Research in Ansari lab was supported by the research grant (No. MCB 1020911) from National Science Foundation.

注：このメソッドはMedler、Sおよびアンサリ、A 2で報告された研究論文で使用されました。 1.培養および収穫細胞<ol><li>新たに画線サッカロマイセス・セレビシエプレートからYPD培地中の細胞の5mLの培養を開始する（を10g / L酵母抽出物が20g / Lペプトン、2％デキストロース）。 </li><li> 30℃、250 rpmでオービタルシェーカーで一晩細胞を増殖させます。 </li><li> 250mLのバッフル付きフラスコ中のYPD培地中で100mLの最終容量まで一晩成長させた培養物を100倍に希釈します。 注：文化の100ミリリットルの合計は、TROの反応ごとに必要とされています。複数の反応が必要な場合は、文化の大容量を使用する必要があります。 </li><li> 600 nmの（ - 1.0 600〜0.8）で1.0から0.8の光学密度に細胞を増殖させます。 </li><li>滅菌した50 mLのコニカルチューブ中で4℃で5分間、820×gでの遠心分離によって細胞を回収。 </li><li>氷冷TMN府の10 mLの細胞を再懸濁ffer（10mMのトリス-HCl pH7.5で、5mMのMgCl 2、100mMのNaCl）と氷上で5分間インキュベートします。 </li><li>細胞をペレット化するために4℃で5分間、820×gで遠心分離します。静かに吸引して上清を除去します。 </li></ol> 2.透過性にして、Run-上のアッセイのための細胞を準備<ol><li>切り捨てられたP 千チップを用いて穏やかに上下にピペッティングし、0.6％のサルコシル溶液1mLで細胞を再懸濁します。チルド1.5 mLのマイクロ遠心チューブに細胞懸濁液を転送します。 </li><li>プラットフォームシェーカー上で25分間、4℃で穏やかに細胞を振ります。 注：微量遠心チューブは、この段階でプロモーターで生じる新しい開始事象の可能性を回避し、低温を維持するために氷で50 mLコニカルチューブに充填されるべきです。 </li><li>卓上冷却遠心機を用いて4℃で6分間、1200×gで細胞を遠心。 </li><li>静かあたりから余分な液体を除去するために上清を吸引細胞ペレットをmeabilized。 </li></ol> 3.転写ランオンの反応<ol><li>転写ランオンバッファの150μLを加える（50 mMトリス-塩酸pHが7.5、100のKCl、10mMのMgCl 2を、2 mMのDTT（ジチオスレイトール）、0.75 mMのATP、CTP、GTP、およびBrUTP、200 UのRNaseの各透過性細胞ペレットに対する阻害剤）。 </li><li>ピペッティングによって切り捨てられたP 200チップを用いてダウン穏やかに混合します。 注：複数のサンプルを処理する場合は、すべてのサンプルが準備が整うまで氷上にすべてを保持し、次のステップに進みます。 </li><li>水浴中で30℃で5分間インキュベートします。 注：新生RNAにBrUTPの最適な取り込みを確実にするために1〜5分の間のインキュベーション時間を調整します。 </li><li>冷たいすぐに使用できるRNA単離試薬500μLを加えて反応を停止します。室温で5分間インキュベートします。 </li></ol> 4. RNA抽出<ol><li>セルsuspensiに酸洗浄ガラスビーズの200μLを追加（ステップ3.4）に、ボルテックスミキサーで4℃で20分間激しく振ります。 </li><li>ホット22 G針を使用して、マイクロチューブの底に穴を開け、15-mLの滅菌コニカルチューブの上に置きます。 </li><li>細胞溶解物を収集するために4℃で1分間、300×gで遠心分離します。 1.5 mLのマイクロ遠心チューブに細胞溶解物を転送します。 </li><li>細胞溶解物に冷たいRNA単離試薬とクロロホルムの200μLの500μLを追加します。 4℃で20分間、16168×gでボルテックスミキサーや遠心分離機上のコンテンツを混ぜます。 </li><li>新しいマイクロチューブに上部の水相を転送します。 </li><li> pHが4-5コールドフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールを等量の（：：24 1 125）を追加します。 4℃で15分間、16168×gでボルテックスミキサーや遠心分離機に激しく振ります。 </li><li>新しいマイクロチューブにRNAを含む上部の水相を転送します。繰り返しステップ4.6をさらに2回。 </li><li>最終的なRNAを含む水相に、5 MのNaCl STOCを追加0.3 Mの最終濃度は、RNAを沈殿させるために冷エタノールの3倍のボリュームを追加取得するにはKです。 <ol><li> 1時間または一晩-20℃でインキュベートします。 注： - 抗BrdUビーズは（ステップ5.3参照）、ブロッキングインキュベートされている間に4.11のステップ4.9を実行します。 </li></ol></li><li> 4℃で20分間、16168×gで遠心分離します。上清を除去し、DEPC（ジエチル）100μLの水でRNAペレットを再懸濁します。 </li><li>取り込まれていないBrUTPヌクレオチドからRNAを分離するために、RNA単離ミニキットを使用してください。 RNaseフリー水100μLを用いてカラムからRNAを溶出。 </li><li> 5分間65℃の水浴中でRNAをインキュベートした後、少なくとも2分間氷上に移します。 </li></ol> BrUTP標識RNAの5アフィニティ精製<ol><li> 3MのNaCl、0.2 MのNaH 2 PO 4：抗BrdUは、バッファ（20×SSPEを結合0.25×SSPE（ナトリウム生理食塩水リン酸EDTA）の500μLを追加し、ビーズを定住の25μLへ</sub&gt;、0.02 M EDTA、pHが7.4、1 mMのEDTA、0.05％のTween、37.5 mMのNaCl）で。 4℃で30秒、200×gで遠心分離し、上清を除去します。 </li><li>繰り返しステップ5.1 3回。 </li><li>ビーズを緩衝液（1×結合緩衝液、0.1％ポリビニルピロリドン、1mgの超高純度ウシ血清アルブミン（BSA））をブロッキングの500μLを加え、1穏やかに振る - プラットフォームシェーカー上で4℃で2時間。 </li><li>ステップ5.1で説明したように、結合緩衝液500μLでビーズをさらに2回洗浄します。 </li><li>ビーズに結合緩衝液400μLを加えます。 </li><li>ビーズに直接RNAの100μL（ステップ4.11から）を転送します。プラットフォームシェーカー上で4℃で2時間 - 穏やかが1振盪しながらインキュベートします。 </li><li>結合緩衝液500μL、低塩緩衝液の500μL（0.2×のSSPE、1 mMのEDTA、0.05％のTween）、高塩緩衝液500μL（0.25×SSPE、1 mMのEDTA、0.05％Tweenでビーズを順番に洗って、で回転100mMのNaCl）、および二回TET緩衝液（1×TE、0.05％のTween）の500μLと、各洗浄の間に4℃で30秒間、200×gで。 </li><li> 150μlので二回、順次ビーズからBrUTP標識したRNAを溶出し、一回の溶出緩衝液（20mMのDTT、150mMのNaCl、50mMのトリス-HCl pH7.5で、1mMのEDTA、0.1％SDS）200μlで、インキュベートすることにより清からビーズを分離するために、短いスピンに続いて水浴中で42℃で4分間。 </li></ol> BrUTP標識RNAの6降水<ol><li> BrUTPは、RNAを標識したアフィニティー精製に5 - pHが4冷たいフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（：：24 1 125）の500μLを追加します。 4℃で15分間16168×gでボルテックスミキサーや遠心分離機に混ぜます。 </li><li>新しいマイクロチューブに上部の水相を転送します。 </li><li> RNAを沈殿させ、0.3Mの最終濃度と冷エタノールの3倍の量を取得するために、5 M NaCl貯蔵を追加します。 </li><li> -20℃で一晩インキュベートします。 </li><li> 4℃で30分間16168×gで遠心分離することによって沈殿したRNAを収集します。&lt;/李&gt; <li>上清を除去し、10分間空気乾燥さペレットを許可します。 </li><li> DEPC水の26μLでRNAペレットを再懸濁します。 </li><li>分光光度計を用いて260nmの吸光度を測定することにより、最終RNA濃度を決定します。また、260/280比を決定します。 〜2の比率は、純粋なRNAサンプルを示します。 </li><li> cDNA合成のために必要とされるまで-80℃でアリコート中のRNAサンプルを保管してください。 </li></ol> BrUTP標識RNAの7.逆転写<ol><li> DEPC水を用いて100 ngの/μLにRNA濃度を調整します。各cDNA合成反応のためのRNA0.5μgのを使用してください。 注：RNA鋳型の濃度が最適なcDNA合成を達成するために、0.5から1.0μgのに変化してもよいです。 </li><li> 図3Aに示すように、ポリ（A）部位（終結部位）の下流に設計された複数のリバースプライマーを用いてRNAを逆転写。 </li><li>各逆転写反応には、RNAのtemplatμlの5を追加電子（0.5μgの）、1μLのdNTPミックス（各10mM）、リバースプライマーC、D、E、FまたはGの2μL（50μMずつ）とヌクレアーゼフリー水（ 図3Aを参照してください）。各チューブの最終反応容量は13μLです。 注：逆転写反応の数は、cDNA合成のために使用されるリバースプライマーの数に依存します。たとえば、ASC1のために5リバースプライマーを使用したため、5逆転写反応を設定しました。 cDNA合成のために使用される逆方向プライマーに基づいてC、D、E、F及びGのような管をラベル。 </li><li>任意の二次構造配座を除去するために5分間65℃でサーモサイクラー中でRNA鋳型、dNTP混合物およびプライマーを含有するチューブをインキュベートし、少なくとも2分間、4℃に冷却します。 </li><li> 1μLを加えるRNA鋳型とし、プライマー（ステップ7.4）を含む各チューブに転写酵素（200 U /μL）、4μLのバッファーと0.1 M DTTの2μLを逆転。上下静かにピペッティングで。 </li><li> 60分間42℃でサーモサイクラーで反応混合物をインキュベートすることによって、逆転写を実行します。 </li><li> 20分間65℃で逆転写酵素を不活性化します。 </li><li> -20℃でのcDNAを保存したり、次のステップに進みます。 </li></ol> cDNAの8.増幅<ol><li>ステップ7.8、1.0μLのフォワードプライマーB（10μM）、1.0μLから3.0μLのcDNAテンプレートを次のようにステップ7.8から（ASC1ためのC、D、E、FおよびG標識）各cDNA調製の増幅のためのPCR反応を行いますリバースプライマーCまたはDまたはEまたはFまたはG（10μM）、2.5μLの10×ポリメラーゼPCR緩衝液、0.5μLdNTPミックス（各10mM）、1.0μLのMgCl 2（2.5 mM）の、15.5μLのPCRグレードの水、および0.5 μL熱安定性ポリメラーゼ酵素。 注：5 1：1の範囲のcDNA鋳型の種々の希釈液100は、PCR産物の収率を最適化するためにテストされるべきです。単一のプロモーター近位フォワードプライマーは、cDNAを増幅するために使用されます異なるリバースプライマーを用いて得られました。例えば、プロモーターの近くに位置する単一の順方向プライマーBはASC1ためのCからGへの5逆方向プライマーと組み合わせて使用​​しました。 BC、BD、BE、BFおよびBGは、図3（a）に示すように、それぞれC、D、E、FおよびGとラベル付けチューブに使用しました。 </li><li>以下の熱サイクルパラメータを用いてPCRを実行します。1サイクルで2分間95°C（ポリメラーゼの活性化のためのホットスタート）、30から40サイクル30秒（変性）、15秒間54℃、95℃（アニーリング） 5分（最終伸長）のために、1分（伸長）のために68°C、および1サイクル68℃。 注：アニーリング温度は、使用する特定のプライマーに応じて変化し、伸長時間は、予想される生成物の大きさに依存して変化します。 </li><li>生成物の予想される大きさに応じて0.8％、1.5％、2％アガロースゲル上での電気泳動によりPCR産物を分離します。 </li><li>エルKaderi らに記載のようにPCR産物を定量化します。 、2012 11。 注：別の方法として、新生転写物の量を定量化するために、リアルタイムRT-qPCRの戦略を使用します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Birse, C. E., Minvielle-Sebastia, L., Lee, B. A., Keller, W., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+termination+of+transcription+to+messenger+RNA+maturation+in+yeast.">Coupling termination of transcription to messenger RNA maturation in yeast.</a> Science. 280 (5361), 298-301 (1998).</li><li>Medler, S., Ansari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+looping+facilitates+TFIIH+kinase-mediated+termination+of+transcription.">Gene looping facilitates TFIIH kinase-mediated termination of transcription.</a> Sci Rep. 5, 12586 (2015).</li><li>Richard, P., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+termination+by+nuclear+RNA+polymerases.">Transcription termination by nuclear RNA polymerases.</a> Genes Dev. 23 (11), 1247-1269 (2009).</li><li>Mischo, H. E., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disengaging+polymerase:+terminating+RNA+polymerase+II+transcription+in+budding+yeast.">Disengaging polymerase: terminating RNA polymerase II transcription in budding yeast.</a> Biochim Biophys Acta. 1829 (1), 174-185 (2013).</li><li>Porrua, O., Libri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+termination+and+the+control+of+the+transcriptome:+why,+where+and+how+to+stop.">Transcription termination and the control of the transcriptome: why, where and how to stop.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (3), 190-202 (2015).</li><li>Jacquier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+eukaryotic+transcriptome:+unexpected+pervasive+transcription+and+novel+small+RNAs.">The complex eukaryotic transcriptome: unexpected pervasive transcription and novel small RNAs.</a> Nat Rev Genet. 10 (12), 833-844 (2009).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+promoters+generate+pervasive+transcription+in+yeast.">Bidirectional promoters generate pervasive transcription in yeast.</a> Nature. 457 (7232), 1033-1037 (2009).</li><li>Neil, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+bidirectional+promoters+are+the+major+source+of+cryptic+transcripts+in+yeast.">Widespread bidirectional promoters are the major source of cryptic transcripts in yeast.</a> Nature. 457 (7232), 1038-1042 (2009).</li><li>Clark, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reality+of+pervasive+transcription.">The reality of pervasive transcription.</a> PLoS Biol. 9 (7), e1000625 (2011).</li><li>Goodman, A. J., Daugharthy, E. R., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+antisense+transcription+is+evolutionarily+conserved+in+budding+yeast.">Pervasive antisense transcription is evolutionarily conserved in budding yeast.</a> Mol Biol Evol. 30 (2), 409-421 (2013).</li><li>El Kaderi, B., Medler, S., Ansari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+between+genomic+loci+through+Chromosome+Conformation+Capture+(3C).">Analysis of interactions between genomic loci through Chromosome Conformation Capture (3C).</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 22, Unit22 15 (2012).</li><li>Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+RNA+sequencing+reveals+widespread+pausing+and+divergent+initiation+at+human+promoters.">Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters.</a> Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ここで使用される本鎖特異的TROプロトコルは、哺乳動物細胞12にGRO-のSeq（グローバルランオンシークエンシング）分析のために使用されるプロトコルから適応されました。我々は成功し、出芽酵母において新生転写を研究するためのプロトコルを変更しました。具体的には転写終結欠陥を分析するために、我々は、RNAの加水分解工程を取り除くことにより、更なるプロトコ?...

真核生物の転写サイクルは、次の3つの主要手順で構成されています。開始、伸長および終結。 RNAポリメラーゼIIによる転写の終結は、2つの異なる、相互に依存する手順3で構成されています。最初のステップは、テンプレートからの切断、ポリアデニル化およびmRNAの放出を伴う、とすぐにテンプレートからのポリメラーゼの離脱によってマーク第二段階が続きます。適切な終端は、転写の開始/再開時のポリメラーゼのリサイクルのため、下流の遺伝子の転写との干渉を防止するため、および広汎非コードRNA 4、5の転写を制限することによって、チェックで異常な転写を維持するために不可欠です。最近の進歩にもかかわらず、終了ははるかにRNAポリメラーゼII転写サイクルの少なくとも理解のステップです。信頼性の高い終端アッセイは、メカニズムを研究するために不可欠であるunderlyinin vivoでの RNAポリメラーゼIIによる転写のグラム終結。 実験的アプローチの数は、生理的条件下で活発に転写遺伝子に終止欠陥を検出するために使用されます。これらには、ノーザンブロット、終結因子チップ（クロマチン免疫沈降）、伝統的なTROアッセイが含まれます。これらの技術のそれぞれは、いくつかの利点と欠点を有します。伝統的なTROアッセイは、 インビボ 1 における転写終結の欠陥を検出するための最も信頼性の高い敏感なアプローチに使用されます。このアッセイは、細胞内の遺伝子の異なる領域に転写活性のポリメラーゼ分子を局在化します。通常の条件下では、アッセイは、厳密遺伝子（ 図1A）のプロモーター及びターミネーター領域との間で分配転写係合ポリメラーゼ分子を示します。不良終了時に、しかし、ポリメラーゼは、終了信号を読み取ることができません遺伝子（ 図1B）の3 &#39;末端の下流の領域で検出されます。 転写終結欠陥がプロモーター近位領域から開始センス転写ポリメラーゼの存在下で明らかにし、終了信号を読み取ることができないされ、 図に示すように、遺伝子の3 &#39;末端の下流の領域を転写続けます2A。真核生物のゲノムおよび遺伝子6、7、8、9、10の周りに圧倒的な普及意味で転写、ならびにアンチセンス方向を示す実現して、それはすぐに従来のTROアッセイは検出できないことが明らかになったポリメラーゼIF信号遺伝子の下流には、プロモーター、開始転写産物（ 図2A）またはSOMを開始した異常なRNAを表し、遺伝子またはターミネーター要素（ 図2B）、または遺伝子（ 図2C）の3 &#39;末端からアンチセンス方向のポリメラーゼ転写の下流の途中でewhere。観察されたリードスルーポリメラーゼ信号がプロモーターで開始さ拡張センスmRNAまたは検査中の遺伝子の下流を開始したアンチセンス転写物を表す場合は使用してBrUTPは、ここで説明する本鎖特異TROアッセイは、区別することができます。我々は成功した酵母2出芽における転写の終結でKin28キナーゼの役割を実証するために、このアプローチを使用しています。ここでのアプローチを採用我々はRna14は出芽酵母におけるASC1の転写の終結のために必要とされていることを示しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phenol -chloroform-isoamyl alcohol mixture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77619</td>
			<td>pH 4-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15596-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, human placenta</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0307S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BrdU beads</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32323AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protoscript II</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M03368L</td>
			<td>or an equivalent enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advantage 2 polymerase Mix</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>639201</td>
			<td>or an equivalent enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromouridine 5&#39; triphosphate sodium salt</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-214314A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0451AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td></td>
			<td>N0454AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td></td>
			<td>N0452AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>MC Labs</td>
			<td>UBSA-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asc1 B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AGATTCGTCGGTCACAAGTCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asc1 C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GAACTTTATACATATTCTTAGTT 
			AGCAGTC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asc1 D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TGTACATATGTATTTTCGCAGCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asc1 E</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GCCAAGGAGACTGAATTTAATG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asc1 F</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CTATGGAATGGGGGTTTTAAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asc1 G</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GGTTATGGCAGACATGCCAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5s cDNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AGATTGCAGCACCTGAGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217; 5s reverse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GGTTGCGGCCATATCTAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; 5s reverse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TGAGTTTCGCGTATGGTC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of termination of transcription using brutp-strand-specific transcription run-on (tro) approach

この原稿は、 インビボで転写終結欠陥を検出するためのプロトコルを記述しています。 BrUTPを使用して本鎖特異的TROプロトコルは、ここで説明する生理学的条件下で転写終結欠陥を分析するための強力な実験的アプローチです。伝統的なTROアッセイと同様に、転写終結欠陥1の指標として遺伝子の3 &#39;末端を越えて転写的に活性なポリメラーゼの存在に依存しています。これは、従来のTROアッセイで遭遇する二つの主要な問題を克服します。終結シグナルを読んポリメラーゼがプロモーター近位領域からの転写を開始したものであれば第一に、それを検出することができ、またはそれは単にどこか身体または3 &#39;内から非特異的に開始した広範囲に転写ポリメラーゼを表している場合遺伝子の末端。第二に、超えた場合に転写活性ポリメラーゼ信号を区別することができますターミネーター領域は、真に読み通しセンスmRNAの転写ポリメラーゼまたはターミネーターが開始非コードアンチセンスRNAの信号です。簡単に言えば、プロトコルは、精製された新生RNAを転写し、使用してcDNAを増幅する逆、指数関数的に増殖する酵母細胞を透過性BrUTPヌクレオチドの存在下で伸長するためにインビボで開始される転写を可能にする、親和性アプローチによってBrUTP標識RNAを精製することを含みますプロモーターと遺伝子2のターミネーター領域に隣接する鎖特異的プライマー。

転写終結欠陥を検出する際にBrUTP鎖特異TRO手続きの適用性を実証するために、我々はrna14-1と呼ばれるRNA14の終端不良、温度感受性変異株を使用していました。 RNAポリメラーゼIIによる転写の終結でRna14の役割が選択された遺伝子1のターミネーター近位領域でRNAを検出した伝統的なTROアッセイを用いて実証しました。非許容温度でrna14-1...

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Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

We describe a basic experimental approach for analysis of termination of transcription by RNA polymerase II in vivo using BrUTP by the strand-specific transcription run-on (TRO) approach in budding yeast. This protocol can be extended to study transcription termination by other RNA polymerases both in yeast and higher eukaryotes.

BrUTP本鎖特異的転写ランオン（TRO）のアプローチを使用した転写の終結の分析

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

analysis-termination-transcription-using-brutp-strand-specific

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

9.7K ビュー.  Wayne State University. We describe a basic experimental approach for analysis of termination of transcription by RNA polymerase II in vivo using BrUTP by the strand-specific transcription run-on (TRO) approach in budding yeast. This protocol can be extended to study transcription termination by other RNA polymerases both in yeast and higher eukaryotes. 

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In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process requires multi-subunit DNA-dependent RNA polymerase (RNAP) and a series of transcription factors that act to modulate the activity of RNAP during gene expression. Sequencing gel electrophoresis of radiolabeled transcripts is used to provide detailed mechanistic information on how transcription proceeds and what parameters can affect it. In this paper we describe the protocol to study how the essential elongation factor NusA regulates transcriptional pausing, as well as a method to identify an antibacterial agent targeting transcription initiation through inhibition of RNAP holoenzyme formation. These methods can be used a as platform for the development of additional approaches to explore the mechanism of action of the transcription factors which still remain unclear, as well as new antibacterial agents targeting transcription which is an underutilized drug target in antibiotic research and development.

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

in vitro転写アッセイおよび創薬への応用

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

遺伝学

Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

サイレージのメタゲノム解析

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. To assess the impact of PM on nuclear genetic integrity, structural chromosomal aberrations are scored in the metaphase spreads of mouse RAW264.7 macrophage cells. PM is collected from ambient air with a high volume total suspended particles sampler. The collected material is solubilized and filtered to retain the water-soluble, fine portion. The particles are characterized for chemical composition by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Different concentrations of particle suspension are added onto an in vitro culture of RAW264.7 mouse macrophages for a total exposure time of 72 hr, along with untreated control cells. At the end of exposure, the culture is treated with colcemid to arrest cells in metaphase. Cells are then harvested, treated with hypotonic solution, fixed in acetomethanol, dropped onto glass slides and finally stained with Giemsa solution. Slides are examined to assess the structural chromosomal aberrations (CAs) in metaphase spreads at 1,000X magnification using a bright-field microscope. 50 to 100 metaphase spread are scored for each treatment group. This technique is adapted for the detection of structural chromosomal aberrations (CAs), such as chromatid-type breaks, chromatid-type exchanges, acentric fragments, dicentric and ring chromosomes, double minutes, endoreduplication, and Robertsonian translocations in vitro after exposure to PM. It is a powerful method to associate a well-established cytogenetic endpoint to epigenetic alterations.

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

This protocol describes techniques for the quantification and characterization of chromosomal aberrations in vitro in RAW264.7 mouse macrophages after treatment with ambient air particulate matter.

使用周囲粒子状物質によって誘発される染色体異常の解析<em&gt;インビトロ</em&gt;システム

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

クロマチン免疫沈降法を用いたc-KITリガンドプロモーターの解析

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In bacteria, the impact of the genetic context on the function of a genetic element can be difficult to assess. Several mechanisms, including topological effects, transcriptional interference from neighboring genes, and/or replication-associated gene dosage, may affect the function of a given genetic element. Here, we describe a method that permits the random integration of a DNA element into the chromosome of Escherichia coli and select the most favorable locations using a simple growth competition experiment. The method takes advantage of a well-described transposon-based system of random insertion, coupled with a selection of the fittest clone(s) by growth advantage, a procedure that is easily adjustable to experimental needs. The nature of the fittest clone(s) can be determined by whole-genome sequencing on a complex multi-clonal population or by easy gene walking for the rapid identification of selected clones. Here, the non-coding DNA region DARS2, which controls the initiation of chromosome replication in E. coli, was used as an example. The function of DARS2 is known to be affected by replication-associated gene dosage; the closer DARS2 gets to the origin of DNA replication, the more active it becomes. DARS2 was randomly inserted into the chromosome of a DARS2-deleted strain. The resultant clones containing individual insertions were pooled and competed against one another for hundreds of generations. Finally, the fittest clones were characterized and found to contain DARS2 inserted in close proximity to the original DARS2 location.

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Here, the power of a transposon-mediated random insertion of a non-coding DNA element was used to resolve its optimal chromosomal position.

新規トランスポゾンを介したアプローチを使用してエシェリヒア属大腸菌DNA 要素の最適な染色体の場所の決定

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

転写因子の結合、細胞活性中に事象を表示する転写、翻訳、回転率のリアルタイム解析

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

真核生物の転写エラーのゲノム全体の監視

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to control gene expression. These regulatory proteins control gene expression either at the level of DNA (transcription) or at the level of RNA (pre-mRNA splicing, polyadenylation, mRNA transport, decay, and translation). Identification of regulatory sequences helps understand not only how a gene is switched on or off, but also which downstream genes are regulated by a particular regulatory protein. Here, we describe a one-step approach that allows saturation mutagenesis of a protein binding site in RNA. It involves doping DNA template with non-wild-type nucleotides within the binding site, synthesis of separate RNAs with each phosphorothioate nucleotide, and isolation of the bound fraction following incubation with protein. Interference from non-wild-type nucleotides results in their preferential exclusion from the protein-bound fraction. This is monitored by gel electrophoresis following selective chemical cleavage with iodine of phosphodiester bonds containing phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis or PTM). This single-step saturation mutagenesis approach is applicable to the characterization of any protein binding site in RNA.

Proteins that bind specific RNA sequences play critical roles in gene expression. Detailed characterization of these binding sites is crucial for our understanding of gene regulation. Here, a single-step approach for saturation mutagenesis of protein-binding sites in RNA is described. This approach is relevant for all protein-binding sites in RNA.

ホスホロチオエートを使用して RNA の結合蛋白質の新規飽和突然変異誘発方法: シングル ステップの特性

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth defects. The goal of this protocol is to quickly detect ZIKV in both human and mosquito samples. The current gold standard for ZIKV detection is quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR); reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) may allow for a more efficient and low-cost testing without the need for expensive equipment. In this study, RT-LAMP is used for ZIKV detection in various biological samples within 30 min, without first isolating the RNA from the sample. This technique is demonstrated using ZIKV infected patient urine and serum, and infected mosquito samples. 18S ribosomal ribonucleic acid and actin are used as controls in human and mosquito samples, respectively.

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

This protocol provides an efficient and low-cost method to detect Zika virus or control targets in human urine and serum samples or in mosquitoes by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). This method does not require RNA isolation and can be done within 30 min.

逆にジカと尿、血清、蚊のサンプルでハウスキーピング遺伝子の転写-ループ - Lamp 法 (RT ランプ) アッセイ

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and host cell proteins on viral DNA synthesis. Here we address the lack of a cell-based, high-coverage, and high-resolution assay that is capable of defining retroviral reverse transcription intermediates within the physiological context of virus infection. The described method captures the 3'-termini of nascent complementary DNA (cDNA) molecules within HIV-1 infected cells at single nucleotide resolution. The protocol involves harvesting of whole cell DNA, targeted enrichment of viral DNA via hybrid capture, adaptor ligation, size fractionation by gel purification, PCR amplification, deep sequencing, and data analysis. A key step is the efficient and unbiased ligation of adaptor molecules to open 3'-DNA termini. Application of the described method determines the abundance of reverse transcripts of each particular length in a given sample. It also provides information about the (internal) sequence variation in reverse transcripts and thereby any potential mutations. In general, the assay is suitable for any questions relating to DNA 3'-extension, provided that the template sequence is known.

Here we present a deep sequencing approach that provides an unbiased determination of nascent 3&#39;-termini as well as mutational profiles of single-stranded DNA molecules. The main application is the characterization of nascent retroviral complementary DNAs (cDNAs), the intermediates generated during the process of retroviral reverse transcription.

決定の 3' 末端と HIV-1 の間に初期の一本鎖のウイルス DNA 分子のシーケンスを逆に感染細胞における転写

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...