仕事はバイオ研究エクセレンス[助成金番号1P20GM109005]、国立航空宇宙局（NASA）[助成金番号NNX15AK32A]を通じてアーカンソースペースグラントコンソーシアムの保健センターの国立研究所、および労働安全のための国立研究所によって部分的にサポートされていました健康（NIOSH）[助成金番号2T420H008436]。著者は、この原稿を校正し、編集するためのクリストファーフェテスに感謝したいと思います。

1.粒子の収集と準備<ol><li> 高容量全浮遊粒子サンプラのキャリブレーション <ol><li>マスフローコントローラからサンプラーモータを取り外し、安定したAC電源（ 図1）にモーターを接続します。 注：フィルタは、この手順の間に使用されていません。 </li><li>サンプラーにキャリブレータオリフィスとトップローディングアダプタプレートをマウントします。空気の漏れが存在しないことを保証するために確実にトップローディングアダプタ押さえナットを締めます。サンプラーモータが通常の動作温度（約10〜15分）まで昇温することを可能にします。 </li><li>手で口にオリフィスと圧力タップの上に穴を覆うことにより、リークテストを実施します。空気をエスケープすることにより作られた甲高いスキール音を聞きます。この音が聞こえる場合はリークが存在しているとして、トップローディングアダプタ押さえナットを締め直してください。音が低い場合、漏出は、SYSの他のガスケットの一つの近くにありますテム。 </li><li>ゴム製の真空管とオリフィスの側の圧力タップに水の圧力計の一方の側を接続します。大気開放圧力計の反対側にしておきます。正確な測定値を確保するために、垂直方向に圧力計を保持します。連続流レコーダーの裏側をタップすると、ペンを中心に、正確な測定値を提供するのに役立ちます。 </li><li> 30〜60フィート/分（約ごとに5〜6フィート3 /分）から操作する流量を表す5の流量を使用して手順を繰り返し1.1.2。 5の異なる位置に可変オリフィス上のノブを調整し、5別の読み取りを行います。 </li><li>認定最後の日付、日付、サイトの場所、およびキャリブレーションシート上のオペレータのイニシャルと周囲の空気の温度、周囲気圧、サンプラーシリアル番号、オリフィスシリアル番号、オリフィススロープとインターセプトを記録します。 </li></ol></li><li> 総浮遊粒子サンプル収集および重量分析 <ol><li>ラップアルミホイルの二つの層8 &quot;×10&quot;の石英繊維フィルター。炉内に包まれたフィルタを置き、550℃に温度を設定。少なくとも4時間、フィルターを焼きます。炉クールにしようとフィルターを取得します。 CaCO 3でデシケーター中にフィルタを配置します。 </li><li> 10μgの精度の天秤でフィルタを計量。日中の測定3回繰り返します。個々の測定値は25μgの範囲内でなければなりません。これが達成されていない場合は、デシケーターに包まれたフィルタを返し、次の日の処理を繰り返します。 </li><li>避難所のふた（ 図2）を開きます。真鍮ボルトとワッシャーが邪魔にならないようにダウンスイングすることができ、4ウィングナットを緩めて、フィルターホルダーフレームを削除します。支援画面上に、粗いサイドアップ、アルミ箔からフィルタを展開し、慎重にそれを中心に清掃鉗子を使用しています。正しく画面にフィルタを合わせます。 </li><li>画面上にフレームを配置し、それを確保縁部での空気漏れを回避するために十分な圧力をかけながら真鍮ボルトとワッシャ。清潔な布でフィルターホルダーの周りの汚れの蓄積を拭いてください。慎重に避難所の蓋を閉じて固定します。 </li><li>すべてのコードが適切なコンセントのソケットに差し込まれており、送風機モータ圧力タップと連続流レコーダー間のチューブが接続されていることを確認します。 </li><li>流れレコーダーを準備します。ペン先を高め、新しいチャートを挿入するためにペンアームリフターを押し下げます。レコーダーのドライブハブにチャートのタブの位置を合わせ、ハブ上にグラフの中心を下げるために親指で押してください。チャート上の正しい時刻が時間インデックスポインタと位置合わせされるまで、ドライブハブを時計回りに回転させることで時間を設定します。 </li><li>手動サンプラーに切り替えて、収集を開始。それが正しくインキングされ、経過時間インジケータは、それが正常に動作していることを確認するために確認するためにレコーダーを監視します。 </li><li>サンプリング期間の終了時に、サンプラー、レコードをオフに時間が経過し、グラフを取得します。フィルタを公開するフレームを削除してください。ピンセットで端で静かに保持することによって支援画面から露出し、フィルタを削除します。サンプルは二回サンプルに触れるように縦にフィルタを折り、元のアルミホイルでそれをラップします。 </li><li>計量前に少なくとも24時間のCaCO 3とデシケーターにフィルタを保管してください。サンプリング後のフィルタの重量を測定するための手順を繰り返し1.2.2。ジップビニール袋にフィルタを配置し、分析まで-80℃に保管してください。 </li></ol></li><li> 収集した全浮遊粒子試料の分析 <ol><li>保存されているフィルタを取得し、アルミ箔を展開し、清潔なテフロン表面にフィルタを転送します。ピンセットやメスを使用して、フィルタの外側（白い）部分を切断して処分します。 <ol><li>次に、100ミリリットルのフラスコに0.5 &quot;×0.5&quot;の作品と場所片でフィルタをカット。超純水の50ミリリットルを追加します。超音波でフラスコを置きますバス、33±3 kHzで60分間超音波処理。 </li></ol></li><li>フィルターを100mlの丸底フラスコに0.45μmのポリプロピレンシリンジフィルターを介して抽出します。約5mlの抽出物をフラスコ中に残るまで50℃で圧力下で回転蒸発器装置を用いて水を蒸発させます。 <ol><li>既知重量の15ミリリットルの梨型フラスコに残った水を蒸発させます。乾燥抽出物の入ったフラスコを計量し、乾燥抽出物の質量を記録します。 </li></ol></li><li> 15分間超音波処理することによって、D 2 Oの400μlの乾燥サンプルを溶解し、5ミリメートルの標準的なNMR管に移します。未溶解物質を除去するために、室温で12,000×gで5分間遠心します。 </li><li> D 2 Oの300μlで繰り返しNMR管にNaN 3を10μlの1.4％（最終濃度：w / vの0.02％）を追加します。 NMRチューブ中のD 2 O（最終濃度0.258ミリモル）に総浮遊粒子（TSP）-d4（3.2 mg / mlで）を10μl（32μgの）を追加します。 </li><li>600.17 MHzで動作するNMR分光計を用いて、1 H NMRスペクトルを取得します。 <ol><li>三重共鳴凍結プローブにNMR管を挿入します。次の順序で機器を較正：ロック、曲、シム、90°パルス長較正及び受信ゲイン調整。 </li><li>デジタルクワッド検出モードで180の水選択パルス、8192スキャン、4ダミースキャン、8012.57ヘルツの掃引幅を使用して、1次元励起彫刻配列と25℃でのスペクトルを測定し、周波数は4.70 ppmに設定された水の信号抑制、1.70のオフセット秒の取得時間、32,768時間領域のデータポイント（TD）、1ミリ秒の持続時間の勾配（P16）、勾配後100μ秒回復遅延（D16）。 </li></ol></li><li> 1ヘルツ及び2（65,536データポイント）倍ゼロフィリングの線幅拡大を適用することによって、プロセス1 H NMRスペクトルを示します。手動相とベースラインを修正して、統合します。 0.0 ppmのTSP-d4のピークを設定します。 </li></ol></li></ol> 2.粒子暴露<ol><li> 文化を設定します <ol><li> （37℃）、10％ウシ胎児血清（FBS）およびペニシリン - ストレプトマイシン溶液（100 U / ml）を、0.25％トリプシン溶液とカルシウムマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水浴中（PBS）を含む暖かい完全増殖培地用培養開始前に少なくとも30分。 </li><li>培養されたRAW264.7細胞を含む、5％CO 2インキュベーターからT75フラスコを取り出し、予め温めておいた2mlのPBSで2回細胞を洗浄します。 </li><li>掻き取り、続いて予熱したトリプシン溶液1mlを使用して、組織培養容器の底から付着RAW264.7細胞を取り除きます。 </li><li>組織培養容器から細胞を収集し、繰り返しピペッティングにより単一細胞懸濁液を作ります。予め温めた完全培地での100mm組織培養皿中で8,000 / cm 2で（合計500,000個の細胞）の密度で、トリパンブルー及びプレートを有する細胞の数を数えます。 50,000個の細胞の最終濃度のために10ミリリットルにメディア音量を調整1mlあたり。 注：DNAメチル化解析も行われている場合、プレートの数を倍増。 </li><li> 37℃、バック、5％CO 2インキュベーター内で新たにメッキRAW264.7細胞を置き、24時間アタッチすることができます。 </li><li>また、安全キャビネット内で、フィルタリングの粒子を再懸濁します。例えば、5μg/ mlの治療用量のための滅菌PBS中の0.5mg / mlの濃度で粒子を希釈および5mg /50μg/ mlの治療用量についてmlで。希釈は、予め月まで調製し、-80℃で保存することができます。 </li></ol></li><li> 粒子状物質による治療 <ol><li> 5％CO 2インキュベーターから細胞を取り出し、細胞増殖、細胞形態、培養条件、および汚染の倒立顕微鏡を用いて10倍の倍率で確認してください。一つは、この段階では、少なくとも30％コンフルエントの細胞を持っていることを期待するべきです。 </li><li>無菌的には、滅菌ピペットを用いて培地を吸引し、2mlの37℃のPBSで培養容器を洗浄します2回完全にメディアおよび浮動または死んだ細胞を除去します。 </li><li>培養容器中の新鮮な培地と粒子状物質の予め決定された投与量を追加し、5％CO 2インキュベーター中、37℃で、所望の時間インキュベートします。本研究では、同時遺伝毒性およびepigenotoxic分析のために使用される露光と平行して72時間のPMでRAW264.7細胞を扱います。 注：細胞毒性は、負に細胞遺伝学的解析の品質に影響を与える可能性があります。したがって、そのような細胞毒性、DNAメチル化、ウエスタンブロッティング、または遺伝子発現分析のような付加的なアッセイは、典型的に処理された細胞上で実行されます。記載されているように細胞を露出させ、所望の特定のアッセイを進めます。経験の浅いユーザーはまた、CAを検出する能力をテストするために、メチルメタンなどのポジティブコントロールを含めることができます。 </li></ol></li></ol> 3.細胞遺伝学的アッセイ<ol><li> 中期で細胞を停止させる治療 <ol><li>そうコルセミドを温めますリューション30分間37℃の水浴中で（10 / mlの）。汚染の危険性を最小限に抑えるために安全キャビネットの下に70％アルコールで蓋を拭きます</li><li>完全に無菌的にメディアを取り出し、2ミリリットル予め温めておいたPBSで2回培養容器を洗います。 </li><li>予め温めておいた新鮮な培地を加える（2ミリリットルメディア/ 10 6細胞）を培養容器中のコルセミド溶液（5μL/ ml）を含む、2時間インキュベートします。 </li></ol></li><li> 細胞収穫 <ol><li> 30分間37℃に維持した水浴中に温かいトリプシン溶液とPBS。以降、このステップから、無菌状態を維持する必要はありません。 </li><li>完全にメディアを取り出し、2回2ミリリットル37°C PBSで培養容器を洗浄し、100ミリメートル皿またはT75フラスコのために予め温めておいたトリプシン溶液（通常は60ミリメートル培養皿またはT25フラスコのための2ミリリットルと4ミリリットルの必要なボリュームを追加）、および1分間37℃、バック、5％CO 2インキュベーター内で培養容器を配置します。 </li><li>ターク電子アウト培養容器を、スクレーパーを用いて細胞を剥離し、トリプシンの作用を停止するためにPBSの10ミリリットルを追加します。 </li><li>上下ピペット少なくとも10回15ミリリットルコニカル遠心管に単一細胞懸濁液と転送細胞を作るために。 </li><li>室温でのアウトスイング遠心機で5分間、400×gで遠心分離細胞懸濁液。 </li><li>上清を取り除き、穏やかなタッピングによって細胞ペレットを破る、PBSの10ミリリットルを追加し、再び5分間遠心します。 </li></ol></li><li> 低張処理および固定 <ol><li>少なくとも30分間、37℃の水浴中でプレ暖かい0.075 M塩化カリウム溶液。 </li><li>細胞ペレットを乱すことなく上清を除去し、PBSの約0.5ミリリットルを残します。 </li><li>静かに細胞ペレットを破壊し、P200のピペットを用いて、単一細胞懸濁液を作ります。 </li><li>穏やかに振盪しながら降下により予熱した塩化カリウム溶液ドロップの4ミリリットルを追加します。 </li><li>低張Pで細胞をインキュベート20分間37℃の水浴中otassium塩化物溶液。 </li><li> 1パート氷酢酸で3部品のメタノールを加えて、新鮮なacetomethanol液を作ります。室温で、この新たに調製した固定液を保管してください。 </li><li>低張処理した後、チューブに固定液の等量の（4 ml）を加え、穏やかにチューブを反転させて溶液を混合。 </li><li>室温で5分間、400×gで遠心分離し、上清を除去します。この段階の細胞ペレットのサイズが大きくなる時に、白っぽいより見えるようになります。 </li><li>上清を除去し、4ミリリットルに新鮮な固定液を追加し、室温で30分間保ちます。 </li><li> 5分間、400×gで遠心分離し、上清を除去し、4ミリリットルの固定液でさらに2回の洗浄を与えます。 </li></ol></li><li> クリーニングと中期スプレッドの準備をスライドさせ <ol><li> 30分間、10％の液体洗剤中に完全にスライドガラスを浸漬します。 </li><li> 30分間冷たいランニング水道水で十分にスライドを洗浄します。 </li><li>凛SEは完全に、界面活性剤を除去蒸留水に浸し、そして将来の使用のために冷蔵庫に保存するために蒸留水で3回スライドさせます。 注：使用が広がると中期の品質を増大させるの均一性を容易にする前に、スライドを清掃。 </li><li>チルド濡れたスライド上の10μlの細胞懸濁液をドロップし、それを室温で一晩乾燥を放送することを可能にします。 </li></ol></li><li> 染色および取り付け <ol><li> PBSの一部でギムザ染色液の一部を混合して50ミリリットルギムザ染色液を調製し、コプリンジャーに注ぎます。 </li><li> 20分間染色液でスライドを浸し。 </li><li>過剰な汚れを除去し、すぐにヘアドライヤーを使用してスライドを乾燥させるために、蒸留水でスライドを洗浄します。 </li><li>室温で一晩スライドを残します。 </li><li>媒体はゆっくりとスライド上に拡散することを可能にする、そっとマウンティング培地にカバースリップを置き、スライド上の封入剤の一滴を適用し、削除ペーパータオルで余分な培地。マウントされたスライドが前に移動、またはカバースリップの動きを回避するために、顕微鏡下での表示に少なくとも1時間乾燥することができます。 注意：このステップの間に気泡を形成することなく、慎重にカバースリップを配置することが重要です。気泡を除去するために過剰な熱の使用は推奨されません。 </li></ol></li><li> 顕微鏡観察および収差の種類 <ol><li>中期は良質の明視野顕微鏡を用いて100倍の倍率で広がるの構造のCAを調べます。 </li><li>少なくとも50〜100中期はCAの多数を誘導治療のために、各治療群スプレッドスコア。小さい効果サイズの場合、最大300の中期スプレッドの分析をお勧めします。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

細胞遺伝学的研究や数字や、主に中期スプレッド中の染色体の構造の顕微鏡分析は、様々な疾患の予後、リスク評価、および治療のための重要な情報を提供しています。現在では、細胞遺伝学的異常は、癌を含むいくつかの疾患の進行と開発にリンクされていることを十分に確立されています。現在までに、CAは、すべての主要な腫瘍タイプで発見されています。細胞遺伝学的改変16の様々なタイプを誘導することができる主要な外部危険因子の1 - CAは、自然に、またはそのような電離放射線（IR）のいずれかと外部または内部刺激によって生じる可能性があります。吸収された放射線量の評価でのCA助剤の分析（細胞遺伝学的、放射線生物学的線量推定と呼ばれます）。また、周波数及び特定の収差の種類の分析は、放射線の品質を決定する重要な情報は、17、18を吸収されています。細胞遺伝学的研究は、iの直接的な画像を提供しますDNA上の損傷剤のMPACT。これは、コメットアッセイなどの間接的な技術とは対照的です。しかし、細胞遺伝学的研究は、部分的には、多数のハンズオン関与のステップで、放射線の外分野での下で、利用されてきました。 PM中の有機炭素の存在への暴露に悪影響私たちの健康に影響することが知られているが、生物学的効果を報告し、いくつかの研究は、それらの組成物9を含みます。これは、彼らが唯一の化合物の非常に特定の種類毎時間の小さなサブセットのための洞察を提供しながら、労働集約型の抽出、加工、濃度、および誘導体化プロトコルを必要とし、高価で面倒なクロマトグラフィー法によるものです。また、プロトコルは、このように、追加のテストを行うことができず、元のサンプルの実質的な操作または破壊をもたらします。核磁気共鳴（NMR）分析の利点は、NMRは、非破壊的な方法であることが挙げられます。それは、STEの非常に限られた数を必要としますPS（400メガヘルツから900メガヘルツまで）分析前に（抽出、濃縮）、および高周波NMR機器は、すべてのコア施設内の大学、多くで利用可能であるかありません。大気エアロゾルNMR研究の包括的な見直しは、最近19を出版されました。最後に、構造情報とグループとの間の結合を提供する能力のため、NMRは、官能基の種類にデータを提供するようなFT-IR、UV、可視、及びラマン分光法などの他の分析方法よりも優れています。必要に応じて、PMの形態学的特徴付けは、走査電子顕微鏡を用いてNMR分析に加えて行うことができます。 でも、単一の場所から、PMの組成物は、一年の時間に応じて変化し得る収集しました。材料の十分な大きさの量が処理され、反復実験や相補性アッセイのために-80℃に維持されなければなりません。 3.1.3を介して2.1.1は、BIOSで無菌的に行うべきであるステップafetyキャビネット。汚染や危険にさらさ細胞形態が観察されている場合は、プロトコルの残りを続行しないでください。トリプシン処理時間は、細胞型に基づいて調整される必要があります。ここでは、マクロファージは非常に粘着性であり、私たちは1分間トリプシンとスクレーピングの組み合わせが最適に動作することを発見しましたが、ほとんどの細胞型のために5分間の作品のためだけではトリプシンいます。低張処理時間は、細胞の種類に応じて変化し、標準化する必要があります。コルセミドの用量および治療時間は、染色体の調製のための最も重要なパラメータです。過剰投与量は、細胞を死滅させるか、細胞周期を停止させることができます。ここではRAW264.7細胞のための条件を記載し、そして最適化は、他の細胞型のために必要とされます。この段階での理想的な条件を見つけるに失敗すると、悪の結果に影響を与え、分裂指数だけでなく、染色体の形態に影響を与える可能性があります。また、細胞遺伝学的分析の前にPMの細胞毒性のレベルを評価し、それに応じて投与量を選択することをお勧めします。 、in vitroでの毒性学的評価が用いられる細胞、露光大きさ、及び粒子濃度の種類によって制限されています。また、本研究では、PMの水溶性抽出物を利用し、したがって、細胞遺伝学的異常を引き起こす水不溶性種の可能性は考慮されないことがあります。他の制限は、「多型変異体」の存在と関連している - セントロメア領域および染色体の短腕の変動;いくつかの超顕微鏡または誤解されることがあり不可解な再配置と複雑な核型の存在。 ここでは、細胞遺伝学的分析の導入は、DNAへのPM誘発性損傷の識別を助けることができ、潜在的に、周囲のPMへの曝露による健康への影響の評価における予測エンドポイントとして働くことができることを示しています。本研究では、我々の知る限り、PMに応じて、CAを示すために、最初の1です。これらの結果の複製され、我々の調査結果を確認することが望ましいです。このプロトコルはまた、疑わしいDNA損傷剤のほぼすべてのタイプを評価するために適合させることができます。

主に、心肺疾患および肺癌1から、粒子状物質（PM）への曝露は、毎年300万人を超える過剰な死亡を引き起こすと推定されています。 PMへの曝露のレベルの増加に伴う肺癌リスクの増加が2が示されているように、実際に、PMは、国際がん研究機関（グループ1）によってヒトに発癌性として認識されました。興味深いことに、ほとんどすべての癌細胞は、数値および/または構造的染色体異常を保有します。粒状有機炭素は、その組成およびサイズ分布の排出量だけでなく、物理的、化学的変換に依存するバリアント、複雑で、不均一な混合物、です。これは、35-55（サイズのPM 2.5ミクロンと小さい）都市PM 2.5質量％と農村部と大陸背景PM 2.5質量3、4の60％以上から占めます。水溶性画分は、有機エアロゾル30〜90％を占めます。有機化合物の多数脂肪族炭化水素、多環芳香族炭化水素、ならびにそれらの酸素化及びニトロ化誘導体、脂肪族アルデヒドおよびアルコール、遊離脂肪酸およびその塩、ジ - カルボン酸、多官能性化合物、タンパク質、及びフミン状高分子（HULIS）の使用を含む、同定されています質量分析技術5-8と結合されたクロマトグラフィー法。これらの化合物は、このように有機炭素の大部分は9未知である、粒子状有機炭素未満の10〜20％を表します。 実験的証拠は、細胞毒性、酸化ストレス、および炎症はPM-関連する病理学的状態の発症に関与していることを示唆しています。それが最近示されたが、PMへの暴露はまた、 インビトロ系および 10-12ヒト被験体の両方の実験において、反復エレメントのDNAメチル化の変化を含む、エピジェネティックな変化の数になります。特に興味深いの効果がありますメジャーとマイナーの衛星 - - の染色体のセントロメアの周りのヘテロクロマチン領域に見出されているサテライトDNA上のPM。それは暴露12の後、少なくとも72時間を検出することができるようにこれらの効果は、本質的に永続的であり得ることが示されました。特にセントロメアの周りのDNAメチル化の変化は、衛星DNAのmRNA転写物の蓄積をもたらす細胞分裂の際に染色体の完全性を損なうことと、その後、病理学的状態13の様々な開発につながることがあります。 PMによって引き起こされるエピジェネティックな変化の終点としてCAの分析のための細胞遺伝学的アプローチの適用は、このように、非常に重要です。ここでは、マウスマクロファージRAW264.7モデルシステムを使用して、CAのインビトロでの曝露と分析で 、周囲のPM収集と準備のためのアプローチを報告しています。マクロファージは、吸入異物に対する防御の最初の行を含み、したがって、トンその細胞株を確立し、粒子毒物11、12、14、15の中で最も頻繁に使用されるモデルとして役立ちます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="726">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Total suspended particulate sampler</td>
			<td style="width:179px;">Tisch Environmental</td>
			<td style="width:119px;">TE-5170</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:261px;">Bruker Avance III NMR spectrometer&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">TopSpin 3.5/pl2 software</td>
			<td style="width:179px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:261px;">ACD/NMR Processor Academic Edition</td>
			<td style="width:179px;">ACD/Labs</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RAW264.7 murine macrophages</td>
			<td style="width:179px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:261px;">High glucose DMEM GlutaMAX media</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10569010</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:261px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15140163</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">25200056</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10010049</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:261px;">KaryoMAX Colcemid Solution in PBS</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15212012</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:261px;">KaryoMAX Potassium Chloride Solution</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10575090</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Methanol (HPLC)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A452N1-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Acetic Acid, Glacial</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1185-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:261px;">Decon Contrad 70 Liquid Detergent</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">04-355-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:261px;">Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-200733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Permount Mounting Medium</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Axio Imager 2</td>
			<td style="width:179px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of the ambient particulate matter-induced chromosomal aberrations using an in vitro system

粒子状物質（PM）への曝露は、核の遺伝物質を含む様々な細胞成分を損傷する恐れがあり、主要な世界的健康問題です。核遺伝的整合性にPMの影響を評価するために、構造的染色体異常は、マウスRAW264.7マクロファージ細胞の分裂中期スプレッドで採点されます。 PMは、大量の全浮遊粒子サンプラと周囲空気から収集されます。捕集された材料は、水溶性、微細な部分を保持するように可溶化し、濾過します。粒子は、核磁気共鳴（NMR）分光法による化学組成を特徴としています。粒子懸濁液の異なる濃度は、未処理対照細胞と一緒に、72時間の総露光時間のRAW264.7マウスマクロファージのインビトロ培養物に添加されます。露光の終了時に、培養は中期で細胞を停止させるコルセミドで処理されます。次いで、細胞を採取し、acetomethanolで固定低張液、Dで処理されていますガラススライド上ropped、最後にギムザ溶液で染色しました。スライドを明視野顕微鏡を用いて1,000倍の倍率で中期スプレッド構造的染色体異常（CAS）内を評価するために調べられます。 50〜100の中期スプレッドは、各処置群について採点します。この技術は、このような染色分型改、染色分型の交換、非中心フラグメント、二動原体とリング染色体、ダブル分、核内倍加、およびPMへの曝露後のin vitroでのロバートソン転座などの構造的染色体異常（CAS）の検出のために適合されています。エピジェネティックな変化に十分に確立された細胞遺伝学的エンドポイントを関連付けるために強力な方法です。

細心の注意は、TSPサンプラーの場所だけでなく、収集が行われる年の時間を選択する際に注意すべきです。化学組成並びに粒子のサイズは、実質的に結果に影響を与え得ます。収集した材料は、白色フィルタに対して表示されるはずです。正常マウスの中期スプレッドは40無動原染色体を持つことになります。技術の目標は、対対照処理細胞における染色体異常の割合の変化（またはその欠如）を実証することです。その変更は、次に（異常な染色体の数）の資格（異常の種類）を定量することができます。 正常マウスの分裂中期スプレッドは40無動原染色体（ 図3A）を持つことになります。 図3に示すように、粒子状物質を用いた治療は、このような染色分の休憩（3B）、無動原体断片（のように、さまざまなCAを誘導します<strオング&gt; 3C）、環状染色体（3D）、二動原体染色体（3E）、ダブル分（3F）、ロバートソン転座（3G）、および核内倍加（3H）。完全な結果を得るために、私たちの発表された研究12を参照してください。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54969/54969fig1.jpg" /> 図1.高容量総浮遊粒子（TSP）サンプラー。絵は、周囲の粒子を収集するために、都市部で屋根に設置TSPサンプラーを示しています。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54969/54969fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54969/54969fig2.jpg" /> 大量TSP Sを使用して、図2ロード石英ファイバーフィルター以下のコレクションampler。使用後は、TSPサンプラにインストールされているフィルタにクローズアップ。フィルタの色が白から灰色に変化していることに注意してください。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54969/54969fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54969/54969fig3.jpg" /> 粒子状物質の異なる濃度で処理した後、RAW264.7細胞において誘導される構造異常の異なるタイプの代表的な例を示す図3の顕微鏡写真。収差は、矢印で示されています。 （A）40末端動原体染色体を有する正常中期スプレッド、（B）染色分型ブレーク（CTB）、（C）無動原体断片（acentrics）、（D）環状染色体、（E）二動原体染色体（DIC）、（F）ダブル分（Dimn）、（ <stroNG&gt; G）ロバートソン転座、及び（H）核内倍加（重複染色体が一緒に保持されています）。オリジナルの倍率100X、スケールバー=5μmです。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54969/54969fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

このプロトコルは、周囲の空気の粒子状物質で処理した後、RAW264.7マウスマクロファージにおけるin vitroで染色体異常の定量および特徴付けのための手法について説明します。

使用周囲粒子状物質によって誘発される染色体異常の解析<em&gt;インビトロ</em&gt;システム

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

analysis-ambient-particulate-matter-induced-chromosomal-aberrations

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

8.6K ビュー.  University of Arkansas for Medical Sciences. このプロトコルは、周囲の空気の粒子状物質で処理した後、RAW264.7マウスマクロファージにおけるin vitroで染色体異常の定量および特徴付けのための手法について説明します。 

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In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process requires multi-subunit DNA-dependent RNA polymerase (RNAP) and a series of transcription factors that act to modulate the activity of RNAP during gene expression. Sequencing gel electrophoresis of radiolabeled transcripts is used to provide detailed mechanistic information on how transcription proceeds and what parameters can affect it. In this paper we describe the protocol to study how the essential elongation factor NusA regulates transcriptional pausing, as well as a method to identify an antibacterial agent targeting transcription initiation through inhibition of RNAP holoenzyme formation. These methods can be used a as platform for the development of additional approaches to explore the mechanism of action of the transcription factors which still remain unclear, as well as new antibacterial agents targeting transcription which is an underutilized drug target in antibiotic research and development.

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

in vitro転写アッセイおよび創薬への応用

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

遺伝学

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

複数の蛍光によるインター染色体安定型異常の検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（mFISH）と照射されたマウスにおけるスペクトル核型分析（SKY）

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

クロマチン免疫沈降法を用いたc-KITリガンドプロモーターの解析

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In bacteria, the impact of the genetic context on the function of a genetic element can be difficult to assess. Several mechanisms, including topological effects, transcriptional interference from neighboring genes, and/or replication-associated gene dosage, may affect the function of a given genetic element. Here, we describe a method that permits the random integration of a DNA element into the chromosome of Escherichia coli and select the most favorable locations using a simple growth competition experiment. The method takes advantage of a well-described transposon-based system of random insertion, coupled with a selection of the fittest clone(s) by growth advantage, a procedure that is easily adjustable to experimental needs. The nature of the fittest clone(s) can be determined by whole-genome sequencing on a complex multi-clonal population or by easy gene walking for the rapid identification of selected clones. Here, the non-coding DNA region DARS2, which controls the initiation of chromosome replication in E. coli, was used as an example. The function of DARS2 is known to be affected by replication-associated gene dosage; the closer DARS2 gets to the origin of DNA replication, the more active it becomes. DARS2 was randomly inserted into the chromosome of a DARS2-deleted strain. The resultant clones containing individual insertions were pooled and competed against one another for hundreds of generations. Finally, the fittest clones were characterized and found to contain DARS2 inserted in close proximity to the original DARS2 location.

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Here, the power of a transposon-mediated random insertion of a non-coding DNA element was used to resolve its optimal chromosomal position.

新規トランスポゾンを介したアプローチを使用してエシェリヒア属大腸菌DNA 要素の最適な染色体の場所の決定

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

In Vivoモデル システムとしてゼブラフィッシュを用いた DNA 複製タイミングのプロファイリング

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene expression, but whether looping is responsible for or a result of alterations in gene expression is still unknown. Until recently, how chromatin looping affects the regulation of gene activity and cellular function has been relatively ambiguous, and limitations in existing methods to manipulate these structures prevented in-depth exploration of these interactions. To resolve this uncertainty, we engineered a method for selective and reversible chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9). The dynamism of the CLOuD9 system has been demonstrated by successful localization of CLOuD9 constructs to target genomic loci to modulate local chromatin conformation. Importantly, the ability to reverse the induced contact and restore the endogenous chromatin conformation has also been confirmed. Modulation of gene expression with this method establishes the capacity to regulate cellular gene expression and underscores the great potential for applications of this technology in creating stable de novo chromatin loops that markedly affect gene expression in the contexts of cancer and development.

Chromatin looping plays a significant role in gene regulation; however, there have been no technological advances that allow for selective and reversible modification of chromatin loops. Here we describe a powerful system for chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demonstrated to selectively and reversibly modulate gene expression at targeted loci.

クロマチンのループ構造の再編を CRISPR 媒介

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel have been described. However, a method to measure the amount of additional animal activity induced through the exercise treatment has been lacking. The Rotating Exercise Quantification System (REQS) fills this need, providing a measure of animal activity for animals experiencing rotational exercise. This protocol details how to use the REQS to assess animal activity during rotational exercise and illustrates the type of data that can be generated. Here, we demonstrate how the REQS is used to measure sex- and strain-specific differences in exercise induced activity. The REQS can also be used to evaluate the impact of various other experimental parameters such as age, diet, or population size on exercise induced activity. In addition, it can be used to compare the efficacy of different exercise training protocols. Importantly, it provides an opportunity to standardize exercise treatments between strains, allowing the researcher to achieve equal amounts of activity between groups if needed. Thus, the REQS is a notable new resource for exercise biologists working with the Drosophila model system and complements existing exercise systems.

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

The Rotating Exercise Quantification System (REQS) can induce exercise in Drosophila melanogaster through rotation while simultaneously measuring the amount of activity performed by the animals. Here, we present a point-by-point protocol detailing how to measure activity levels of animals experiencing rotational exercise treatments using the REQS.

回転運動の定量化システム (リクエスト) を用いたキイロショウジョウバエの運動レベルの測定

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences is desired. We herein provide a detailed in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) protocol to study the RNA structural change in the presence of an experimental drug for spinal muscular atrophy (SMA), survival of motor neuron (SMN)-C2, and in exon 7 of the pre-mRNA of the SMN2 gene. In in vitro SHAPE, an RNA sequence of 140 nucleotides containing SMN2 exon 7 is transcribed by T7 RNA polymerase, folded in the presence of SMN-C2, and subsequently modified by a mild 2&#39;-OH acylation reagent, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). This 2&#39;-OH-NAI adduct is further probed by a 32P-labeled primer extension and resolved by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Conversely, 2&#39;-OH acylation in in-cell SHAPE takes place in situ with SMN-C2 bound cellular RNA in living cells. The pre-mRNA sequence of exon 7 in the SMN2 gene, along with SHAPE-induced mutations in the primer extension, was then amplified by PCR and subject to next-generation sequencing. Comparing the two methodologies, in vitro SHAPE is a more cost-effective method and does not require computational power to visualize results. However, the in vitro SHAPE-derived RNA model sometimes deviates from the secondary structure in a cellular context, likely due to the loss of all interactions with RNA-binding proteins. In-cell SHAPE does not need a radioactive material workplace and yields a more accurate RNA secondary structure in the cellular context. Furthermore, in-cell SHAPE is usually applicable for a larger range of RNA sequences (~1,000 nucleotides) by utilizing next-generation sequencing, compared to in vitro SHAPE (~200 nucleotides) that usually relies on PAGE analysis. In case of exon 7 in SMN2 pre-mRNA, the in vitro and in-cell SHAPE derived RNA models are similar to each other.

Detailed protocols for both in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) experiments to determine the secondary structure of pre-mRNA sequences of interest in the presence of an RNA-targeting small molecule are presented in this article.

MRNA の構造変化を誘導培養と細胞の形で使用して小分子を調査するには

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant viruses they vector. Despite numerous studies of the biology of these species in different environments, a key life history parameter, offspring sex ratios, has received little attention, yet is important for predicting population dynamics. The primary sex ratio (sex ratio at oviposition) of Bemisia tabaci has never been reported but can be found by determining the egg fertilization rate of this haplodiploid insect. The technique involves the dechorionation of eggs with bleach, a series of fixation steps, and the application of the general DNA fluorescent stain, DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole, a DNA-binding fluorescent dye), to bind to female and male pronuclei. Here, we present the technique, and an example of its application, to test whether an endosymbiotic bacterium, Rickettsia sp. nr. bellii, influenced the primary sex ratio of B. tabaci. This method may assist in population studies of whiteflies, or in determining if sex allocation exists with certain environmental stimuli.

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

We present a simple cytogenetic technique using 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) to determine the fertilization rate and primary sex ratio of the haplodiploid invasive pest Bemisia tabaci.

細胞遺伝学的手法を用いたタバココナジラミの卵の受精率を決定します。

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported for in vitro differentiation of keratinocytes cultured in two-dimensional (2D) submerged manners using various induction conditions. Described here is a procedure for 2D in vitro keratinocyte differentiation method by contact inhibition and subsequent molecular characterization by RNA-seq. In brief, keratinocytes are grown in defined keratinocyte medium supplemented with growth factors until they are fully confluent. Differentiation is induced by close contacts between the keratinocytes and further stimulated by excluding growth factors in the medium. Using RNA-seq analyses, it is shown that both 1) differentiated keratinocytes exhibit distinct molecular signatures during differentiation and 2) the dynamic gene expression pattern largely resembles cells during epidermal stratification. As for comparison to normal keratinocyte differentiation, keratinocytes carrying mutations of the transcription factor p63 exhibit altered morphology and molecular signatures, consistent with their differentiation defects. In conclusion, this protocol details the steps for 2D in vitro keratinocyte differentiation and its molecular characterization, with an emphasis on bioinformatic analysis of RNA-seq data. Because RNA extraction and RNA-seq procedures have been well-documented, it is not the focus of this protocol. The experimental procedure of in vitro keratinocyte differentiation and bioinformatic analysis pipeline can be used to study molecular events during epidermal differentiation in healthy and diseased keratinocytes.

Presented here is a stepwise procedure for in vitro differentiation of human primary keratinocytes by contact inhibition followed by characterization at the molecular level by RNA-seq analysis.

RNA-Seq解析によるヒト原発性角化細胞のインビトロ分化の特徴

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...