Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Grant HL127711 an AVK unterstützt.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Der Actin-Co-Sedimentationstest ist eine einfache Technik, die schnell bestimmen kann, ob ein Protein F-Actin bindet. Mit einigen Modifikationen kann die Technik auch verwendet werden, um die Affinität der Wechselwirkung zu messen. Zusätzlich zu den im oben genannten Protokoll aufgeführten Punkten sollten bei der Gestaltung, Durchführung und Interpretation des Assays die folgenden Punkte berücksichtigt werden. Protein von Interesse Frisch zubereitetes oder gefrorenes Protein kann im Assay verwendet werden. Wenn gefrorenes Protein verwendet wird, wird dringend empfohlen, dass die Ergebnisse mit frischem (nie gefrorenem) Protein verglichen werden, um sicherzustellen, dass das Einfrieren die F-Aktinbindung nicht beeinflusst. G-Aktin Quelle Viele Pelletierexperimente verwenden G-Actin, das aus dem Muskel isoliert ist, wegen seiner relativen Häufigkeit. Es gibt drei Haupt-Actin-Isotypen bei Säugetieren - Alpha, Beta und Gamma - das sind bemerkenswert ähnlich (&gt; 90% Sequenz identiTy) Dennoch gibt es funktionale Unterschiede zwischen den Isotypen 12 , 13 . Wenn möglich, sollte der in dem Bindungsassay verwendete G-Aktin-Isotyp mit dem in vivo- Isotyp übereinstimmen. Zum Beispiel, wenn ein Protein im Skelettmuskel exprimiert wird, ist Alpha-Aktin die beste Wahl; Bei der Untersuchung eines in Fibroblasten exprimierten Proteins wird Beta-Actin empfohlen. Phalloidin Gebrauch Da Phalloidin F-Actin bindet, kann es die Bindung einiger F-Aktin-bindender Proteine ​​stören oder sogar blockieren ( z. B. Phalloidin-Blöcke cofilin aus Bindung an Aktin-Filamente) 14 . So sollte Phalloidin mit Vorsicht verwendet werden und die Ergebnisse im Vergleich zu Nicht-Phalloidin-behandelten Proben, wenn möglich. Hoher hintergrund Es ist nicht ungewöhnlich, daß Proteine ​​in Abwesenheit von F-Aktin sedimentieren ( Fig. 1A , keine F-Aktin-PelletprobeS). Allerdings können hohe Niveaus der Hintergrund-Sedimentation die echte Aktin-Co-Sedimentation maskieren und es schwierig machen, wenn nicht gar unmöglich zu bestimmen, ob ein Protein F-Actin bindet oder die Affinität der Wechselwirkung mißt. Das Hinzufügen von Polidicanol zum Reaktionspuffer (Schritt 4.1) kann den Hintergrund erheblich reduzieren und ist eine einfache Lösung. Wenn das nicht den Hintergrund verringert, kann die Einstellung des Reaktionspuffers, der Salzkonzentration und / oder der Inkubationstemperatur helfen. Bindekurve Um eine Bindungskurve zu erzeugen, ist es notwendig, die Konzentration von entweder dem interessierenden Protein oder dem F-Aktin über eine Reihe von Reaktionen zu variieren. In der Praxis ist es einfacher und bevorzugt, F-Aktin in einer festen Konzentration aufrechtzuerhalten und die Konzentration des interessierenden Proteins zu variieren. Die Aufrechterhaltung von F-Aktin in einer festen Konzentration ( z. B. 2 &amp; mgr; M) im Pelletier-Assay begrenzt das unspezifische Fallen bei höheren Konzentrationen von F-Aktin und verhindertDepolymerisation bei niedrigeren (&lt;0,5 μM) Konzentrationen von F-Aktin. Die Depolymerisation kann mit Phalloidin verhindert werden, obwohl dies einen potentiellen komplizierenden Faktor in das System einführt (siehe Schritt 3.3 und darüber). Die Aufrechterhaltung von F-Aktin in einer festen Konzentration erlaubt es auch, das F-Aktin-Pellet über Proben zu vergleichen (und zu normalisieren) und um fehlgeschlagene Experimente zu identifizieren ( dh wo das F-Aktin-Pellet sehr variabel ist und eine Analyse über Konzentrationen hinweg verhindert). Schließlich ermöglicht die Aufrechterhaltung von F-Aktin in einer festen Konzentration, dass man bestimmt, ob die Bindung an den Aktin-Filament kooperativ ist ( 1C ). Gesättigte Bindung Wie bei allen Bindungsexperimenten ist es entscheidend, dass die Bindung an F-Actin gesättigt ist und dass die Konzentration von Protein plus F-Aktin-Plateaus (Abbildung 1C ). Ohne Plateau ist es nicht möglich, eine genaue Dissoziationsgleichgewichtskonstante zu berechnen. Also, esIst wichtig, die zu testende Verdünnungsreihe sorgfältig zu planen und immer höhere Protein-Konzentrationen ( dh mindestens 5- bis 10-fach höher als die erwarteten K d ) zu enthalten. Bindungsanalyse Damit die gemessenen Dissoziationskonstanten schlüssig sind, sollte der Assay unter Verwendung einer F-Aktin-Konzentration durchgeführt werden, die es ermöglicht, dass die Konzentration von Bindungsstellen auf F-Aktin für das interessierende Protein viel niedriger als die Affinität ist. Um zu prüfen, ob dieses Kriterium erfüllt ist, schätzen Sie die Konzentration der Bindungsstellen von B max . Zum Beispiel, wenn [F-Aktin] 2 μM und B max = 0,5 war, dann [Bindungsstellen] ≈ 1 μM. Das K d sollte mindestens 5- bis 10-fach größer sein als [Bindungsstellen]. Ist das gemessene K d in der gleichen Größenordnung wie [Bindungsstellen], so ist es möglich, dass die beobachtete Bindungskurve eine Titration der hochaffinen Bindungsstelle darstelltEher als eine echte Bindungsisotherme. Wenn dies beobachtet wird, wiederholen Sie den Assay mit einer 10-fach niedrigeren F-Aktin-Konzentration, um eine genaue Affinität zu messen. Für hochaffine Wechselwirkungen kann eine Phalloidin-Stabilisierung (Schritt 3.3) notwendig sein, um eine F-Aktin-Konzentration zu erreichen, die niedrig genug ist, um die Affinität genau zu messen. Schließlich gibt es grundsätzliche Einschränkungen mit dem Co-Sedimentationstest, den die Forscher bei der Durchführung und Bewertung des Assays bewusst sein sollten. Am wichtigsten ist, dass der Co-Sedimentationstest keine echte Gleichgewichtskonstante ergibt. Die Produkte der Bindung ( dh Protein plus F-Aktin) werden bei der Zentrifugation von den Reaktanten abgetrennt, woraufhin die Produkte dann dissoziieren können, um ein neues Gleichgewicht zu erzeugen. Infolgedessen kann der Co-Sedimentations-Assay die Wechselwirkung mit geringer Affinität fiskussieren oder nicht erkennen. Da viele aktinbindende Proteine ​​eine niedrige ( dh mikromolare) Affinität für F-Aktin aufweisen , ist ein negatives Ergebnis ( <eM&gt; dh keine nachweisbare Bindung) im Assay bedeutet nicht zwangsläufig, dass ein Protein nicht F-Actin bindet. Als Alternative sind TIRF-Mikroskopie-basierte Einzelfilament-Bindungsassays empfindlicher und genauer für die Bestimmung einer Dissoziationskonstante (für Rezensionen zu dieser Technik siehe Literatur 15,16 ). Trotz dieser Einschränkungen liegt der Pelletierassay innerhalb der Mittel der meisten Forscher und ist ein wirksames Instrument, um festzustellen, ob ein Protein F-Aktin bindet und die Affinität der Wechselwirkung misst.

Actin ist ein essentielles zytoskeletales Protein, das in zahlreichen zellulären Prozessen eine entscheidende Rolle spielt, einschließlich Motilität, Kontraktion, Adhäsion und Morphologie 1 . Actin besteht in zwei Formen: monomeres globuläres Actin (G-Actin) und polymerisiertes filamentöses Actin (F-Aktin). Innerhalb der Zellen wird die F-Aktin-Organisation durch eine große Sammlung von Proteinen kontrolliert, die die Keimbildung, das Wachstum, die Vernetzung und die Demontage der Aktinfilamente 2 , 3 , 4 regulieren. Doch wie viele aktinbindende Proteine ​​im Zusammenspiel zur Regulierung der Aktin-Netzwerkorganisation funktionieren, ist noch weitgehend unklar. Die Messung von Protein-Protein-Wechselwirkungen ist ein wichtiger Ansatz für das Verständnis, wie Proteine ​​ihre Auswirkungen auf das zelluläre Verhalten auf biochemischer Ebene ausüben. Viele verschiedene Assays können verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen gereinigten Proteinen zu detektieren.Häufige Ansätze für lösliche Proteine ​​umfassen Pull-Downs, Fluoreszenzpolarisation, isotherme Titrationskalorimetrie und Oberflächenplasmonenresonanz. Wichtig ist, dass alle diese Assays Proteine ​​benötigen, um löslich zu sein, und sind daher schwierig für die Verwendung mit einem polymeren, filamentösen Protein wie F-Actin anzupassen. Hier beschreiben wir eine Technik - die Aktin-Co-Sedimentation oder Pelletierung, Assay - um festzustellen, ob eine Protein- oder Proteindomäne F-Actin bindet und die Affinität der Wechselwirkung mißt. Der Aktin-Pelletier-Assay ist eine relativ einfache Technik, die keine spezialisierte Ausrüstung erfordert, abgesehen von einer Ultrazentrifuge. Alle Reagenzien können hergestellt werden, die Kenntnis der Grundbiochemie annehmen oder erworben werden. Sobald die Bindung an F-Actin etabliert ist, kann der Assay verwendet werden, um die scheinbare Affinität ( dh die Dissoziationsgleichgewichtskonstante) zu messen. Auch wenn einmal eine Affinität festgestellt ist, wird der PelletierungsassayIst ein nützliches Werkzeug, um zu messen, wie sich Veränderungen des interessierenden Proteins ( dh posttranslationale Modifikationen, Mutationen oder Ligandenbindung) auf die Wechselwirkung mit F-Aktin 6 auswirken. Die Technik hat Einschränkungen (siehe die Diskussion ), die der Forscher sich bewusst sein sollte, bevor er den Test versuchte.

<table><tbody><tr><td>Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>S100-AT3 rotor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45585</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tubes - 0.2 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45233</td><td></td></tr><tr><td>Actin, rabbit skeletal muscle</td><td>Cytoskeleton</td><td>AKL99</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>Polidicanol (Thesit)&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>88315</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3457</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine triphosphate (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3196</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis(&amp;beta;-aminoethyl ether)-N,N,N&#039;,N&#039;-tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>3779</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey CLx Imaging System</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Colloidal Blue Staining Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC6025</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation

Die filamentöse Aktin (F-Aktin) -Organisation innerhalb der Zellen wird durch eine große Anzahl von aktinbindenden Proteinen reguliert, die die Aktin-Keimbildung, das Wachstum, die Vernetzung und / oder die Demontage kontrollieren. Dieses Protokoll beschreibt eine Technik - die Aktin-Co-Sedimentation oder Pelletierung, Assay - um zu bestimmen, ob eine Protein- oder Proteindomäne F-Actin bindet und die Affinität der Wechselwirkung ( dh die Dissoziationsgleichgewichtskonstante) misst. Bei dieser Technik wird zunächst ein Protein von Interesse mit F-Actin in Lösung inkubiert. Dann wird eine Differentialzentrifugation verwendet, um die Aktinfilamente zu sedimentieren, und das pelletierte Material wird durch SDS-PAGE analysiert. Wenn das interessierende Protein F-Aktin bindet, wird es mit den Aktinfilamenten co-sedimentieren. Die Produkte der Bindungsreaktion ( dh F-Aktin und des Proteins von Interesse) können quantifiziert werden, um die Affinität der Wechselwirkung zu bestimmen. Der Aktin-Pelletierassay ist eine einfache Technik zur BestimmungWenn ein Protein von Interesse F-Aktin bindet und für die Beurteilung, wie Veränderungen an diesem Protein, wie Ligandenbindung, seine Wechselwirkung mit F-Actin beeinflussen.

Wir untersuchten die αE-Catenin-Homodimer-Bindung an F-Actin im Co-Sedimentationstest. Da vergangene Experimente gezeigt haben, dass die Affinität des αE-Catenin-Homodimers für F-Aktin etwa 1 μM und der B max bei 1 11 liegt , haben wir den Assay mit einer geringen Konzentration an F-Aktin (0,2 μM anstatt 2 μM) durchgeführt die Diskussion). Da 0,2 μM unterhalb der kritischen Konzentration liegt, wurde Phalloidin zugegeben, um das aus dem Kaninchen-Skelettmuskel G-Actin polymerisierte F-Aktin zu stabilisieren (Schritt 3.3). Zunehmende Konzentrationen von &amp; agr; E-Catenin-Homodimeren (0,125 &amp; ndash; 12,0 &amp; mgr; M) wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,2 &amp; mgr; M F-Aktin inkubiert. Die Proben wurden zentrifugiert und die resultierenden Pellets wurden analysiert ( Fig. 1A ). Wie erwartet, wurde der αE-Catenin-Homodimer mit F-Aktin über dem Hintergrund co-sedimentiert (Abbildung 1A , Vergleich der F-Aktin-Pelletproben mit dem No-F-acZinnpelletproben). BSA wurde als Negativkontrolle ausgeführt ( Abbildung 1B ). Das gebundene Protein wurde quantifiziert und über freies Protein aufgetragen, um die Affinität der Wechselwirkung zu berechnen (Abbildung 1C ). Die geplante Daten passen am besten zu einer Hill-Gleichung. Das berechnete K d betrug 2,9 &amp; mgr; M, das B max betrug 0,2 und der Hill-Koeffizient (h) betrug 4,8. Somit bindet das αE-Catenin-Homodimer F-Actin kooperativ mit einer geringen mikromolaren Affinität, konsistent mit früheren Arbeiten (ein Kd von 2,9 &amp; mgr; M gegenüber &amp; ndash; 1,0 &amp; mgr; M) 11 . <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> Abbildung 1: Hochgeschwindigkeits-F-Aktin-Co-Sedimentationstest ( A ) Zunehmende Konzentrationen (0,125-12,0 μM) des αE-Catenin-Homodimers wurden mit (linken Tafeln) oder ohne (rechte Tafeln) mit 0,2 &amp; mgr; M F-Aktin, stabilisiert mit Phalloidi, inkubiertN. Sie wurden für 30 min bei RT inkubiert und zentrifugiert. Die Gesamtmenge (7,5% des Ausgangsmaterials) und das pelletierte Material (50% des pelletierten Materials) wurden durch SDS-PAGE getrennt und mit Coomassie-Farbstoff gefärbt. ( B ) 4 &amp; mgr; M BSA wurde als Negativkontrolle durchgeführt. Gesamt- und Pelletproben mit (+) oder ohne (-) F-Aktin wurden durch SDS-PAGE getrennt und mit Coomassie-Farbstoff gefärbt. ( C ) Das gebundene αE-Catenin (μM / μM Actin) aus A wurde gegen freies αE-Catenin (μM) aufgetragen und die Daten passen zu einer Hill-Gleichung (rote Linie). Der K d , B max und der Hill-Koeffizient (h) sind aufgeführt. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> Abbildung 2: Aktin-Pelletierung Quantifizierung </sTrong&gt; - Flussdiagramm In diesem Schema werden die wichtigsten Schritte in Abschnitt 5 mit Beispielen für Total- und Pelletproben ( A , CE ) und der zur Quantifizierung verwendeten Standardkurve ( B ) erläutert. 5.13 Schritte: 1 ) Messen Sie die Menge des Proteins von Interesse in den Gesamtproben (A). 2 ) Erzeugen Sie eine Standardkurve, indem Sie die Bandintensität gegenüber der Proteinmasse (B) aufzeichnen. 3 ) Messen Sie die Menge an Interesse von Interesse, die mit F-Aktin ( C ) co-sedimentiert wurde . 4 ) Messen Sie die Menge an Interesse von Interesse, die in Abwesenheit von F-Aktin ( D ) pelletiert. 5 ) Subtrahieren Sie D von C, um die Menge an Protein zu bestimmen, die an F-Actin gebunden ist. 6 ) Messen Sie die Menge an F-Aktin in jedem Pellet (E), berechnen Sie die durchschnittliche Menge an F-Aktin pro Probe und teilen Sie jede Probe mit dem Durchschnitt (die Zahlen unten zeigen das Verhältnis). 7 )Für jede Probe teilen Sie die Menge an gebundenem Protein (berechnet in Schritt 5) durch das F-Aktin-Pellet-Verhältnis (berechnet in Schritt 6), um die Unterschiede im Pellet einzustellen. 8 ) Verwenden Sie die Standardkurve ( B ), um die Menge (Masse) des normalisierten gebundenen Proteins in jeder Probe zu berechnen (Schritt 7). 9 ) Bestimmen Sie die Konzentration von freiem Protein und gebundenem Protein, um eine Bindungskurve zu erzeugen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, um die Fähigkeit eines Proteins zu testen, mit filamentösem Actin (F-Aktin) zu coedimieren und, falls die Bindung beobachtet wird, die Affinität der Wechselwirkung zu messen.

Messung der Proteinbindung an F-Aktin durch Co-Sedimentation

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

measuring-protein-binding-to-f-actin-by-co-sedimentation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

16.4K Aufrufe.  University of Pittsburgh School of Medicine.  Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, um die Fähigkeit eines Proteins zu testen, mit filamentösem Actin (F-Aktin) zu coedimieren und, falls die Bindung beobachtet wird, die Affinität der Wechselwirkung zu messen. 

Serie: Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is necessary to characterize it at the structural and mechanistic level. Several biochemical and biophysical methods exist for such purpose. Among them, fluorescence anisotropy is a powerful technique particularly used when the fluorescence intensity of a fluorophore-labeled protein remains constant upon protein-protein interaction. In this technique, a fluorophore-labeled protein is excited with vertically polarized light of an appropriate wavelength that selectively excites a subset of the fluorophores according to their relative orientation with the incoming beam. The resulting emission also has a directionality whose relationship in the vertical and horizontal planes defines anisotropy (r) as follows: r=(IVV-IVH)/(IVV+2IVH), where IVV and IVH are the fluorescence intensities of the vertical and horizontal components, respectively. Fluorescence anisotropy is sensitive to the rotational diffusion of a fluorophore, namely the apparent molecular size of a fluorophore attached to a protein, which is altered upon protein-protein interaction. In the present text, the use of fluorescence anisotropy as a tool to study protein-protein interactions was exemplified to address the binding between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor like-1 GTPase (EFL1). Conventionally, labeling of a protein with a fluorophore is carried out on the thiol groups (cysteine) or in the amino groups (the N-terminal amine or lysine) of the protein. However, SBDS possesses several cysteines and lysines that did not allow site directed labeling of it. As an alternative technique, the dye 4&#39;,5&#39;-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein was used to specifically label a tetracysteine motif, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetically engineered in the C-terminus of the recombinant SBDS protein. Fitting of the experimental data provided quantitative and mechanistic information on the binding mode between these proteins.

Protein interactions are at the heart of a cell&#39;s function. Calorimetric and spectroscopic techniques are commonly used to characterize them. Here we describe fluorescence anisotropy as a tool to study the interaction between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor-like 1 GTPase (EFL1).

Fluoreszenzanisotropiemessungen als Werkzeug Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Forschung

Biochemie

Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and under physiological conditions. This makes AUC a method of choice to quantitatively assess stoichiometry and thermodynamics of homo- and hetero-association that are transient and reversible in biochemical processes. In the modality of sedimentation equilibrium (SE), a balance between diffusion and sedimentation provides a profile as a function of radial distance that depends on a specific association model. Herein, a detailed SE protocol is described to determine the size and monomer-monomer association energy of a small membrane protein oligomer using an analytical ultracentrifuge. AUC-ES is label-free, only based on physical principles, and can be used on both water soluble and membrane proteins. An example is shown of the latter, the small hydrophobic (SH) protein in the human respiratory syncytial virus (hRSV), a 65-amino acid polypeptide with a single &#945;-helical transmembrane (TM) domain that forms pentameric ion channels. NMR-based structural data shows that SH protein has two protonatable His residues in its transmembrane domain that are oriented facing the lumen of the channel. SE experiments have been designed to determine how pH affects association constant and the oligomeric size of SH protein. While the pentameric form was preserved in all cases, its association constant was reduced at low pH. These data are in agreement with a similar pH dependency observed for SH channel activity, consistent with a lumenal orientation of the two His residues in SH protein. The latter may experience electrostatic repulsion and reduced oligomer stability at low pH. In summary, this method is applicable whenever quantitative information on subtle protein-protein association changes in physiological conditions have to be measured.&#160;&#160;

Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

Sedimentationsgleichgewicht eines Klein Oligomer bildenden Membrane Protein: Wirkung von Histidin Protonierung auf pentamere Stabilität

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

Chemie

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Biologie

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

From a 2DE-Gel Spot to Protein Function: Lesson Learned From HS1 in Chronic Lymphocytic Leukemia

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a consequence, for the clinical management of patients. In the present work we will describe an optimized proteomic approach for the identification of molecules involved in the progression of Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). In detail, leukemic cell lysates are resolved by 2-dimensional Electrophoresis (2DE) and visualized as &#8220;spots&#8221; on the 2DE gels. Comparative analysis of proteomic maps allows the identification of differentially expressed proteins (in terms of abundance and post-translational modifications) that are picked, isolated and identified by Mass Spectrometry (MS). The biological function of the identified candidates can be tested by different assays (i.e. migration, adhesion and F-actin polymerization), that we have optimized for primary leukemic cells.

Here we describe a protocol that couples two proteomic techniques, namely 2-dimensional Electrophoresis (2DE) and Mass Spectrometry (MS), to identify differentially expressed/post-translational modified proteins among two or more groups of primary samples. This approach, together with functional experiments, allows the identification and characterization of prognostic markers/therapeutic targets.

Von einem 2DE-Gel-Spot die Proteinfunktion: Lektion gelernt von HS1 in chronischer lymphatischer Leukämie

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a ...

Medizin

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different tags, truncations, deletions, fusion partner insertions, and stabilizing mutations to find one that is not aggregated after extraction from the membrane. Furthermore, buffer screening to determine the detergent, additive, ligand, or polymer that provides the most stabilizing condition for the membrane protein is an important practice. The early characterization of membrane protein quality by fluorescent size exclusion chromatography provides a powerful tool to assess and rank different constructs or conditions without the requirement for protein purification, and this tool also minimizes the sample requirement. The membrane proteins must be fluorescently tagged, commonly by expressing them with a GFP tag or similar. The protein can be solubilized directly from whole cells and then crudely clarified by centrifugation; subsequently, the protein is passed down a size exclusion column, and a fluorescent trace is collected. Here, a method for running FSEC and representative FSEC data on the GPCR targets sphingosine-1-phosphate receptor (S1PR1) and serotonin receptor (5HT2AR) are presented.

The present protocol describes a procedure to perform fluorescent size exclusion chromatography (FSEC) on membrane proteins to assess their quality for downstream functional and structural analysis. Representative FSEC results collected for several G-protein coupled receptors (GPCRs) under detergent-solubilized and detergent-free conditions are presented.

Schnelle Beurteilung der Qualität von Membranproteinen durch Fluoreszenzgrößenausschlusschromatographie

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals and starch in plants. The crystal structures of glucan phosphatase with model glucan substrates reveal distinct glucan-binding interfaces made of DSP and carbohydrate-binding domains. However, quantitative measurements of glucan-glucan phosphatase interactions with physiologically relevant substrates are fundamental to the biological understanding of the glucan phosphatase family of enzymes and the regulation of energy metabolism. This manuscript reports a Concanavalin A (ConA)-based in vitro sedimentation assay designed to detect the substrate binding affinity of glucan phosphatases against different glucan substrates.&#160;As a proof of concept, the dissociation constant (KD) of glucan phosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) and amylopectin was determined. The characterization of SEX4 mutants and other members of the glucan phosphatase family of enzymes further demonstrates the utility of this assay to assess the differential binding of protein- carbohydrate interactions. These data demonstrate the suitability of this assay to characterize a wide range of starch and glycogen interacting proteins.

This method describes a lectin-based in vitro sedimentation assay to quantify the binding affinity of glucan phosphatase and amylopectin. This co-sedimentation assay is reliable for measuring glucan phosphatase substrate binding and can be applied to various solubilized glucan substrates.

Concanavalin A-basierter Sedimentationsassay zur Messung der Substratbindung von Glucanphosphatasen

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a dynamic network at the surface of the cell, organelle, or bacterium. The biochemical and mechanical basis of force production during this process can be studied by reproducing actin-based movement in an acellular manner on inert surfaces such as beads that are functionalized and incubated with a controlled set of components. Under the appropriate conditions, an elastic actin network assembles at the bead surface and breaks open due to the stress generated by network growth, forming an "actin comet" that propels the bead forward. However, such experiments require the purification of a host of different actin-binding proteins, often putting them beyond the reach of non-specialists. This article details a protocol for reproducibly obtaining actin comets and motility of beads using commercially available reagents. Bead coating, bead size, and motility mixture can be altered to observe the effect on bead speed, trajectories, and other parameters. This assay can be used for testing the biochemical activities of different actin-binding proteins, and for performing quantitative physical measurements that shed light on active matter properties of actin networks. This will be a useful tool for the community, enabling the study of in vitro actin-based motility without expert knowledge in actin-binding protein purification.

This protocol describes how to produce actin comets on the surfaces of beads using commercially available protein ingredients. Such systems mimic the protrusive structures found in cells, and can be used to examine physiological mechanisms of force production in a simplified way.

Rekonstitution der Aktin-basierten Motilität mit kommerziell erhältlichen Proteinen

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a ...

Biotechnik

FtsZ Polymerization Assays: Simple Protocols and Considerations

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long filaments in the presence of GTP in vitro, and polymerization is regulated by several accessory proteins. FtsZ polymerization has been extensively studied in vitro using basic methods including light scattering, sedimentation, GTP hydrolysis assays and electron microscopy. Buffer conditions influence both the polymerization properties of FtsZ, and the ability of FtsZ to interact with regulatory proteins. Here, we describe protocols for FtsZ polymerization studies and validate conditions and controls using Escherichia coli and Bacillus subtilis FtsZ as model proteins. A low speed sedimentation assay is introduced that allows the study of the interaction of FtsZ with proteins that bundle or tubulate FtsZ polymers. An improved GTPase assay protocol is described that allows testing of GTP hydrolysis over time using various conditions in a 96-well plate setup, with standardized incubation times that abolish variation in color development in the phosphate detection reaction. The preparation of samples for light scattering studies and electron microscopy is described. Several buffers are used to establish suitable buffer pH and salt concentration for FtsZ polymerization studies. A high concentration of KCl is the best for most of the experiments. Our methods provide a starting point for the in vitro characterization of FtsZ, not only from E. coli and B. subtilis but from any other bacterium. As such, the methods can be used for studies of the interaction of FtsZ with regulatory proteins or the testing of antibacterial drugs which may affect FtsZ polymerization.

Polymerization of FtsZ is essential for bacterial cell division. In this report, we detail simple protocols to monitor FtsZ polymerization activity and discuss the influence of buffer composition. The protocols can be used to study the interaction of FtsZ with regulatory proteins or antibacterial drugs that affect FtsZ polymerization.

FtsZ Polymerisation Assays: Einfache Protokolle und Überlegungen

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long ...

Lebendzell-Einzelmolekül-Imaging-basierte Quantifizierung von Proteininteraktionen

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number of cellular functions. Characterizing LLPS in live cells is also important because aberrant condensation has been linked to numerous diseases, including cancers and neurodegenerative disorders. LLPS is often driven by selective, transient, and multivalent interactions between intrinsically disordered proteins. Of great interest are the interaction dynamics of proteins participating in LLPS, which are well-summarized by measurements of their binding residence time (RT), that is, the amount of time they spend bound within condensates. Here, we present a method based on live-cell single-molecule imaging that allows us to measure the mean RT of a specific protein within condensates. We simultaneously visualize individual protein molecules and the condensates with which they associate, use single-particle tracking (SPT) to plot single-molecule trajectories, and then fit the trajectories to a model of protein-droplet binding to extract the mean RT of the protein. Finally, we show representative results where this single-molecule imaging method was applied to compare the mean RTs of a protein at its LLPS condensates when fused and unfused to an oligomerizing domain. This protocol is broadly applicable to measuring the interaction dynamics of any protein that participates in LLPS.

Autor im Rampenlicht: Bewertung der Protein-Kondensat-Dynamik in lebenden menschlichen Zellen

Many intrinsically disordered proteins have been shown to participate in the formation of highly dynamic biomolecular condensates, a behavior important for numerous cellular processes. Here, we present a single-molecule imaging-based method for quantifying the dynamics by which proteins interact with each other in biomolecular condensates in live cells.

Einzelmolekülmessung der Proteininteraktionsdynamik in biomolekularen Kondensaten

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...