interactions. We, therefore, developed an easy-to-use RNA pull-down procedure that allowed identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a lncRNA using psoralen, a molecule that cross-links only RNA/RNA interactions. Bioinformatics modeling of the lncRNA secondary structure allowed the selection of several specific antisense DNA oligonucleotide probes with a strong affinity for regions displaying a low probability of internal base pairing. Since the specific probes that were designed targeted accessible regions throughout the length of the lncRNA, the RNA-interaction zones could be delineated in the sequence of the lncRNA. When coupled with a high throughput RNA sequencing, this protocol can be used for the whole direct RNA interactome studies of a lncRNA of interest.

An easy-to-use RNA pull-down protocol is designed for the identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a long non-coding RNA. The protocol uses psoralen as a fixative to cross-link only RNA/RNA interactions and provides the whole direct RNA interactome of a long non-coding RNA when coupled with RNA sequencing.

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome ...

Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry

RNA is a biopolymer present in all domains of life, and its interactions with other molecules and/or reactive species, e.g., DNA, proteins, ions, drugs, and free radicals, are ubiquitous. As a result, RNA undergoes various reactions that include its cleavage, degradation, or modification, leading to biologically relevant species with distinct functions and implications. One example is the oxidation of guanine to 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG), which may occur in the presence of reactive oxygen species (ROS). Overall, procedures that characterize such products and transformations are largely valuable to the scientific community. To this end, matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry is a widely used method. The present protocol describes how to characterize RNA fragments formed after enzymatic treatment. The chosen model uses a reaction between RNA and the exoribonuclease Xrn-1, where enzymatic digestion is halted at oxidized sites. Two 20-nucleotide long RNA sequences [5&#39;-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] and [5&#39;-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] were obtained via solid-phase synthesis, quantified by UV-vis spectroscopy, and characterized via MALDI-TOF. The obtained strands were then (1) 5&#39;-phosphorylated and characterized via MALDI-TOF; (2) treated with Xrn-1; (3) filtered and desalted; (4) analyzed via MALDI-TOF. This experimental setup led to the unequivocal identification of the fragments associated with the stalling of Xrn-1: [5&#39;-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5&#39;-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], and [5&#39;-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. The described experiments were carried out with 200 picomols of RNA (20 pmol used for MALDI analyses); however, lower amounts may result in detectable peaks with spectrometers using laser sources with more power than the one used in this work. Importantly, the described methodology can be generalized and potentially extended to product identification for other processes involving RNA and DNA, and may aid in the characterization/elucidation of other biochemical pathways.

MALDI-TOF was used to characterize fragments obtained from the reactivity between oxidized RNA and the exoribonuclease Xrn-1. The present protocol describes a methodology that can be applied to other processes involving RNA and/or DNA.

MALDI-TOF 질량 분광법을 이용한 효소적 분해로 인한 RNA 단편의 확인

RNA is a biopolymer present in all domains of life, and its interactions with other molecules and/or reactive species, e.g., DNA, proteins, ions, drugs, ...

<meta charset="utf8"></head><body>판별 RNA 및 DNA 분석을 위한 정밀 DNAzyme 나노머신

DNAzyme 10-23 - Based Nanomachines for Nucleic Acid Recognition

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their functions include tight analyte binding, highly selective analyte recognition, fluorescent signal amplification by multiple catalytic cleavages of a fluorogenic reporter substrate, and fluorogenic substrate attraction for an increase in sensor response. Functional units are attached to a common DNA scaffold for their cooperative action. The RNA-cleaving 10-23 DNMs feature&#160;improved sensitivity in comparison with non-catalytic hybridization probes. The stability of the DNM and the increased chances of substrate recognition are provided&#160;by a double-stranded DNA fragment,&#160;a tile. DNM can differentiate two analytes with a single nucleotide difference in a folded RNA and a double-stranded DNA and detect analytes at concentrations ~1000 times lower than other protein-free hybridization probes. This article presents the concept behind the diagnostic potential of DNA-nanomachine activity and overviews DNM design, assembly, and application&#160;in nucleic acid detection assays.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: DNA 나노센서의 발전 – 분자 검출의 감도 및 선택성 문제 해결

The DNAzyme-based nanomachines can be used for highly selective and sensitive detection of nucleic acids. This article describes a detailed protocol for the design of DNAzyme-based nanomachines with a 10-23 core using free software and their application in the detection of an Epstein-Barr virus fragment as an example.

DNAzyme 10-23 - 핵산 인식을 위한 기반 나노머신

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their ...

시퀀스 및 선택적 인식 하 여 단일 가닥 RNAs에 더블-좌초 RNAs의 화학적 펩 티 드 핵 산 수정

요약

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올리고 뉴클레오티드 지시 용출을 사용하여 세포에서 동족 RNA 단백질 단지의 분리

빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리

뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트 - 합성에서 생화학 적 특성에

Phosphorothioates를 사용 하 여 RNA에서 사이트 바인딩 규제 단백질의 소설 포화 Mutagenesis 접근: 단일 단계 특성

규제 RNA 결합 단백질에 대한 결합 부위를 식별하기 위한 서열 공간 탐색

기능 모티브과 바인딩 파트너 펩타이드 기반의 식별

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

MALDI-TOF 질량 분광법을 이용한 효소적 분해로 인한 RNA 단편의 확인

DNAzyme 10-23 - 핵산 인식을 위한 기반 나노머신

DNAzyme 10-23 - 핵산 인식을 위한 기반 나노머신