著者らは、細胞培養のヘルプについて夫人 Béatrice Dimitriades をありがとうございます。この作品は、スイスの全米科学財団の補助金 #31003A_170216 と 51NF40_141735 によって支持された (国立がん RNA &#38; 病)。

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著者が明らかに何もありません。

コアや mRNA の 3' 終わり処理に関与している補助要因の多くは、それに応じて複雑な起こる風景に反映されます。また、起こるも転写、スプライシングなど他のプロセスの変化に敏感です。Mrna の 3' 終わり胸の谷間サイトは通常 5' 開裂製品に追加される特性多尾に基づいて識別されます。ほとんどのメソッドを使用して、ポリ (A) の特定の変換を許可する変数の長さのランダムプライマー プライマー-逆転写反応の Cdna に Mrna を含みます。このアプローチの一般的な問題は、人工胸の谷間サイトの結果の豊富なシーケンスに内部起爆剤です。サンプル準備の段階でこのアーティファクトを回避することを目指す 2 つの方法が提案されています。3 P seq の方法1のアダプターが具体的にポリ a の尾の部分の RNase T1 消化し、唯一の deoxynucleotide として反作用で TTP と逆のトランスクリプションが続くスプリント oligo の助けを借りての両端に組み合わされて。結果 poly(A)-poly(dT) heteroduplexes は、RNase H で消化され、残りの RNA のフラグメントの分離、アダプターに結紮およびシーケンスします。シンプルでエレガントな方法、2 P seq、シーケンシング反応で残りのランダムプライマー ストレッチは同じ作者2によって報告されたスキップ カスタム シーケンス プライマーを使用します。関連メソッドで 3' 35 の異常に長いプライマー私たちと読み取り 45 Ts、また、ビオチンを含む 50 以上のヌクレオチドのポリ a の尾を持つ RNA 分子を選択する厳しい洗浄に続いて、断片化された RNA に焼鈍します。3' 読み取り内部プライミングの周波数を大幅に短縮、なくなるわけでなく完全にそれ3。直接 RNA 配列のためのプロトコルも提案されているが、結果の読み取りエラー率が高いをして、短いとこのアプローチされていないさらに先進18,19,20。ポリア Seq と製品化のクオンツ Seq プロトコル cDNA の第 2 鎖合成20のランダムなプライミング手順に基づくランダムプライマー プライミングを兼ね備えています。モロニー マウス白血病ウイルス (MMLV) 逆転写酵素とテンプレート スイッチの逆転写反応の使用単一ステップのリンカーと Cdna の生成につながるし、それにより PAS Seq および SAPAS メソッドでないアダプター ダイマーが表示21,22。
A seq2 メソッドは、ビオチン化ランダムプライマー プライマー内劈開ヌクレオチド (dU) の活用で際立ってを紹介しました。この変更を組み合わせたランダムプライマーを交配、ライブラリを準備する前に孤立した断片からオリゴ (dT)25シーケンスのほとんどの除去と polyadenylated ターゲットおよび 3 Ts の保全の充実のユーティリティをポリ a の尾の前の存在を示します。対照的に、ランダムに RNA 分子からポリ a を削除するリボヌクレアーゼ H を利用する方法をいくつかとして残します。A seq2、シーケンスはアンチセンス鎖の 3' 末端から行われる、ので、胸の谷間のサイトは塩基配列読み取りの先頭 NNNNTTT モチーフの後に位置する予測されます。無作為化のテトラマー PCR 増幅アーティファクトの除去も呼び出す基本を許可するだけではなくサービスを提供します。長い行政にも対応できます。内部プライミングの可能性 A seq2 内に残りますと負荷に対処は、最初 3' を破棄して終了で内部のプライミングによって説明することができる 3' 側クラスターを破棄して、genomically でエンコードされた、A 豊富な下流のシーケンスと、A 豊富な多信号自体。多数のプロトコルによって一意に推論多サイトの最近の分析は、A seq2 に固有のサイトが予想されるヌクレオチドの分布とシーケンス プロトコルを終了し遺伝子のような他の 3' 内の場所をいるを示します。
A seq2 の重要なステップは、polyadenylated RNA の選択とリボソーム Rna と様々 な低分子 Rna の除去です。オリゴ (dT)25磁気ビーズの mRNA 分離キットでこれは最も簡単です。原則として、ソリューションも含むフェノールで分離された総 RNA は、高品質の mRNA 分離キットまたはオリゴ (dT) agarose によって選択をさらに受けることが RNA を与えます。A seq2 に変化するステップは、短縮または拡張サイズの異なる RNA のフラグメントを取得することができるアルカリ加水分解による治療です。重要なは、3' 3' ポリ a ポリメラーゼによって RNA のフラグメントの端に dATP 添加効率がよいこともです。ここで説明したプロトコルで、この治療法は ligation の反作用の間に concatemerization を避けるために、すべての RNA のフラグメントに適用されます。最後に、我々 はここで cDNA 分子の 5' 端にアダプターを縛ること事がある、RNA リガーゼ 1 は RNA リガーゼとして通常使用されますが、また効率的に単一の鎖の DNA を郭を注意します。
したがって、A seq2 は、効率的で mRNA 3' 末端処理サイトの識別のためのプロトコルを実装する簡単です。今後の展開は、プロトコルと必要な材料の量の量をさらに削減を含めることができます。さらの計算データ解析ツールの関連するセットは、3' 末端のさまざまなプロトコルを用いての読み取りをシーケンスの均一処理を有効にします。

キャプチャと mRNA の 3' 端のシーケンスは、mRNA プロセシングの研究と遺伝子の発現定量をことができます。真核生物 Mrna がポリ a の尾のためビードを固定化したオリゴ チミジン (cDNA 合成の主なことができます oligo(dT)) 分子と合計セル lysates から効率的に精製することができます。ただし、このアプローチには、2 つ欠点があります。最初、トラン スクリプト内部にある A の伸張できる cDNA 合成、スプリアス多サイトの結果の主要なも。第二に、均質多ストレッチは、トラン スクリプト識別のための情報されていない別のシーケンスの特定課題を提起します。ポリ a を逆転写など、これらの制限を回避するために様々 なアプローチが提案されているツインテール RNase H 消化 (3 P seq 1)、続いて 20 で終わるカスタム配列のプライマーの使用 Ts (2 P seq 2) の選択基準RNase H 消化 (3' 読み取り3)、そしてヘアピン (A seq 4) で 3' アダプターを含むオリゴ dT プライマーの使用によって続いて CU5T45プライマーで 50 以上のヌクレオチドのポリ a の尾を持つ RNA 断片。
最近開発された A seq2 方法5は多と特に発生するアダプターの自己 ligation によって生成されるダイマーの割合を最小限に抑えるために同時にシーケンスをバイパスすることを目的とするときのアダプターのモル濃度挿入濃度を上回る。この問題は、両方のアダプターが、seq2、3' アダプターが逆転写後の RNA のフラグメントと Cdna の 5' 末端に 5' アダプターの 5' 端に結紮がようにポリヌクレオチド終了の同じ型に組み合わされてときに排除できます。方法は当社従来 - seq - シーケンスが、5'-に - 3 年より便利な ' により、正確に方向制御 RNA 断片化-、ポリ a サイトの識別の高精度を維持しながら。典型的なサンプルのシーケンス処理された読み取りの約 80% はゲノムに一意にマップし、以上 20,000 多サイト クラスター、注釈付き 3' UTRs と重複の 70% 以上の識別に 。
簡単に言えば、A seq2 プロトコルは mRNA の断片化と逆の補数 3' 5' RNA のフラグメントの端にアダプターの ligation から始まります。ポリ (A)-含む Rna は、リバース 3' 末端、位置 4 dU および 5' 端、ビオチンでアンカー ヌクレオチドを含む 25 のヌクレオチド (nt) 長いランダムプライマー プライマーと転写磁気ストレプトアビジン ビーズに cDNA のバインディングが可能です。、ビオチンを含むプライマーのほとんどはウラシル DNA グリコシラーゼ (UDG) と DNA グリコシラーゼ リアーゼ エンドヌクレアーゼ VIII を含むユーザー酵素ミックスによるデュで胸の谷間で cDNA から削除されます。胸の谷間に残るポリ a テールの位置をマークするこの反応 5' アダプター、および 3 つの Ts 左の結紮のためそのまま終了を残します。受信者の 5' 端に結紮 5' と 3' の両方のアダプターが添付されているので、アダプターの二量体は生成されません。4 ヌクレオチド ランダム-mers 読み取りの初めに導入された最新のシーケンシングの楽器のクラスター分解能を可能し、検出と PCR 増幅アーチファクト除去のため分子意識 (UMI) としても利用できます。UMI のサイズは、他の研究6ではさらに増加することができます。プロトコルすべて無作為化の四量体で、5' 端始まるによって PCR 増幅デジタルアーティファクトの補正で 3 診断 Ts を持っている読み取りの 3 ts 処理に続いて始まる mRNA 3' 端に相補的な逆が読み取りを生成します。行政、3' アダプター配列除去を悪用し、逆に補完。A 豊富なサイトは内部でランダムプライマー プライミングから由来している可能性があります読み取りまた計算識別、破棄されます。偽のサイトは一般的に 18 の特徴の一つを欠いているとする必要があります保存された多信号 〜 21 ヌクレオチド上流明らか胸の谷間サイト7の。
プロトコル細胞培養と一晩をカウントされません約 8 h の実践的な時間が必要です。解析ソフトウェアで高精度な多サイト id を関連付けられている読みます。ポリ a サイトからクラスターが作成この注釈付きの遺伝子とこれらの原稿 (コントロール siRNA と si HNRNPC 処理細胞の 2 つの生物学的複製) 84% 重複と 3' UTR、75% の重複、86% どちらかとさらに強調表示 4 のサンプルに基づいて、3' UTR またはターミナル エクソン。3' 端レプリケートのサンプルでの発現のピアソンの相関係数は 0.92 と、0.9 以上の値は、通常、メソッドで取得します。したがって、A seq2、非常に再現性のある結果を与える便利な方法です。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose, ultra pure</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Cordycepin triphosphate (3&amp;rsquo; dATP)</td><td>SIGMA</td><td>C9137</td><td></td></tr><tr><td>DNA low bind vials, 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>SIGMA</td><td>D8637</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA-DIRECT Kit</td><td>Ambion</td><td>AM61012</td><td></td></tr><tr><td>GR-Green dye</td><td>Excellgen</td><td>EG-1071</td><td>use 1:10,000 dillution</td></tr><tr><td>HiSeq 2500 or NextSeq 500 next generation sequencers</td><td>Illumina</td><td>inquire with supplier</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hotstart DNA polymerase mix</td><td>KAPA/Roche</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) polymerase, yeast</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>74225Z25KU</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) polymerase, E.coli</td><td>New England Biolabs</td><td>M0276L</td><td></td></tr><tr><td>Polynucleotide kinase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EK0032</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>RNA ligase 1, high concentration</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M</td><td>includes PEG-8000</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute RNA Cleanup kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>New England Biolabs</td><td>M0279</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus, ribonuclease inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2618</td><td></td></tr><tr><td>Superscript IV reverse transcriptase</td><td>Thermo Fisher Scientiific</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>USER enzyme mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M5505</td><td></td></tr><tr><td>Dyna-Mag-2 magnetic rack</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Heated mixer with heated lid</td></tr><tr><td>MicroSpin columns</td><td>GE-Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline hydrolysis buffer, 1.5 x</td><td></td><td></td><td>Mix 1 part 0.1 M Na2CO3 and 9 parts 0.1 M NaHCO3. Add EDTA to 1 mM. Adjust pH to 9.2. Store aliquots at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>5x poly(A) polymerase buffer</td><td>Thermo Fisher Scientiific</td><td></td><td>100 mM Tris-HCl, pH 7.0, 3 mM MnCl2, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 mg/ml acetylated BSA, 50% glycerol</td></tr><tr><td>Biotin binding buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris&amp;shy;Cl pH 7.5, 2 M NaCl, 0.1% NP&amp;shy;40</td></tr><tr><td>TEN buffer</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris&amp;shy;Cl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.02% NP&amp;shy;40</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Sequence&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Oligonucleotides according to Illumina TruSeq Small RNA Sample Prep Kits, for GA-IIx and Hiseq2000/2500 sequencers&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Microsynth&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>revRA3 (RNA)</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&amp;rsquo; amino&amp;shy; CCUUGGCACCCGAGAAUUCCA&amp;shy; 3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>revDA5</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&amp;rsquo; amino&amp;shy; GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC GATCNNNN-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Bio-dU-dT25, RT primer</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&#039; Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3&#039; (V = G, A or C)</td></tr><tr><td>PCR primer forward, RP1</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&#039; AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACGTTCAGAGTTCTACAG&lt;br/&gt;TCCGA 3&#039;</td></tr><tr><td>PCR primer reverse, RPI1, barcode in bold</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&#039; CAAGCAGAAGACGGCATACGAG&lt;br/&gt;
AT&lt;strong&gt;CGTGAT&lt;/strong&gt;GTGACTGGAGTTCCT&lt;br/&gt;
TGGCACCCGAGAATTCCA 3&#039;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Oligonucleotides according to Illumina TruSeq HT-Small RNA Sample Prep Kits, for HiSeq2000/2500 and NextSeq500 sequencers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT-rev3A (DNA/RNA)</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&#039;-amino-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTG&lt;br/&gt;
CTCTTCCrGrAUrC-3&#039;</td></tr><tr><td>HT-rev5A</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&#039; amino-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT&lt;br/&gt;
CTTCCGATCTNNNN 3&#039;</td></tr><tr><td>Bio-dU-dT25, RT primer</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&#039; Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3&#039;</td></tr><tr><td>PCR primers forward (D501-506)</td><td>Microsynth or Illumina</td><td></td><td>5&#039;-AATGATACGGCGACCACCGAGAT&lt;br/&gt;CTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACA&lt;br/&gt;CGACGCTCTTCCGATCT -3&#039;</td></tr><tr><td>PCR primers reverse (D701-D712)</td><td>Microsynth or Illumina</td><td></td><td>5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG A[i7]GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATC-3&#039;</td></tr><tr><td>Documentation for Illumina multiplexing:</td><td>Illumina</td><td></td><td>https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/illumina-adapter-sequences_1000000002694-01.pdf</td></tr></tbody></table>

3' end sequencing library preparation with a-seq2

過去 10 年間の研究は、複雑で動的なさまざまな mRNA の開裂と起こる反応を明らかにしました。長い 3' 非翻訳領域 (UTRs) の Mrna は、細胞の増殖は優先的に短い 3' UTRs と成績証明書を表現に対し分化した細胞で生成されます。今起こるサイト ゲノムのマップ、mRNA の 3' 終わり処理の規制を検討し開発された、2 番目のバージョンでは seq プロトコルについて述べる。また現在このプロトコルを活用 polyadenylate (豊かに完全に処理された mRNAs のためにほとんどの哺乳類の mRNAs の器官の中に追加される poly(A)) 尾。4 番目の位置にある deoxyuracil の DNA アダプター mRNA 3' 端フラグメントの配列のための精密加工が可能します。細胞培養、一晩を含まないプロトコルは約 8 h ハンズオン時間を必要があります。それに伴い派生シーケンス データの分析のための簡単に使用できるソフトウェア パッケージを提供しています。A seq2 と関連付けられた解析ソフトウェア 10 から、条件の広い範囲で最終的に、mRNA 3' のマッピングに効率的かつ信頼性の高いソリューションを提供する6または少ないセル。

ポリ (A)-アルカリ加水分解による断片化の培養細胞から分離された RNA を含むと Cdna のランダムプライマー プライマーが付いているトランスクリプションを逆で作られました。結果として得られる cDNA はストレプトアビジン ビーズに固定化した、ウラシル特定切除反応でデュ開裂、5 ' アダプターを結紮、3' 端に裂かれたフラグメントの挿入されました。図 1は、実験のグラフィカルな概要を示しています。
Hela 細胞 HEK293 細胞の 10 の6セルされたプロシージャの終わりに蛋白質のコーディングの遺伝子の大半のためのポリ a サイトを特定するのに足りる。ただし、他の種類の細胞や組織の識別された多サイト数実験で使用されているセルの数と彩度をテストする必要があります増加します。パイロットの PCR の代表の結果のステップし、DNA のフラグメントのシーケンスの前にサンプルの分析は、図 2に示します。
シーケンサーから得られるゲノムにマップする準備ができている品質チェック、アダプターによりトリミングされた読み取りで終わる fastq ファイルから始まって計算の分析の前処理のステップを図 3に示します。図 4は、mRNA 3' 末端処理特定のサンプルで特定されたサイトのカタログに対応するゲノムと末尾に読み取りのマッピングで始まる解析手順を示します。複数のサンプルを分析するときの追加手順が個々 のサンプルで発見されたサイトを処理して、3' 末端に一致し、サンプルの間で彼らの余剰を報告する実行されます。これらの手順は、図 5のとおりです。
したがって、サンプル化されている、利用可能な処理パイプラインを通じて (fastq 形式) のファイルを読み取り結果のシーケンスの分析は簡単です。サンプルについての情報を構成ファイルに追加すると、パイプラインの実行は出力ファイルの 2 つの主なタイプになります: 1) ベッド-ファイルとすべて 3' 終了 (は例えば「個々 のサンプルの識別処理サイトsample1.3pSites.noIP.bed.gz「)、2) 研究のすべてのサンプルの間ですべてのポリ a サイト クラスター (clusters.merged.bed) とベッド ファイル。出力では、すべての読み取り (例: "sample1 それぞれの個々 のサンプルからのゲノム座標も含まれています。STAR_out/Aligned.sortedByCoord.out.bam") その後 IGV16のようなゲノムのブラウザーで表示できます。読み取りのプロファイルの外観検査は一般的にポリ a ゲノムの研究で実施された特定の摂動によって発生する変更サイトで配信の最初の一見を提供します。たとえば、図 6の HNRNPC 蛋白質のノックダウンする特定の遺伝子の応答が表示されます。
これらのゲノム広い分布の概要は (表 1) を設けています。具体的には、"カウント/annotation_overlap"ディレクトリ内の出力ファイルを含む特定の注釈機能と重複サイトの分数 (gtf ファイルから入力として提供; 注釈: 3' UTR、ターミナルのエクソン、エクソン、イントロン、遺伝子間)。最後に、各サンプルは、個別の処理ステップの結果は、("sample1.summary.tsv"など) をも保存されます。これの数が含まれています: ゲノムに一意に対応する各サンプル、5' 末端の予想される構造の読み取り、読み取りにおける PCR 重複を崩壊した後で、読み取り、高品質 9.2 のステップで定義されている条件に従って読む読み取り(シーケンス エラーに起因するそれらを崩壊した後手順 9.5 を参照)、複数のマッピングを読み取り (シーケンス エラーに起因するそれらを崩壊した後手順 9.5 を参照)、生 (クラスター化されていない) 3' 端の各サンプルでは、raw 3' 末端処理サイトのサイトを処理候補内部プライミングすることがなくユニークな 3' 終了処理サイト内部プライミング候補と最終的なポリ a サイトのクラスターのセットなしすべてのサンプルから。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2.jpg"> 
図 1: A seq2 プロトコルの主な手順です。個々 のステップは、図の左側に示されます。挿入の RNA のフラグメントは、逆のトランスクリプション; 後の cDNA の赤く緑の線として描かれています。アダプターは、明るい青またはオレンジに着色されています。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig2.jpg"> 
図 2: パイロット PCR および最終製品プロファイル。PCR の反作用から (、) の因数は異なるサイクルで収集された、2% アガロースゲル上区切られます。左に数字は、ヌクレオチド DNA の梯子のそれぞれのバンドのサイズを示します。この実験で 12 サイクル (*) は、大規模な PCR の反作用のため選ばれました。サイズの後サンプルの例 (b) 選択は、明らかに平均サイズは約 280 のヌクレオチドのフラグメント サイズ アナライザーで実行します。[FU] 左に数字は相対的な信号強度を示します。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56129/56129fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig3.jpg"> 
図 3: 読み取りをシーケンシングの前処理のアウトライン。シーケンサー機器関連ソフトウェアによって生成される読み取り fastq ファイルは、対応するゲノムにマップする高品質の読み取りを識別するために処理されます。「データ処理」に記載されているプロトコル個々 手順へのリンクが、パイプライン個々 ステップの入力/出力仕様を示します。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56129/56129fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig4.jpg"> 
図 4: シーケンスの概要読んで処理、個別 3' 末端の世代にゲノムにマッピングの手順から処理サイト。図は i へのリンクと、パイプラインの個々 のステップの入力/出力仕様「データ処理」に記載されているプロトコル個々 手順を実行。ユーザーに配信される主な出力ファイルは、太字で示されます。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56129/56129fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig5.jpg"> 
図 5: 共同規制 3' 末端配列サイトのクラスターを生成する撮影されている手順の概要です。「データ処理」に記載されているプロトコル個々 手順へのリンクが、パイプライン個々 ステップの入力/出力仕様を示します。メイン出力ファイルは、太字で示されます。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56129/56129fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig6.jpg"> 
図 6: 3' のプロファイルの例の結果終了 IGV 16ゲノム ブラウザーに表示される NUP214 遺伝子のターミナルのエクソンに沿って処理読み取ります。A seq2 読み取り HEK 293 細胞、コントロール siRNA または HNRNPC siRNA との 2 つのサンプルの調製。解析パイプラインによって注釈が付けられる多サイト記載されている読み取り IGV のゲノムのブラウザーへの入力として使用された BAM 形式で保存されました。MRNA 3' にマップ読み取りピークの 3' 端 Ensembl で注釈が終了します。プロファイルは、HNRNPC ノック ダウン時に長い 3' UTR アイソの使用の増加を示します。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56129/56129fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>si コントロール複製 1</td>
			<td>si コントロール複製 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>id: 29765</td>
			<td>id: 32682</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>raw 読み取りの数</td>
			<td>44210258</td>
			<td>68570640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>トリミングとフィルタ リングは有効な読み取りの数</td>
			<td>14024538</td>
			<td>21211793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>一意にマッピングの読み取り数</td>
			<td>6953674</td>
			<td>13946436</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>多遺伝子座にマップの読み込み回数</td>
			<td>2040646</td>
			<td>2925839</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>個別 3' 末端処理サイトの数</td>
			<td>1107493</td>
			<td>1710353</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1: 解析パイプラインの出力例。個々 のステップで得られた読み取りの概要。

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3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

このプロトコルでは、マッピング mRNA 3' 末端のサイトを処理する方法について説明します。

3' 末端配列 A seq2 とライブラリの準備

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

3-end-sequencing-library-preparation-with-a-seq2

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.5K ビュー.  University of Basel. このプロトコルでは、マッピング mRNA 3' 末端のサイトを処理する方法について説明します。

ビデオ: 3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

真核生物の転写エラーのゲノム全体の監視

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

遺伝学

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

AQRNA-seqを用いたtRNA動態の解析

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate quantification of the pool of small RNAs. The AQRNA-seq library preparation procedure described here involves the use of custom-designed sequencing linkers and a step for reducing methylation RNA modifications that block reverse transcription processivity, which results in an increased yield of full-length cDNAs. In addition, a detailed implementation of the accompanying bioinformatics pipeline is presented. This demonstration of AQRNA-seq was conducted through a quantitative analysis of the 45 tRNAs in Mycobacterium bovis BCG harvested on 5 selected days across a 20-day time course of nutrient deprivation and 6 days of resuscitation. Ongoing efforts to improve the efficiency and rigor of AQRNA-seq will also be discussed here. This includes exploring methods to obviate gel purification for mitigating primer dimer issues after PCR amplification and to increase the proportion of full-length reads to enable more accurate read mapping. Future enhancements to AQRNA-seq will be focused on facilitating automation and high-throughput implementation of this technology for quantifying all small RNA species in cell and tissue samples from diverse organisms.

著者スポットライト:低分子RNAのマッピングとタンパク質翻訳メカニズムの解明におけるAQRNA-seqの役割

Absolute quantification RNA sequencing (AQRNA-seq) is a technology developed to quantify the landscape of all small RNAs in biological mixtures. Here, both the library preparation and data processing steps of AQRNA-seq are demonstrated, quantifying changes in the transfer RNA (tRNA) pool in Mycobacterium bovis BCG during starvation-induced dormancy.

低分子RNAの定量のためのAQRNA-seq

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

<meta charset="utf8"></head><body>CIRCLE-SeqによるオフターゲットCRISPR-Cas9切断イベントの検出

CIRCLE-Seq for Interrogation of Off-Target Gene Editing

Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing (CIRCLE-seq) is a novel technique developed for the impartial identification of unintended cleavage sites of CRISPR-Cas9 through targeted sequencing of CRISPR-Cas9 cleaved DNA. The protocol involves circularizing genomic DNA (gDNA), which is subsequently treated with the Cas9 protein and a guide RNA (gRNA) of interest. Following treatment, the cleaved DNA is purified and prepared as a library for Illumina sequencing. The sequencing process generates paired-end reads, offering comprehensive data on each cleavage site. CIRCLE-seq provides several advantages over other in vitro methods, including minimal sequencing depth requirements, low background, and high enrichment for Cas9-cleaved gDNA. These advantages enhance sensitivity in identifying both intended and unintended cleavage events. This study provides a comprehensive, step-by-step procedure for examining the off-target activity of CRISPR-Cas9 using CIRCLE-seq. As an example, this protocol is validated by mapping genome-wide unintended cleavage sites of CRISPR-Cas9 during the modification of the AAVS1 locus. The entire CIRCLE-seq process can be completed in two weeks, allowing sufficient time for cell growth, DNA purification, library preparation, and Illumina sequencing. The input of sequencing data into the CIRCLE-seq pipeline facilitates streamlined interpretation and analysis of cleavage sites.

<meta charset="utf8"></head><body>オフターゲット遺伝子編集の検討のためのCIRCLE-Seq

A significant barrier to technologies like CRISPR is the off-target events that can disrupt vital genes. 'Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing' (CIRCLE-seq) is a technique designed to identify unintended cleavage sites. This method maps the genome-wide activity of CRISPR-Cas9 with high sensitivity and without bias.

オフターゲット遺伝子編集の検討のためのCIRCLE-Seq

Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing (CIRCLE-seq) is a novel technique developed for the impartial identification of ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of this method, in comparison to other approaches, is its ability to monitor translation by precisely mapping the position and number of ribosomes on a mRNA transcript.
In this article, we describe the consecutive stages of sample collection and preparation for RIBO-seq method in bacteria, highlighting the details relevant to the planning and execution of the experiment.
Since the RIBO-seq relies on intact ribosomes and related mRNAs, the key step is rapid inhibition of translation and adequate disintegration of cells. Thus, we suggest filtration and flash-freezing in liquid nitrogen for cell harvesting with an optional pretreatment with chloramphenicol to arrest translation in bacteria. For the disintegration, we propose grinding frozen cells with mortar and pestle in the presence of aluminum oxide to mechanically disrupt the cell wall. In this protocol, sucrose cushion or a sucrose gradient ultracentrifugation for monosome purification is not required. Instead, mRNA separation using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by the ribosomal footprint excision (28-30 nt band) is applied and provides satisfactory results. This largely simplifies the method as well as reduces the time and equipment requirements for the procedure. For library preparation, we recommend using the commercially available small RNA kit for Illumina sequencing from New England Biolabs, following manufacturer&#39;s guidelines with some degree of optimization.
The resulting cDNA libraries present appropriate quantity and quality required for next generation sequencing (NGS). Sequencing of the libraries prepared according to the described protocol results in 2 to 10 mln uniquely mapped reads per sample providing sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is quick and relatively easy and can be performed with standard laboratory equipment.

Here we describe the stages of sample collection and preparation for RIBO-seq in bacteria. Sequencing of the libraries prepared according to these guidelines results in sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is simple, uses standard laboratory equipment and takes seven days from lysis to obtaining libraries.

細菌におけるRIBO-seq:NGSシーケンシングのためのサンプル収集とライブラリ調製プロトコル

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

生化学

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the standard protocols for generating genomic or transcriptomic libraries are incompatible and researchers must choose whether to sequence DNA or RNA for a particular sample. Gel-seq solves this problem by enabling researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA and RNA starting with 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries. We designed Gel-seq so that it could be easily implemented by other researchers; many genetics labs already have the necessary equipment to reproduce the Gel-seq device fabrication. Our protocol employs commonly-used kits for both whole-transcript amplification (WTA) and library preparation, which are also likely to be familiar to researchers already versed in generating genomic and transcriptomic libraries. Our approach allows researchers to bring to bear the power of both DNA and RNA sequencing on a single sample without splitting and with negligible added cost.

Gel-seq enables researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA- and RNA-seq at negligible added cost starting from 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries.

ゲル-seq: DNA および RNA のゲルのマトリックスを使用しての同時配列ライブラリの準備の方法

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

3' 末端配列 A seq2 とライブラリの準備

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