ペンシルベニア州立大学ミレニアム科学複雑な流れの Cytometry 中核施設に感謝したいと思います。

<ol>
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著者は明らかに利害の衝突があります。

病気の進行の分子メカニズムを理解するアテローム性動脈硬化、単純な脂肪肝、肝炎などの併存を模倣し、タイプ 2 の糖尿病の食事誘発代謝性疾患モデルが採用されます。コラゲナーゼの消化力依存は細胞外マトリックス (ECM)16,27から細胞を解放するために組織を分離するによく使用されます。コラゲナーゼなどの酵素は、隣接する細胞の構造的なサポートを提供するコラーゲンを混乱させます。組織の構造指示組織マトリックス剛性 (変形抵抗)、成功した ECM 混乱28を確保する上で最も効率的な粗コラゲナーゼ製品です。「ソフト ・ マトリックス」で構成されているワットはしばしば同時にセル表面のインスリン受容体29の整合性を維持しながら脂肪細胞と免疫細胞を解放するために II 型コラゲナーゼで消化されます。大動脈の線維成分のマイクロ アーキテクチャは、「硬いマトリックス」、その他酵素との組み合わせで使用する (最も高いコラゲナーゼ活性のある) XI 型コラゲナーゼと効果的な大動脈の消化力に貢献します。大動脈とは異なり、肝臓消化はマトリックスを混乱させると実行可能な実質および非実質細胞30を解放する弱い酵素活性、タイプ IV コラゲナーゼと、コラゲナーゼを使用します。慢性的な炎症を起こした組織は、適切な酵素の消化力を防ぐことができる背景は多くの場合改造を受ける C57BL6 のマウス野生型の食事供給またはアポリポ蛋白 E 欠損 (アポ島) から派生します。このセクションは、最小化および/または不適切な組織解離と低細胞回復の可能性を排除するための戦略について説明します。
肥満、動脈硬化症、および/または非アルコール性脂肪性肝疾患を模倣する食事供給のモデルマウス由来組織の共通の特徴は、異常組織の改造です。白色脂肪組織、大動脈および肝臓、コラーゲンなどの繊維成分の過剰沈着に ECM の構成は変更されます。野生型 C57BL6 マウス 18 週間高脂肪の食事を維持拡張白色脂肪組織などの組織固有の異常が発生して脂肪肝 (単純な脂肪肝) を拡大します。しばしばこれらの代謝機能は組織解離過程中に克服するために厄介な障害物です。その一方より悪化させた表現型をミラー化する他の食事誘発性モデルで組織の大規模な改造問題を提起できる組織消化中。アポ KO マウスを供給 HFHCD が頻繁に使用されるモデル アテローム性動脈硬化、肝炎。高度な肝炎に関連付けられている共通の特徴は、肝臓 (または線維症) の ECM の過度の沈着です。線維肝酵素組織解離中にかなり問題があることが示されているし、しばしば低細胞収量31が生成されます。細胞収率を高めるためには、偏りなく消化力のプロトコルに従う必要です。消化バッファーによる血液灌流が肝臓の細胞外マトリックスとコラゲナーゼ溶液との接触を最大化正常な肝臓をみじん切り、解離を達成するために、消化バッファーに浸漬することができます、・したがってこの方法は、強くお勧めします。さらに、20-30 mL の消化バッファーはしばしば; 正常な肝臓の正常な解離の十分なボリュームただし、肝臓の肥大や線維化を開発マウス モデルに関しては、細胞死を最小限に抑えながら適切な消化力を確保するための消化バッファーの 50 mL による血液灌流を好んだ。1.5 g を大幅に超えることの重みと肝臓、消化バッファーのボリュームを増やすことが正常な消化を保証する推奨されます。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>組織</td>
			<td>問題</td>
			<td>可能な理由</td>
			<td>ソリューション</td>
		</tr>
<tr>
<td>白色脂肪組織 (WAT)</td>
			<td>貧困層の細胞解離</td>
			<td>消化不良</td>
			<td>消化バッファーが 37 で確認° C</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>細胞死</td>
			<td>過度のコラゲナーゼの消化力</td>
			<td>消化の時間を短縮します。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>消化バッファーの量を減らす</td>
		</tr>
<tr>
<td>大動脈</td>
			<td>貧困層の細胞解離</td>
			<td>消化不良</td>
			<td>消化バッファーが 37 ° C であることを確認します。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>消化バッファーの大動脈部分が大きすぎます。</td>
			<td>大動脈は約 1 mm の部分にカットを確認してください。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>大動脈部分がない潜伏中に解離バッファーで揺れていた</td>
			<td>消化ソリューションで揺れている大動脈部分を必ず</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>細胞死</td>
			<td>過度のコラゲナーゼの消化力</td>
			<td>消化の時間を短縮します。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>消化バッファーの量を減らす</td>
		</tr>
<tr>
<td>肝臓</td>
			<td>貧困層の細胞解離</td>
			<td>消化不良</td>
			<td>消化バッファーが 37 ° C であることを確認します。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>消化バッファーの増加量</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>IVC (下大静脈周囲に発生します組織の腫れ) の不適切なカニュレーション</td>
			<td>下大静脈に針が正しく挿入されていることを必ず</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>破裂下大静脈</td>
			<td>灌流前に下大静脈に針を適切に保護します。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>血流の速度を減らす</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>破裂の組織</td>
			<td>血流の速度を減らす</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>細胞死</td>
			<td>不適切なリリース、グリソン鞘の細胞の</td>
			<td>前述メソッドをなでるカプセルを使用してから細胞を分離することを確認します。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>過度のコラゲナーゼの消化力</td>
			<td>消化の時間を短縮します。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>消化バッファーの量を減らす</td>
		</tr>
</tbody></table>テーブル 3: トラブルシューティング失敗した組織解離します。フローサイトメトリーによる細胞選別フローまたは FACS が細胞集団を隔離するための強力な技術高純度が必要であります。ときにセルを並べ替えることにより細胞を浄化、細胞の高も高純度の並べ替えを実現する適切な並べ替え方法を使用して必要があります。このセクションでマルチ蛍光体を改善する方法は、フローサイトメトリーを用いた細胞組織食飼育マウスから派生した居住者のマクロファージは、説明の並べ替えをフローします。異なる組織常駐マクロファージ分離表面マーカーの選択は重要なステップです。マクロファージに由来するワット、大動脈および肝臓がしばしば区別、CD45 を使用して+、CD11b+、F4/80+戦略をゲートします。追加のフロー フローサイト メーター パネルは、常在型マクロファージ組織を識別するために使用できます。これらのパネルは、マクロファージ特定の糖蛋白質 (CD64、CD68、および CD14)、主要組織適合性複合体 (動的) の発現を検出する抗体とアポトーシス細胞のチロシンのキナーゼ受容体 (MerTK) の32, 33. 特定の大食細胞の表現型は M2 の選択的な発現の調査によって、線引きできます (CD163、CD209、および CD206) または M1 マーカー (CD38、CD40、CD80、CD86)34,35。自動蛍光脂質荷を積んだ大食細胞によって生成されるは、集団をゲーティングといくつかの問題を提示できます。(PE、PE/Cy5 PE/Cy7 など) 黄緑色のレーザーで励起される蛍光色素が付いた抗体を使用してまたは (など APC の, APC Cy7) 赤色レーザー自動蛍光よりも著しく明るいは、放出される蛍光の結果、このように改善することができます。結果36。このような高い染色インデックスと潜在的な発光スペクトルの重複と共役 fluorophore を選択、適切なコントロールを含めることが重要です。単一染色 (SS) コントロールおよびアイソタイプ コントロールを含めることは、正/負の集団の描写とそれぞれ一次抗体によって引き起こされる非固有バック グラウンド信号の測定ゲートの境界を識別するとき37。 セルが不足している状況の SS およびアイソタイプ コントロールの補償粒子を使用してお勧めします。補償粒子は、通常生物学的コントロールよりも明るい信号を発する、また蛍光バック グラウンドで以下の差異があります。さらに、マイナス 1 つ (FMO) コントロールの蛍光は、ゲートの境界の輪郭を描くに最適です。FMO コントロールを含めるには、その特定の蛍光チャネルの螢光色素付き抗体が除外された38最大蛍光染色のサブセットに対する期待はチャンネルにで明らかにしました。単一の染色補正粒子コントロールに加えて、我々 の経験で無染色の生物学的比較制御をより正確な正/負の境界を設定するため記載します。
細胞残渣およびゲートの戦略で細胞凝集塊を除く自己蛍光を最小限に抑えるために使用される追加アプローチしています。実行可能な細胞集団から細胞の残骸を区別するには、前方散乱 (FSC) と側方散乱 (SSC) を使用して、最も一般的なゲート戦略です。記事並べ替え解析に使用する、DNA ・ RNA の抽出の高い生存率を必要とする隔離されたセルの固定および/または透過操作性汚れを使用しないことをお勧めします。ホルムアルデヒド固定細胞の核酸-タンパク質架橋による核酸の整合性を妥協でき、分離効率、検出、および正確な数量が制限されます。細胞凝集塊の前に述べたようにことはできません生成された自動蛍光信号に貢献するだけがまた「偶然を中止」.一種の高純度を維持するためにこのようなアクションが発生しますが、並べ替えられた細胞収量を減らす場合はあまりにも頻繁に。並べ替えバッファー (FACS) 細胞染色中に DNAse と MgCl2を添加した細胞凝集を最小化できます。それは酵素の活性を阻害すると、DNAse との組み合わせで EDTA を使用しないことをお勧めします。並べ替えの前に 70 μ m セル ストレーナーを介して単一細胞懸濁液をフィルタ リングも集計から細胞を解放できます。集計を抑える細胞懸濁液が最小限の量 0.4 mL の mL あたり 500 万セルの濃度にする必要があります注意してくださいすることが不可欠です。脂質荷を積んだ組織から分離した細胞は集計になりやすい傾向があり、この結果は偶然、中止され、低い収量。サンプルをさらに希釈する集計が解決しない場合は、それをお勧めします。並べ替えられた大食細胞は、細胞回復を最大化する胎児の牛の豊富な媒体を含んでいるポリプロピレンの丸底コレクション チューブで収集できます。濃度は、最終的に各ソートされた液滴と希釈になりますので、初期の高 FBS 濃度は細胞回復を保証します。DNA または RNA の解析に使用する細胞を採取、RNAse の混入を防ぐために適切な抽出試薬を (例えばTriZol) に直接セルを並べ替えることができます。高ボリュームをソートするには、セルを並べ替え最初政府短期証券のより低い集中を添加した培地にお勧めします。すぐに次の並べ替え、セル、ペレット、DNA ・ RNA 抽出分離します。遺伝子発現変化の分離の遺伝物質のプロファイルをすることができます。Tnf α など IL1 β、il-6、IL 12, 1 L 23、肝腎、Nos2、MCP1 プロ炎症性遺伝子 (CCL2) 出展古典的活性化 (M1) 表現型39マクロファージで亢進が多い。その一方で、表現型 (M2) または活性化マクロファージは頻繁に Chi3l3 をコードする遺伝子の誘導によりマーク (Ym1)、Fizz1、アルギナーゼ 1、CD206、CD163、CD209 1 L-10、および TGFβ34,40。最近、CD38、Fpr2 と Gpr18 は、M1 固有遺伝子 C-myc と M2 固有遺伝子34として Egr2 として検証されています。
マルチカラー フロー フローサイトメトリーを用いた細胞選別高純度でマクロファージを隔離するための貴重なツールですが、この方法は高価なことができます。FACS による並べ替えの強力な利点に加えて、細胞選別機メンテナンス用試薬の高費用のセルソーターを操縦できる運用担当者に依存しています。代替的なアプローチは、高価な流れフローサイトメトリーによる細胞選別の代わりに使用できます。磁気活性化細胞 (MAC) を並べ替えまたは密度勾配遠心法が含まれます。並べ替え方法を述べた最初の代替セル包含磁気および/または血または固体ティッシュ41から興味のセルを分離するマイクロ ビーズ列分離キット。アプローチを並べ替える 2 番目のセルは、密度と遠心力に基づく異種細胞懸濁液を分離します。残念ながら、密度を介した遠心分離は大動脈またはワットに派生した単一細胞懸濁液からの大食細胞を分離するため実用的ではありません。多くの場合、差動遠心分離から得られる製品が汚染されているし、低収量します。その結果、最初酵素の消化力の後いくつかのセルの結果 (大動脈またはワット) などより小さい組織は差動遠心分離のための理想的な候補者ではありません。一方、解離肝臓由来細胞懸濁液は、記事並べ替え実験と文化の刺激、qPCR、または西部のしみが付く分析などの解析で使用することができます並べ替えられた大食細胞の適切な数を作り出すことができます。これらの代替アプローチは、FACS、クリーナーのソートを可能にする前に人口を豊かにも使用できます。注記のうち、組織マクロファージは、ワット、肝臓、大動脈全体のセル人口の小さい割合を構成します。FACS 並べ替えする前に細胞の濃縮がそれほど頻繁にセルの人口を隔離するときに使用されるアプローチをされています。小集団に分離するが一般的である 1 つの問題は、大規模なセル番号は、その後の分析のための十分なセルを取得する処理が必要です。濃縮または事前の並べ替えは、このような問題を解決する使用できます。このメソッドは、正と負の選択をセルのより簡潔な人口を得ることでエイズが、FACS 並べ替え肝臓などの密なティッシュ ソースに永続的なプロセスをすることができます、それはまた時間の保全をことができます。
炎症の生物学の最近の進歩は、慢性的な炎症を調節するこれらの免疫細胞の複雑な役割の理解を促進するマクロファージの多様性の表現型および機能特性の重要性を強調表示します。簡単に言えば、この包括的なプロトコルは、マクロファージ組織 3 つの特徴から確立された食事誘発性肥満および炎症モデルで検討組織を特徴づけるに多次元的なアプローチを提供します。さらに重要なこの議定書、難易度を考慮ときれいな隔離措置単一細胞懸濁液調節不全からワット、大動脈のプラークや脂肪肝などの組織の炎症します。プロトコルでは、cytometry 流れと組織マクロファージ、肥満の主調整装置を特徴付けるための革新的な次元で FACS 並べ替えツールを適用する研究者をことができます。マクロファージの動態の詳細な特性評価は、単球の炎症を起こした組織に人身売買に洞察力を提供でき、ソートされたマクロファージに対する実験的アプローチの多くを継続的な機械論的評価を可能にします。マクロファージの個体群の更なる特性は、健康と病気におけるマクロファージの不均一性を規制する生物的基盤に重要な洞察力を提供できます。

マウス モデルは、人間の病気の研究に広く使用されています。病気の状態のマウスから常駐細胞の適切な分離は、病1の病態を分子・細胞の貢献を理解するためのプラットフォームを提供できます。重要です 1 つの障害は、肥満です。肥満の発生率は、インスリン抵抗性と並行世界的に上昇、タイプ 2 の糖尿病、心血管疾患、脂肪肝疾患2,3を継続します。過剰栄養摂取はさらに減らされた身体活動4大動脈および肝臓などの末梢組織の細胞環境を変更することができます脂肪組織から発せられる変更された信号をトリガーによって偏っています。代謝恒常性のような混乱は、慢性低学年全身性炎症5の結果します。
古典的活性化マクロファージの白色脂肪組織 (WAT) の募集と同様に大動脈および肝臓に居住者だけでなく代謝シグナルの調節不全を開始、また炎症6,7を維持する示されています。大食細胞の表現型および機能の多様性は肥満の病因に強く関連付けられている関連する併存7。マクロファージ偏波の動的塑性進行を調整するアクティブ化された表現型の範囲と炎症8の解像度を展示するこれらの細胞が可能です。一方、古典的活性化 (M1) マクロファージは炎症の進展に関与している、あるいはマクロファージ (M2) が解像度と組織修復9,10に関連付けられています。
体は代謝ストレスを受けると白色脂肪組織が異常蓄積されます。拡張の脂肪組織を引き付ける、インスリン抵抗性、高血糖、最終的に 2 型糖尿病、インスリン抵抗性や高血糖11を促進するために通常の脂肪細胞機能を深く変更炎症細胞を保持 12。並行して、白色脂肪組織改造によって解放の炎症性反応では古典的活性化 (M1) 脂肪組織マクロファージ (Atm)13,14を浸透させた。この多細胞器官は肝4大動脈などの他の臓器の正常な機能を derails シグナルのカスケードを発揮します。
肝臓は、近くの調節不全ワット15発刺激への応答の適応代謝パワーハウスです。肝マクロファージまたは代謝の変化に対応した、クッパー細胞実質の両方を変換する炎症性サイトカインと非実質細胞表現型を分泌して組織リモデリングを促進します。肝臓への脂肪蓄積、炎症、過剰な細胞外マトリックス預金、壊死、肝臓障害の広い範囲に貢献して炎症性の侮辱は、非アルコール性脂肪性肝疾患に関連付けられている最終的な関数の損失次のよう16,17,18。
並行して侵害されたワットと肝機能、太い動脈累積動脈壁内の脂質、体は慢性的な代謝ストレス19を受けます。動脈の脂質の蓄積は、活性化された血管内皮細胞によるケモカイン分泌および単球20の後の採用をトリガーします。募集、一度単球増殖を区別するため、リポ蛋白を摂取、泡沫細胞になります。粥状動脈硬化を開始され、プロ炎症性活動による持続的な募集と組織マクロファージ脂質荷を積んだ。この動脈硬化の微小環境の中継細胞外と細胞内ストレス信号に屈して、これらマクロファージは、アポトーシスのシグナル伝達カスケードに従事しています。これらの泡の細胞が死ぬと、プラーク破裂、心筋梗塞や脳卒中につながる病巣の壊死性コアに満たされた脂質内容を貢献します。
総称して、マクロファージの表現型の多様性は一部ワット、肝臓、大動脈8,21などの調節不全組織における炎症性変化による肥満を調整します。特性の採用し、組織マクロファージは、大食細胞の表現型の1を操作する分子標的の可能性への洞察を提供すること。効果的に炎症を起こした組織の肥満によるマクロファージを特徴付ける、酵素消化による単一細胞懸濁液が得られます。このような分離のプロトコルは免疫細胞死を最小限に抑えながら、最適な細胞収率を提供する結合組織を十分に分解に効果的である必要があります。酵素の混合、組織とその構造のメイクアップの種類に依存します。大動脈など弾力性のある組織では、肝組織の解離を達成するためにワットと比較してより強力な酵素活性を必要があります。単一細胞懸濁液から組織マクロファージが明確に特徴するまたは、転写プロファイリングなどさらに下流解析の分離します。
ここで組織固有のプロトコルは説明を効果的に分離し、伝統的な食生活による肥満、住民組織マクロファージを特徴付けるコラゲナーゼ依存組織消化と多色フローサイトメトリーを使用します。アテローム性動脈硬化、単純な脂肪肝と肝炎マウス モデル。同時白血球 - (CD45 や CD11b) やマクロファージに対する抗体と細胞表面のマーカーの染色 (F4/80) 特定の抗原は、しばしばマクロファージ人口22を識別するために使用されます。蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えは、高純度でこれらの特定の集団を並べ替えるために使用する強力な戦略です。並べ替えられた人口は、表現型特異的遺伝子プロファイル (量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応) などの下流の分子分析23を使用して評価できます。標準フローサイトメトリー ・ フロー フローサイトメトリーを用いた細胞のソーティングは非常に異種細胞懸濁液内マクロファージを区別する強力なツールであるが、正常な出力を確保するため元のプロトコルを最適化する必要があります。本研究では効果的に分離し、実行可能なティッシュ特定の大食細胞を特徴付けるプロトコルを説明します。もっと重要なは、この研究は、しばしば発生を防ぐおよび/またはそれらを解決するプロアクティブとトラブルシューティング戦略だけでなく、技術的な問題に重要な洞察を提供します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="940">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">26G x 5/8 in Needles</td>
			<td style="width:151px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305115</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:321px;">23G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set</td>
			<td style="width:151px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">367297</td>
			<td style="width:349px;">Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">21G 1 1/2 in. Needles</td>
			<td style="width:151px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305156</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">1mL syringe with rubber stops</td>
			<td style="width:151px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">10mL Syringes</td>
			<td style="width:151px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309604</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">1mL Syringe</td>
			<td style="width:151px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">F4/80 PE</td>
			<td style="width:151px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">123110</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">CD11c PE/Cy7</td>
			<td style="width:151px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">117318</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">CD11b PE/Cy5</td>
			<td style="width:151px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">15-0112-81</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Anti-mouse CD16/32 Fc Block&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">101320</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">CD45 Pacific Blue</td>
			<td style="width:151px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">103126</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">PE Rat IgG2a</td>
			<td style="width:151px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">400508</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">PE/Cy7 Armenian Hamster IgG</td>
			<td style="width:151px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">400922</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">PE/Cy5 Rat IgG2b</td>
			<td style="width:151px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">400610</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Pacific Blue Rat IgG2c</td>
			<td style="width:151px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">400717</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">15-017-CV</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">1X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:151px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">21-031-CV</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">70 micron cell strainers</td>
			<td style="width:151px;">Corning, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">352350</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">&#160;1.7 mL microcentrifuge tube&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Denville</td>
			<td style="width:119px;">C2170</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:321px;">Paraformaldehyde Aqueous Solution -16X</td>
			<td style="width:151px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">CAS #30525-89-4</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:321px;">Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23mm, Sharp&#160;</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>52132-10P</td>
			<td style="width:349px;">Used for general dissecting purposes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Forceps, 4in, full curve, 0.8mm</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>52102-37P&#160;</td>
			<td style="width:349px;">Used for general dissecting purposes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Spring dissection scissors &#8211; 3 mm Cutting edge&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Fine Science Tool</td>
			<td style="width:119px;">15000-10</td>
			<td style="width:349px;">Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Curved 0.07 x 0.04 mm Tip Forceps&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Fine Science Tool</td>
			<td style="width:119px;">11297-10</td>
			<td style="width:349px;">Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Hemostatic Forceps (Curved)</td>
			<td style="width:151px;">Fine Science Tool</td>
			<td style="width:119px;">13021-12</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Heparin Sodium Salt</td>
			<td style="width:151px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">9041-08-1</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">35mm Cell Culture/Petri Dishes</td>
			<td style="width:151px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-565-90</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid</td>
			<td style="width:151px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100D</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">15mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene)</td>
			<td style="width:151px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-959-53A</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">50mL Conical Centrifuge Tubes&#160;(Polypropylene)</td>
			<td style="width:151px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-432-22</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">5mL Round-Bottom Polystyrene Tubes&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-959-5</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:151px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:119px;">100-106</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:321px;">Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous)</td>
			<td style="width:151px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">EX0285-1</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:151px;">Rockland</td>
			<td style="width:119px;">BSA-50</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">HEPES</td>
			<td style="width:151px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Collagenase Type II</td>
			<td style="width:151px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C6885</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Collagenasse Type XI</td>
			<td style="width:151px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C7657</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Hyaluronidase Type I</td>
			<td style="width:151px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3506</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">DNAse</td>
			<td style="width:151px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">DN25</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Collagenase Type I</td>
			<td style="width:151px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C0130</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">NaOH</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">1310-73-2&#160;</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:321px;">CaCl2</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">449709-10G</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">500mL beaker&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">02-540M</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">4 cm Hemostatic clamp</td>
			<td style="width:151px;">Stoelting</td>
			<td style="width:119px;">52120-40</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Toothed forceps</td>
			<td style="width:151px;">Stoelting</td>
			<td style="width:119px;">52104-33P</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">50 micron Disposable filters</td>
			<td style="width:151px;">Systemex</td>
			<td style="width:119px;">04-0042-2317</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:321px;">Collagenase Type IV</td>
			<td style="width:151px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17104019</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:321px;">Ammonium Chloride Potassium (ACK)</td>
			<td style="width:151px;">ThermoFischer Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A1049201</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Razors (0.22 mm (0.009&#34;))</td>
			<td style="width:151px;">VWR International</td>
			<td style="width:119px;">55411-050</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Texas Red Live/Dead stain</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:349px;">Red viability stain (in Figure 1A)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization, and purification of macrophages from tissues affected by obesity-related inflammation

肥満は、主として単球由来マクロファージと同様に、住民組織マクロファージによる慢性的な炎症状態を促進します。食餌誘導性肥満 (DIO) はマクロファージの多様性; の役割を勉強の貴重なモデルただし、分離十分なマクロファージは炎症を起こした組織から取得する困難です。このプロトコルでは、私達は分離手順と必要なトラブルシューティングのガイドライン 18 週間の高脂肪 (HFD) または高脂肪高コレステロール (マウスから住民組織マクロファージの適切な人口を得るため私たちの研究から派生した輪郭を描くHFHCD) 食事介入。このプロトコルは、肥満や動脈硬化、肝、白色脂肪組織 (WAT)、大動脈などで学んだ 3 つのホールマーク組織に焦点を当てください。我々 はどのように二元的な使用を強調流れの cytometry 分離の新しいディメンションと住民組織マクロファージの性質を達成できます。このプロトコルの基本的なセクションは、フローサイトメトリーによる解析の染色後の細胞表面抗体とマクロファージの分離、組織固有の酵素の消化力の基になる複雑さを扱います。このプロトコルは、蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えの基になる既存の複雑さに対処し、適切に並べ替えられた細胞集団から幅広い評価を得られるようにこれらの複雑さへの明確化を提案します。豊かな代替メソッドは、並べ替え FACS を操作するときの柔軟性と時間の管理を可能にする高密度の肝臓などの細胞に含まれています。簡単に言えば、このプロトコルを特定の研究では炎症を起こした組織の多数のマクロファージの不均一性を評価する研究者を助けるし、良好な細胞の単離と解析の成功している洞察力のトラブルシューティングのヒントを提供しますDIO を介した炎症における免疫細胞。

アポリポ蛋白 E 欠損 (アポ島) C57BL/6 (BL6) マウス 18 週間、1 x 10 の4 - 2 × 104 CD45 (HCHFD または HCD) 高脂肪高コレステロール食で維持を使用する場合+F4/80+ 2 つのサンプルは、大動脈マクロファージが分離することができますプール。HFHCD 給電アポ KO マウスの胃から肝臓生産 (これは、使用可能な並べ替え時間異なります) 5 x 105並べ替えクッパー細胞より大きかった。うんざりした野生型 (WT) c57bl/6 マウスの高脂肪食 (HFD) を使用して、間質血管の分画 (SVF) 5 x 105 1 x 106居住者の脂肪組織マクロファージ (Atm) を並べ替えることができます。指定された組織から並べ替えることができますマクロファージの述べられた合計数は量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) を用いた遺伝子発現解析を実行するため十分なだった、大動脈など、マクロファージの人口のより少ない数字が回復の組織は、これらの解析で必要な RNA を隔離する場合共同沈殿 (たとえばグリコーゲン) と一晩沈殿物を使用することをお勧めします。
ここでは、基本的なを使用してマクロファージの表現型に及ぼす食事誘発代謝異常フロー フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞分別 (FACS) とダウン ストリーム ポスト並べ替え分析が表示されます。これらの調査結果は、マウスでは管内大動脈 (図 1 b) などの影響を受けたティッシュの古典的活性化 (M1) マクロファージの HFD または HFHCD 増加展示浸透以前に発行された観察を裏付けます。フローサイトメトリー、FACS、および遺伝子発現解析の活用 (量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) ロン受容体チロシンのキナーゼ - CD45 を表現するための支配的な表現型を経由+ F4/80+マクロファージに由来します。食事与えられたマウスから分離した組織が観察されました。ロン受容体発現大動脈マクロファージ炎症表現型を示したが (図 1とD) HFHCD 給電マウスで減少した.並べ替えられたロン受容体を発現したマクロファージ由来消化大動脈実証増加アルギナーゼ (図 1E) 確立された M2 マクロファージ マーカー 1 (Arg1) 遺伝子発現しています。CD45 として特徴付けられたプロ炎症性マクロファージ+ F4/80+ CD11c+ HFHCD 給電マウス (図 1 bとD) から分離された大動脈に増加しました。ロン受容体発現集団 (図 2 a) の支配的な表現型を解明さらに肝臓居住者マクロファージを特徴付けます。CD11c + プロ炎症性マクロファージ集団は、Arg1 とロン (図 2 b) などの抗炎症 (M2) 表現型に強く関連付けられている遺伝子発現減少を示した。同様の傾向は、消化の白色脂肪組織 (図 3) から分離されたマクロファージ集団で観察されました。マクロファージ炎症性のシグネチャを持つ人口は、ロンの受容体 (図 3) の表面発現の低下を示した。アプローチ、基本的なフローサイトメトリー、FACS を組み合わせ、さらにロン受容体を活性化マクロファージ32(M2) 代替のレギュレータとして検証する決定的なデータで起因しました。抗炎症 (M2) 表現に向かってこのようなバイアスは、開発と肥満、動脈硬化、肝炎の31の進行で保護の役割を果たすことに示されています。
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55445/55445fig1.jpg"> 図 1:解離大動脈由来マクロファージの特性が、HCD の 18 週間維持アポ KO マウスから削除します。(A) セルされた CD45 のゲート最初+白血球、細胞残屑を除きます。(B) CD45 マクロファージと推定される二重肯定的な集団を描くため F4/80 と一緒に染色します。CD11c の割合を示すために使用した追加ゲート+CD45+F4/80+ (M1) と (C) ロン+CD45+F4/80+ (潜在的な m 2) 大動脈由来のマウスにおけるマクロファージがいずれかの供給、通常の食事や、18 週間高コレステロール食。(D) CD11c の割合を増加した+CD45+F4/80+ (M1) ロン+CD45+F4/80+ (潜在的な m 2) の減少割合と同様に大食細胞、マクロファージを認めた大動脈通常食事飼料飼育マウスに比べて HCD を飼育マウスから派生します。(E) の遺伝子発現解析並べ替えられたロン+CD45+F4/80+マクロファージは、アルギナーゼ活性の発現の増加を示した私 (よく知られているマウス M2 マーカー)。< 0.05 を有意と考えられた学生の t テスト分析統計解析ソフトウェアを使用して実行、± SEM. P を意味として表されるを使用して得られた値 (* P < 0.05、* * * P < 0.001)。図は、ゆうらから変更されています。(2016)31.<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55445/55445fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55445/55445fig2.jpg"> 図 2: 18 週間、HCD の維持アポ KO マウスから解剖消化肝臓からソート クッパー細胞集団の遺伝子転写プロファイリングします。(A) 特性およびクッパー細胞集団をソート用の一般的なゲート方式。(B) の並べ替えられたロン (Ron+) を表現して非発現 (Ron-) CD45 遺伝子発現解析+F4/80+定量的 RT-PCR によるマクロファージ。学生の t テスト分析を行った統計ソフトウェアを使用して、値が ± 0.05 < は、統計的に有意と考えられていた SEM. P を意味として表された (* P < 0.05、* * * P < 0.001)。図は、ゆうらから変更されています。(2016)31.<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55445/55445fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/55445/55445fig3.jpg"> 図 3:特性の Atm WT BL6 マウスから解剖白色脂肪組織より分離した飼育 18 週間、HFD 。(A) 一般的なゲート方式の特性および脂肪組織をソート用派生マクロファージ集団 (B) 割合のロン + CD45 の細胞+F4/80+CD11c-と CD45+F4/80+CD11c+ワットからソート マクロファージ集団。図は、ゆうらから変更されています。(2016)31.<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55445/55445fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

このプロトコルにより、研究者を分離し、特徴付ける組織居住者様々 なマクロファージ ホールマーク食事誘発代謝疾患モデルから抽出された組織の炎症。

肥満に関連する炎症によって影響を受ける組織のマクロファージの精製と性質、分離

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

isolation-characterization-purification-macrophages-from-tissues

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

25.0K ビュー.  The Pennsylvania State University. このプロトコルにより、研究者を分離し、特徴付ける組織居住者様々 なマクロファージ ホールマーク食事誘発代謝疾患モデルから抽出された組織の炎症。

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Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

マウスの腸からの樹状細胞およびマクロファージの単離とキャラクタリゼーション

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

免疫・感染学

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

2D電気泳動によるマクロファージのプロテオームプロファイリング

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

母体·胎児界面におけるマウス組織からの白血球の分離

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells are therefore characterized as an innate T cell population capable of activating and steering adaptive immune responses. The development of improved techniques for the culture and expansion of murine iNKT cells facilitates the study of iNKT cell biology in in vitro and in vivo model systems. Here we describe an optimized procedure for the isolation and expansion of murine splenic iNKT cells.
Spleens from C57Bl/6 mice are removed, dissected and strained and the resulting cellular suspension is layered over density gradient media. Following centrifugation, splenic mononuclear cells (MNCs) are collected and CD5-positive (CD5+) lymphocytes are enriched for using magnetic beads. iNKT cells within the CD5+ fraction are subsequently stained with &#945;GalCer-loaded CD1d tetramer and purified by fluorescence activated cell sorting (FACS). FACS sorted iNKT cells are then initially cultured in vitro using a combination of recombinant murine cytokines and plate-bound T cell receptor (TCR) stimuli before being expanded in the presence of murine recombinant IL-7. Using this technique, approximately 108 iNKT cells can be generated within 18-20 days of culture, after which they can be used for functional assays in vitro, or for in vivo transfer experiments in mice.

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

マウスの脾臓から不変ナチュラルキラーT細胞を単離および拡張するための最適化方法

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

We have established a technique for the isolation, phenotypic characterization and functional analysis of immune cells from murine gingiva.

単離、特徴付けおよび歯肉免疫細胞ネットワークの機能検討

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the allograft early after transplantation, mount a graft reactive response against the transplanted organ, and initiate organ rejection2. Recent data suggest that suppressive macrophages facilitate successful long-term transplantation3 and are required for the induction of transplantation tolerance4. This suggests a multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation, and function, which demands a new roadmap for the isolation and analysis of macrophage function5. Due to the plasticity of macrophages, it is necessary to provide a methodology to isolate and characterize macrophages, depending on the tissue environment, and to define their functions according to different scenarios. Here, we describe a protocol for immune characterization of graft-infiltrating macrophages and the methods we used to functionally evaluate their capacity to inhibit CD8+ T proliferation and to promote CD4+Foxp3+ Treg expansion in vitro.

Macrophages are plastic cells of the hematopoietic system that have a crucial role in protective immunity and homeostasis. In this report, we describe optimized in vitro techniques to phenotypically and functionally characterize graft-infiltrating regulatory macrophages that accumulate in the transplanted organ under tolerogenic conditions.

グラフト反応性免疫を阻害する調節性マクロファージの機能的特徴付け

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

フローサイトメトリーによるラットの腎臓からのマクロファージの表現型の特徴

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of heterogeneous vesicles, whose size range between 40 and 1,000 nm. Accumulated evidence indicated that EVs play important regulatory roles in pathogen-host interactions. A deep understanding of schistosome EVs should provide insights into the mechanisms underlying schistosome-host interactions, enabling development of novel strategies against schistosomiasis. Here, we aim to further study EVs functions in schistosomes by presenting a protocol for the isolation and characterization of EVs from adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs were isolated from in vitro culture medium using centrifugation combined with a commercial exosome isolation kit. The isolated S. japonicum EVs (SjEVs) typically possess a diameter of 100 - 400 nm, and are characterized by transmission electronic microscopy and western blotting. The usage of PKH67 dye-labeled SjEVs has demonstrated that SjEVs are internalized by the recipient cells. Overall, our protocol provides an alternative method for isolating EVs from adult schistosomes; the isolated SjEVs may be suitable for functional analysis.

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Here, we present a protocol to describe extracellular vesicles (EVs) isolation in in vitro cultured medium from adult Schistosoma japonicum.

分離と大人住血吸虫から細胞外小胞のキャラクタリゼーション

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution of inflammation. Accumulation of apoptotic debris in the body may trigger chronic inflammatory responses that lead to systemic autoimmune diseases over time. Impaired apoptotic cell clearance has been implicated in a variety of autoimmune diseases. Apoptotic clearance is a complex process rarely detected under physiological conditions. It involves abundant surface receptors and signaling molecules. Studying the process of apoptotic cell clearance provides insightful molecular mechanisms and subsequent biological responses, which may lead to the development of new therapeutics. Here, we describe protocols for the induction of apoptotic thymocytes, the preparation of peritoneal macrophages, and the analysis of apoptotic cell clearance by flow cytometry and microscopy. All cells will undergo apoptosis at a certain stage, and many residential and circulating cells can uptake apoptotic debris. Therefore, the protocol described here can be used in many applications to characterize apoptotic cell binding and ingestion by many other cell types.

Here, we present a protocol to prepare apoptotic thymocytes and peritoneal macrophages and analyze the efficiency of efferocytosis and the specific inhibitor-mediated blocking of apoptotic thymocytes engulfment. This protocol has a broad application in cell-mediated clearance of other particles including artificial beads and bacteria.

マクロファージに貪食アポトーシス胸腺細胞の実験的解析

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...