Wir anerkennen das Vienna Drosophila Resource Center und Bloomington Drosophila Lager Zentrum (NIH P40OD018537) für die Bereitstellung von Drosophila -Stämme. Wir sind dankbar, Klämbt Labor für die Einführung von uns, die Insel-Assay und Martijn Eidhof für den Bau der Insel-Assay-Setup. Diese Studie wurde teilweise unterstützt durch E-RARE-3 gemeinsame länderübergreifende rufen gewähren "Therapien für autosomal rezessive Ataxien vorbereitet" PREPARE (NWO 9003037604), mit einem TOP Stipendium die niederländische Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) und von (912-12-109) zwei DCN/Radboud University Medical Center PhD Stipendien. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung.

<ol>
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Dieses Protokoll beschreibt das"Drosophila Insel Assay" Makro, das quantitativ Drosophila motor Verhalten während der Insel-Assay bewertet. Das Makro zählt genau die fliegen auf der Plattform im Laufe der Zeit machen die Insel-Assay, sehr empfindlich und für quantitative Hochdurchsatz-Bewertung des Bewegungsapparates Mängel. Die Methode ermöglicht für den Vergleich von jedem Zustand mit fliegen unter verschiedenen genetischen und/oder ökologischen Bedingungen, einschließlich der Arzneimittelexposition angebaut. Diese Anzeige eignet sich somit besonders als Discovery-Tool bei genetischen oder pharmazeutische Großbildschirmen, beim Studium der Drosophila -Modelle von Bewegungsstörungen und anderen neurologischen Erkrankungen oder bei der Fortbewegung oder Flug Prüfung Verhalten.
Die Insel-Assay-Protokoll präsentiert in dieser Handschrift bietet Vorteile gegenüber bestehenden/Alternative Methoden. Video-Tracking Fortbewegung ist beispielsweise viel mehr Zeit in Anspruch und weniger geeignet für große Stichproben zu testen. Die Insel-Assay ist ein Hochdurchsatz-Screening-Tool, und in diesem Sinne ist vergleichbar mit der schnellen interaktive negative Geotaxis (RING) Assay16. Der Unterschied zwischen den beiden ist, dass die Insel-Assays ermöglicht die Erkennung von ein breiteres Spektrum an motorischen Probleme; die Unfähigkeit von fliegen, die Plattform verlassen kann durch Defekte im Flug, springen, oder zu Fuß Verhalten verursacht durch Flügel (Muskel/neuronale) und/oder Bein (Muskel/neuronale) Mängel. Auf der anderen Seite beurteilt die RING-Assay Mängel im Klettern/Wandern Verhalten verursacht durch defekte Bein (Muskel/neuronale). Für den Fall, dass mehrere Verhaltens anzeigen Nutzer interessiert sind, kann die Insel-Assay auch leicht mit anderen Tests, wie der RING-Test kombiniert werden. Darüber hinaus Laser erforderlich für Optogenetik können problemlos in der Insel-Assay-Box installiert werden, und das Setup ist so einfach, dass es leicht zu einem Raum bewegt werden kann wo Licht und Temperatur gesteuert werden kann.
Um den Erfolg und die Reproduzierbarkeit des hier beschriebenen Insel Assays zu gewährleisten, sollten mehrere Empfehlungen befolgt werden. Aliquoten und Transfer die fliegen auf die experimentelle Probe Fläschchen auf mindestens einen Tag vor dem Experiment, die Auswirkungen der CO2 oder Kälte Narkose zu vermeiden. Nicht überfüllen die experimentelle Fläschchen (10-15 fliegen pro Fläschchen verwenden; es empfiehlt sich, immer die gleiche Anzahl von fliegen legen Sie pro Fläschchen). Halten Sie die fliegen auf frische Lebensmittel zu allen Zeiten. Wenn nicht noch nicht vertraut mit der Durchführung des Tests, Praxis werfen fliegt auf die Plattform, um den Ertrag zu maximieren. Auch die Praxis schnell zurückziehen der Hand gleich hinterher, wie es die Datenanalyse (Bildanalyse und fliegen zählen beginnen stört erst mit die Hand aus dem Bild ist). Halten Sie die Umwelt- und experimentellen Bedingungen identisch in Experimenten, die verglichen werden müssen (z. B. Kontrollen gegen Mutanten oder ein Genotyp getestet in verschiedenen Altersstufen). Immer zur gleichen Zeit des Tages die Experimente durchführen und die Fläschchen unter kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit zu erhalten. Testen Sie für statistische Aussagekraft mindestens drei technische Wiederholungen pro biologische replizieren.
Sicherstellung der erfolgreichen Aufführung des Makros beschrieben hier, Webcam und Bild-Einstellungen müssen angepasst werden, um maximalen Kontrast zu erzielen: fliegt als schwarze Objekte auf einer weißen Plattform erscheinen. Wenn die Anzahl der fliegen durch das Makro nicht richtig gezählt wird, passen Sie die Kontrasteinstellungen, prüfen Sie, ob der ROI richtig ausgewählt ist und stellen Sie sicher, dass die Größe der fliegen auf der Plattform über dem angegebenen Minimum Größe einstellen (siehe Punkt 8.3 dieses Protokolls) zu fliegen. Die Einstellungen müssen nur einmal definiert werden. Sie gelten für alle Experimente, solange der Abstand zwischen der Plattform und die Webcam nicht geändert wird. Die Circularity_min und max Einstellungen definieren die Kreisförmigkeit der Partikel (Teilchen = gezählte fliegen), die für die Analyse berücksichtigt werden wird (fliegt = gezählte Objekte). 1 steht einen perfekten Kreis, und 0 für eine Zeile17. Da die fliegen immer ein gewisses Maß an Zirkularität vorhanden (eine Fliege kann nicht als eine gerade Linie angezeigt), die "Circularity_max"-Einstellung ist auf 1 gesetzt und die "Circularity_min" Einstellung bei 0,4. Es ist unwahrscheinlich, dass der Benutzer diese Einstellungen anpassen muss.
Das Makro macht gelegentlich zählen Fehler, wenn eine Fliege in der Nähe der Grenze der Plattform befindet. Dies kann auftreten, wenn die fliegen nicht, aber zu Fuß in die und aus der benutzerdefinierten ROI fliegen können. In den meisten Fällen kann dazu den ROI (so weit wie möglich auf die Plattform Einbau) dieses Problem leicht lösen. Jedoch das "Insel-Assay-Analyse" Skript ist in der Lage, zu erkennen und richtig falsche Daten zählt hervorgerufen fliegen innerhalb und außerhalb der ROI relativ gut zu gehen. Obwohl die Auflösung der hier vorgestellten Webcam hoch genug, um fliegen in der Nähe ziemlich gut zu unterscheiden ist, haben wir umgesetzt zusätzliche Algorithmen in der Bild-Verarbeitungsprozess des Makros"Drosophila Insel Assay", wie die Wasserscheide und erodieren Funktion17. Diese erleichtern die richtige Abgrenzung von fliegen, die in unmittelbarer Nähe auf der Plattform befinden. Darüber hinaus das Makro ist nicht in der Lage zu fliegen unterscheiden, die von der Plattform sprang oder flog davon. Dennoch ist es in der Regel beobachtet, dass gesunde junge Stämme fliegen away Fly sofort, wenn auf der Plattform abgelegt, während ältere fliegen und fliegen mit motorischen Defiziten länger auf der Plattform bleiben und werden schließlich zu springen oder Weg von der Plattform fallen. Trotz dieser Einschränkungen bieten die Assay und Analysen eine sehr genaue Messung der motorischen Verhalten.
Um der erfolgreichen Aufführung des "Insel-Assay-Analyse" Skripts zu gewährleisten, muss der Benutzer sicherstellen, dass die richtigen Pfade für die Input- und Output-Dateien in den Skript-Zeilen im Protokoll angegeben eingeben und die Daten in die richtigen Ordner Format (wie angegeben in Abbildung 2). Wenn der Benutzer die Kriterien verwendet, um unzuverlässig zu streng experimentellen Daten herausfiltern findet (Zeile 68: der erste Wert in der Spalte "Zählen" ist kleiner als oder gleich 5, Zeile 71: der erste Wert in der Spalte "Anzahl" ist höher als die Gesamtzahl der fliegen auf der Platfo geworfen RM + 3), schalten Sie diese Filter-Einstellungen durch ein # vor dem Text in den Zeilen 68 und 71 in der "Insel-Assay-Analyse" Skript hinzufügen. In diesem Fall werden alle Datensätze in die Analyse einbezogen werden. Alternativ können Filtereinstellungen geändert werden, indem Sie die Werte in den Zeilen 68 und 71 je nach Benutzeranforderungen anpassen. Mögliche Artefakte in der Zählwerte in der "results.txt" durch das"Drosophila Insel Assay" Makro erzeugt auch manuell eingestellt werden, und das Skript kann auf die korrigierten Daten erneut ausgeführt werden. Wenn der Benutzer interessiert sich für Verarbeitung von mehr als 10 fps oder mehr als 10 s Daten, sollte die Anzahl der Frames, die von der "Insel-Assay-Analyse" Skript verarbeitetangepasst werden. Die statistische Auswertung kann auch durch benutzerdefinierte Alternativen ersetzt werden.
Ein Ordner namens "Beispiele Insel Assay", mit Beispielen mit Bild-Zeitreihen mit Hilfe der Insel-Test finden Sie auf der folgenden Website: https://doi-org.remotexs.ntu.edu.sg/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. Laden Sie den Ordner "Beispiele Insel Assay" und befolgen Sie die Schritte in diesem Protokoll, sich schnell mit der Struktur der Dateiablage, die Verarbeitung von Bildern mit das Makro "Drosophila Insel Assay" und die "Insel-Assay-Analyse" vertraut werden Skript.
Die Insel-Assay kann in Kombination mit dem entwickelten Makro und Analyse Skript verwendet werden, zu bewerten und zu quantifizieren das aberrante Bewegungsverhalten eines Drosophila -Modells der Ataxia Telangiectasia. Da der Test effizient auf verschiedenen Alters angewendet werden kann, ist es gut geeignet für die Analyse der potenziell Progressivität der Phänotypen.
Zusammenfassend ist die Insel-Assay, in Kombination mit das Makro"Drosophila Insel Assay" und das "Insel-Assay-Analyse"-Skript, eine kostengünstige, zuverlässige und hocheffiziente Assay objektiv analysieren und Bewegungsorgane Mängel der zu quantifizieren Drosophila Modelle von Bewegungsstörungen in gewissem Sinne Hochdurchsatz-.

In den letzten Jahren haben Fortschritte in der nächsten Generation Sequenziertechnologien zur Identifizierung von Genen, die zugrundeliegenden degenerativen Bewegungsstörungen des Gehirns (z.B., zerebelläre Ataxie und Parkinson), des peripheren neuronalen wesentlich beigetragen. Herkunft (z.B. Amyotrophe Lateralsklerose und erbliche spastische Paraplegie), und von muskulären Ursprungs (z. B. Duchenne-Muskeldystrophie und myotonische Dystrophie)1,2,3,4 . Trotz dieser bekannt wenig über die molekularen Mechanismen, die meisten dieser Störungen zugrunde liegen. Ein besseres Verständnis dieser Mechanismen ist wichtig, Therapien zu entwickeln.
Wie beim Menschen ist Bewegung in Modellorganismen wie Flug und Fortbewegung in Drosophila, die zentrales Gehirn, peripheren Nervensystem und Muskeln gesteuert. Darüber hinaus machen die schnelle Generationsdauer und genetischen Werkzeugkasten von Drosophila diesem Modellorganismus besonders geeignet für den Hochdurchsatz-Screening von Genen beteiligt in Bewegungsstörungen und für Drogentests5,6 . Aufgrund der erheblichen Zahl von Bedingungen, die in solche Bildschirme, zuverlässige, kostengünstige, und relativ einfache Assays sowie Werkzeuge, um die Ausgabeergebnisse in automatisierter Weise quantifizieren geprüft werden müssen, sind höchst wünschenswert.
Schmidt Et al. (2012) 7 beschrieben einen Low-Cost-Test genannt "Insel-Assay", Drosophila lokomotorische Verhalten zu bewerten. Die Insel-Assay wurde erfolgreich in großen Vorführungen eingesetzt Gene zu identifizieren, mit Glia-spezifische Funktionen7, bei der Bewertung der Drosophila -Modelle von geistiger Behinderung8und für die allgemeine Bewertung des Fliegen Sie motor Verhalten9. Prinzip besteht des Insel-Assays aus einer erhöhten Plattform, auf der mehrere fliegen geworfen werden. Dies führt zu eine angeborene motor Verhalten, die gesunde fliegen zu entkommen, die Plattform innerhalb von Sekunden ermöglicht. Der Test misst die Anzahl der fliegen noch auf der Plattform über Zeit7,8,9. Diese Eigenschaften zeigen, dass die Insel-Assay ein leistungsfähiges Screening-Tool für Bewegungsstörungen beteiligten Gene sein kann.
Derzeit erfolgt die Quantitative Analyse der gefilmten Insel Assay Daten manuell7,8,9. Zur Verbesserung der Effizienz des Assays wurde eine Low-Cost-Methode entwickelt, um semi-automatisch die Flucht von fliegen von der Plattform zu quantifizieren. Das Setup verwendet eine einfache Webcam an einen Laptop angeschlossen Bild Zeit Reihe von der Plattform, mit Frames pro 0,1 erwarb S. Bilder dann mit dem"Drosophila Insel Assay" Makro verarbeitet werden zu sammeln, die die Anzahl der fliegen auf der Plattform über quantifiziert Zeit. Das Makro"Drosophila Insel Assay" gliedert sich in drei unabhängige Sub Makros: (I) die "Create Stack und Projektion," Sub-Macro identifiziert verschiedene Insel Experimente in verschiedenen Unterordnern gespeichert und schafft einen Stapel und eine Projektion der einzelnen Zeitreihen. (II) die "Plattform definieren" Sub-Macro öffnet nacheinander alle "Projection_image_name.tif" Dateien in den einzelnen experimentellen Unterordnern, an welcher, die Stelle der Benutzer angefordert wird, um manuell den Inselbahnsteig als der Region of Interest (ROI) zu definieren. (III) "Analyse" wird automatisch die Anzahl der fliegen bleibt auf der Plattform während der Zeitreihe quantifiziert. Die Sub-Makros ausgeführt werden können, nacheinander (in einem Durchgang) oder unabhängig. Für statistische Datenanalyse wurde ein Skript entwickelt, die gewonnenen Daten automatisch zu verarbeiten und anzuwenden einen statistischen Test um festzustellen, ob Behandlungen/Genotypen signifikant verschieden von einander (Abbildung 1) Verhalten. Schließlich wird gezeigt, dass diese Einrichtung zu bewerten und zu quantifizieren die aberrante Bewegungsorgane Fähigkeit eines Drosophila -Modells für Ataxia Telangiectasia (AT) verwendet werden kann.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td class="xl19">25 x 95 mm Drosophila vials</td>
			<td class="xl19">Flystuff</td>
			<td class="xl20">32-116SB</td>
			<td class="xl19">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl21">Logitech C525 HD Webcam</td>
			<td class="xl19">Logitech</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Any webcam with USB connection is suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Stand to hold webcam</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Lamp</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">12 V LED lights are appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Pounding pad</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Any mouse pad works</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island Assay box</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island Assay bath</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 42x38x25 cm. Non white.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island/platform</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Soap</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Standard dishwashing detergent is suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Computer</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Scripts run both on Windows and Mac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl22">Image-recording software: HandiAvi&#174;</td>
			<td class="xl23">AZcendant&#174;</td>
			<td class="xl23">-</td>
			<td class="xl19">HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl22">Image-recording software: WebcamCapture</td>
			<td class="xl25">-</td>
			<td class="xl25">-</td>
			<td class="xl25">Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the &#34;Drosophila Island Assay&#34; macro on this data, no text should be present in the &#34;First frame identifier&#34; setting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Fiji</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">R studio</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl24">Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">R</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl24">Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput analysis of locomotor behavior in the drosophila island assay

Fortschritte in der Next Generation Sequencing Technologien dazu beitragen, die Identifizierung von Krankheitsgenen (Kandidat) für Bewegungsstörungen und anderen neurologischen Erkrankungen mit einer zunehmenden Geschwindigkeit. Jedoch ist wenig über die molekularen Mechanismen bekannt, die diese Störungen zugrunde liegen. Die genetische, molekulare und Verhaltensstörungen Toolbox von Drosophila Melanogaster macht dieses Modellorganismus besonders nützlich, um neue Krankheitsgene und Mechanismen in gewissem Sinne Hochdurchsatz-charakterisieren. Trotzdem, Hochdurchsatz-Bildschirme benötigen effiziente und zuverlässige Assays, die im Idealfall sind kostengünstige und ermöglichen die automatisierte Quantifizierung der Merkmale relevant für diese Erkrankungen. Die Insel-Assay ist eine kostengünstige und einfach Setup Methode, Drosophila lokomotorische Verhalten zu bewerten. In diesem Test sind fliegen auf einer Plattform aus eine feste Höhe ausgelöst. Dies führt zu eine angeborene motorische Reaktion, die die fliegen zu entkommen, die Plattform innerhalb von Sekunden ermöglicht. Zur Zeit sind Quantitative Analysen von gefilmten Insel Assays manuell, erfolgt die eine mühsame Aufgabe, besonders bei großen Bildschirmen.
Dieses Manuskript beschreibt die"Drosophila Insel Assay" und "Insel-Assay-Analyse" Algorithmen für Hochdurchsatz-, automatisierte Datenverarbeitung und Quantifizierung der Insel Assay Daten. Im Setup sammelt eine einfache Webcam an einen Laptop angeschlossen eine Bilderserie der Plattform, während der Test durchgeführt wird. Der"Drosophila Insel Assay" Algorithmus entwickelt für Open-Source-Software Fidschi verarbeitet diese Bildserien und quantifiziert, für jede experimentelle Bedingung, die Anzahl der fliegen auf der Plattform im Laufe der Zeit. Das "Insel-Assay-Analyse"-Skript, kompatibel mit der kostenlosen Software R, entwickelte sich die gewonnenen Daten automatisch zu verarbeiten und zu berechnen, ob Behandlungen/Genotypen statistisch unterschiedlich sind. Dies verbessert die Effizienz des Insel-Assays und macht es eine leistungsfähige Auslesen für grundlegende Fortbewegung und Flugverhalten. Es kann somit auf großen Bildschirmen Untersuchung fliegen Bewegungsorgane Fähigkeit, Drosophila Modelle von Bewegungsstörungen und Wirksamkeit von Arzneimitteln angewendet werden.

In dem beschriebenen Protokoll sind Drosophila Insel Assay Daten erworben und in drei Schritten verarbeitet. Erstens ist Flucht-Flucht-Reaktion von Drosophila auf dem Inselbahnsteig geworfen mit einer Webcam aufgezeichnet und gespeichert als einzelne BMP-Bilder (Protokoll Abschnitte 1 bis 7). Zweitens verarbeitet"Drosophila Insel Assay" Makro (Schritt 8), die Frames, erzeugt eine "result.txt" Textdatei (Tabelle 1), in denen die Anzahl der Objekte in den einzelnen Frames erkannt zusammengefasst werden, und ein Bildstapel "Result_stack.tiff", die zeigt die Objekte innerhalb des Bereichs der Plattform in jedem Frame erkannt. Drittens verarbeitet das Skript "Insel-Assay-Analyse" (Protokoll Abschnitt 9) die Makrodaten im "results.txt" Dateien der einzelnen Experimente. Mehreren Schritten fließen in das Skript zu filtern und die Daten für die statistische Analyse kombinieren. Das erste Bild, in dem die fliegen auf der Plattform geworfen werden, erkannt und als Zeitpunkt 1. Frühere Bilder werden aus dem Dataset eliminiert. 100 Bilder nach Zeit Punkt 1 (entspricht 10 s) sind für die Analyse ausgewählt. Experimente, in denen die ursprüngliche Anzahl der fliegen entdeckt auf der Plattform ist kleiner als 5 automatisch von der Analyse, Beseitigung von unzuverlässigen Ergebnissen aus untermotorisiert Experimenten ausgeschlossen sind. Experimente, bei denen die ursprüngliche Anzahl der fliegen entdeckt auf der Plattform eingestellten "Anzahl der fliegen pro Fläschchen" plus eine Toleranz von 3 überschreitet, sind ebenfalls ausgeschlossen. Dadurch werden Datensätze in welches, die Geräusch Partikel fälschlicherweise als fliegen entdeckt wurden. Das Skript berechnet dann den Prozentsatz von fliegen für jeden Zeitpunkt verglichen mit der höchsten Anzahl von fliegen in der Serie erkannt erkannt. Fehler in Datasets verursacht durch fliegen zu Fuß innerhalb und außerhalb der ROI (erkannt als eine Abnahme, gefolgt von einer Erhöhung des Anteils der fliegen auf der Plattform im Laufe der Zeit) werden automatisch über sie als konsequent auf die Plattform in früheren Stadien vorhanden korrigiert . Alle replizieren Datasets für einer bestimmten experimentellen Bedingungen, die im Hauptverzeichnis waren kombiniert und in die Datei "data_all_conditions.csv" exportiert. Die Spalten in Tabelle 2beschriebenen Variablen. Das Skript wird auch ein Liniendiagramm für jede experimentelle Bedingung, benannt nach dem Ordner mit den Daten exportieren. Diese Grafik zeigt den Prozentsatz der fliegen noch auf die Plattform im Laufe der Zeit (Flucht-Flucht-Reaktion) für die experimentelle repliziert in den jeweiligen Ordner ()Abbildung 3Avorhanden-B). Der Mittelwert, SD und SEM für jede experimentelle Bedingung berechnet und in die Datei "Statistik summary.csv" zusammengefasst. Ein Liniendiagramm, genannt "Escape_response_all_conditions.tiff" zeigt die durchschnittliche Flucht-Flucht-Reaktion für bis zu 12 experimentellen Bedingungen in den Hauptordner ()Abbildung 3() zu präsentieren. Schließlich ist die Fläche unter der Kurve für alle experimentellen Bedingungen vorhanden im Hauptordner berechnet und in der Datei "AUC.csv" zusammengefasst. Abhängig von der Anzahl der Bedingungen in den Hauptordner vorhanden, das Skript entweder führt einen zweiseitigen ungepaarte Welch t-Test (2 Bedingungen) oder einer ANOVA mit Tukey-Korrektur zu Testzwecken mehrere (mehr als 2 Bedingungen) um festzustellen, ob die experimentelle Bedingungen unterscheiden sich erheblich voneinander unterscheiden. Diese Ergebnisse sind zusammengefasst in "Welch_t-test_results.txt" oder "AUC_anova_results.txt." Bei der Durchführung der ANOVA wird das Skript auch eine "AUC_anova.tiff"-Datei exportieren, die zeigt den Unterschied in der AUC und der 95 %-Konfidenzintervall der Versuchsbedingungen, die verglichen werden. Die Werte der absoluten Fläche unter der Kurve von der experimentellen Wiederholungen für alle experimentellen Bedingungen werden als einzelne Datenpunkte mit Mittelstreifen in "AUC.tiff" (Abbildung 3D) angezeigt.
Ataxia Telangiectasia (AT) ist eine autosomal rezessive Bewegungsstörung zeichnet sich durch früh einsetzende zerebelläre Ataxie aufgrund von Mutationen in der Ataxia Telangiectasia mutiert (ATM) gen14. Mutanten der Drosophila orthologs ATM, Tefu, anzeigen Mängel in der Mobilität und Langlebigkeit15 Um das Makro"Drosophila Insel Assay" zu bewerten, wurde eine Drosophila -Modell des AT in der Insel-Assay getestet, und die Datenausgabe des Makros war im Vergleich zu manuellen Daten zählt. Die Ergebnisse zeigen, dass allgegenwärtigen Tefu Zuschlag (w-; Actin-Gal4/GD11950) erheblich verringert die Fähigkeit dieser fliegen, lassen Sie die Plattform im Vergleich zu ihren genetischen Hintergrund-Kontrollen (w-; Actin-Gal4/+) ()Abb. 4). Nach 1 s, 50 % der Kontrolle fliegen flüchteten die Plattform im Gegensatz zu den &#60; 1 % des Tefu- RNAi fliegt. Wichtig ist, die Daten mit dem Makro treu reproduziert die Daten manuell zählen, was darauf hinweist, dass das Makro ist ein zuverlässiges Werkzeug für die Quantifizierung der Insel-Assay-Daten und die Auswertung der Bewegung Defekte ( ) verwendet werden kann Abbildung 4 A-B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Flussdiagramm, in die Anforderungen, Versuchsdurchführung und Analyse des Insel-Assays. (A) Insel assay Ausrüstung. (B) Versuchsaufbau für die Insel-Assay. (C) Insel assay. (D) Verarbeitung von Insel-Assay-Daten mit dem"Drosophila Insel Assay" Makro. Das Makro"Drosophila Insel Assay" besteht aus 3 Sub-Makros: 1) Stack und Projektion, (2) definieren Plattform und (3) Analyse. (E) Verarbeitung und statistische Auswertung der Daten mit dem Skript "Insel-Assay-Analyse". <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55892/55892fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Beispiele für verschiedene Anpassungen während des Protokolls erforderlich. (A) die erforderliche Verzeichnisstruktur in welcher Insel Assay Experimente für Datenverarbeitung und-Analyse gespeichert werden müssen. (B) wenn die Videoeinstellungen anpassen fliegen müssen erscheinen schwarz auf weißem Hintergrund. (C) Bildrahmen Ausgabedateienwie von der Bild-Aufnahme-Software in diesem Manuskript beschrieben gespeichert. (D) die gelben Umriss zeigt die Plattformauswahl. Die gespeicherten Plattformauswahl im "ROI-Manager" ist blau markiert. (E) fliegen werden als weiße Punkte dargestellt, während der Anpassung des "Fly Mindestgröße einstellen." Das Ergebnisfenster zeigt den Bereich der fliegen in Pixel. (F) Beispiel für eine einzelne Aufnahme Rahmen (auf der linken Seite) und den entsprechenden Rahmen in der daraus resultierenden Bildstapel, erhalten mit dem Makro"Drosophila Insel Assay" (auf der rechten Seite). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55892/55892fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Ergebnis Bilder erhalten nach der Datenverarbeitung mit der "Insel-Assay-Analyse" Skript (A) Line Graph zeigt die Flucht-Flucht-Reaktion für jede Kontrolle experimentelle replizieren. (B) Line graph zeigt Flucht-Flucht-Reaktion für jedes Tefu RNAi experimentelle replizieren. (C) durchschnittliche Flucht-Flucht-Reaktion für angegebenen Versuchsbedingungen; Die Fehlerbalken repräsentieren die SEM (D) Punkt plottet, die Fläche unter der Kurve-Verteilung für Kontrolle und mutierten Bedingungen darstellt. Experimentelle Wiederholungen für beide Tefu RNAi und Kontrolle Bedingungen werden als einzelne Datenpunkte (in schwarz) mit Mittelstreifen (rote Linie) angezeigt. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55892/55892fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig4.jpg"> 
Abbildung 4: Allgegenwärtige Tefu Knockdown fliegen zeigen eine deutlich verminderte Fähigkeit, die Plattform zu verlassen. Die Daten repräsentieren die Prozent der fliegen auf der Plattform im Laufe der Zeit (s) für die Steuerung (w-; Actin-Gal4/+) und Tefu RNAi (w-; Actin-Gal4/GD11950) fliegt. (Anzahl der Wiederholungen = 5; Die Fehlerbalken darzustellen das SEM). (A) Raw-Daten mit dem Makro"Drosophila Insel Assay" erhalten. (B) Dot Grundstücke repräsentiert die Fläche unter der Kurve-Verteilung für Kontroll- und Tefu RNAi Bedingungen mit dem Makro"Drosophila Insel Assay" (Welch ungepaarten t-Test, ** p &#60; 0,01). (C) Raw Daten manuell zählen die Anzahl der fliegen auf der Insel pro Sekunde vorhanden. (D) Punkt plottet die Fläche unter der Kurve-Verteilung für Kontrolle und Tefu RNAi Bedingungen von Hand zählen darstellt (Welch ungepaarten t-Test, ** p &#60; 0,01). Die Fehlerbalken darzustellen SEM <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55892/55892fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Spaltenname</td>
			<td colspan="3">Beschreibung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice</td>
			<td colspan="3">Frame-Name.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graf</td>
			<td colspan="3">Die Anzahl der Objekte in den Rahmen innerhalb der Grenzen der Plattform (ROI) erkannt.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gesamtfläche</td>
			<td colspan="3">Gesamtfläche der Objekte erkannt im Rahmen im Rahmen der Plattform (ROI) in Pixel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durchschnittliche Größe</td>
			<td colspan="3">Gesamtfläche der Objekte in den Rahmen geteilt durch die Anzahl der Objekte innerhalb der Grenzen der Plattform (ROI) erkannt.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>% Bereich</td>
			<td colspan="3">Der Anteil der Fläche, die von den Objekten in Bezug auf die Gesamtfläche der Plattform (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perim.</td>
			<td colspan="3">Gesamtumfang der Objekte erkannt im Rahmen im Rahmen der Plattform (ROI) in Pixel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Min. Größe fliegen</td>
			<td colspan="3">Die minimale fliegen Größeneinstellung definiert durch den Benutzer in der grafischen Oberfläche des Makros"Drosophila Insel Assay" (in Pixel).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bereich ROI</td>
			<td colspan="3">Der Bereich der Plattform (ROI) durch den Benutzer während des Laufs des Sub Makros definiert definieren Plattform (in Pixel).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anzahl der fliegen</td>
			<td colspan="3">Die Anzahl der fliegen pro Experiment definiert durch den Benutzer in der grafischen Oberfläche des"Drosophila Insel Assay" Makros verwendet.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Parameter durch das Makro"Drosophila Insel Assay" gemessen. Die Parameter in dieser Tabelle beschriebenen erscheint in der Datei "results.txt" beim Ausführen des Makros"Drosophila -Insel-Test".
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Spaltenname</td>
			<td colspan="3">Beschreibung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice</td>
			<td colspan="3">Frame-Nummer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graf</td>
			<td colspan="3">Die Anzahl der fliegen im Rahmen im Rahmen der Plattform (ROI) erkannt.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Area</td>
			<td colspan="3">Gesamtfläche der fliegen in den Rahmen innerhalb der Grenzen der Plattform (ROI) in Pixeln erkannt.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Min. Größe fliegen</td>
			<td colspan="3">Die minimale fliegen Größeneinstellung Eintrag definiert durch den Benutzer in der grafischen Oberfläche des Makros"Drosophila Insel Assay" (in Pixel).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bereich ROI</td>
			<td colspan="3">Der Bereich der Plattform (ROI, in Pixeln) durch den Benutzer definiert, wenn der Sub Makroausführung "Plattform definieren".</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anzahl der fliegen</td>
			<td colspan="3">Die Anzahl der fliegen pro Experiment definiert durch den Benutzer in der grafischen Oberfläche des"Drosophila Insel Assay" Makros verwendet.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Count</td>
			<td colspan="3">% fliegt in den jeweiligen Slice/Rahmen bezogen auf die höchste Anzahl der fliegen auf der Plattform während Experiment erkannt auf der Plattform vorhanden.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TimePoint</td>
			<td colspan="3">Zeitpunkt 1 repräsentiert den ersten Frame analysiert werden und entspricht den Rahmen, wo die fliegen zuerst auf der Plattform angezeigt. Es gibt insgesamt 100 Bilder pro replizieren analysiert (entspricht 10 s, wenn die beschriebenen Einstellungen verwenden.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experiment</td>
			<td colspan="3">Anzahl der Wiederholungen pro Zustand.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zustand</td>
			<td colspan="3">Gibt den Namen der Versuchsbedingung (nach der benutzerdefinierte Name des Ordners mit den Daten).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 2: Beschreibung der Variablen nach der Verarbeitung der Daten mit der "Insel-Assay-Analyse" Skript erhalten Die Parameter in dieser Tabelle beschriebenen erscheinen in der Datei "data_all_conditions.csv" bei der Verarbeitung der Daten mit dem Skript "Insel-Assay-Analyse".

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High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Die Insel-Assay ist ein relativ neuer, kostengünstiger Assay, der verwendet werden, um der Bewegungsorgane Grundverhalten von Drosophila Melanogasterzu bewerten. Dieses Manuskript beschreibt Algorithmen für die automatische Datenverarbeitung und objektive Quantifizierung der Insel Assay Daten, so dass dies eine sensible, Hochdurchsatz-Auslesen für große genetische oder pharmakologische Bildschirme assay.

Hochdurchsatz-Analyse des Bewegungsapparates Verhaltens in der Drosophila -Insel-Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

high-throughput-analysis-locomotor-behavior-drosophila-island

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

8.8K Aufrufe.  Radboud University Medical Center. Die Insel-Assay ist ein relativ neuer, kostengünstiger Assay, der verwendet werden, um der Bewegungsorgane Grundverhalten von Drosophila Melanogasterzu bewerten. Dieses Manuskript beschreibt Algorithmen für die automatische Datenverarbeitung und objektive Quantifizierung der Insel Assay Daten, so dass dies eine sensible, Hochdurchsatz-Auslesen für große genetische oder pharmakologische Bildschirme assay.

Serie: High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Einzel Sensillum Recordings in der Insekten Drosophila melanogaster Und Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Forschung

Neurowissenschaften

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of these diseases, including Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease are characterized by age-dependent deterioration in learning and memory functions and movement coordination2. Here we use behavioral assays, including the negative geotaxis assay3 and the aversive phototaxic suppression assay (APS assay)4,5, to show that some of the behavior characteristics associated with human neurodegeneration can be recapitulated in flies. In the negative geotaxis assay, the natural tendency of flies to move against gravity when agitated is utilized to study genes or conditions that may hinder locomotor capacities. In the APS assay, the learning and memory functions are tested in positively-phototactic flies trained to associate light with aversive bitter taste and hence avoid this otherwise natural tendency to move toward light. Testing these trained flies 6 hours post-training is used to assess memory functions. Using these assays, the contribution of any genetic or environmental factors toward developing neurodegeneration can be easily studied in flies.

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior assays for measuring locomotor functions, learning, and memory abilities in Drosophila.

Assaying Bewegungsapparat, Lernen und Gedächtnis Defizite in Drosophila Modelle von Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Studying the Neural Basis of Adaptive Locomotor Behavior in Insects

Studying the neural basis of walking behavior, one often faces the problem that it is hard to separate the neuronally produced stepping output from those leg movements that result from passive forces and interactions with other legs through the common contact with the substrate. If we want to understand, which part of a given movement is produced by nervous system motor output, kinematic analysis of stepping movements, therefore, needs to be complemented with electrophysiological recordings of motor activity. The recording of neuronal or muscular activity in a behaving animal is often limited by the electrophysiological equipment which can constrain the animal in its ability to move with as many degrees of freedom as possible. This can either be avoided by using implantable electrodes and then having the animal move on a long tether (i.e. Clarac et al., 1987; Duch &amp; Pfl&uuml;ger, 1995; B&ouml;hm et al., 1997; Gruhn &amp; Rathmayer, 2002) or by transmitting the data using telemetric devices (Kutsch et al, 1993; Fischer et al., 1996; Tsuchida et al. 2004; Hama et al., 2007; Wang et al., 2008). Both of these elegant methods, which are successfully used in larger arthropods, often prove difficult to apply in smaller walking insects which either easily get entangled in the long tether or are hindered by the weight of the telemetric device and its batteries. In addition, in all these cases, it is still impossible to distinguish between the purely neuronal basis of locomotion and the effects exerted by mechanical coupling between the walking legs through the substrate. One solution for this problem is to conduct the experiments in a tethered animal that is free to walk in place and that is locally suspended, for example over a slippery surface, which effectively removes most ground contact mechanics. This has been used to study escape responses (Camhi and Nolen, 1981; Camhi and Levy, 1988), turning (Tryba and Ritzman, 2000a,b; Gruhn et al., 2009a), backward walking (Graham and Epstein, 1985) or changes in velocity (Gruhn et al., 2009b) and it allows the experimenter easily to combine intra- and extracellular physiology with kinematic analyses (Gruhn et al., 2006).
We use a slippery surface setup to investigate the timing of leg muscles in the behaving stick insect with respect to touch-down and lift-off under different behavioral paradigms such as straight forward and curved walking in intact and reduced preparations.

We describe a method to record motor activity, timed to the electrically recorded tarsal contact signal in a tethered insect, walking on a slippery surface. This is used to study the neural basis of adaptive behavior under reduced influence of mechanical interaction between legs through the substrate.

Studium der neuronalen Basis Adaptive Fortbewegung bei Insekten

Studying the neural basis of walking behavior, one often faces the problem that it is hard to separate the neuronally produced stepping output from those ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Methoden zum Test Drosophila Verhalten

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenetische Stimulation von Escape Verhalten in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

Ein Single-fly-Assay für Sammelverhalten in<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Bestimmung der spontanen lokomotorischen Aktivität in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

Assay mit hohem Durchsatz Eiablage Präferenzen der einzelnen zu untersuchen<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Ein einfacher Weg zu messen Veränderungen in Reward-seeking Verhalten verwenden<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...