この研究は、国立衛生研究所認可HL127711のAVKに支持された。

<ol>
	<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+Actin-Binding+Proteins.">Actin and Actin-Binding Proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).</li><li>Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+simple+and+informative+binding+assays.">A guide to simple and informative binding assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li><li>Hansen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaE-catenin+actin-binding+domain+alters+actin+filament+conformation+and+regulates+binding+of+nucleation+and+disassembly+factors.">alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors.</a> Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).</li><li>Perrin, B. J., Ervasti, J. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+actin:+purification+and+single+molecule+assembly+assays.">Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays.</a> Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).</li></ol>

著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

アクチン共沈降アッセイは、タンパク質がF-アクチンに結合するかどうかを迅速に判定することができる簡単な技術である。いくつかの変更を加えて、この技術を用いて相互作用の親和性を測定することもできる。上記のプロトコールで提起された点に加えて、アッセイの設計、実施および解釈の際には、以下の問題を考慮する必要があります。 関心のあるタンパク質新たに調製または凍結したタンパク質をアッセイに使用することができる。凍結タンパク質が使用される場合、凍結がF-アクチン結合に影響を及ぼさないように、結果を新鮮な（決して凍結されていない）タンパク質と比較することが強く推奨される。 G-アクチン源多くのペレット化実験は、その豊富な存在のために筋肉から単離されたG-アクチンを使用する。哺乳動物には、α、β、γの3つの主要なアクチンアイソタイプがあり、それらは非常に類似している（&gt; 90％の配列同一性ty）。それにもかかわらず、アイソタイプ12,13の間に機能的な相違がある。可能であれば、結合アッセイに使用されるG-アクチンアイソタイプは、インビボアイソタイプと一致するはずである。例えば、骨格筋で発現されるタンパク質を試験する場合、α-アクチンが最良の選択である。線維芽細胞で発現されるタンパク質を調べる場合は、β-アクチンが推奨される。 ファロイジン使用ファロイジンはFアクチンに結合するので、Fアクチン結合タンパク質（アクチンフィラメントへの結合からのコフィリンなどのファロイジンブロック）の結合を妨害したり、ブロックすることさえあります14 。従って、ファロイジンは注意して使用すべきであり、可能であれば非ファロイジン処理した試料と比較した。 高い背景 F-アクチンの非存在下でタンパク質が沈降することは珍しいことではない（ 図1A 、F-アクチンペレット試料なしs）。しかしながら、高いレベルのバックグラウンド沈降は、真のアクチン共沈降を隠し、不可能ではないにしても、タンパク質がF-アクチンに結合するか、または相互作用の親和性を測定するのを困難にする可能性がある。ポリジカノールを反応緩衝液（工程4.1）に添加することにより、バックグラウンドを有意に減少させることができ、容易な解決策である。それがバックグラウンドを減少させないならば、反応緩衝液、塩濃度、および/またはインキュベーション温度を調整することが役立ち得る。 結合曲線結合曲線を生成するためには、目的のタンパク質またはF-アクチンの濃度を一連の反応にわたって変化させることが必要である。実際には、固定された濃度でF-アクチンを維持し、目的のタンパク質の濃度を変化させることがより容易で好ましい。ペレット化アッセイにおいて固定濃度（ 例えば、 2μM）でF-アクチンを維持することにより、より高い濃度のF-アクチンでの非特異的捕捉が制限され、より低い（&lt;0.5μM）濃度のF-アクチンでの解重合。脱重合はファロイジンを用いて防止することができるが、これは系に潜在的な複雑化因子を導入する（工程3.3以上参照）。固定濃度でF-アクチンを維持することにより、サンプル間でF-アクチンペレットを比較（および標準化）することができ、失敗した実験（ すなわち、 F-アクチンペレットが非常に変動し、濃度間の分析を妨げる）を同定することができる。最後に、固定濃度でF-アクチンを維持することにより、アクチンフィラメントへの結合が協同的であるかどうかを決定することができる（ 図1C ）。 飽和結合すべての結合実験と同様に、F-アクチンへの結合が飽和し、タンパク質+ F-アクチンの濃度が安定することが重要です（ 図1C ）。プラトーがなければ、正確な解離平衡定数を計算することはできません。したがって、それ試験すべき希釈シリーズを注意深く計画し、常により高濃度のタンパク質（ すなわち、予想されるK dよりも少なくとも5〜10倍高い）を含むことが重要である。 バインディング分析測定された解離定数が決定的であるためには、目的タンパク質に対するF-アクチン上の結合部位の濃度が親和性よりもはるかに低くなるようにするF-アクチン濃度を用いてアッセイを実施すべきである。この基準が満たされたかどうかを確認するために、B maxから結合部位の濃度を推定する。例えば、[F-アクチン]が2μMでBmax = 0.5である場合、[結合部位]は約1μMである。 K dは[結合部位]よりも少なくとも5〜10倍大きくなければならない。測定されたK dが[結合部位]と同じオーダーの大きさである場合、観察された結合曲線は高親和性結合siの滴定を表す可能性がある真の結合等温線ではなく、これが観察される場合は、正確な親和性を測定するために、10倍低いF-アクチン濃度を用いてアッセイを繰り返す。高親和性相互作用のために、親和性を正確に測定するのに十分低いF-アクチン濃度を達成するために、ファロイジン安定化（ステップ3.3）が必要であるかもしれない。 最後に、アッセイを実施し、評価する際に研究者が認識すべき共沈降アッセイに関する根本的な制限がある。最も重要なことに、共沈降アッセイは真の平衡定数を生成しない。結合生成物（ すなわち、タンパク質+ F-アクチン）は、遠心分離の間に反応物から分離され、その後、生成物は解離して新たな平衡を作り出すことができる。その結果、共沈降アッセイは、誤った親和性の相互作用を誤って計算したり、検出しなかったりする可能性があります。多くのアクチン結合タンパク質は、Fアクチンに対して低い（ すなわち、マイクロモル）親和性を有するので、陰性の結果（ <eすなわち検出不可能な結合）は、タンパク質がF-アクチンに結合しないことを必ずしも意味しない。代替として、TIRF顕微鏡に基づく単一フィラメント結合アッセイは、解離定数を決定するために、より高感度で正確である（この技術の総説については、参考文献15,16を参照）。これらの制限にもかかわらず、ペレット化アッセイは、ほとんどの研究者の手段の範囲内であり、タンパク質がF-アクチンに結合するかどうかを決定し、相互作用の親和性を測定するための有効なツールである。

アクチンは、運動性、収縮、接着、および形態学を含む、複数の細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす必須の細胞骨格タンパク質である1 。アクチンは、単球球状アクチン（G-アクチン）および重合した糸状アクチン（F-アクチン）の2つの形態で存在する。細胞内では、Fアクチンの組織化はアクチンフィラメント2,3,4の核形成、成長、架橋、分解を制御する大量のタンパク質によって制御されています。しかしながら、複数のアクチン結合タンパク質がアクチンネットワークの組織化を調節するためにどのように機能するかは依然としてほとんど不明である。 タンパク質 - タンパク質相互作用の測定は、タンパク質が生化学レベルでどのように細胞行動に影響を及ぼすかを理解するための重要なアプローチである。多くの異なるアッセイを使用して、精製タンパク質間の相互作用を検出することができる。可溶性タンパク質の一般的なアプローチには、プルダウン、蛍光偏光、等温滴定熱量測定、および表面プラズモン共鳴が含まれる。重要なことに、これらのアッセイの全ては、タンパク質が可溶性であることを必要とし、したがって、Fアクチンのような高分子の糸状タンパク質での使用に適応するのが困難である。ここでは、タンパク質またはタンパク質ドメインがF-アクチンに結合するかどうかを決定し、相互作用の親和性を測定するためのテクニック、すなわちアクチン共沈降、またはペレット化アッセイを説明します。 アクチンペレット化アッセイは、超遠心分離機以外の特別な装置を必要としない比較的簡単な技術である。すべての試薬は、基本的な生化学の知識を前提に作成するか、購入することができます。 F-アクチンへの結合が確立されると、このアッセイを使用して見かけの親和性（ すなわち、解離平衡定数）を測定することができる5 。また、いったん親和性が確立されると、ペレット化アッセイ目的タンパク質の変化（ すなわち 、翻訳後修飾、突然変異、またはリガンド結合）がFアクチンとの相互作用にどのように影響するかを測定するのに有用なツールです。この手法には、アッセイを試みる前に研究者が知っておくべき限界（ 議論を参照）があります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="842">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46960</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">S100-AT3 rotor</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45585</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ultracentrifuge tubes - 0.2 ml</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45233</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Actin, rabbit skeletal muscle</td>
			<td style="width:224px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">AKL99</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8531</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Polidicanol (Thesit)&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">88315</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Phalloidin</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P3457</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0862</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2383</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Imidazole</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">O3196</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M33</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P217</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3779</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Odyssey CLx Imaging System</td>
			<td style="width:224px;">LI-COR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20278</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colloidal Blue Staining Kit</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">LC6025</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation

細胞内の糸状アクチン（F-アクチン）の組織化は、アクチン核形成、増殖、架橋および/または分解を制御する多数のアクチン結合タンパク質によって調節される。このプロトコルは、タンパク質またはタンパク質ドメインがF-アクチンに結合するかどうかを決定し、相互作用の親和性（ すなわち、解離平衡定数）を測定する技法、すなわちアクチン共沈降、またはペレット化アッセイを記載する。この技術では、目的のタンパク質をまず溶液中のF-アクチンとともにインキュベートする。次いで、分別遠心分離を用いてアクチンフィラメントを沈降させ、ペレット化した物質をSDS-PAGEにより分析する。目的のタンパク質がF-アクチンと結合すると、アクチンフィラメントと一緒に沈降する。結合反応の生成物（ すなわち、 F-アクチンおよび目的のタンパク質）を定量化して、相互作用の親和性を決定することができる。アクチンペレット化アッセイは、目的のタンパク質がF-アクチンと結合し、リガンド結合などのそのタンパク質への変化がF-アクチンとのその相互作用にどのように影響するかを評価するために使用される。

本発明者らは、共沈降アッセイにおいてF-アクチンへのαE-カテニンホモダイマーの結合を調べた。過去の実験から、F-アクチンに対するαE-カテニンホモダイマーの親和性は約1μMであり、 Bmaxは 11に近いことが示されているので、低濃度のF-アクチン（0.2μMではなく2μM;議論）。 0.2μMが臨界濃度未満であるため、ウサギ骨格筋G-アクチンから重合したF-アクチンを安定化するためにファロイジンを添加した（ステップ3.3）。増加する濃度のαE-カテニンホモダイマー（0.125-12.0μM）を、0.2μMのF-アクチンの存在下または非存在下でインキュベートした。試料を遠心分離し、得られたペレットを分析した（ 図1A ）。予想通り、バックグラウンドより上のF-アクチンと一緒に沈降したαE-カテニンホモダイマー（ 図1A 、F-アクチンペレットサンプルを非F-acスズペレットサンプル）。 BSAを陰性対照として用いた（ 図1B ）。結合したタンパク質を定量し、遊離タンパク質上にプロットして、相互作用の親和性を計算した（ 図1C ）。プロットされたデータはヒルの方程式に最もよく合います。計算されたK dは2.9μMであり、B maxは0.2であり、ヒル係数（h）は4.8であった。したがって、αE-カテニンホモダイマーは、以前の研究（〜1.0μMに対して2.9μMのK d）と一致して、低いマイクロモル親和性でF-アクチンに協同して結合する11 。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> 図1： 高速F-アクチン同時沈降アッセイ。 （ A ）増加する濃度（0.125-12.0μM）のαE-カテニンホモダイマーを、ファロイドで安定化した0.2μMのF-アクチン（左パネル）または非存在下（右パネル）でインキュベートしたn。それらをRTで30分間インキュベートし、遠心分離した。全部（出発材料の7.5％）およびペレット化した材料（ペレット化した材料の50％）をSDS-PAGEによって分離し、クマシー色素で染色した。 （ B ）陰性対照として4μMBSAを流した。 F-アクチンを含む（+）または含まない（ - ）アクチビンを含む全サンプルおよびペレットサンプルをSDS-PAGEによって分離し、クマシー色素で染色した。 （ C ）遊離αE-カテニン（μM）に対して、Aから結合したαE-カテニン（μM/μMアクチン）をプロットし、ヒル式（赤線）に適合した。 K d 、B max 、及びヒル係数（h）が列挙される。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> 図2： アクチンペレット化定量 </strong&gt; - フローチャート。この概略図は、定量化に使用されたTotalおよびPelletサンプル（ A 、 CE ）および標準曲線（ B ）の例を含む第5章の重要なステップを概説しています。 5.13ステップ： 1 ）総サンプル（A）中の目的のタンパク質の量を測定する。 2 ）バンド強度対タンパク質質量（B）をプロットして標準曲線を作成する。 3 ）F-アクチン（ C ）と一緒に沈降する目的のタンパク質の量を測定する。 4 ）F-アクチン（ D ）の非存在下でペレット化した目的タンパク質の量を測定する。 5 ）Fをアクチンに結合したタンパク質の量を決定するためにCからDを引く。 6 ）各ペレット中のF-アクチンの量（E）を測定し、1サンプル当たりのF-アクチンの平均量を計算し、各サンプルを平均で割り出す（以下の数字はその比を示す）。 7 ）各サンプルについて、結合タンパク質の量（ステップ5で計算）をF-アクチンペレット比（ステップ6で計算）で割り、ペレットの違いを調整する。 8 ）標準曲線（ B ）を用いて、各試料中の正規化された結合タンパク質の量（質量）を計算する（工程7）。 9 ）遊離タンパク質および結合タンパク質の濃度を決定して結合曲線を作成する。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

このプロトコールは、糸状アクチン（F-アクチン）と同時沈降するタンパク質の能力を試験し、結合が観察された場合に相互作用の親和性を測定する方法を記載する。

共沈降によるF-アクチンへのタンパク質結合の測定

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

measuring-protein-binding-to-f-actin-by-co-sedimentation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

16.3K ビュー.  University of Pittsburgh School of Medicine. このプロトコールは、糸状アクチン（F-アクチン）と同時沈降するタンパク質の能力を試験し、結合が観察された場合に相互作用の親和性を測定する方法を記載する。 

ビデオ: Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

生化学

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a major pharmacological target for multiple indications, including analgesia, blood pressure regulation, and the treatment of psychiatric disease. Upon ligand binding, GPCRs catalyze the activation of intracellular G-proteins by stimulating the incorporation of guanosine triphosphate (GTP). Activated G-proteins then stimulate signaling pathways that elicit cellular responses. GPCR signaling can be monitored by measuring the incorporation of a radiolabeled and non-hydrolyzable form of GTP, [35S]guanosine-5&#39;-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTP&#947;S), into G-proteins. Unlike other methods that assess more downstream signaling processes, [35S]GTP&#947;S binding measures a proximal event in GPCR signaling and, importantly, can distinguish agonists, antagonists, and inverse agonists. The present protocol outlines a sensitive and specific method for studying GPCR signaling using crude membrane preparations of an archetypal GPCR, the &#181;-opioid receptor (MOR1). Although alternative approaches to fractionate cells and tissues exist, many are cost-prohibitive, tedious, and/or require non-standard laboratory equipment. The present method provides a simple procedure that enriches functional crude membranes. After isolating MOR1, various pharmacological properties of its agonist, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol]-enkephalin (DAMGO), and antagonist, naloxone, were determined.

Guanosine triphosphate (GTP) binding is one of the earliest events in G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) activation. This protocol describes how to pharmacologically characterize specific GPCR-ligand interactions by monitoring the binding of the radio-labeled GTP analog, [35S]guanosine-5&#39;-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTP&#947;S), in response to a ligand of interest.

ラジオ標識GTP結合を介したGタンパク質共役型受容体シグナルの測定

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto the endosomal membrane. We have established a microscopy-based in vitro assay that reconstitutes the nucleation and polymerization of F-actin on early endosomal membranes in test tubes, thus rendering this complex series of reactions amenable to genetic and biochemical manipulations. Endosomal fractions are prepared by floatation in sucrose gradients from cells expressing the early endosomal protein GFP-RAB5. Cytosolic fractions are prepared from separate batches of cells. Both endosomal and cytosolic fractions can be stored frozen in liquid nitrogen, if needed. In the assay, the endosomal and cytosolic fractions are mixed, and the mixture is incubated at 37 &#176;C under appropriate conditions (e.g., ionic strength, reducing environment). At the desired time, the reaction mixture is fixed, and the F-actin is revealed with phalloidin. Actin nucleation and polymerization are then analyzed by fluorescence microscopy. Here, we report that this assay can be used to investigate the role of factors that are involved either in actin nucleation on the membrane, or in the subsequent elongation, branching, or crosslinking of F-actin filaments.

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Early endosome functions depend on F-actin polymerization. Here, we describe a microscopy-based in vitro assay that reconstitutes the nucleation and polymerization of F-actin on early endosomal membranes in test tubes, thus rendering this complex series of reactions amenable to biochemical and genetic manipulations.

体外初期エンドソームの F-アクチンの重合

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding interactions. This information is critical in the design of new pharmaceutical compounds. However, many pharmaceutically relevant ligands are chemically unstable at the high temperatures used in DSC analyses. Thus, measuring binding interactions is challenging because the concentrations of ligands and thermally-converted products are constantly changing within the calorimeter cell. Here, we present a protocol using thermolabile ligands and DSC for rapidly obtaining thermodynamic and kinetic information on the folding, binding, and ligand conversion processes. We have applied our method to the DNA aptamer MN4 that binds to the thermolabile ligand cocaine. Using a new global fitting analysis that accounts for thermolabile ligand conversion, the complete set of folding and binding parameters are obtained from a pair of DSC experiments. In addition, we show that the rate constant for thermolabile ligand conversion may be obtained with only one supplementary DSC dataset. The guidelines for identifying and analyzing data from several more complicated scenarios are presented, including irreversible aggregation of the biomolecule, slow folding, slow binding, and rapid depletion of the thermolabile ligand.

We present a protocol for rapid characterization of biomolecular folding and binding interactions with thermolabile ligands using differential scanning calorimetry.

急速に折りたたみと結合の相互作用を特徴付ける不耐熱配位子を持つ生体分子 DSC プロファイルを測定

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage by extracellular oxidants. This process of transporting electrons from intracellular reductants to extracellular oxidants is not well defined. Here we present spectrophotometric assays by C2C12 myotubes to monitor tPMET utilizing the extracellular electron acceptors: water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1) and 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP or DCIP). Through reduction of these electron acceptors, we are able to monitor this process in a real-time analysis. With the addition of enzymes such as ascorbate oxidase (AO) and superoxide dismutase (SOD) to the assays, we can determine which portion of tPMET is due to ascorbate export or superoxide production, respectively. While WST-1 was shown to produce stable results with low background, DPIP was able to be re-oxidized after the addition of AO and SOD, which was demonstrated with spectrophotometric analysis. This method demonstrates a real-time, multi-well, quick spectrophotometric assay with advantages over other methods used to monitor tPMET, such as ferricyanide (FeCN) and ferricytochrome c reduction.

The goal of this protocol is to spectrophotometrically monitor trans-plasma membrane electron transport utilizing extracellular electron acceptors and to analyze enzymatic interactions that may occur with these extracellular electron acceptors.

C2C12 細胞によるトランス プラズマ膜電子輸送特性の測定

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

散逸の Microgravimetry 結合タンパク質アネキシン A2 への水晶振動子を用いた固相担脂質膜リン脂質の結合動態を研究するには

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the progression of cancer, diabetes, neurodegeneration, and aging to name a few. For instance, changes in mitochondrial activity, the cell&#39;s metabolic powerhouse, have been characterized in many such diseases. Generally, the oxygen consumption rates of mitochondria were considered a reliable readout of mitochondrial activity and measurements in some of these studies were based on isolated mitochondria or cells. However, such conditions may not represent the complexity of a whole tissue. Recently, we have developed a novel method that enables the dynamic measurement of oxygen consumption rates from whole isolated fly heads. By utilizing this method, we have recorded lower oxygen consumption rates of the whole head segment in young versus aged flies. Secondly, we have discovered that lysine deacetylase inhibitors rapidly alter the oxygen consumption in the whole head. Our novel technique may therefore aid in uncovering new properties of various drugs, which may impact metabolic rates. Furthermore, our method may give a better understanding of metabolic behavior in an experimental setup that more closely resembles physiological states.

Measuring alterations in metabolic rates is central to understanding the progression of various diseases and aging. Here, we present a novel technique to measure whole head oxygen consumption that more closely resembles the physiological state and may aid in revealing novel drugs that modify mitochondrial activity.

測定と酸素消費量全体の解釈飛ぶ頭セグメント

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing approaches suffer from significant limitations, we have developed a new method for determining TF-DNA binding affinities with high sensitivity on a large scale. The assay relies on the established fluorescence anisotropy (FA) principle but introduces important technical improvements. First, we measure a full FA competitive titration curve in a single well by incorporating TF and a fluorescently labeled reference DNA in a porous agarose gel matrix. Unlabeled DNA oligomer is loaded on the top as a competitor and, through diffusion, forms a spatio-temporal gradient. The resulting FA gradient is then read out using a customized epifluorescence microscope setup. This improved setup greatly increases the sensitivity of FA signal detection, allowing both weak and strong binding to be reliably quantified, even for molecules of similar molecular weights. In this fashion, we can measure one titration curve per well of a multi-well plate, and through a fitting procedure, we can extract both the absolute dissociation constant (KD) and active protein concentration. By testing all single-point mutation variants of a given consensus binding sequence, we can survey the entire binding specificity landscape of a TF, typically on a single plate. The resulting position weight matrices (PWMs) outperform those derived from other methods in predicting in vivo TF occupancy. Here, we present a detailed guide for implementing HiP-FA on a conventional automated fluorescent microscope and the data analysis pipeline.

Here we present a novel method for determining binding affinities at equilibrium and in solution with high sensitivity on a large scale. This improves the quantitative analysis of transcription factor-DNA binding. The method is based on automated fluorescence anisotropy measurements in a controlled delivery system.

蛍光顕微鏡を使用して競争力のある滴定による転写因子の DNA 結合親和性の高感度測定

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

タンパク質の折り畳み、トランスポート、および放射性パルス追跡による生体細胞の劣化の解析

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...