著者らは、T -迷路と動作の部屋を提供するための博士チャールズLuetjeに感謝したいと思います。この作品は、米国心臓協会（YAへ）、神経疾患のための国立研究所と脳卒中グラントR01NS64269（RGZに）、とピュー慈善信託（RGZまで）によってサポートされています。

1。はじめこのビデオでは、我々は運動と神経変性疾患の危険にさらされている学習と記憶機能の測定を示すために、 ショウジョウバエを使って 2つの行動アッセイのデモンストレーションを行います。最初に、我々は、運動行動が負の走地性アッセイを用いて測定することができる方法を紹介します。第二に、我々は嫌悪苦味を有する光を関連付けるために訓練して、メモリ機能を評価するために6時間後に試験されている正走光ハエを使用して、学習と記憶能力を評価します。最後に、我々はこれらの行動アッセイの意義と限界について説明します。 2。機器と試薬<ol><li>仕事を飛ぶ<ul><li>ステレオスコープ（ツァイス） </li><li>ハエをプッシュするための小さなペイントブラシ</li><li> ショウジョウバエ二酸化炭素（CO 2）麻酔器（Geneseesci、株式会社） </li></ul></li><li>負の走地性アッセイ<ul><li> 28.5 × 95 mmのポリスチレンバイアル（キャピトルバイアル、（株）） </li><li>ミニアラームタイマー/ストップウォッチ（VWRインターナショナル） </li><li>シャーピーペン</li><li>接着テープ</li></ul></li><li>嫌悪走光性の抑制アッセイ<ul><li>塩酸キニーネ（シグマアルドリッチ、CAS番号：6119-47-7） </li><li>蒸留水</li><li>重量で正確な希釈用デジタル測定尺度</li><li>クイックディスコネクタ、高密度ポリエチレン（NALGENE VWR商品番号62868〜021） </li><li>光源用クイックディスコネクタアダプタと合わせて閉鎖端から2mLのマークでカット15 ml遠心チューブ（VWRインターナショナル）、 </li><li>チャンバーの内側を覆うフィルター紙の上にキニーネのソリューションをロードするために、シングルチャンネル200μLピペッター</li><li> T -迷路（シンプルな行動システム、図1） </li><li>アルミ箔</li><li>光源（ツァイス） </li><li>赤い光でランプ。 </li><li>ろ紙</li><li>ミニアラームタイマー/ストップウォッチ（VWRインターナショナル） </li></ul></li></ol> 3。ハエの準備<ul><li>ハエは25℃、標準コーンミール寒天、糖蜜、酵母の培地で12時間の明/暗サイクルでCに保持されます。 </li><li>処女のハエが羽化の日の二酸化炭素麻酔下で絶縁されています。老化研究のために、ハエがバイアル当たり20のグループ内に保持され、3日ごとに新鮮なバイアルに移した。遺伝的背景に起因する違いを最小限に抑えるため、老化研究のために、同じ親のクロスから兄弟のハエを使用することが重要です。 </li><li>両方のアッセイでは、ハエがバイアルあたり10個ハエのグループに性欲を刺激すると保持されます。行動に男女差は有意であり、データは6を解釈し、再現するのは難しいかもしれませんが、それは研究で、男性と女性のハエが混在しないことをお勧めします。 </li><li>負の走地性アッセイのために、ハエがバイアルごとに10のグループにソートされ、麻酔後1時間をテストした。これは運動活動に影響を与える可能性があるのでハエが麻酔から完全に回復することが重要です。 </li><li> APSアッセイのために、各グループのハエは、アッセイを実行する前に6時間ろ紙を湿らせた水と空のポリスチレンバイアルに配置されます。これは、ハエがアッセイの前に飢えていると嫌悪味に、より鋭敏になることが保証されます。検定が実行される直前に、10のグループからそれぞれのフライは、エスケープを避けるために、ゆるく蓋をされ、空の15mlの遠心管に配置されます。 </li></ul> 4。負の走地性アッセイ<ul><li>走地性は一般に、同じ遺伝子型や治療の10人（各遺伝子型/治療のために合計100から200ハエ）7の十から二十グループに対して測定されます。 CO 2麻酔器と場所には10の女性または男性のハエのソートグループ別のバイアル内の各グループ。麻酔から回復するハエの少なくとも1つの時間を許可します。 </li><li>二つの空ポリスチレンバイアルが垂直に対向してテープでつながっているように各グループのクライミング装置を、準備します。バイアルの開口部が完全にハエのためにも登山の表面を提供するために、互いに整列していることを確認することが重要です。 </li><li>下のバイアルの場合は、底面上に8cmの垂直距離を測定し、バイアルの全周に円を描くことによって、各バイアルをマーク。 </li><li>慎重にフライの脱出を防止する低バイアルに10ハエのグループを転送します。すぐにしっかりと接触する開口部の近くにバイアルおよびテープと下バイアルをカバー。ハエは、アッセイを行う前に1分間のための新しい設定に慣れることができます。 </li><li>ゆっくりとバイアルの底にハエをタップし、タップした後、10秒で、8 cmのマークの上に登ることができますハエの数を測定する。 </li><li>各試行の間に1分間の休止期間を考慮し、同じグループに10回、このアッセイを繰り返します。 </li><li>として8 cmのマークを渡されたグループごとのハエの数を記録合計ハエの割合。 </li></ul> 5。嫌悪走光性の抑制アッセイ（APSアッセイ） もともとルブールとBuecher（2002）4から適応、このアッセイは、嫌悪刺激（この場合は、キニーネの苦味）の光を関連付けるためにそれらを訓練するためにハエの正の走光性行動を悪用します。トレーニング/コンディショニング段階の後、野生型のハエは、嫌悪の味と明るい領域を関連付けると、それを避けることができるようになります。侵害の学習能力を持つハエはこの関連付けを行うために失敗します。さらに、APSのアッセイはまた、学んだタスクを思い出すの能力をテストするために同じテストを6時間後のコンディショニングに既に訓練されたハエを施すことにより5を飛ぶの短期記憶機能を測定するために使用することができます。 <ol><li>キニーネ溶液を調製<ul><li> 0.1Mストック溶液（50mLの蒸留水で1.98グラム）を作るために蒸留水で塩酸キニーネを溶かす。ストック溶液は小分けに年に-20℃までのために保持することができます</li><li>蒸留水でのストック溶液を希釈することにより、1μMのワーキング溶液を調製。 </li></ul></li><li> T -迷路の準備<ul><li> T -迷路はトラップドアと2つの独立したチャンバー、&quot;暗い&quot;チャンバーと&quot;点灯&quot;チャンバー（図1）と中央の列で構成されています。 </li><li>チャンバーの準備には2つの15mlのプラスチック遠心管に取り、底から2 mLのマークで切断手動で終了して閉じていた。両端にコネクタアダプタを合わせ、パラフィルムで接続をシール。チューブの端のアダプタは、グースネックの光源の入力スロットとして機能します。光源とつのチューブを接続し、このチューブは&quot;明るい&quot;チャンバーになります。 &quot;暗い&quot;室として機能するようにアルミホイルを使用して他のチューブを巻きます。 </li><li>蒸留水や光のチャンバー内で紙と場所をフィルタリングするためにキニーネのソリューションのいずれかの180uLを追加。 </li><li>中央の閉鎖（図1）のトラップドアで、中央の列の両側に点灯し、暗いチャンバーをねじ込んでT -迷路を組み立てる。 </li><li>照明室に光源を挿入します。 </li></ul></li><li>訓練は、嫌悪刺激と走光性を抑制するために飛ぶ<ul><li> T -迷路から緩めて暗室をし、このチャンバ内に単一のフライを転送し、すぐに迷路に戻って暗いチューブをねじ込みます。 </li><li>部屋の照明をオフにし、赤のランプをオンにします。 </li><li>フライは、30秒間暗室に順応し、徐々に明るい部屋を照らす光源をオンにすることができます。徐々に二つの部屋を分けるトラップドアを開きます。 </li><li>フライは10秒以内に点灯室に歩いている場合、それは積極的に走光とみなされ、アッセイのために訓練される状態になります。走光性の障害は、アッセイから除外する必要がある負の走光性と視覚系とハエの問題があることを示します。 </li><li>忌避走光性の抑制（APS）トレーニング、暗室に戻って向光性を示したフライをタップするために、トラップドアを閉じて、光をオフにする。 acclimatizingの30秒を許可する。この時間の間に照明室にキニーネ溶液をろ紙を置く。徐々にトラップドアを開いて、光をオンにします。キニーネコーティング点灯チャンバ内へのハエの散歩を許可します。 1分後、暗室に戻ってフライをタップし、これを9回以上繰り返す。 （通常、野生型は3〜5訓練の試験後に点灯チャンバーを避ける飛ぶ。） </li><li>すぐにトレーニングの後、5つのテストの試験が実施される。各試験の試験では、光が照明室に歩いて訓練されたハエのためにオンになって10秒後に許可する。照明バイアルに歩いて失敗は、&quot;強化を通じて学習タスク&quot;に相当する、&quot;パス&quot;として記録されます。 5年連続の試行の合格率はPC0（0時間後のコンディショニング）として記録し、下の図2に示されています。 </li></ul></li><li>ハエの短期記憶の機能を評価する<ul><li>訓練と初期PC0録音した後、各フライは元の食品のバイアル瓶に戻し入れられ、6時間わき続け​​た。 </li><li>六時間後研修、被験者の前と同じ方法で再び5試験にそれぞれのフライ、そして（失敗）フライは回避（合格）または入る明るいバイアルを回数を記録。この合格率は、短期記憶の指標であるPC6（6時間ポストコンディショニング）、として記録されます。 </li></ul></li></ol> 6。データの解釈と統計解析<ol><li>負の走地性アッセイ<ul><li>このアッセイから生成された生データは、各グループに10秒で8センチの大台にハエの数を表します。割合にこれを変換し、10セッション以上の各群の平均合格率を計算する。 </li><li>データは平均値の標準誤差（SEM）を持つグループごとの平均合格率（遺伝子型、治療法など）としてグラフィカルに表現されます。 </li><li>群間の差して、Student t検定またはANOVAを用いて統計的に有意かどうかであると決定することができます。 </li></ul></li><li>嫌悪走光性の抑制アッセイ<ul><li>このアッセイからの生データは、各フライは5つの連続試験では照明室を回避する回数として表されます。合格率は、合計回の試行の成功回避の試行の割合として計算されます。グループごとに15ハエの最小値は、この方法で平均合格率を計算する。 </li><li>または平均合格率PC6（6時間後のコンディショニング、&quot;メモリ&quot;インジケータ）、それぞれのSEMと、データがグラフィカルに平均合格率PC0（インジケータを&quot;学ぶ&quot;すぐにコンディショニング後）として表されます。 </li><li>学習と記憶のインデックスは、野生型と&quot;遺伝子操作 - 良性&quot;グループ（GFP過剰発現が飛ぶような）適切に両方と群間で比較されています。 </li></ul></li></ol> 7。代表的な結果このビデオの実験では、我々は中枢神経系でハエを過剰発現するヒトのタウの学習と記憶と運動障害を評価していますし、ハエを過剰発現するGFPのものに彼らのパフォーマンスを比較。 ショウジョウバエにヒトのタウの神経過剰発現は、脳8に深刻な空胞化を引き起こすと学習と記憶機能の9の大幅な赤字につながることが示されている。図2Aに示すように、10日齢の雄または雌のショウジョウバエを過剰発現するヒトのタウは、年齢をマッチさせたGFP過剰発現が飛ぶと比較して有意な運動の障害を持っている。さらに、これらのハエは、対照群に比べてPC0合格率によって示されるように苦味を有する光を関連付けるだけでなく、PC6合格率（図2B）の減少によって示されるように、この関連付けを覚えて失敗する失敗しました。この実験では、さらにショウジョウバエモデルは人間の神経変性状態を研究し、ヒトや哺乳動物で観察された行動の表現型の一部をrecapitulatingに使用できることを検証します。 <img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。忌避走光性の抑制アッセイのためのT -迷路のセットアップ。A.トラップドアで区切られた濾紙と左側に&quot;暗く&quot;チューブ（箔で覆われた）と並ぶ&quot;点灯&quot;ファルコンチューブに接続されている光源とAPSAの実験のための総合的な実験、、。 B.トレーニングやテストのフェーズにおいて、フライは、暗室内にあり、光が明るい部屋でオンになって後にトラップドアが開きました。 <img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。汎神経ドライバでハエを過剰発現するGFPまたはTauを使用して負の走地性とAPSの実験から代表的な結果。A.負の走地性の検定では、10日齢の雄（青列）またはメス（赤の列）を過剰発現するGFPは、タウ過剰発現が飛ぶよりも高い上昇活性を示した飛ぶ。 B. 20日齢の雌では過剰発現するGFPは、タウ過剰発現が飛ぶよりも、よりよい学習（PC0）とメモリ（PC6）の機能を示した飛ぶ。

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利害の衝突は宣言されません。

負の走地性とAPSアッセイの両方は、遺伝的または環境的操作に起因する運動や学習と記憶容量の変化を測定するための堅牢な行動アッセイです。しかし、さらなる最適化を待って、これらのアッセイにはいくつかの欠点があります。 負の走地性の検定では、特定の遺伝子の突然変異はハエで重度の運動機能障害をレンダリングすることができます。このようなケースでは、ハエはほとんど攪拌時に重力に反応して壁を登ることはできません。直接運動を測定する他の行動アッセイでは、より適切な場合があります。これらのアッセイは、麻痺と発作10を測定する立ち直り反射行動、および運動協調の損失を記録する微細運動行動11があります。 APSのアッセイでは、最初の障害は、ランダムに前方に移動することなく、照明室の入り口で停止ハエすることができます。古いハエが一般的にあまり積極的であり、長期間停止して休息する傾向があるので、高齢化が、研究条件のいずれかである場合、これは問題の多くになります。この場合、実験者は、常に効果的ではない動きを、促進するための機械的な刺激を提供しなければならない。第二に、一つは障害が正の走光性の損失からつけられたチャンバーの結果に移動すると主張するかもしれない。強化負が4を削除すると、以前の仕事はハエが光反応性に引き返すことが示されているので、これは、あまりないケースです。第三に、嫌悪刺激との接触の持続期間は、裁判から裁判に異なる場合があります。この変化は通常、キニーネを避けてからハエを防ぐために浸したろ紙を容器の内壁を取り囲むことによって減らすことができます。さらに、実験者は各フライは特に断りのない1分からチャンバーに費やされる時間の量を増やすことによって、ろ紙との接触に十分な時間を過ごすようにすることができます。 要約すると、負の走地性とAPSのアッセイは、行動障害を評価するための高速かつ簡単な方法であり、定量的に運動し、 ショウジョウバエにおける学習と記憶の能力を示している。これらのアッセイは、 ショウジョウバエにおける人間の神経変性条件をモデル化するのに特に有用である。

<table border="1"><tbody><tr><th>材料</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>ポリスチレンバイアル</td><td>キャピトルバイアル、（株） </td><td> 28Fly </td><td> 28.5 × 95 mmのポリスチレンバイアル、材料の品質の重要な、悪いハエが登るにはあまりにも滑りやすい場合。 </td></tr><tr><td>解剖ステレオスコープ</td><td>ツァイス</td><td> 000000-1432-979 </td><td> 2枝雁首ライトガイド（12V/30W） </td></tr><tr><td>塩酸キニーネ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 6119-47-7 </td><td>蒸留水に溶解する。 </td></tr><tr><td>クイックディスコネクタ</td><td> Nalgene（VWR） </td><td> 62868-021 </td><td>高密度ポリエチレン</td></tr><tr><td> T -迷路</td><td>シンプルな行動システム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シングルチャンネル200μLピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td> 022443305 </td><td></td></tr></tbody></table>

assaying locomotor, learning, and memory deficits in drosophila models of neurodegeneration

遺伝的手法の進歩は、モデルシステム1としてショウジョウバエを用いてヒト神経変性疾患に関与する遺伝子の研究が有効になっている。アルツハイマー病、パーキンソン病やハンチントン病を含むこれらの疾患のほとんどは、学習と記憶機能と運動協調2の年齢依存性劣化によって特徴付けられる。ここでは、人間の神経変性に関連した行動の特性のいくつかはハエでrecapitulatedできることを示すために、負の走地性の検定3と嫌悪phototaxic抑制アッセイ（APSアッセイ）4,5、を含む行動アッセイを、使用してください。動揺が運動能力を妨げる可能性の遺伝子または条件を調査するために利用される際に、負の走地性の検定では、ハエの自然な傾向は、重力に逆らって移動する。 APSのアッセイでは、学習と記憶の機能は、正に走でテストされている嫌悪苦味を有する光を関連付ける、従って光に向かって移動するには、このそうでない場合は自然な傾向を避けるために、訓練飛行。 6時間後のトレーニングはメモリ機能を評価するために使用されているこれらの訓練されたハエのテスト。これらのアッセイを用いて、神経変性を発展させるためのあらゆる遺伝的または環境的要因の寄与は、簡単にハエで検討することができます。

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Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

測定運動機能、学習、およびメモリ能力のための行動アッセイ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;。

でアッセイする運動、学習、記憶障害ショウジョウバエ</em神経変性の>モデル

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

assaying-locomotor-learning-memory-deficits-drosophila-models

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

33.5K ビュー.  University of Miami, Miller School of Medicine. 測定運動機能、学習、およびメモリ能力のための行動アッセイショウジョウバエ。

ビデオ: Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

Neurodegenerative diseases are frequently associated with a progressive loss of movement ability, reduced life span, and age-dependent neurodegeneration. To understand the mechanism of these cellular events, and their causal relationships with each other, Drosophila melanogaster, with its sophisticated genetic tools and diverse behavioral features, are used as disease models for assessing neurodegenerative phenotypes. Here we describe a high-throughput method to analyze Drosophila adult negative geotaxis behavior, as an indication for possible motor defects associated with neurodegeneration. An automated machine is designed and developed to drive fly synchronization using an initial electric impulse, later allowing the recording of negative geotaxis behavior over a course of secs to mins. Images from the digitally recorded video are then processed with the self-designed RflyDetection software for statistical data manipulation. Different from the manually controlled negative geotaxis assay based on single fly, this precise, fast, and high-throughput protocol allows data acquisition from more than hundreds of flies simultaneously, providing an efficient approach to advance our understanding in the underlying mechanism of locomotor deficits associated with neurodegeneration.

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

This step-by-step protocol analyzes Drosophila negative geotaxis behavior using an automated multi-cylinder system that hosts hundreds of flies and synchronizes their action by an electric motor. Upon synchronization, fly negative geotaxis behavior is assayed, digitally recorded, and analyzed using the self-designed RflyDetection software.

神経変性のショウジョウバエモデル アダルト登山行動を分析するための自動化された迅速な反復負走アッセイ

Neurodegenerative diseases are frequently associated with a progressive loss of movement ability, reduced life span, and age-dependent neurodegeneration. ...

行動学

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

発生生物学

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

ショウジョウバエアダルト嗅覚ショックラーニング

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

神経科学

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

神経変性表現型を評価する<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;クライミングアッセイによりドーパミン作動性ニューロンと脳全体の免疫染色

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

における自発運動量の測定<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and diverse behavioral features. Identifying behavioral deficiency in animal models is a crucial measure of disease severity, for example, in neurodegenerative diseases where patients often experience impairments in motor function. However, with the availability of various systems to track and assess motor deficits in fly models, such as drug-treated or transgenic individuals, an economical and user-friendly system for precise evaluation from multiple angles is still lacking. A method based on the AnimalTracker application programming interface (API) is developed here, which is compatible with the Fiji image processing program, to systematically evaluate the movement activities of both adult and larval individuals from recorded video, thus allowing for the analysis of their tracking behavior. This method requires only a high-definition camera and a computer peripheral hardware integration to record and analyze behavior, making it an affordable and effective approach for screening fly models with transgenic or environmental behavioral deficiencies. Examples of behavioral tests using pharmacologically treated flies are given to show how the techniques can detect behavioral changes in both adult flies and larvae in a highly repeatable manner.

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

The present protocol assesses the locomotor activity of Drosophila by tracking and analyzing the movement of flies in a hand-made arena using open-source software Fiji, compatible with plugins to segment pixels of each frame based on high-definition video recording to calculate parameters of speed, distance, etc.

ショウジョウバエの自発運動活性をアッセイする簡単な技術

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and thus current therapeutic treatment strategies are not curative. Through the use of whole exome sequencing, an increasing number of genes have been identified to play a role in human locomotion. Despite identifying these genes, it is not known how these genes are crucial to normal locomotive functioning. Therefore, a reliable assay, which utilizes model organisms to elucidate the role of these genes in order to identify novel targets of therapeutic interest, is needed more than ever. We have designed a sensitized version of the negative geotaxis assay that allows for the detection of milder defects earlier and has the ability to evaluate these defects over time. The assay is performed in a glass graduated cylinder, which is sealed with a wax barrier film. By increasing the threshold distance to be climbed to 17.5 cm and increasing the experiment duration to 2 min&#160;we have observed a greater sensitivity in detecting mild mobility dysfunctions. The assay is cost effective and does not require extensive training to obtain highly reproducible results. This makes it an excellent technique for screening candidate drugs in Drosophila mutants with locomotion defects.

We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.

神経変性疾患のショウジョウバエモデルにおけるクライミング欠陥の定量分析

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health worldwide. Although mammalian models have provided important insights into the underlying mechanisms of pathogenicity, the complexity of mammalian systems together with their high costs are limiting their use. Therefore, the simple but well-established Drosophila model-system&#160;provides an alternative for investigating the molecular pathways that are affected in these diseases. Besides behavioral deficits, neurodegenerative diseases are characterized by histological phenotypes such as neuronal death and axonopathy. To quantify neuronal degeneration and to determine how it is affected by genetic and environmental factors, we use a histological approach that is based on measuring the vacuoles in adult fly brains. To minimize the effects of systematic error and to directly compare sections from control and experimental flies in one preparation, we use the &#39;collar&#39; method for paraffin sections. Neurodegeneration is then assessed by measuring the size and/or number of vacuoles that have developed in the fly brain. This can either be done by focusing on a specific region of interest or by analyzing the entire brain by obtaining serial sections that span the complete head. Therefore, this method allows one to measure not only severe degeneration but also relatively mild phenotypes that are only detectable in a few sections, as occurs during normal aging.

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Drosophila is widely used as a model system to study neurodegeneration. This protocol describes a method by which degeneration, as determined by vacuole formation in the brain, can be quantified. It also minimizes effects due to the experimental procedure by processing and sectioning control and experimental flies as one sample.

に神経変性を定量化するために、マス組織学<em&gt;ショウジョウバエ</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model organisms such as the fruit fly, Drosophila melanogaster. Drosophila is useful for understanding the basic neurobiology underlying cognitive deficits resulting from mutations in genes associated with human cognitive disorders, such as intellectual disability (ID) and autism. This work describes a methodology for testing learning and memory using a classic paradigm in Drosophila known as courtship conditioning. Male flies court females using a distinct pattern of easily recognizable behaviors. Premated females are not receptive to mating and will reject the male&#39;s copulation attempts. In response to this rejection, male flies reduce their courtship behavior. This learned reduction in courtship behavior is measured over time, serving as an indicator of learning and memory. The basic numerical output of this assay is the courtship index (CI), which is defined as the percentage of time that a male spends courting during a 10 min interval. The learning index (LI) is the relative reduction of CI in flies that have been exposed to a premated female compared to na&#239;ve flies with no previous social encounters. For the statistical comparison of LIs between genotypes, a randomization test with bootstrapping is used. To illustrate how the assay can be used to address the role of a gene relating to learning and memory, the pan-neuronal knockdown of Dihydroxyacetone phosphate acyltransferase (Dhap-at) was characterized here. The human ortholog of Dhap-at, glyceronephosphate O-acyltransferase (GNPT), is involved in rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2, an autosomal-recessive syndrome characterized by severe ID. Using the courtship conditioning assay, it was determined that Dhap-at is required for long-term memory, but not for short-term memory. This result serves as a basis for further investigation of the underlying molecular mechanisms.

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

This protocol describes a Drosophila learning and memory assay called courtship conditioning. This classic assay is based on a reduction of male courtship behavior after sexual rejection by a non-receptive premated female. This natural form of behavioral plasticity can be used to test learning, short-term memory, and long-term memory.

ショウジョウバエの訓練と記憶の尺度としてのコンディショニング

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

転写産物および代謝物からの精製<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ヘッド

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

でアッセイする運動、学習、記憶障害ショウジョウバエモデル

要約

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この動画の章

神経変性のショウジョウバエモデルアダルト登山行動を分析するための自動化された迅速な反復負走アッセイ

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

ショウジョウバエアダルト嗅覚ショックラーニング

神経変性表現型を評価する

における自発運動量の測定

ショウジョウバエの自発運動活性をアッセイする簡単な技術

神経変性疾患のショウジョウバエモデルにおけるクライミング欠陥の定量分析

に神経変性を定量化するために、マス組織学

ショウジョウバエの訓練と記憶の尺度としてのコンディショニング

転写産物および代謝物からの精製

でアッセイする運動、学習、記憶障害ショウジョウバエモデル

要約

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神経変性のショウジョウバエモデル アダルト登山行動を分析するための自動化された迅速な反復負走アッセイ

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

ショウジョウバエアダルト嗅覚ショックラーニング

神経変性表現型を評価する

における自発運動量の測定

ショウジョウバエの自発運動活性をアッセイする簡単な技術

神経変性疾患のショウジョウバエモデルにおけるクライミング欠陥の定量分析

に神経変性を定量化するために、マス組織学

ショウジョウバエの訓練と記憶の尺度としてのコンディショニング

転写産物および代謝物からの精製

神経変性のショウジョウバエモデルアダルト登山行動を分析するための自動化された迅速な反復負走アッセイ