我々 は、ウィーンショウジョウバエリソースやショウジョウバエ系統を提供するブルーミントンショウジョウバエストック センター (NIH P40OD018537) を認めます。島アッセイ セットアップを構築するため島の試金し、Martijn Eidhof に私たちを導入するための Klämbt 研究所に感謝しております。本研究は E 珍しい 3 共同国境を越えた電話でサポートされている一部の許可「常染色体優性劣性 ataxias 療法の準備」科学的研究 (NWO) のため、オランダの組織からトップの助成金 (912-12-109) によって準備 (NWO 9003037604)2 DCN/Radboud 大学医療センター博士フェローシップ。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。

<ol>
	<li>Smeets, C. J., Verbeek, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+ataxia+and+functional+genomics:+Identifying+the+routes+to+cerebellar+neurodegeneration.">Cerebellar ataxia and functional genomics: Identifying the routes to cerebellar neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1842, 2030-2038 (2014).</li><li>Liu, Y. T., Lee, Y. C., Soong, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+have+learned+from+the+next-generation+sequencing:+Contributions+to+the+genetic+diagnoses+and+understanding+of+pathomechanisms+of+neurodegenerative+diseases.">What we have learned from the next-generation sequencing: Contributions to the genetic diagnoses and understanding of pathomechanisms of neurodegenerative diseases.</a> J Neurogenet. 29, 103-112 (2015).</li><li>He, J., Mangelsdorf, M., Fan, D., Bartlett, P., Brown, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+Genetic+Studies:+From+Genome-wide+Association+Mapping+to+Genome+Sequencing.">Amyotrophic Lateral Sclerosis Genetic Studies: From Genome-wide Association Mapping to Genome Sequencing.</a> Neuroscientist. 21, 599-615 (2015).</li><li>Lill, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Parkinson's+disease.">Genetics of Parkinson's disease.</a> Mol Cell Probes. 30, 386-396 (2016).</li><li>Bjedov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+life+span+extension+by+rapamycin+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster.">Mechanisms of life span extension by rapamycin in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Cell Metab. 11, 35-46 (2010).</li><li>Hada, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-chiro-inositol+and+pinitol+extend+the+life+span+of+Drosophila+melanogaster.">D-chiro-inositol and pinitol extend the life span of Drosophila melanogaster.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 68, 226-234 (2013).</li><li>Schmidt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+heavy+chain+function+in+Drosophila+glial+cells+controls+neuronal+activity.">Kinesin heavy chain function in Drosophila glial cells controls neuronal activity.</a> J Neurosci. 32, 7466-7476 (2012).</li><li>Kochinke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Phenomics+Analysis+Deconvolutes+Genes+Mutated+in+Intellectual+Disability+into+Biologically+Coherent+Modules.">Systematic Phenomics Analysis Deconvolutes Genes Mutated in Intellectual Disability into Biologically Coherent Modules.</a> Am J Hum Genet. 98, 149-164 (2016).</li><li>Volkenhoff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+Glycolysis+Is+Essential+for+Neuronal+Survival+in+Drosophila.">Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila.</a> Cell Metab. 22, 437-447 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A language and environment for statistical computing. , (2008).</li><li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).</li><li>Rothblum-Oviatt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxia+telangiectasia:+a+review.">Ataxia telangiectasia: a review.</a> Orphanet J Rare Dis. 11, 159 (2016).</li><li>Petersen, A. J., Rimkus, S. A., Wassarman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+kinase+inhibition+in+glial+cells+activates+the+innate+immune+response+and+causes+neurodegeneration+in+Drosophila.">ATM kinase inhibition in glial cells activates the innate immune response and causes neurodegeneration in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E656-E664 (2012).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li><li>. ImageJ User Guide - IJ 1.46 Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html</a> (2012)</li></ol>

著者はある利益相反を開示します。

このプロトコルでは、島のアッセイ中ショウジョウバエモーター動作を定量的に評価「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロについて説明します。マクロは、正確に高感度・運動の欠陥の定量的高スループット評価に適した島アッセイを行う時間をかけてのプラットフォームでハエをカウントします。方法論により、任意の条件の比較のためハエ薬曝露を含む、異なる遺伝的または環境条件下で栽培できます。この読み出しは運動障害のショウジョウバエモデルと他の神経疾患を勉強して大きな遺伝的または医薬品の画面を実行するとき、または歩行またはフライトを調べる検出ツールとして特に有用、します。動作です。
この原稿で示される島の試金プロトコルは、既存/代替方法上の利点を提供します。たとえば、ビデオ追跡歩行ははるかに時間がかかり、大規模なサンプル サイズのテストには適して。島の試金は高スループット スクリーニング ツールをあり、この意味で、迅速な対話型負走 (リング) アッセイ16に匹敵します。2 つの違いは、広範な運動の問題を検出するため島の試金ができます。降壇するハエの無力は、ジャンプ、飛行中の欠陥によって生じるまたはによる歩行行動特性 (筋肉・神経) の翼や脚 (筋肉・神経) の欠陥。その一方で、リング アッセイは登山歩行動作脚 (筋肉・神経) 欠陥によって引き起こされる欠陥を評価します。に備えてユーザー複数行動読み出しに興味を持っている、島アッセイはリング法などの他のアッセイでも簡単に結合できます。さらに、光遺伝学に必要なレーザーは島のアッセイでは、簡単にインストールできるし、セットアップがとても簡単なそれすることができます簡単に温度と光を制御できる部屋に移動すること。
成功とここで説明島アッセイの再現性を確保するため、いくつかの推奨事項に従ってください。因数と転送実験にハエは CO2か風邪麻酔の影響を避けるために実験の前に少なくとも 1 日でバイアルします。実験バイアルを満杯になるか (バイアルあたり 10-15 ハエを使用; バイアルあたりハエの数が同じを常に配置するが最適です)。生鮮食品にハエを保つため、すべての回で。そうでない場合はまだアッセイを行うに精通して、収率を最大限にプラットフォームに飛ぶ練習を投げます。また手をすぐに取り消し、練習データの解析 (画像解析と画像の手が後にのみ開始をカウントのフライ) と干渉する、その後、右します。環境・実験の条件を比較する必要がある実験で同一に保つ (異なった年齢でテスト対変異または遺伝子型のコントロールなど)。常に同じ時刻で実験を実行し、制御温度と湿度の条件の下でバイアルを維持します。統計的検出力の生物あたり、少なくとも 3 つの技術的なレプリケートをテストします。
説明するマクロのパフォーマンスの成功を確保するためここでは、ウェブカメラとイメージの設定する必要があります調整する最大コントラストを達成するために: 飛ぶ白いプラットフォーム上の黒のオブジェクトとして表示されます。マクロでハエの数を適切にカウントされないときのコントラストの設定を調整、投資収益率が選択が適切かどうかを確認、プラットフォームにおけるハエのサイズが指定した最小値以上であることを確認サイズの設定 (このプロトコルの手順 8.3 参照) を飛ぶ。設定は一度定義するだけです。彼らは、ウェブカメラとプラットフォーム間の距離が変更されない限り、すべての実験に適用されます。Circularity_min と最大の設定を定義、粒子の真円度 (粒子カウント ハエを =) 分析のために考慮するが表示されます (飛ぶカウントが設定されたオブジェクトを =)。1 は完全な円を表し、0 行17。ハエは、循環 (ハエは直線として表示できません) のある程度を常に存在、ので"Circularity_max"設定が 1 で、"Circularity_min"設定が 0.4 で。それはユーザーがこれらの設定を調整する必要があることはできません。
マクロ時折ミス カウント時にハエがプラットフォームの国境近くに位置しています。これは、ユーザー定義の投資収益率のうち徒歩がハエが飛ぶことができない場合に発生します。ほとんどの場合、投資収益率 (プラットフォームに可能な限りそれをフィッティング) を再度選択することによってこの問題が解決する簡単にできます。しかし、「島の試金分析」スクリプトを検出することが、投資収益率を比較的よくウォーキング ハエによる正しい不適切なデータ数。ここで紹介するウェブカメラの解像度が十分に高い近接かなりよくハエを差別するが実施して追加アルゴリズム「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロの画像処理手順のよう、流域関数17をむしばむと。これらはプラットフォームに近接しているハエの適切な描写を促進します。加えて、マクロはプラットフォームから飛び降りまたはそれから離れて飛んでいるハエを区別することができます。それにもかかわらず、健康な若い飛ぶ系統も飛んで古いや歩行の赤字蠅プラットフォームに長く残ると最終的に跳ぶか、またはプラットフォームから落ちるに対し、プラットフォームにドロップしたら直ちにが一般的に観察されます。これらの制限にもかかわらずアッセイと分析は、行動の非常に正確な測定を提供します。
「島の試金分析」スクリプトのパフォーマンスの成功を確保するため、ユーザーがプロトコルで指定されるスクリプト行で入力と出力ファイルの正しいパスを入力すると (示されるように適切なフォルダー形式でデータを提供するかどうかを確認するには図 2)。ユーザーにあまりにも厳しい信頼性の低い実験データをフィルター処理するための条件が検出された場合 (行 68:「数」の列の最初の値が 5 未満; 71 行:「数」の列の最初の値は、プラットフォーム上でスローされたハエの数の合計より高いrm +3) オフ行 68 と 71「島の試金分析」スクリプトでテキスト前に # 追加することによってこれらフィルターの設定。この場合、すべてのデータセットは、分析されます。また、フィルターの設定は、行 68 とユーザーのニーズによると 71 の値を調整することによって変更できます。「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロによって生成された"results.txt」のカウント値の可能な成果物も手動で調整することができ、、調整後のデータでスクリプトを再実行することができます。10 fps 以上、または 10 以上の処理中のユーザーの関心とデータの s、「島の試金分析」スクリプトによって処理されるフレーム数が調整します。統計解析は、ユーザー定義の代わりに置き換えることができます。
「例島アッセイは、」島の試金を使用して取得した画像時系列の例を含むをという名前のフォルダーは、次の web サイトで見つけることができます: https://doi-org.remotexs.ntu.edu.sg/10.6084/m9.figshare.4309652.v1。「例島アッセイ」フォルダーをダウンロードし迅速に徹底、「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロと「島の試金分析」で画像の処理のファイル ストレージの構造このプロトコルで説明されている手順に従ってくださいスクリプトです。
島アッセイ毛細血管拡張性運動失調のショウジョウバエモデルの異常な挙動を定量化して評価で開発したマクロの分析] スクリプトと組み合わせてを使用できます。アッセイは、様々 な年齢層に効率的に適用できます、ので、表現型の潜在的進歩的な性質を分析する適しています。
「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロと「島の試金分析」スクリプトと組み合わせて島アッセイは要約すると、客観的に分析し、の自発の欠陥を定量化する費用対効果、信頼性、および効率の高いアッセイショウジョウバエ高スループット方法で運動障害のモデル。

脳 (例えば、小脳性運動失調とパーキンソン病)、末梢神経の変性疾患が根底にある遺伝子の同定に、近年、次世代シーケンシング技術の進歩が大きく貢献してください。(例えば、筋萎縮性側索硬化症、遺伝性痙性対麻痺) の起源と筋の起源 (例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー)1,2,3,4.それにもかかわらず、これらの疾患のほとんどの根底にある分子メカニズムについてはほとんど知られています。治療法の開発には、これらのメカニズムの理解が欠かせません。
人間のようにフライトやショウジョウバエ、歩行などのモデル生物の動きは、中央脳、末梢神経系と筋肉によって制御されます。さらに、高速生成時間とショウジョウバエの遺伝のツールボックスを作るこのモデル生物遺伝子の高スループット スクリーニングに適して関与運動障害、薬物検査の5,6.このような画面は、信頼性が高く、コスト効率の高いと相対的なシンプルなアッセイとして自動化された方法で出力結果を定量化するためのツールでテストする必要がある条件のかなりの数のため、非常に望ましい。
シュミットら(2012 年)7 「島の試金」と呼ばれる低コスト テストを説明したショウジョウバエの歩行動作を評価します。島アッセイがグリア細胞に固有の機能と7、ショウジョウバエモデル知的障害8との一般的な評価のための評価の遺伝子を識別するために正常に大規模な上映で使用されてモーター動作9を飛ぶ。島の試金の原則の設計は、いくつかのハエのスローを高架のプラットフォームで構成されます。これは健全なハエのプラットフォームから秒以内に脱出することができる生得的な運動行動を誘導します。アッセイは、時間7,8,9以上のプラットフォームで残りのハエの数を測定します。これらすべての機能は、島アッセイが運動障害に関与する遺伝子の強力なスクリーニング ツールであることを示します。
現在、撮影島アッセイ データの量的分析は7、8,9を手動で行われます。アッセイの効率を向上させる、半自動的にプラットフォームからハエのエスケープを定量化する低コストの方法を開発しました。セットアップ上のプラットフォームでのハエの数を定量化する一連のフレームを持つ、プラットフォームの取得ごとに 0.1 s. フレームは「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロで処理して画像時間を収集するためにノート パソコンに接続されているシンプルなウェブカメラを使用してください。時間。「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロは 3 つの独立したサブ マクロに分かれています: (I)「作成スタックと投影」サブのマクロは別々 のサブフォルダーに格納されている別の島実験を識別し、スタックとそれぞれの投影を作成しますタイム シリーズ。(II)「定義プラットフォーム」サブ マクロが連続して利益 (率 ROI) の領域として島式ホームを手動で定義するその時点でユーザーが要求される個々 実験サブフォルダーにあるすべての"Projection_image_name.tif"ファイルを開きます。(III)「分析」は、自動的にプラットフォームで残りの時間シリーズ間ハエ数を定量化します。連続 (実行) でサブのマクロを実行できるまたは独立。統計的データ解析のための治療および遺伝子型動作お互い (図 1) と大幅に異なるかどうかを決定する統計テストを適用して自動的に得られたデータを処理するスクリプトが開発されました。最後に、(AT) 失調症毛細血管拡張症ショウジョウバエモデルの異常な運動能力を定量化して評価このセットアップが使えることを示した。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td class="xl19">25 x 95 mm Drosophila vials</td>
			<td class="xl19">Flystuff</td>
			<td class="xl20">32-116SB</td>
			<td class="xl19">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl21">Logitech C525 HD Webcam</td>
			<td class="xl19">Logitech</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Any webcam with USB connection is suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Stand to hold webcam</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Lamp</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">12 V LED lights are appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Pounding pad</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Any mouse pad works</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island Assay box</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island Assay bath</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 42x38x25 cm. Non white.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island/platform</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Soap</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Standard dishwashing detergent is suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Computer</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Scripts run both on Windows and Mac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl22">Image-recording software: HandiAvi&#174;</td>
			<td class="xl23">AZcendant&#174;</td>
			<td class="xl23">-</td>
			<td class="xl19">HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl22">Image-recording software: WebcamCapture</td>
			<td class="xl25">-</td>
			<td class="xl25">-</td>
			<td class="xl25">Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the &#34;Drosophila Island Assay&#34; macro on this data, no text should be present in the &#34;First frame identifier&#34; setting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Fiji</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">R studio</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl24">Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">R</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl24">Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput analysis of locomotor behavior in the drosophila island assay

次世代シーケンシング技術の進歩は、運動障害の増加速度で他の神経学的な病気 (候補者) 疾患遺伝子の同定に貢献します。しかし、少しはこれらの疾患の根底にある分子メカニズムについて知られています。キイロショウジョウバエの遺伝、分子のおよび行動のツールボックスは、このモデル生物を高スループット方法で新しい病気の遺伝子のメカニズムを特徴付けるに特に便利になります。それにもかかわらず、高スループットの画面を理想的には、これらの疾患に関連する形質の自動化の定量化を可能にする、コスト効率の高い効率的かつ信頼性の高いアッセイが必要です。島の試金は費用対効果と簡単にセットアップ方法ショウジョウバエの歩行動作を評価します。このアッセイでハエはプラットフォーム上に固定の高さからスローされます。これは、プラットフォームから秒以内に脱出する飛ぶことができる生得的な運動反応を誘導します。現在、撮影島アッセイの定量分析は、手動で行うが、大画面を実行する場合は特に骨の折れる作業であります。
この原稿では、高スループット、自動データ処理島アッセイ データの定量化に「ショウジョウバエ島アッセイ」と「島の試金分析」のアルゴリズムについて説明します。セットアップでノート パソコンに接続されているシンプルなウェブカメラは試金の実行はプラットフォームのイメージのシリーズを収集します。フィジーのオープン ソース ソフトウェアの開発「ショウジョウバエ島アッセイ」アルゴリズムは、これらイメージ シリーズを処理し、、実験条件ごと時間の経過と共にプラットフォーム ハエ数を定量化。自動的に得られたデータを処理し、治療および遺伝子型が統計的に有意に異なるかどうかを計算します、「島の試金分析」スクリプト、フリー ソフトウェア R と互換性が開発されました。これは大幅島アッセイの効率を向上させ、基本的な歩行や飛行行動の強力な読み出しになります。それはこうして調査飛ぶ運動能力運動障害と薬効のショウジョウバエモデルの大型スクリーンに適用できます。

説明プロトコル、ショウジョウバエ島アッセイ データが取得され、3 つの手順で処理されます。まず、ショウジョウバエ島式ホーム上にスロー フライト脱出応答がウェブカメラを記録、個々 の .bmp 画像 (プロトコル セクション 1-7) として格納されます。第二に、「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロ (手順 8) 処理"result.txt"テキスト ファイル(表 1)、要約する各フレームで検出されたオブジェクトの数を生成するフレームと画像のスタックを表わす「Result_stack.tiff」各フレームで、プラットフォームの領域内で検知されたオブジェクト。第三に、「島の試金分析」スクリプト (プロトコル セクション 9) は、個々 の実験「results.txt」ファイルに格納されているマクロ データを処理します。いくつかの手順は、フィルター処理および統計分析のためのデータを結合するスクリプトに組み込まれています。プラットフォームにハエがスローされます最初のフレームは、検出され、時間ポイント 1 として考慮されます。以前のフレームは、データセットから削除されます。次の時間 100 フレーム ポイント 1 (10 に対応する s) 分析対象として選択されます。ハエはプラットフォームの検出数の初期値 5 より小さい実験自動的に、パワー不足の実験から信頼性の低い結果を排除すること、分析から除外されます。プラットフォーム上に検出されたハエ数の初期値が「バイアルあたりハエの数」設定プラス 3 の許容範囲を超えている実験も除外されます。これは、ノイズの粒子はハエとして誤って検出されたデータセットを排除します。スクリプトは、ハエ ハエ シリーズの検出の最高数と比較して各時間ポイント検出の割合を計算します。投資収益率 (時間上プラットフォーム上にハエの割合の増加に続いて減少として検出される) ウォーキング ハエによるデータセット内のエラーが自動的に訂正によってそれらに関する以前の段階でプラットフォームに一貫して存在として.特定の実験条件のメイン ディレクトリに存在していたすべてのレプリケート データセットを結合して"data_all_conditions.csv"ファイルにエクスポートします。その列は、表 2に示す変数を表します。スクリプトは、データを含むフォルダー名に従って名前、各実験条件の線グラフもエクスポートされます。このグラフは、ハエを用いた実験 (飛行エスケープ応答) を時間をかけて残りのプラットフォーム上の % 複製(図 3 aのそれぞれのフォルダーに存在を示していますB)。平均、SD、実験条件ごとに SEM で計算され「統計 summary.csv"ファイルにまとめます。線グラフを"Escape_response_all_conditions.tiff"と呼ばれる応答を示しています平均飛行脱出まで 12 の実験的(図 3)のメインのフォルダーに存在する条件。最後に、メインのフォルダーにあるすべての実験条件の曲線下面積は計算され"AUC.csv"ファイルにまとめます。メイン フォルダーに存在の条件の数によってはスクリプトを披露するか 2 尾対ウェルチ t 検定 (2 条件) またはテューキー補正 ANOVA 多重検定 (以上 2 条件) を決定するかどうか実験条件は、お互いから大幅に異なります。これらの結果は"Welch_t-test_results.txt"または"AUC_anova_results.txt"にまとめて分散を実行すると、スクリプトはまた平均 AUC の差との比較実験の条件の 95% 信頼区間を表示する"AUC_anova.tiff"ファイルをエクスポートします。すべての実験条件の実験的複製の曲線の下の絶対領域の値は、"AUC.tiff"(図 3 D) の中央値で個々 のデータ ポイントとして表示されます。
失調症毛細血管拡張症 (AT) は、14失調症毛細血管拡張症変異 (ATM) の遺伝子の突然変異による小脳失調症の発症によって特徴付けられる常染色体優性劣性運動障害です。ATM、 tefu、ショウジョウバエの細胞の突然変異体は、モビリティと長寿の15の欠陥を表示します。「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロを評価するには、ATショウジョウバエモデルを島の試金のテストし、手動でデータ カウント マクロのデータ出力を比較しましたしました。そのユビキタスtefuを示したノックダウン (w-;Actin-Gal4/GD11950)自分の遺伝的背景のコントロール (w-; に比べてプラットフォームを残してこれらのはえの能力が大幅に減少Actin-Gal4/+) (図 4).1 後 s、コントロール ハエの 50% は、対照的に、プラットフォームを逃れていた、&#60; tefuの 1%-RNAi 飛ぶ。忠実にマクロで得られたデータがカウント マクロが島アッセイ データの定量化と動き欠陥(の評価に使用することができます信頼性の高いツールであることを示すマニュアルによって得られたデータを再現する重要なは、図 4A ・ B)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig1.jpg"> 
図 1: 要件、実験の手順、および島の試金の分析の概要を示すフローチャート。(A) 島アッセイ装置。(B) 島の試金のための実験装置。(C) 島の試金します。(D)「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロで島アッセイ データの処理します。「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロ、3 サブ マクロで構成されます: 1) スタックと投影を作る、2) 定義するプラットフォーム、および 3) 分析。(E) 処理と「島の試金分析」スクリプトを使用してデータの統計的評価。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55892/55892fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig2.jpg"> 
図 2: プロトコルの中に必要なさまざまな調整の例です。(A) 必要なディレクトリ構造がどの島でアッセイ実験をデータ処理および分析のため保存必要があります。(B) ハエが表示する必要があります、ビデオ設定を調整するとき白地に黒。(C) 画像フレームの出力ファイル本稿で説明する画像記録ソフトウェアによって保存されます。(D) 黄色のアウトラインは、プラットフォームの選択を示しています。「ROI マネージャー」でストアドのプラットフォームの選択は、青色で強調表示されます。(E) ハエは「最小飛ぶサイズ設定」の調整中の白い点として表されます結果ウィンドウは、ピクセル単位でハエの領域を示しています。(F) 事例 (右側)「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロで得られた結果の画像のスタックに対応するフレーム (左側) 単一の記録された画像フレーム。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55892/55892fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig3.jpg"> 
図 3:「島の試金分析」スクリプトでデータ処理後に得られる結果画像(A) 行ごと飛行脱出の応答を示すグラフ制御実験複製。(B) 線各 tefu RNAi 実験複製の飛行脱出の応答を示すグラフします。(C) 平均飛行エスケープ応答実験条件を示されている;誤差範囲を表す曲線分布制御と変異条件の下の領域を表す SEM. (D) ドット プロット。Tefu RNAi とコントロールの両方の条件の実験的複製は、中央分離帯 (赤い線) (黒) で個々 のデータ ポイントとして表示されます。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55892/55892fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig4.jpg"> 
図 4: ユビキタスtefuノックダウン ハエはプラットフォームを残す能力の大幅低下を示しています。データ コントロール (w-; (s) 時間をかけてプラットフォームにおけるハエの % を表すActin-Gal4/+) と tefu RNAi (w-;Actin-Gal4/GD11950) 飛ぶ。(複製の数 = 5; 誤差範囲を表す SEM)。(A)「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロで得られる生データ。(B) ドット プロット曲線分布「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロで得られた制御および tefu RNAi 条件の下の領域を表す (ウェルチの t 検定登録 * * p &#60; 0.01)。(C) 生データは手動で 1 秒あたりの島に現在ハエの数をカウントすることによって得られます。(D) ドット プロット カーブ コントロール Tefu RNAi 条件手カウントすることによって得られた分布の下の領域を表す (ウェルチの t 検定登録 * * p &#60; 0.01)。誤差範囲を表す SEM<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55892/55892fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>列名</td>
			<td colspan="3">説明</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>スライス</td>
			<td colspan="3">フレームの名前。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>カウント</td>
			<td colspan="3">フレーム (率 ROI) プラットフォームの限界内で検出されたオブジェクトの数。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>総面積</td>
			<td colspan="3">プラットフォーム (ROI) ピクセルの範囲内でフレーム内で検知されたオブジェクトの総面積。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>平均サイズ</td>
			<td colspan="3">フレーム (率 ROI) プラットフォームの限界内のオブジェクトの数で割った値で検出されたオブジェクトの総面積。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>% 領域</td>
			<td colspan="3">プラットフォーム (ROI) の総面積に対してオブジェクトによって占有されている領域の割合です。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perim。</td>
			<td colspan="3">プラットフォーム (ROI) ピクセルの範囲内でフレーム内で検知されたオブジェクトの総周長。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>分飛ぶサイズ</td>
			<td colspan="3">最低限は飛ぶ (単位: ピクセル)「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロのグラフィカル インターフェイスでユーザーが定義したサイズ設定です。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROI の領域</td>
			<td colspan="3">サブのマクロの実行中に、ユーザーが定義したプラットフォーム (ROI) の領域 (単位: ピクセル) プラットフォームを定義します。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ハエの数</td>
			<td colspan="3">「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロのグラフィカル インターフェイスでユーザーが定義した実験あたり使用されるハエの数です。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1: パラメーター「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロで測定。この表で説明されているパラメーターが「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロを実行する時に"results.txt」ファイルで表示されます。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>列名</td>
			<td colspan="3">説明</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>スライス</td>
			<td colspan="3">フレーム番号。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>カウント</td>
			<td colspan="3">ハエ検出 (率 ROI) プラットフォームの限界内のフレームの数です。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Area</td>
			<td colspan="3">ピクセルの (ROI) プラットフォームの限界内のフレームに検出されたハエの総面積。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>分飛ぶサイズ</td>
			<td colspan="3">最低限飛ぶサイズ エントリ設定 (単位はピクセル)「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロのグラフィカル インターフェイスでユーザーが定義されています。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROI の領域</td>
			<td colspan="3">「プラットフォームの定義」サブのマクロを実行するときに、ユーザーが定義したプラットフォーム (ピクセル単位で、投資収益率) の領域。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ハエの数</td>
			<td colspan="3">「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロのグラフィカル インターフェイスでユーザーが定義した実験あたり使用されるハエの数です。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Count</td>
			<td colspan="3">% 飛ぶハエの実験中にプラットフォーム上で検出された数の最大値を基準にしてそれぞれのスライス/フレームのプラットフォーム上に存在。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timepoint</td>
			<td colspan="3">1 の時点を表し分析する最初のフレーム、ハエがプラットフォーム上で最初表示フレームに対応します。分析あたり 100 フレームの合計がある (10 に対応する s、説明されている設定を使用する場合。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>実験</td>
			<td colspan="3">1 つの条件複製の数です。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>条件</td>
			<td colspan="3">(ユーザー定義のデータを含むフォルダーの名前) によると実験条件の名前を示します。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 2:「島の試金分析」スクリプトを使用してデータを処理して得られた変数の説明この表に記載されているパラメーターは、「島の試金分析」スクリプトによるデータ処理時に"data_all_conditions.csv"ファイルに表示されます。

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High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

島の試金は比較的新しい、コスト効果の高いアッセイキイロショウジョウバエの基本的な運動動作を評価するために使用できます。本稿では、自動データ処理と島のアッセイのデータ、このアッセイの大きな遺伝的または薬理学的画面の高感度、高速読み出しの客観的定量化のためのアルゴリズムについて説明します。

ショウジョウバエ島アッセイにおける歩行行動の高スループット解析

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

high-throughput-analysis-locomotor-behavior-drosophila-island

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

8.8K ビュー.  Radboud University Medical Center. 島の試金は比較的新しい、コスト効果の高いアッセイキイロショウジョウバエの基本的な運動動作を評価するために使用できます。本稿では、自動データ処理と島のアッセイのデータ、このアッセイの大きな遺伝的または薬理学的画面の高感度、高速読み出しの客観的定量化のためのアルゴリズムについて説明します。

ビデオ: High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

昆虫における単一感覚子録音キイロショウジョウバエとハマダラカ</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

神経科学

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of these diseases, including Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease are characterized by age-dependent deterioration in learning and memory functions and movement coordination2. Here we use behavioral assays, including the negative geotaxis assay3 and the aversive phototaxic suppression assay (APS assay)4,5, to show that some of the behavior characteristics associated with human neurodegeneration can be recapitulated in flies. In the negative geotaxis assay, the natural tendency of flies to move against gravity when agitated is utilized to study genes or conditions that may hinder locomotor capacities. In the APS assay, the learning and memory functions are tested in positively-phototactic flies trained to associate light with aversive bitter taste and hence avoid this otherwise natural tendency to move toward light. Testing these trained flies 6 hours post-training is used to assess memory functions. Using these assays, the contribution of any genetic or environmental factors toward developing neurodegeneration can be easily studied in flies.

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior assays for measuring locomotor functions, learning, and memory abilities in Drosophila.

でアッセイする運動、学習、記憶障害ショウジョウバエ</em神経変性の>モデル

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Studying the Neural Basis of Adaptive Locomotor Behavior in Insects

Studying the neural basis of walking behavior, one often faces the problem that it is hard to separate the neuronally produced stepping output from those leg movements that result from passive forces and interactions with other legs through the common contact with the substrate. If we want to understand, which part of a given movement is produced by nervous system motor output, kinematic analysis of stepping movements, therefore, needs to be complemented with electrophysiological recordings of motor activity. The recording of neuronal or muscular activity in a behaving animal is often limited by the electrophysiological equipment which can constrain the animal in its ability to move with as many degrees of freedom as possible. This can either be avoided by using implantable electrodes and then having the animal move on a long tether (i.e. Clarac et al., 1987; Duch &amp; Pfl&uuml;ger, 1995; B&ouml;hm et al., 1997; Gruhn &amp; Rathmayer, 2002) or by transmitting the data using telemetric devices (Kutsch et al, 1993; Fischer et al., 1996; Tsuchida et al. 2004; Hama et al., 2007; Wang et al., 2008). Both of these elegant methods, which are successfully used in larger arthropods, often prove difficult to apply in smaller walking insects which either easily get entangled in the long tether or are hindered by the weight of the telemetric device and its batteries. In addition, in all these cases, it is still impossible to distinguish between the purely neuronal basis of locomotion and the effects exerted by mechanical coupling between the walking legs through the substrate. One solution for this problem is to conduct the experiments in a tethered animal that is free to walk in place and that is locally suspended, for example over a slippery surface, which effectively removes most ground contact mechanics. This has been used to study escape responses (Camhi and Nolen, 1981; Camhi and Levy, 1988), turning (Tryba and Ritzman, 2000a,b; Gruhn et al., 2009a), backward walking (Graham and Epstein, 1985) or changes in velocity (Gruhn et al., 2009b) and it allows the experimenter easily to combine intra- and extracellular physiology with kinematic analyses (Gruhn et al., 2006).
We use a slippery surface setup to investigate the timing of leg muscles in the behaving stick insect with respect to touch-down and lift-off under different behavioral paradigms such as straight forward and curved walking in intact and reduced preparations.

We describe a method to record motor activity, timed to the electrically recorded tarsal contact signal in a tethered insect, walking on a slippery surface. This is used to study the neural basis of adaptive behavior under reduced influence of mechanical interaction between legs through the substrate.

昆虫に適応運動行動の神経基盤を研究し

Studying the neural basis of walking behavior, one often faces the problem that it is hard to separate the neuronally produced stepping output from those ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

開発マウス網膜の in vivoエレクトロポレーションで

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

アッセイのメソッドショウジョウバエ行動

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

で逃避行動のOptogenetic刺激<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

での採餌行動のためのシングル·フライアッセイ<em&gt;ショウジョウバエ</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

における自発運動量の測定<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

個々の産卵環境を調べるために、ハイスループットアッセイ<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

使用して報酬を求める行動の変化を測定するための簡単な方法<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...