אנו להכיר מרכז המשאבים דרוזופילה וינה ומרכז בלומינגטון דרוזופילה מניות (NIH P40OD018537) למתן זנים דרוזופילה . אנחנו אסירי תודה למעבדה Klämbt פיבי וזמינותו האי, מרטין Eidhof לבניית הגדרת assay האי מחקר זה היה חלק בתמיכת את E-נדיר-3 משותפת חוצה גבולות להתקשר הענק "הכנת טיפולים ataxias הקרים autosomal" הכן (בתחרות 9003037604), על ידי מענק העליון (912-12-109) מארגון הולנד על מחקר מדעי (בתחרות), ועל -ידי שתי מלגות לתואר שלישי מרכז רפואי של DCN/Radboud האוניברסיטה. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד.

<ol>
	<li>Smeets, C. J., Verbeek, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+ataxia+and+functional+genomics:+Identifying+the+routes+to+cerebellar+neurodegeneration.">Cerebellar ataxia and functional genomics: Identifying the routes to cerebellar neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1842, 2030-2038 (2014).</li><li>Liu, Y. T., Lee, Y. C., Soong, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+have+learned+from+the+next-generation+sequencing:+Contributions+to+the+genetic+diagnoses+and+understanding+of+pathomechanisms+of+neurodegenerative+diseases.">What we have learned from the next-generation sequencing: Contributions to the genetic diagnoses and understanding of pathomechanisms of neurodegenerative diseases.</a> J Neurogenet. 29, 103-112 (2015).</li><li>He, J., Mangelsdorf, M., Fan, D., Bartlett, P., Brown, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+Genetic+Studies:+From+Genome-wide+Association+Mapping+to+Genome+Sequencing.">Amyotrophic Lateral Sclerosis Genetic Studies: From Genome-wide Association Mapping to Genome Sequencing.</a> Neuroscientist. 21, 599-615 (2015).</li><li>Lill, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Parkinson's+disease.">Genetics of Parkinson's disease.</a> Mol Cell Probes. 30, 386-396 (2016).</li><li>Bjedov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+life+span+extension+by+rapamycin+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster.">Mechanisms of life span extension by rapamycin in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Cell Metab. 11, 35-46 (2010).</li><li>Hada, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-chiro-inositol+and+pinitol+extend+the+life+span+of+Drosophila+melanogaster.">D-chiro-inositol and pinitol extend the life span of Drosophila melanogaster.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 68, 226-234 (2013).</li><li>Schmidt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+heavy+chain+function+in+Drosophila+glial+cells+controls+neuronal+activity.">Kinesin heavy chain function in Drosophila glial cells controls neuronal activity.</a> J Neurosci. 32, 7466-7476 (2012).</li><li>Kochinke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Phenomics+Analysis+Deconvolutes+Genes+Mutated+in+Intellectual+Disability+into+Biologically+Coherent+Modules.">Systematic Phenomics Analysis Deconvolutes Genes Mutated in Intellectual Disability into Biologically Coherent Modules.</a> Am J Hum Genet. 98, 149-164 (2016).</li><li>Volkenhoff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+Glycolysis+Is+Essential+for+Neuronal+Survival+in+Drosophila.">Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila.</a> Cell Metab. 22, 437-447 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A language and environment for statistical computing. , (2008).</li><li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).</li><li>Rothblum-Oviatt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxia+telangiectasia:+a+review.">Ataxia telangiectasia: a review.</a> Orphanet J Rare Dis. 11, 159 (2016).</li><li>Petersen, A. J., Rimkus, S. A., Wassarman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+kinase+inhibition+in+glial+cells+activates+the+innate+immune+response+and+causes+neurodegeneration+in+Drosophila.">ATM kinase inhibition in glial cells activates the innate immune response and causes neurodegeneration in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E656-E664 (2012).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li><li>. ImageJ User Guide - IJ 1.46 Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html</a> (2012)</li></ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר את המאקרו"דרוזופילה האי Assay" הבודק באופן כמותי התנהגות מוטורית דרוזופילה במהלך וזמינותו האי. המאקרו במדויק ספירת הזבובים על פלטפורמת לאורך זמן, ביצוע וזמינותו האי רגיש מאוד ומתאים הערכה כמותית תפוקה גבוהה של פגמים גינקולוגיות. המתודולוגיה מאפשר השוואת תנאי כלשהו, עם זבובים גדל תחת מצבים גנטיים או סביבתיים שונים, כולל חשיפה לסמים. המחוון הזה ולכן שימושי במיוחד ככלי גילוי בעת ביצוע מסכי גנטית או תרופות גדולים, כשלמדתי דרוזופילה מודלים של הפרעות תנועה, מחלות נוירולוגיות אחרות, או כאשר בדיקת גפיים או טיסה התנהגות.
פרוטוקול assay האי שהוצגו בכתב יד זה מספק יתרונות על פני שיטות קיימות/חלופית. לדוגמה, גפיים מעקב וידאו הוא ועתירת פחות מתאים לבדיקה מדגמים גדולים הרבה יותר. וזמינותו האי הוא כלי סינון תפוקה גבוהה, במובן זה, דומה לדקל ה assay מהירה geotaxis שלילי אינטראקטיבי (טבעת)16. ההבדל בין השניים הוא מבחני האי מאפשר איתור של מגוון רחב יותר של בעיות גינקולוגיות; חוסר היכולת של זבובים לעזוב את הפלטפורמה יכולה להיגרם על ידי ליקויים-טיסה, קפיצות, או הליכה להתנהגות הנגרמת על ידי אגף (שריר/עצביים) ו/או הרגל (שריר/עצביים) פגמים. מצד שני, וזמינותו טבעת מעריך פגמים בהתנהגות טיפוס/הליכה הנגרמת על ידי פגמים הרגל (שריר/עצביים). למקרה המשתמשים מעוניינות המפרט התנהגותית מרובים, ניתן לשלב וזמינותו האי בקלות גם עם מבחני אחרים, כגון הטבעת וזמינותו. בנוסף, לייזרים הדרושים עבור optogenetics יכול בקלות להיות מותקן בתיבת האי assay, הסידור הזה כל כך פשוט כי ניתן בקלות להזיז לחדר שבו לטמפרטורה ואור יכול להיות נשלט.
כדי להבטיח את ההצלחה ואת הפארמצבטית של האי וזמינותו המתוארים כאן, צריכה להיות מלווה מספר המלצות. Aliquot והעברת שבקבוקי הזבובים במבחן ניסויי לפחות יום אחד לפני הניסוי כדי למנוע את השפעת ההרדמה CO2 או קור. לא overcrowd את הבקבוקונים ניסיוני (השתמש זבובים 10-15 לכל מבחנה; מומלץ תמיד יש להציב מספר זהה של זבובים לכל מבחנה). שמור את הזבובים על מזון טרי בכל עת. אם לא מוכר כבר עם ביצוע וזמינותו, תרגול זריקת זבובים על הפלטפורמה כדי למקסם את התשואה. גם להתאמן במהירות בכדי לבטל את היד מיד לאחר מכן, כפי זה מפריע ניתוח הנתונים (ניתוח תמונות וטיסה ספירת התחלה רק לאחר היד היא מחוץ לתמונה). לשמור על התנאים הסביבתיים וניסויים זהים בניסויים צריך להשוות (למשל, פקדים נגד מוטציות או של גנוטיפ נבדק בגילאים שונים). תמיד לבצע את הניסויים באותו זמן של היום ולתחזק את הבקבוקונים תחת טמפרטורה מבוקרת, בתנאי לחות. עבור עוצמה סטטיסטית, מבחן משכפל טכנית לפחות שלושה לכל שכפול ביולוגי.
כדי להבטיח את הביצועים מוצלחת של המאקרו המתוארות כאן, מצלמת אינטרנט הגדרות התמונה שתישמר להשגת חדות מירבית: טס להופיע כאובייקטים שחור על משטח לבן. כאשר המספר של זבובים לא נספרת כראוי על-ידי המאקרו, לכוונן את הגדרות החדות, לבדוק אם רועי נבחר כראוי, להבטיח הגודל של הזבובים על הפלטפורמה מעל המינימום שצוין לטוס גודל הגדרת (ראה שלב 8.3 של פרוטוקול זה). ההגדרות רק צריכה להיות מוגדרת פעם אחת. הם חלים על כל הניסויים, כל עוד המרחק בין מצלמת האינטרנט פלטפורמת אינו משתנה. Circularity_min ואת הגדרות מקסימום להגדיר את מעגליות של החלקיקים (חלקיקים = שנספרו זבובים) זה יילקח בחשבון לניתוח (זבובים = שנספרו אובייקטים). 1 מייצג מעגל מושלם ו- 0 מייצג קו17. מאז הזבובים תמיד נוכח מידה מסוימת של מעגליות (זבוב לא יכול להופיע בתור קו ישר), הגדרת "Circularity_max" נקבע על 1, ההגדרה "Circularity_min" מוגדר ב- 0.4. לא סביר כי המשתמש צריך לכוונן הגדרות אלה.
המאקרו מדי פעם עושה טעויות הספירה כאשר זבוב ממוקם בסמוך לגבול של הפלטפורמה. הדבר יכול להתרחש אם הזבובים לא יכולים לעוף אבל הליכה בין רועי על-ידי המשתמש. ברוב המקרים, וטבלה רועי (התאמת זה ככל האפשר פלטפורמת) ניתן בקלות לפתור בעיה זו. אולם, התסריט "האי Assay ניתוח" הוא מסוגל לזהות, הנתונים הנכונים פסולים ספירות הנגרמת על ידי זבובים הליכה ויוצאים רועי בצורה טובה יחסית. למרות הרזולוציה של מצלמת האינטרנט המוצג כאן הוא גבוה מספיק כדי להפלות זבובים בסמיכות יחסית טוב, יישמנו אלגוריתמים נוספים במסגרת ההליך עיבוד התמונה המאקרו"דרוזופילה האי Assay", כגון קו פרשת המים, לשחוק את הפונקציה17. אלה מאפשרים את התיחום נאותה של הזבובים הנמצאים בסמיכות על הרציף. בנוסף, המאקרו אינו מסוגל להבחין בין זבובים קפץ מן הרציף או עף מחוץ לה. למרות זאת, הוא בדרך כלל ציין כי בריא צעיר זנים לעוף לעוף משם מיד כאשר נפל על הפלטפורמה, ואילו זבובים בוגרים וזבובים עם גירעונות גינקולוגיות להישאר זמן רב יותר על הרציף, בסופו של דבר לקפוץ או ליפול הפלטפורמה. למרות מגבלות אלו, וזמינותו של ניתוח לספק מידה מאוד מדויק של התנהגות גינקולוגיות.
כדי להבטיח את הביצועים מוצלחת של ה-script "האי Assay ניתוח", למשתמש יש לוודא כדי להזין את הנתיבים הנכון עבור קבצי קלט ופלט השורות התסריט המצוין הפרוטוקול וכדי לספק את הנתונים בתבנית של התיקיה הנכונה (כפי שמצוין איור 2). אם המשתמש ימצא את הקריטריונים המשמשים כדי לסנן נתוני הניסוי לא אמין גם מחמירים (שורה 68: הערך הראשון בעמודה "סמוך" הוא קטן או שווה ל- 5; שורה 71: הערך הראשון בעמודה "ספירה" הוא גבוה יותר מאשר המספר הכולל של זבובים הושלכו על משחקי פלטפורמה. rm +3), בטל את הגדרות סינון אלה על-ידי הוספה של # לפני הטקסט בשורות 68, 71 בקובץ ה-script "האי Assay ניתוח". במקרה זה, datasets כל ייכללו בניתוח. לחלופין, ניתן לשנות הגדרות המסנן על-ידי התאמת הערכים של שורות 68, 71 על פי צרכי המשתמש. החפצים האפשריים ב ספירת הערכים "results.txt" שנוצר על-ידי המאקרו"דרוזופילה האי Assay" ניתן גם להתאימם באופן ידני, ניתן להפעיל מחדש התסריט על נתונים מנוכי עונתיות. כאשר המשתמש מעוניין עיבוד יותר מ 10 fps, או יותר מ 10 s של נתונים, צריך מספר המסגרות שעובדו על-ידי קובץ ה-script "האי Assay ניתוח"ניתן להתאים. ניתוח סטטיסטי גם יכול להיות מוחלף על ידי חלופות המוגדרות על-ידי המשתמש.
תיקיה בשם "דוגמאות האי Assay," המכיל דוגמאות עם זמן תמונות-תוך שימוש assay את האי, הסדרה ניתן למצוא באתר הבא: https://doi-org.remotexs.ntu.edu.sg/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. הורד את התיקיה "דוגמאות האי Assay" ובצע את השלבים המתוארים פרוטוקול זה כדי במהירות להפוך היכרות עם המבנה של קובץ אחסון, העיבוד של התמונות עם המאקרו "assay דרוזופילה האי", "האי Assay הניתוח" . התסריט.
האי וזמינותו, בשילוב עם מאקרו מפותחת, ניתוח תסריט, ניתן להשתמש כדי להעריך ולכמת את אופן הפעולה של תנועה חריגה של מודל דרוזופילה של תסמונת אטקסיה טלנגיאקטזיה. מאז וזמינותו ניתן להחיל ביעילות על הגילאים השונים, זה גם מתאים לניתוח אופי פרוגרסיבי פוטנציאל פנוטיפים.
לסיכום, וזמינותו האי, בשילוב עם המאקרו"דרוזופילה האי Assay" התסריט "האי Assay ניתוח", הוא assay חסכוני, אמין ויעיל מאוד לנתח באופן אובייקטיבי לכמת גינקולוגיות פגמים של דרוזופילה מודלים של הפרעות תנועה באופן תפוקה גבוהה.

בשנים האחרונות, ההתקדמות בטכנולוגיות הדור הבא רצפי תרמו במידה רבה הזיהוי של גנים שבבסיס הפרעות תנועה ניווניות של המוח (למשל, אסטרוציטומה אטקסיה, פרקינסון), של העצבית ההיקפית המקור (למשל, נוירודגנרטיביות, גפיים ספסטית תורשתי), ושל שרירי המקור (למשל, שרירים דושן, ניוון חולים myotonic)1,2,3,4 . למרות זאת, מעט מאוד ידוע על המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס רוב ההפרעות האלה. הבנה טובה יותר של מנגנונים אלה חיוני לפיתוח טיפולים.
כמו אצל בני אדם, תנועה אורגניזמים מודל, כגון טיסה, וחיות ב דרוזופילה, נשלטת על ידי מרכזי המוח, מערכת העצבים ההיקפית, והשרירים. בנוסף, הדור מהיר והזמן גנטי בארגז הכלים של דרוזופילה להפוך את זה אורגניזם מודל מתאים במיוחד עבור ההקרנה תפוקה גבוהה של גנים המעורבים בהפרעות תנועה עבור5,6 בדיקות סמים . עקב מספר משמעותי של תנאי זה צריך להיבדק ב כגון מסכי, אמין, חסכוני, מבחני פשוטה יחסית, וכן כלים לכמת את התוצאות בצורה אוטומטית, הם רצוי מאוד.
שמידט. et al. (2012) 7 תיאר מבחן נמוכים שנקרא "וזמינותו האי" כדי להעריך את התנהגות גינקולוגיות דרוזופילה . וזמינותו האי שימש בהצלחה ב הקרנות בקנה מידה גדול לזיהוי גנים עם פונקציות ייחודיות עכשיו, דונלד7, בהערכה של דרוזופילה מודלים של מוגבלות8, וגם עבור הערכת כללי לטוס התנהגות מוטורית9. העיצוב עיקרון של וזמינותו האי מורכב פלטפורמה מוגבהת שעליו נזרקים כמה זבובים. זה גורם של התנהגות מוטורית מולדת המאפשרת זבובים בריא להימלט מן הרציף בתוך שניות. וזמינותו מודד את מספר זבובים שנותרו על הרציף נגמר הזמן7,8,9. כל התכונות הללו מציינים כי וזמינותו האי עשוי להיות כלי סינון רב עוצמה עבור גנים המעורבים בהפרעות תנועה.
כיום, ניתוח כמותי של האי מצולם assay נתונים מתבצעת באופן ידני7,8,9. כדי לשפר את היעילות של וזמינותו, פותחה שיטה בעלות נמוכה באופן אוטומטי למחצה לכמת הבריחה של זבובים מן הרציף. הגדרת משתמש פשוט מצלמת רשת מחובר למחשב נייד כדי לאסוף את הזמן התמונה סדרה של הפלטפורמה, עם מסגרות רכשה כל 0.1 מסגרות ס' מעובדים אז עם המאקרו"דרוזופילה האי Assay" מכמת את המספר של זבובים על פלטפורמת מעל הגיע הזמן. המאקרו"דרוזופילה האי Assay" מחולק שלוש פקודות מאקרו עצמאיות משנה: (I) "מחסנית צור, הקרנה," המשנה מאקרו מזהה אי אחר ניסויים המאוחסנים בתיקיות שונות ויוצר ערימה והקרנה של כל אחד סדרת זמן. (II) המאקרו המשנה "פלטפורמה להגדיר" יפתח ברציפות כל "Projection_image_name.tif" קבצים הממוקמים בתיקיות המשנה בודדים ניסיוני, ובשלב המשתמש הוא מתבקש להגדיר באופן ידני פלטפורמת האי אזור בעל עניין (ROI). (III) "ניתוח" מכמתת באופן אוטומטי את המספר של זבובים שנותרו על הבמה במהלך סדרת הזמן. ניתן להפעיל את פקודות המאקרו משנה ברציפות (בהפעלה אחת) או באופן עצמאי. עבור ניתוח נתונים סטטיסטיים, תסריט פותחה לעיבוד אוטומטי של נתונים המתקבלים, כדי להחיל מבחן סטטיסטי כדי לקבוע אם טיפולי/אחרים מתנהגים שונה באופן משמעותי מזו (איור 1). בסופו של דבר, הוכח כי תוכנית התקנה זו ניתן להשתמש כדי להעריך ולכמת את היכולת גינקולוגיות aberrant של מודל דרוזופילה תסמונת של אטקסיה טלנגיאקטזיה (ב).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td class="xl19">25 x 95 mm Drosophila vials</td>
			<td class="xl19">Flystuff</td>
			<td class="xl20">32-116SB</td>
			<td class="xl19">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl21">Logitech C525 HD Webcam</td>
			<td class="xl19">Logitech</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Any webcam with USB connection is suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Stand to hold webcam</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Lamp</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">12 V LED lights are appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Pounding pad</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Any mouse pad works</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island Assay box</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island Assay bath</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 42x38x25 cm. Non white.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island/platform</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Soap</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Standard dishwashing detergent is suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Computer</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Scripts run both on Windows and Mac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl22">Image-recording software: HandiAvi&#174;</td>
			<td class="xl23">AZcendant&#174;</td>
			<td class="xl23">-</td>
			<td class="xl19">HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl22">Image-recording software: WebcamCapture</td>
			<td class="xl25">-</td>
			<td class="xl25">-</td>
			<td class="xl25">Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the &#34;Drosophila Island Assay&#34; macro on this data, no text should be present in the &#34;First frame identifier&#34; setting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Fiji</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">R studio</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl24">Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">R</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl24">Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput analysis of locomotor behavior in the drosophila island assay

ההתקדמות בטכנולוגיות הדור הבא רצפי לתרום זיהוי גנים מחלה (מועמד) הפרעות תנועה, מחלות נוירולוגיות אחרות במהירות גוברת. עם זאת, מעט מאוד ידוע על המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הפרעות אלה. ארגז הכלים הגנטי המולקולרי, התנהגותיות של דרוזופילה melanogaster הופך את זה אורגניזם מודל שימושי במיוחד לאפיון גנים מחלה חדשה ומנגנונים באופן תפוקה גבוהה. למרות זאת, תפוקה גבוהה מסכי לדרוש מבחני יעיל ואמין כי, באופן אידיאלי, הם חסכוניים ולא לאפשר כימות automatized של תכונות רלוונטיות להפרעות אלה. האי וזמינותו היא חסכונית בקלות הגדרת שיטה להערכת התנהגות גינקולוגיות דרוזופילה . ב הזה assay, זבובים נזרקים על גבי פלטפורמה של גובה קבוע. זה גורם תגובה מוטורית הטבועה, המאפשרת את הזבובים להימלט מן הרציף בתוך שניות. בזמן הנוכחי, כמותני של האי מצולם מבחני נעשים באופן ידני, וזו משימה מייגעת, במיוחד בעת ביצוע במסכים גדולים.
כתב יד זה מתאר את האלגוריתמים"דרוזופילה האי Assay" ו- "האי Assay ניתוח" תפוקה גבוהה, עיבוד נתונים אוטומטי של כימות של האי assay נתונים. בכיוונון, פשוט מצלמת רשת מחובר למחשב נישא אוסף סדרות תמונה של פלטפורמת בזמן ביצוע וזמינותו. האלגוריתם"דרוזופילה האי Assay" שפותחה עבור תוכנת קוד פתוח פיג'י תהליכים אלה סדרת תמונות, מכמתת, עבור כל תנאי הניסוי, המספר של זבובים על פלטפורמת לאורך זמן. התסריט של "האי Assay ניתוח", תואם את התוכנה חינם R, פותחה לעיבוד אוטומטי של נתונים המתקבלים, כדי לחשב אם טיפולי/אחרים שונים מבחינה סטטיסטית. זה מאוד משפר את היעילות של האי וזמינותו, מקל על הבדיקה עוצמה ומכניקה בסיסית והתנהגות טיסה. ניתן להחיל אותו ובכך למסכים גדולים חוקרים גינקולוגיות היכולת לעוף, דרוזופילה מודלים של הפרעות תנועה, יעילות התרופה.

ב פרוטוקול המתואר, דרוזופילה האי assay נתונים רכשה, מעובד בשלושה צעדים. ראשית, תגובת הבריחה טיסה דרוזופילה נזרק על הפלטפורמה איילנד נרשמים עם מצלמת אינטרנט ומאוחסנים כתמונות בודדות. bmp (סעיפים 1-7 לפרוטוקול). שנית, המאקרו"דרוזופילה האי Assay" (שלב 8) תהליכי המסגרות, יצירת "result" של. טקסט txt (טבלה 1), בו מסוכם מספר האובייקטים זוהה בכל מסגרת, ואוסף תמונות "Result_stack.tiff", אשר מציג האובייקטים אותר בתוך האזור של פלטפורמת בכל מסגרת. שלישית, התסריט "האי Assay ניתוח" (פרוטוקול סעיף 9) מעבד את נתוני מאקרו המאוחסן בתוך הקבצים "results.txt" של ניסויים בודדים. מספר צעדים משולבים בקובץ ה-script כדי לסנן ולשלב את הנתונים לניתוח סטטיסטי. המסגרת הראשונה שבה הזבובים נזרקים על פלטפורמת זוהה ונחשב כנקודת זמן 1. מסגרות קודמות מסולקות החל ערכת הנתונים. 100 מסגרות בעקבות הזמן נקודה 1 (המקביל 10 s) נבחרו לניתוח. ניסויים שבהם המספר הראשוני של זבובים זוהה על הרציף הוא קטן יותר 5 מושמטים אוטומטית מניתוח, ביטול לא אמין תוצאות של ניסויים חלשה. ניסויים בהם המספר הראשוני של זבובים זוהה על פלטפורמת חורגת ההגדרה "מספר זבובים לכל מבחנה" פלוס סובלנות של 3 לא יכללו גם. פעולה זו מבטלת datasets איזה רעש חלקיקים זוהו בטעות כמו זבובים. קובץ ה-script מחשב את אחוז זבובים זוהה עבור כל נקודת זמן לעומת המספר הגבוה ביותר של זבובים זוהה בסדרה. שגיאות ב- datasets הנגרמת על ידי זבובים הליכה ויוצאים רועי (מזוהה כמו ירידה ואחריו עלייה באחוזים של זבובים על פלטפורמת לאורך זמן) באופן אוטומטי מתוקנות על ידי ביחס אליהם כפי שהוא נוכח באופן עקבי על פלטפורמת בשלבים מוקדמים יותר . כל datasets שכפל עבור תנאי ניסויי ספציפי שהיו קיימים בספריה הראשית בשילוב, מיוצאים לקובץ ה-"data_all_conditions.csv". העמודות מייצגות המשתנים המתוארות בטבלה 2. קובץ ה-script ייצא גם גרף קווים עבור כל תנאי הניסוי, שמות בהתאם התיקייה המכילה את הנתונים. גרף זה מראה האחוזים של זבובים שנותרו על פלטפורמת לאורך זמן (טיסה לברוח תגובה) ניסיוני משכפל נוכח בתיקיה בהתאמה (איור 3A-B). אומרת, SD ו- SEM עבור כל תנאי הניסוי הם מחושבים ומסוכם בקובץ "סטטיסטיקה summary.csv". גרף קו הנקרא "Escape_response_all_conditions.tiff" מציגה את התגובה לברוח טיסה ממוצע עד 12 ניסיוני תנאים להציג התיקיה הראשית (איור 3C). בסופו של דבר, האזור מתחת העקומה עבור כל התנאים הניסיונית הנוכחית בתיקייה הראשית מחושב, סיכם בקובץ ה-"AUC.csv". בהתאם למספר תנאים נוכח בתיקייה הראשית, קובץ ה-script או יבצע דו-זנבית אינטראקצית ולש מבחן t של (2 התנאים) או של אנובה עם תיקון Tukey עבור מספר בדיקות (תנאי יותר מ-2) לקבוע אם ניסיוני תנאים שונים באופן משמעותי אחד מהשני. תוצאות אלה מסוכמות "Welch_t-test_results.txt" או "AUC_anova_results.txt". בעת ביצוע מקרה ANOVA, התסריט גם תייצא קובץ "AUC_anova.tiff" מציגה את ההבדל בין הממוצע חאן אל ומרווחי בטחון 95% מהמצבים ניסיוני מושווים. הערכים של אזור מוחלטת מתחת העקומה של משכפל ניסיוני עבור כל התנאים ניסיוני מוצגים כנקודות נתונים נפרדים עם medians ב "AUC.tiff" (דמות תלת-ממד).
אטקסיה Telangiectasia (AT) היא הפרעת תנועה הקרים autosomal מאופיין על ידי התפרצות מוקדמת. של אטקסיה אסטרוציטומה עקב מוטציות ב ג'ין אטקסיה Telangiectasia מוטציה (ATM)14. מוטציות של orthologue דרוזופילה של ATM, tefu, להציג פגמים ניידות ואריכות ימים15. כדי להעריך את המאקרו"דרוזופילה האי Assay", מודל דרוזופילה של AT נבדקה ב וזמינותו האי, הפלט נתוני המאקרו היה להשוותו למונים ידנית של נתונים. התוצאות מציגות את בכל מקום tefu נוקאאוט (w–; Actin-Gal4/GD11950) מקטין באופן משמעותי את היכולת של הזבובים האלה לעזוב את הפלטפורמה לעומת שולט הרקע הגנטי שלהם (w–; Actin-Gal4/+) (איור 4). לאחר 1 s, 50% של הזבובים שליטה נמלט הפלטפורמה, בניגוד ל &#60; 1% של tefu- RNAi זבובים. חשוב, נתונים שהושגו עם המאקרו בנאמנות לשכפל את הנתונים שבידי ידני סופר, המציין המאקרו הוא כלי אמין שיכול לשמש עבור כימות של האי assay נתונים והערכת ליקויי תנועה ( איור 4 A-B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig1.jpg"> 
איור 1: תרשים זרימה חלוקה לרמות את דרישות, ניתוח ניסיוני, וניתוח וזמינותו האי. (א) האי assay ציוד. (B) הגדרת הניסוי עבור וזמינותו האי. (ג) האי וזמינותו. (ד) עיבוד של האי assay נתוני המאקרו"דרוזופילה האי Assay". המאקרו"דרוזופילה האי Assay" מורכב מאקרו המשנה 3: 1) להפוך מחסנית והקרנה, 2) מגדירים פלטפורמה, וניתוח 3). (E) עיבוד והערכה סטטיסטי של נתונים באמצעות קובץ ה-script "האי Assay ניתוח". <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55892/55892fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig2.jpg"> 
איור 2: דוגמאות של התאמות שונים הדרושים במהלך הפרוטוקול. מבנה הספריות (A) הדרוש באי אילו ניסויים assay מוכרחים להיות מאוחסנים עבור עיבוד נתונים וניתוח. (B) כאשר כוונון הגדרות וידאו, זבובים להופיע שחור על רקע לבן. (ג) תמונת מסגרת פלט קבציםכפי שנשמרו על ידי תוכנת צריבת התמונה המתוארת בכתב היד. חלוקה לרמות (D) הצהוב מציג את בחירת פלטפורמה. בחירת פלטפורמה מאוחסנות במנהל"רועי" מסומן בכחול. זבובים (E) מיוצגים כמו נקודות לבנות במהלך התאמת גודל מזערי לטוס הגדרת." החלון תוצאות מציג את האזור של הזבובים בפיקסלים. דוגמה (F) של מסגרת תמונה בודדת מוקלטות (בצד השמאל), את המסגרת המתאימה במחסנית התמונה המתקבלת, שהושג עם המאקרו"דרוזופילה האי Assay" (בצד ימין). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55892/55892fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig3.jpg"> 
איור 3: תמונות התוצאה מושגת לאחר עיבוד הנתונים עם script. "האי Assay ניתוח" (א) קו גרף המציג את התגובה לברוח טיסה עבור כל אחד לשלוט שכפול ניסיוני. (B) קו הגרף מציג התגובה לברוח טיסה עבור שכפול ניסיוני RNAi כל tefu. (ג) טיסה ממוצע לברוח בתגובה ל המצוין התנאים ניסיוני; קווי השגיאה מייצגים החלקות Dot ב- SEM (D) המייצג את האזור שמתחת עקומת התפלגות שליטה ומצבים מוטציה. משכפל ניסיוני עבור שני התנאים RNAi ושליטה של tefu מוצגים כנקודות נתונים נפרדים (בשחור) עם medians (הקו האדום). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55892/55892fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig4.jpg"> 
איור 4: זבובים תמונות ציפורים בכל מקום tefu להראות לך היכולת ירד משמעותית לעזוב את הרציף. הנתונים מייצגים את האחוזים של זבובים על פלטפורמת לאורך זמן (s) עבור פקד (w–; Actin-Gal4/+), tefu RNAi (w–; Actin-Gal4/GD11950) יש טיסות. (מספר משכפל = 5; קווי השגיאה מייצגים SEM). (א) נתונים גולמיים שהושג עם המאקרו"דרוזופילה האי Assay". הנקודה (B) מתווה המייצג את האזור תחת ההתפלגות עקומת עבור פקד tefu RNAi ותנאי שהושג עם המאקרו"דרוזופילה האי Assay" (ולש אינטראקצית-t-test, * * p &#60; 0.01). (ג) מתקבל על ידי ספירת המספר באופן ידני נתונים גולמיים זבובים נוכח באי לשניה. (ד) נקודה מתווה המייצג את האזור תחת עקומת התפלגות שליטה ומצבים Tefu RNAi מתקבל על ידי ספירת יד (ולש אינטראקצית-t-test, * * p &#60; 0.01). קווי השגיאה מייצגים ב- SEM <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55892/55892fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>שם עמודה</td>
			<td colspan="3">תיאור</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>פרוסה</td>
			<td colspan="3">שם מסגרת.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ספירה</td>
			<td colspan="3">מספר האובייקטים שאותרו במסגרת. במסגרת הפלטפורמה (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>השטח הכולל</td>
			<td colspan="3">השטח הכולל של האובייקטים שאותרו במסגרת. במסגרת הפלטפורמה (ROI) בפיקסלים.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>גודל ממוצע</td>
			<td colspan="3">השטח הכולל של האובייקטים שאותרו במסגרת לחלק למספר אובייקטים בתוך הגבולות של פלטפורמת (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>% שטח</td>
			<td colspan="3">האחוז באזור שנכבשו על ידי האובייקטים ביחס מכלל השטח הרציף (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perim.</td>
			<td colspan="3">ההיקף הכולל של האובייקטים שאותרו במסגרת. במסגרת הפלטפורמה (ROI) בפיקסלים.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>גודל לטוס מ</td>
			<td colspan="3">המינימום לטוס הגדרת גודל המוגדר על-ידי המשתמש בממשק גרפי של המאקרו"דרוזופילה האי Assay" (בפיקסלים).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>אזור רועי</td>
			<td colspan="3">האזור של פלטפורמת (ROI) שהוגדרו על-ידי המשתמש במהלך ההפעלה של מאקרו המשנה הגדרת פלטפורמה (בפיקסלים).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מספר זבובים</td>
			<td colspan="3">המספר של זבובים משמש לכל ניסוי המוגדר על-ידי המשתמש בממשק גרפי של המאקרו"דרוזופילה האי Assay".</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: פרמטרים נמדדת המאקרו"דרוזופילה האי Assay". שאר הפרמטרים המתוארים בטבלה זו יופיעו בקובץ ה-"results.txt" בעת הפעלת המאקרו"דרוזופילה האי Assay".
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>שם עמודה</td>
			<td colspan="3">תיאור</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>פרוסה</td>
			<td colspan="3">מספר מסגרת.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ספירה</td>
			<td colspan="3">המספר של זבובים שאותרו במסגרת. במסגרת הפלטפורמה (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Area</td>
			<td colspan="3">השטח הכולל של הזבובים שאותרו במסגרת. במסגרת הפלטפורמה (ROI) בפיקסלים.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>גודל לטוס מ</td>
			<td colspan="3">המינימום לטוס הגדרת ערך גודל המוגדר על-ידי המשתמש בממשק גרפי של המאקרו"דרוזופילה האי Assay" (בפיקסלים).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>אזור רועי</td>
			<td colspan="3">האזור של הפלטפורמה (ROI, בפיקסלים) שהוגדרו על-ידי המשתמש בעת הפעלת המאקרו המשנה "להגדיר פלטפורמה".</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מספר זבובים</td>
			<td colspan="3">המספר של זבובים משמש לכל ניסוי המוגדר על-ידי המשתמש בממשק גרפי של המאקרו"דרוזופילה האי Assay".</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Count</td>
			<td colspan="3">% זבובים הנוכחי על פלטפורמת הפרוסה/מסגרת בהתאמה ביחס המספר הגבוה ביותר של זבובים מזוהה על הבמה במהלך הניסוי.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timepoint</td>
			<td colspan="3">נקודת הזמן 1 מייצג המסגרת הראשונה כדי להיות מנותח, מתאים למסגרת שבה הזבובים החלו להופיע על הבמה. ישנם בסך הכל 100 מסגרות שכפול ניתח (המקביל 10 s, בעת שימוש בהגדרות המתואר.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ניסוי</td>
			<td colspan="3">מספר משכפל לכל תנאי.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>תנאי</td>
			<td colspan="3">ציון השם של המצב ניסיוני (לפי השם על-ידי המשתמש של התיקיה המכילה את הנתונים).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
בטבלה 2: תיאור של המשתנים שהושג לאחר עיבוד הנתונים עם script. "האי Assay ניתוח" שאר הפרמטרים המתוארים בטבלה זו מופיעים בקובץ ה-"data_all_conditions.csv" בעת עיבוד הנתונים עם התסריט "האי Assay ניתוח".

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay at JoVE.com

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

וזמינותו האי הוא חדש יחסית, חסכונית assay יכול לשמש כדי להעריך את התנהגות גינקולוגיות בסיסי melanogaster דרוזופילה. כתב יד זה מתאר אלגוריתמים עיבוד נתונים אוטומטי, כימות אובייקטיבי של האי assay נתונים, שהופך את assay readout רגיש, תפוקה גבוהה במסכים גדולים גנטית או תרופתי.

ניתוח תפוקה גבוהה של התנהגות גינקולוגיות וזמינותו האי דרוזופילה

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

high-throughput-analysis-locomotor-behavior-drosophila-island

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

8.8K Views.  Radboud University Medical Center. וזמינותו האי הוא חדש יחסית, חסכונית assay יכול לשמש כדי להעריך את התנהגות גינקולוגיות בסיסי melanogaster דרוזופילה. כתב יד זה מתאר אלגוריתמים עיבוד נתונים אוטומטי, כימות אובייקטיבי של האי assay נתונים, שהופך את assay readout רגיש, תפוקה גבוהה במסכים גדולים גנטית או תרופתי.

Video: High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Sensillum הקלטות סינגל חרקים תסיסנית melanogaster ו אנופלס gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of these diseases, including Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease are characterized by age-dependent deterioration in learning and memory functions and movement coordination2. Here we use behavioral assays, including the negative geotaxis assay3 and the aversive phototaxic suppression assay (APS assay)4,5, to show that some of the behavior characteristics associated with human neurodegeneration can be recapitulated in flies. In the negative geotaxis assay, the natural tendency of flies to move against gravity when agitated is utilized to study genes or conditions that may hinder locomotor capacities. In the APS assay, the learning and memory functions are tested in positively-phototactic flies trained to associate light with aversive bitter taste and hence avoid this otherwise natural tendency to move toward light. Testing these trained flies 6 hours post-training is used to assess memory functions. Using these assays, the contribution of any genetic or environmental factors toward developing neurodegeneration can be easily studied in flies.

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior assays for measuring locomotor functions, learning, and memory abilities in Drosophila.

Assaying של תנועה, למידה, וזיכרון גירעונות תסיסנית מודלים של ניוון מוחיים

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Studying the Neural Basis of Adaptive Locomotor Behavior in Insects

Studying the neural basis of walking behavior, one often faces the problem that it is hard to separate the neuronally produced stepping output from those leg movements that result from passive forces and interactions with other legs through the common contact with the substrate. If we want to understand, which part of a given movement is produced by nervous system motor output, kinematic analysis of stepping movements, therefore, needs to be complemented with electrophysiological recordings of motor activity. The recording of neuronal or muscular activity in a behaving animal is often limited by the electrophysiological equipment which can constrain the animal in its ability to move with as many degrees of freedom as possible. This can either be avoided by using implantable electrodes and then having the animal move on a long tether (i.e. Clarac et al., 1987; Duch &amp; Pfl&uuml;ger, 1995; B&ouml;hm et al., 1997; Gruhn &amp; Rathmayer, 2002) or by transmitting the data using telemetric devices (Kutsch et al, 1993; Fischer et al., 1996; Tsuchida et al. 2004; Hama et al., 2007; Wang et al., 2008). Both of these elegant methods, which are successfully used in larger arthropods, often prove difficult to apply in smaller walking insects which either easily get entangled in the long tether or are hindered by the weight of the telemetric device and its batteries. In addition, in all these cases, it is still impossible to distinguish between the purely neuronal basis of locomotion and the effects exerted by mechanical coupling between the walking legs through the substrate. One solution for this problem is to conduct the experiments in a tethered animal that is free to walk in place and that is locally suspended, for example over a slippery surface, which effectively removes most ground contact mechanics. This has been used to study escape responses (Camhi and Nolen, 1981; Camhi and Levy, 1988), turning (Tryba and Ritzman, 2000a,b; Gruhn et al., 2009a), backward walking (Graham and Epstein, 1985) or changes in velocity (Gruhn et al., 2009b) and it allows the experimenter easily to combine intra- and extracellular physiology with kinematic analyses (Gruhn et al., 2006).
We use a slippery surface setup to investigate the timing of leg muscles in the behaving stick insect with respect to touch-down and lift-off under different behavioral paradigms such as straight forward and curved walking in intact and reduced preparations.

We describe a method to record motor activity, timed to the electrically recorded tarsal contact signal in a tethered insect, walking on a slippery surface. This is used to study the neural basis of adaptive behavior under reduced influence of mechanical interaction between legs through the substrate.

ללמוד את הבסיס העצבי של התנהגות מסתגלת של תנועה בתוך חרקים

Studying the neural basis of walking behavior, one often faces the problem that it is hard to separate the neuronally produced stepping output from those ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

שיטות Assay תסיסנית התנהגות

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

גירוי Optogenetic של התנהגות בריחה ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

יחיד לטוס Assay עבור התנהגות שיחור מזון ב<em&gt; דרוזופילה</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

קביעת הפעילות של תנועה הספונטנית ב<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

Assay תפוקה גבוהה לבחינת העדפות הטלה של פרט<em&gt; תסיסנית</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

דרך פשוטה למדוד שינויים בהתנהגות שוחרת זכה שימוש<em&gt; תסיסנית</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...