우리는 펜실베니아 주립 대학교 밀레니엄 과학 단지에서 Flow Cytometry 핵심 시설을 감사 하 고 싶습니다.

<ol>
	<li>Davies, L. C., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages:+Then+and+Now.">Tissue-resident macrophages: Then and Now.</a> Immunology. 144 (4), 541-548 (2015).</li><li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (12), 840-846 (2006).</li><li>Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. 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R., Maria Paola, L., Giorgio, F., Marco, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+as+a+link+between+obesity+and+metabolic+syndrome.">Inflammation as a link between obesity and metabolic syndrome.</a> Nutr Metab. 2012, 1-7 (2012).</li><li>Vieira-Potter, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+macrophage+modulation+in+adipose+tissues.">Inflammation and macrophage modulation in adipose tissues.</a> Cell Microbiol. 16 (10), 1484-1492 (2014).</li><li>Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ron+Receptor+Tyrosine+Kinase+Regulates+Macrophage+Heterogeneity+and+Plays+a+Protective+Role+in+Diet-Induced+Obesity,+Atherosclerosis,+and+Hepatosteatosis.">The Ron Receptor Tyrosine Kinase Regulates Macrophage Heterogeneity and Plays a Protective Role in Diet-Induced Obesity, Atherosclerosis, and Hepatosteatosis.</a> J Immunol. 197 (1), 256-265 (2016).</li><li>Yu, Y. R. A., O'Koren, E. 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W., Heydari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+Flow+Cytometry:+A+Practical+Approach.">Modern Flow Cytometry: A Practical Approach.</a> Clin Lab Med. 27 (3), 453-468 (2007).</li><li>Martinez, F. O., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+M1+and+M2+paradigm+of+macrophage+activation:+time+for+reassessment.">The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment.</a> F1000. 6 (3), 13 (2014).</li><li>Porcheray, F., Viaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+switching:+An+asset+for+the+resolution+of+inflammation.">Macrophage activation switching: An asset for the resolution of inflammation.</a> Clin Exp Immunol. 142 (3), 481-489 (2005).</li><li>Plouffe, B. D., Murthy, S. K., Lewis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+and+Application+of+Magnetic+Particles+in+Cell+Isolation+and+Enrichment.">Fundamentals and Application of Magnetic Particles in Cell Isolation and Enrichment.</a> Rep Prog Phys. 1 (78), 1-6 (2010).</li></ol>

저자는 공개 관심의 충돌이 있다.

아 테 롬, 간단한 steatosis steatohepatitis 공동 morbidities을 모방 하 고 제 2 형 당뇨병 다이어트 유발 대사 장애 모델 광범위 하 게 질병의 진행의 기본 분자 메커니즘을 더 잘 이해 하는 데 사용 됩니다. 콜라 종속 소화 자주 분열 조직의 세포 외 기질 (ECM)16,27에서 해방 하는 데 사용 됩니다. 콜라 같은 효소 콜라겐 세포를 이웃에 대 한 구조 지원을 제공 하는 중단. 조직 구조 구성 지시 조직 매트릭스 강성 (변형 저항) 그리고 원유 콜라 제품 성공적인 ECM 중단28보장에 가장 효율적입니다. 와트, "부드러운 매트릭스"의 구성 되는 자주 콜라 유형 ii 동시에 세포 표면의 인슐린 수용 체29의 무결성을 유지 하면서 해방 adipocytes와 주민 면역 세포를 소화 된다. 대동맥의 fibril 구성 요소 마이크로 추가 효소와 함께에서 (이 높은 콜라 활동) 콜라 종류 사이 효과적인 대동맥 소화 사용 "뻣 뻣 한 매트릭스"에 기여 한다. 대동맥, 달리 간 소화 행렬을 방해 하 고 가능한 parenchymal 및 비 parenchymal 세포30해방에 약한 효소 활동, 콜라 종류 IV는 콜라를 사용 합니다. 만성 염증된 조직에 적절 한 효소 소화를 방지할 수 있는 배경 종종 개장 받아야 C57BL6 마우스 다이어트 먹이 야생 타입 또는 apolipoprotein E 결핍 (ApoE 코)에서 파생. 이 섹션은 최소화 부적절 한 조직 분리 및 낮은 셀 복구의 가능성을 제거 하는 전략을 논의할 예정 이다.
비만, 동맥 경화, 또는 비 알코올 지방산 간 질환, 모방 다이어트 먹이 마우스 모델에서 파생 된 조직의 일반적인 기능은 비정상적인 조직 리 모델링 이다. 백색 지방 조직, 대동맥, 그리고 간, ECM 구성 변경, collagens 등 원 구성의 과도 한 증 착에서 자주 발생. 18 주 동안 높은 지방 다이어트에 유지 하는 야생 타입 C57BL6 마우스 확장된 백색 지방 조직 등 조직 관련 이상 경험 하 고 지방 (간단한 방증) 확대. 종종 이러한 대사 기능은 성가신 장애물을 조직 분리 과정에서 극복 되지 않습니다. 다른 한편으로, 거울 더 악화 고기 다른 다이어트 유발 모델에서 조직의 광범위 한 리 모델링 발생할 수 있습니다 문제가 조직 소화 하는 동안. ApoE 코 쥐를 먹이 하는 HFHCD에 사용 되는 모델 아 테 롬 및 steatohepatitis. 고급 steatohepatitis와 관련 된 일반적인 기능 간 (또는 섬유 증) ECM의 과도 한 증 착 이다. 거리 간 효소 조직 분리 하는 동안 꽤 문제가 될 표시 되었습니다 하 고 종종 낮은 셀 수율31를 생성 합니다. 셀 수율 개선, 소화 프로토콜 편차 없이 따라야 중요 하다. 정상적인 간은 다진 수 있으며 분리를 달성 하기 위해 소화 버퍼에 빠져들, 소화 버퍼와 관류 극대화 접촉 간 세포 외 매트릭스와 콜라 솔루션; 그리고 따라서이 방법은 것이 좋습니다. 또한, 소화 버퍼의 20-30 mL는 종종 정상적인 간;의 성공적인 분리에 대 한 적절 한 볼륨 그러나, 개발 확대 및 거리 간 마우스 모델에 관해서는, 소화 버퍼의 50 mL와 관류 세포 죽음을 최소화 하면서 적절 한 소화를 위해 선호 된다. 간을 크게 1.5 g을 초과 하는 무게와, 소화 버퍼의 볼륨을 증가 것이 좋습니다 성공적인 소화 되도록.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>조직</td>
			<td>문제</td>
			<td>가능한 이유</td>
			<td>솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td>흰색 Adipose 조직 (WAT)</td>
			<td>불 쌍 한 세포 분리</td>
			<td>불 쌍 한 소화</td>
			<td>확인 소화 버퍼 37° C</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>세포 죽음</td>
			<td>과도 한 콜라 소화</td>
			<td>소화 시간을 단축</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>소화 버퍼의 볼륨을 감소</td>
		</tr>
<tr>
<td>대동맥</td>
			<td>불 쌍 한 세포 분리</td>
			<td>불 쌍 한 소화</td>
			<td>37 ° C에서 소화 버퍼 있는지 확인</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>대동맥 소화 버퍼에서 했다 너무 커서</td>
			<td>대동맥 약 1 m m 조각으로 잘라 있는지 확인</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>대동맥 조각 인큐베이션 기간 동안 분리 버퍼에 떨고 하지 했다</td>
			<td>대동맥 조각 소화 솔루션에 떨고는 반드시</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>세포 죽음</td>
			<td>과도 한 콜라 소화</td>
			<td>소화 시간을 단축</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>소화 버퍼의 볼륨을 감소</td>
		</tr>
<tr>
<td>간</td>
			<td>불 쌍 한 세포 분리</td>
			<td>불 쌍 한 소화</td>
			<td>37 ° C에서 소화 버퍼 있는지 확인</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>소화 버퍼의 볼륨을 증가</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>IVC (붓기 조직의 주변 IVC 발생)의 부적 절 한 cannulation</td>
			<td>바늘에는 IVC 올바르게 삽입 하십시오</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>파열된 IVC</td>
			<td>관류 이전 IVC에서 제대로 보안 바늘</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>관류 속도 감소</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>파열된 조직</td>
			<td>관류 속도 감소</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>세포 죽음</td>
			<td>잘못 된 릴리스 Glisson의 캡슐에서 셀의</td>
			<td>반드시 캡슐을 사용 하 여 세포 분열을 쓰 다듬어 메서드는 이전에 논의</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>과도 한 콜라 소화</td>
			<td>소화 시간을 단축</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>소화 버퍼의 볼륨을 감소</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: 문제 해결 실패 조직 분리. Flow cytometry 기반 셀 정렬 또는 FACS 순도 필요 세포 인구를 고립 시키기를 위한 강력한 기술입니다. 셀 정렬 셀을 정화 때 달성 높은 셀 생산량 뿐만 아니라 고 순도 정렬 적절 한 정렬 전략을 사용 하 여 필요 합니다. 이 섹션에서는 멀티 fluorophore 개선을 위한 방법 cytometry 기반 셀 정렬 조직 거주 macrophage 규정식 먹인 쥐에서 파생 된 설명의 흐름. 별개 조직 상주 대 식 세포 분리, 표면 마커 선택은 중요 한 단계입니다. 종종 와트, 대동맥, 그리고 간은에서 파생 된 대 식 세포는 CD45를 사용 하 여 고유+, CD11b+, F4/80+ 게이팅 전략. 추가 흐름 cytometric 패널 조직 주민 대 식 세포를 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 대 식 세포 특정 glycoproteins (CD64, CD68, 그리고 CD14) 중요 한 조직 적합성 복합물 (MHCII)의 표면 표현에 대 한 조사는 항 체를 포함 하는이 패널과 apoptotic 세포 티로신 키 니 아 제 수용 체 (MerTK)32, 33. 특정 대 식 세포 표현 형 M2의 선택적 표면 표현에 대 한 의해 delineated 다음 수 (CD163, CD209, 및 CD206) 또는 M1 마커 (CD38, CD40, CD80, 그리고 CD86)34,35. 지질-라덴 대 식 세포에 의해 생성 된 자동 형광 인구 게이팅 때 몇 가지 문제를 제시할 수 있습니다. 형광 노랑-녹색 레이저 (PE, PE/Cy5 PE/Cy7 등)에 의해 흥분 하는 태그로 항 체를 사용 하 여 또는 (와 같은 송출, APC Cy7) 빨간 레이저는 자동 형광 보다 훨씬 밝은 방출된 형광 고 따라서 향상 시킬 수 있습니다. 결과36. 같은 높은 착 색 인덱스 및 잠재적인 방출 스펙트럼 중복 변화 fluorophore를 선택 하는 경우 해당 컨트롤의 포함은 중요 합니다. 긍정/부정 인구의 묘사와 각각 1 차 항 체에 의해 발생 하는 일반적인 배경 신호 측정에 대 한 단일 얼룩 (SS) 컨트롤 및 isotype 컨트롤의 포함 허용 제어 경계를 식별 하는 경우 37. 세포가 부족 한 상황에 대 한 SS와 isotype 컨트롤에 대 한 보상 입자를 사용 하 여 것이 좋습니다. 보상 입자 일반적으로 생물 학적 컨트롤 보다 밝은 신호를 방출 하 고 또한 배경 형광에 있는 더 적은 편차. 또한, 마이너스 1 (FMO) 컨트롤 형광 제어 경계 묘사에 이상적입니다. FMO 컨트롤을 포함 하 여 얼룩 하위 집합에 대 한 예상 최대 형광은 형광 색소 태그 항 체는 특정 형광 채널에 대 한 특정 제외 된38때 주어진된 채널에 계시 된다. 단일 스테인드 보상 입자 컨트롤 뿐 아니라 우리의 경험에는 흠 없는 생물 학적 비교 컨트롤 더 정확한 긍정적인/부정적인 경계를 설정 하기 위한 포함 되어야 합니다.
세포질 파편 및 제어 전략에서 셀 집계 제외 자동 형광을 최소화 하는 데 사용 하는 추가 접근 이기도 합니다. 실행 가능한 세포 인구 세포 파편 구별, 앞으로 산포 (FSC) 및 측면 살포 (SSC)를 사용 하 여 가장 일반적인 제어 전략 이다. 게시물 정렬 분석에 사용 됩니다와 DNA/RNA 추출에 대 한 높은 가능성을 필요로 하는 셀에 대 한 격리, 그 생존 얼룩 사용 하지 고정 및/또는 permeabilization 절차 것이 좋습니다. 포름알데히드 셀의 고정 때문에 핵 산 단백질 가교 핵 산 무결성을 손상 하 고 따라서 격리 효율성, 검출 및 정확한 정량화를 제한할 수 있습니다. 셀 집계 하기 전에 언급 한 대로 내보낸된 자동 형광 신호를 기여할 수 있지만 또한 "우연의 일치 중단"에서. 정렬에서 고 순도 유지 하기 위해 이러한 작업이 발생 하지만 경우 너무 자주, 그것은 정렬된 셀 수확량 감소. 정렬 버퍼 (버퍼 FACS) 셀 얼룩 동안 DNAse 및 MgCl2 보충 셀 집계를 최소화할 수 있습니다. 그것은 그것은 효소의 활동을 억제로 함께 DNAse EDTA를 사용 하지 않는 것이 좋습니다. 정렬 전에 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 단일 세포 현 탁 액을 필터링 집계에서 셀 해방 또한 수 있습니다. 집계를 최소화 하기 위해 셀 정지 한다는 것 0.4 mL의 최소 볼륨에 mL 당 5 백만 셀의 농도에 주의 하는 것이 필수적입니다. 라덴 지질 조직에서 분리 된 셀 집계 하는 경향이 경향이 있고이 일치 될 수 있습니다 중단 되 고 낮은 정렬 항복. 집계 지속 되 면 샘플 희석 더는 것이 좋습니다. 정렬 된 대 식 세포 세포 복구를 최대화 하기 위해 태아 소 풍부한 매체를 포함 하는 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 컬렉션 튜브에서 수집할 수 있습니다. 초기 높은 FBS 농도 농도 결국 각 정렬된 방울 희석 된다 이후 셀 복구를 보장 합니다. 수집 DNA 또는 RNA 분석에 사용할 수 있는 셀, 셀 (예: TriZol) RNAse 오염을 방지 하기 위해 적절 한 추출 시에 직접 정렬할 수 있습니다. 높은 볼륨을 정렬할 때 정렬 셀 처음 문화 미디어 FBS의 더 낮은 농도 가진 보충으로 것이 좋습니다. 바로 다음 정렬, 셀 다음 수송과 고 DNA/RNA 추출 lysed. 격리 된 유전 물질 변경된 유전자 발현에 대 한는 프로 파일링 될 수 있습니다. 프로-염증 성 유전자 등 TNFα, IL1-β, 일리노이-6, 일리노이-12, 1 L-23, IFNγ, Nos2, MCP1 (CCL2) upregulated 고전적인 활성화 (M1) 형39전시 세포에 많습니다. 다른 한편으로, 또는 활성화 (M2) 표현 형 세포에 종종 인코딩 Chi3l3 유전자의 유도 의해 표시 된다 (Ym1), Fizz1, Arginase 1, CD206, CD163, 10-CD209 1 L, 및 TGFβ34,40. 최근, CD38, Fpr2, 및 Gpr18 M1 관련 유전자 및 c-Myc Egr2 M2 특정 유전자34로 검증 되었습니다.
멀티 컬러 흐름 cytometry 기반 셀 정렬 순도에서 세포를 분리 하는 데 유용한 도구입니다,이 이렇게 비용이 많이 드는 될 수 있습니다. FACS 중재 정렬의 강력한 장점 셀 정렬 셀 정렬 유지 보수 시 약의 높은 비용 이외에 기동 수 작업 인원에 따라 달라 집니다. 다른 접근 방식의 대체 비용이 많이 드는 흐름 기반 cytometry 셀 정렬에 사용할 수 있습니다. 그들은 자석 활성화 된 셀 정렬 (맥) 또는 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 포함 합니다. 정렬 방법 언급 한 첫 번째 대체 셀 포함 자석 또는 microbead 열 절연 키트 혈액 또는 단단한 조직41에서 관심의 세포를 분리. 접근을 정렬 하는 두 번째 셀 밀도 및 원심의 힘에 따라 다른 유형의 세포 현 탁 액을 분리 한다. 불행 하 게도, 밀도 중재 원심 대동맥 또는 와트 파생 된 단일 셀 정지에서 세포를 분리 하는 데 실용적이 지 않습니다. 때때로, 차동 원심에서 얻은 제품, 오염 그리고 낮은 항복. 따라서, 처음 효소 소화 다음 몇 셀의 결과 (예: 대동맥 또는 와트) 작은 조직 차등 원심 분리에 대 한 이상적인 후보가 되지 않습니다. 다른 한편으로, 해리 간은에서 파생 된 셀 정지 게시물 정렬 실험 및 문화 stimulations, 정량, 또는 서쪽 더 럽 히 분석 등 분석에 사용할 수 있는 정렬 된 대 식 세포의 적절 한 번호를 생성할 수 있습니다. 이러한 대체 방법은 FACS, 청소기 종류에 대 한 수 전에 인구를 풍부 하 게 사용할 수 있습니다. 메모의 조직 주민 대 식 세포는 와트, 간 및 대동맥 전체 셀 인구의 작은 비율을 확인합니다. FACS 정렬 하기 전에 셀의 농축 접근 덜 자주 셀의 인구를 분리 하는 때 사용 되었습니다. 작은 인구를 고립 시키기에 공통 되는 하나의 문제는 그 큰 셀 번호 후속 분석을 위해 충분 한 세포를 처리 해야 합니다. 농축 또는 미리 정렬 같은 문제를 해결 하려면 사용할 수 있습니다. 이 방법은 긍정적이 고 부정적인 선택을 통해 세포의 더 간결한 인구를 얻기에서 에이즈 하지만 또한 시간의 절약 FACS 정렬 간 같은 조밀한 조직 소스에 대 한 지속적인 프로세스 일 수 있다.
염증 생물학의 최근 발전 만성 염증 조절에 이러한 면역 세포의 복잡 한 역할의 이해를 심화 하기 위해 대 식 세포 이종의 phenotypic와 기능 특성의 중요성을 강조 표시 합니다. 간단히,이 포괄적인 프로토콜 조직 설립된 다이어트 유발 된 비만 및 염증 모델에서 공부 하는 3 개의 각 인 조직에서 거주 세포 특성화에 대 한 다차원 접근을 제공 합니다. 더 중요 한 것은이 프로토콜은 계정에 어려움 하 고 깨끗 한 분리 하는 데 필요한 조치 단일 셀 정지 dysregulated에서 와트, 대동맥 플 라크와 지방 간 조직 염증이. 프로토콜 연구원을 cytometry 및 FACS 조직 주민 대 식 세포, 비만에서 염증의 주요 규제 하는 혁신 차원에서 정렬 도구를 적용할 수 있습니다. 대 식 세포 인구 역학의 심층적인 특성화 monocyte 염증된 조직에서 인신 매매에 대 한 통찰력을 제공 하 고 정렬 된 대 식 세포에 실험적인 접근의 무리를 통해 지속적인된 기계적 평가 대 한 허용 수 있습니다. 대 식 세포 인구의 더 특성화 macrophage이 건강과 질병을 조절 하는 생물학적 토대에 대 한 중추적인 통찰력을 제공할 수 있습니다.

마우스 모델 인간의 질병의 역학 연구를 광범위 하 게 사용 되었습니다. 병에 걸린 상태에서 쥐에서 조직 거주 세포의 적절 한 절연1질병 병 인에 분자와 세포질 기여를 이해 하기 위한 플랫폼을 제공할 수 있습니다. 중요 한 중요 한 장애는 비만 이다. 비만의 발생률 인슐린 저항을 가진 동시에 전세계 상승 입력 2 당뇨병, 심혈 관 질환, 지방 간 질환2,3계속 됩니다. 과도 한 영양소 소비는 더4대동맥과 간 등 다른 주변 조직 세포 주위를 변경할 수 있습니다 지방 조직에서 나오는 변경된 신호 트리거링 줄된 신체 활동에 의해 비뚤어진 다. 같은 변화 항상성 장애 만성 낮은 학년 조직의 염증5발생합니다.
흰색 adipose 조직 (WAT)을 그들의 신규 모집 뿐만 아니라 대동맥 및 간 거주 대 식 세포의 클래식 활성화 뿐만 아니라 신진 대사 신호 dysregulation를 시작 하지만 염증6,7유지 표시 되었습니다. 대 식 세포의 phenotypic와 기능적인이 질은 비만의 병에 강하게 연관 공동 morbidities7관련. 대 식 세포 분극에 동적 소성 전시 진행 협조 하는 활성화 된 고기의 범위와 염증8의 해상도를이 셀에 대 한 수 있습니다. 고전적인 활성화 (M1) 세포는 염증의 전파에 연루는, 하는 동안 또는 활성화 (M2) 세포 해상도 조직 수리9,10와 연결 되었습니다.
으로 신체 대사 스트레스를 겪 습, 백색 지방 조직 비정상적으로 축적. 확장 된 지방 조직 매력과 뿌리깊은 인슐린 저항, 혈당 및 궁극적으로 2 형 당뇨병, 인슐린 저항 또는 혈당11, 홍보 일반 체형 기능을 변경 하는 염증 성 세포 유지 12. 동시에 발표 하는 염증 성 신호에 응답 개장 한다 백색 지방 조직 침투 고전적인 활성화 (M1) 지방 조직 대 식 세포 (Atm)13,14. 이 멀티 셀룰러 기관 간4대동맥 등 다른 신체 기관의 정상적인 기능 derails 신호 폭포를 발휘 한다.
간 근처 dysregulated 와트15에서 발생 하는 자극에 적응 하는 신진 대사 강국 이다. 간 세포 또는 Kupffer 세포 신진 대사 변화에 대응 parenchymal 모두 변환 하는 선 동적인 cytokines 및 비 parenchymal 세포 표현 형을 분 비 하 고 조직 리 모델링 추진. 간 장의 지질 축적, 염증, 과도 한 세포 외 기질 예금, 괴 사 및 간 손상의 넓은 스펙트럼에 기여 하는 염증 성 모욕 비 알코올 지방산 간 질환 와 관련 된 최종 기능 손실 다음과 16,,1718.
손상 된 와트와 간 기능에 병렬로 큰 동맥 시체는 만성 대사 스트레스19를 겪 습으로 동맥 벽 내 지질 축적. 내 피 세포를 활성화 하 여 발산의 분 비 및 monocytes20의 후속 모집 동맥 지질 축적을 트리거합니다. 일단 채용, monocytes 증식, 분화, 단백질을 섭취 하 고 거품 세포가. Atherogenesis를 시작 하 고 프로-염증 성 활동의 지속적인 채용 및 조직 거주 지질 라덴 대 식 세포. 이 atherogenic microenvironment에 릴레이 extracellular와 세포 스트레스 신호에 굴복, 이러한 세포는 다음는 apoptotic 신호 폭포에에서 종사. 이 거품 세포는 죽지로 그들은 그들의 지질 가득 괴 사 성 병 변, 다음 플 라크 파열, 심근 경색과 뇌졸중에 이르게 핵심 내용을 기여.
대 식 세포 고기의이 부분에 와트, 간 등 대동맥8,21dysregulated 조직에 염증 성 변화에 의해 유도 된 비만 총괄. 채용 그리고 조직 상주 대 식 세포 대 식 세포 표현 형1를 조작 하는 잠재적인 분자 표적에 대 한 통찰력을 제공할 수 있다. 효과적으로 비만 유발 염증된 조직에서 세포 특성, 단일 세포 현 탁 액은 효소 소화를 통해 얻어질 수 있다. 이러한 분리 프로토콜 충분히 결합 조직 면역 세포 죽음을 최소화 하 고 최적의 셀 수익률을 제공 하는 동안 저하에 효과적 이어야 합니다. 효소 혼합 조직 및 그것의 구조상 메이크업의 종류에 따라 달라 집니다. 대동맥 등 탄력적인 조직 간와 와트, 조직 분리를 달성 하기 위해 강력한 효소 활동을 요구 한다. 단일 세포 현 탁 액에서 조직 주민 대 식 세포 수 명확 하 게 특징 또는 transcriptional 프로 파일링 같은 추가 다운스트림 분석에 대 한 격리.
여기는 조직 관련 프로토콜 설명 하는 콜라-종속 조직 소화와 색채 cytometry 효과적으로 분리 하 고 유도 하는 전통적인 다이어트 비만에서 얻은 조직 상주 세포 특성화를 사용 하 동맥 경화 증, 간단한 steatosis 및 steatohepatitis 마우스 모델입니다. 백혈구-(CD45 또는 CD11b)와 대 식 세포-에 대 한 항 체와 세포 표면 마커 얼룩 동시 (f 4/80) 특정 항 원 자주 사용 한다 대 식 세포 인구22식별 하. 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 고 순도에서 이러한 확인 된 인구를 정렬 하는 데 사용 하는 강력한 전략 이다. 정렬 된 인구 다음 형 특정 유전자 프로 파일 (예: 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응) 다운스트림 분자 분석23을 사용 하 여 평가할 수 있습니다. 표준 cytometry와 교류 cytometry 기반 세포 분류는 크게 다른 유형의 세포 현 탁 액 내에서 세포를 구별에 강력한 도구, 비록 전 프로토콜 성공적인 출력 되도록 낙관 되어야 한다. 이 연구에서는 프로토콜을 효과적으로 분리 하 고 가능한 조직의 특정 세포 특성화 설명; 더 중요 한 것은,이 연구는 사전 및 문제 해결 전략을 방지 또는 해결 뿐만 아니라 자주 발생 하는 기술적인 문제에 대 한 중요 한 통찰력을 제공 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="940">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">26G x 5/8 in Needles</td>
			<td style="width:151px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305115</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:321px;">23G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set</td>
			<td style="width:151px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">367297</td>
			<td style="width:349px;">Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">21G 1 1/2 in. Needles</td>
			<td style="width:151px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305156</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">1mL syringe with rubber stops</td>
			<td style="width:151px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">10mL Syringes</td>
			<td style="width:151px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309604</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">1mL Syringe</td>
			<td style="width:151px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">F4/80 PE</td>
			<td style="width:151px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">123110</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">CD11c PE/Cy7</td>
			<td style="width:151px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">117318</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">CD11b PE/Cy5</td>
			<td style="width:151px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">15-0112-81</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Anti-mouse CD16/32 Fc Block&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">101320</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">CD45 Pacific Blue</td>
			<td style="width:151px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">103126</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">PE Rat IgG2a</td>
			<td style="width:151px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">400508</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">PE/Cy7 Armenian Hamster IgG</td>
			<td style="width:151px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">400922</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">PE/Cy5 Rat IgG2b</td>
			<td style="width:151px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">400610</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Pacific Blue Rat IgG2c</td>
			<td style="width:151px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">400717</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">15-017-CV</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">1X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:151px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">21-031-CV</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">70 micron cell strainers</td>
			<td style="width:151px;">Corning, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">352350</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">&#160;1.7 mL microcentrifuge tube&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Denville</td>
			<td style="width:119px;">C2170</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:321px;">Paraformaldehyde Aqueous Solution -16X</td>
			<td style="width:151px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">CAS #30525-89-4</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:321px;">Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23mm, Sharp&#160;</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>52132-10P</td>
			<td style="width:349px;">Used for general dissecting purposes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Forceps, 4in, full curve, 0.8mm</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>52102-37P&#160;</td>
			<td style="width:349px;">Used for general dissecting purposes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Spring dissection scissors &#8211; 3 mm Cutting edge&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Fine Science Tool</td>
			<td style="width:119px;">15000-10</td>
			<td style="width:349px;">Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Curved 0.07 x 0.04 mm Tip Forceps&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Fine Science Tool</td>
			<td style="width:119px;">11297-10</td>
			<td style="width:349px;">Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Hemostatic Forceps (Curved)</td>
			<td style="width:151px;">Fine Science Tool</td>
			<td style="width:119px;">13021-12</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Heparin Sodium Salt</td>
			<td style="width:151px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">9041-08-1</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">35mm Cell Culture/Petri Dishes</td>
			<td style="width:151px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-565-90</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid</td>
			<td style="width:151px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100D</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">15mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene)</td>
			<td style="width:151px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-959-53A</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">50mL Conical Centrifuge Tubes&#160;(Polypropylene)</td>
			<td style="width:151px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-432-22</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">5mL Round-Bottom Polystyrene Tubes&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-959-5</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:151px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:119px;">100-106</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:321px;">Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous)</td>
			<td style="width:151px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">EX0285-1</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:151px;">Rockland</td>
			<td style="width:119px;">BSA-50</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">HEPES</td>
			<td style="width:151px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Collagenase Type II</td>
			<td style="width:151px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C6885</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Collagenasse Type XI</td>
			<td style="width:151px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C7657</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Hyaluronidase Type I</td>
			<td style="width:151px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3506</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">DNAse</td>
			<td style="width:151px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">DN25</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Collagenase Type I</td>
			<td style="width:151px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C0130</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">NaOH</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">1310-73-2&#160;</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:321px;">CaCl2</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">449709-10G</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">500mL beaker&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">02-540M</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">4 cm Hemostatic clamp</td>
			<td style="width:151px;">Stoelting</td>
			<td style="width:119px;">52120-40</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Toothed forceps</td>
			<td style="width:151px;">Stoelting</td>
			<td style="width:119px;">52104-33P</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">50 micron Disposable filters</td>
			<td style="width:151px;">Systemex</td>
			<td style="width:119px;">04-0042-2317</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:321px;">Collagenase Type IV</td>
			<td style="width:151px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17104019</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:321px;">Ammonium Chloride Potassium (ACK)</td>
			<td style="width:151px;">ThermoFischer Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A1049201</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Razors (0.22 mm (0.009&#34;))</td>
			<td style="width:151px;">VWR International</td>
			<td style="width:119px;">55411-050</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Texas Red Live/Dead stain</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:349px;">Red viability stain (in Figure 1A)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization, and purification of macrophages from tissues affected by obesity-related inflammation

비만 크게 조직 상주 세포 monocyte 파생 된 대 식 세포에 의해 중재 만성 염증 상태를 촉진 합니다. 다이어트 유발 된 비만 (DIO)는 대 식 세포가;의 역할을 공부 하 고 귀중 한 모델 그러나, 적절 한 대 식 세포 격리는 염증된 조직에서 취득 하기 어렵다. 이 프로토콜에서 우리는 격리 단계와 높은 지방 (HFD) 또는 높은 콜레스테롤 높은 지방 (18 주 다음 쥐에서 조직 상주 대 식 세포의 적당 한 인구를 얻기 위한 우리의 연구에서 파생 된 필요한 문제 해결 지침 개요 HFHCD) 규정식 내정간섭입니다. 이 프로토콜은 비만 동맥 경화는 간, 대동맥, 흰색 adipose 조직 (WAT) 등에서 공부 하는 3 각 인 조직에 초점을 맞추고. 우리가 어떻게 dualistic 사용 강조 흐름의 cytometry 격리의 새로운 차원과 조직 상주 대 식 세포의 특성을 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜의 기본 섹션에서는 기본 조직 관련 효소 소화 및 대 식 세포 격리, 이후 세포 표면 항 체 얼룩이 흐름 cytometric 분석에 대 한 복잡 한 합니다. 이 프로토콜 기존의 복잡 한 형광 활성화 된 세포 (FACS) 정렬 기본 해결 하 고 적절 하 게 정렬 된 세포 인구에서 광범위 한 특성을 얻을 수 있도록 이러한 복잡성을 설명 제공. 대체 농축 방법 FACS 작업할 때 유연성 및 시간 관리에 대 한 수 있도록 밀도 간 같은 셀 정렬에 대 한 포함 되어 있습니다. 간단히,이 프로토콜 macrophage 다양 한 주어진된 연구에서 염증된 조직에서에서이 평가 하는 연구를 보조 하 고 유리한 세포 분리 및 특성에 대 한 성공적인 통찰력 있는 문제 해결 팁을 제공 합니다. DIO 중재 염증에서 면역 세포.

18 주, 1 x 104 -2 × 104 CD45 (HCHFD 또는 HCD) 높은 지방 높은 콜레스테롤 다이어트 유지 apolipoprotein E 결핍 (ApoE 코) C57BL/6 (BL6) 마우스를 사용할 때++ F4/80 두 표본이 때 대동맥 세포 격리 될 수 있습니다 풀링된. ApoE 코 HFHCD 먹인 쥐에서 해 부 간은 5 x 105 정렬 Kupffer 세포 (사용 가능한 정렬 시간에 따라 달라 집니다) 보다 더 큰 생산. 먹 일 때 높은 지방 다이어트 (HFD)를 사용 하 여 야생 타입 (WT) C57BL/6 마우스, stromal 혈관 분수 (SVF)에서 5 x 105 1 x 106 거주 지방 조직 대 식 세포 (Atm)를 정렬할 수 있습니다. 대 식 세포는 특정된 조직에서 정렬할 수 있습니다 언급 한 총 수 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)를 사용 하 여 유전자 표정 분석을 수행 하기 위한 적절 한 했다. 대동맥, 같은 대 식 세포 인구의 적은 숫자 복구는 조직에 대 한 이러한 분석에 필요한 RNA를 분리 하는 때 공동 침 (예: glycogen)와 하룻밤 강 수를 사용 하는 것이 좋습니다.
여기, 다이어트 유발 대사 장애의 효과 기본 사용 하 여 대 식 세포 표현 형에 흐름 cytometry, 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS), 다운스트림 게시물 정렬 분석 표시 됩니다. 이 발견 이전에 게시 관측 쥐 대동맥 (그림 1B) 등 영향을 받는 조직에 고전적인 활성화 (M1) 세포의 HFD 또는 HFHCD 전시 증가 침투를 먹이 확증. Cytometry, FACS, 및 유전자 식 프로 파일링의 활용 (정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량), 론 수용 체 티로신 키 니 아 제 표현 CD45 위한 predominating 표현 형을 통해+ + F4/80 대 식 세포에서 파생 된 규정식 먹인 쥐에서 분리 된 조직 관찰 되었다. 론 수용 체 표현 대동맥 대 식 세포는 항 염증 성 표현 형을 설명 하는 HFHCD 먹인 쥐 (그림 1 c 와 D) 감소 했다. 정렬 된 론 표현 하는 수용 체 세포 (그림 1E) 확고 M2 대 식 세포 마커 인 1 (Arg1) 유전자 발현 소화 aortas 시연된 증가 arginase에서 파생. 프로-염증 성 세포로 CD45 특징은+ + CD11c F4/80+ aortas HFHCD 먹인 쥐 (그림 1B와 D)에서 절연에 증가 했다. 론 수용 체를 표현 부분 모집단 (그림 2A)의 통용 형 해명 더 간 상주 세포 특성화. CD11c + 프로-염증 성 대 식 세포 인구 감소 식 Arg1 및 론 (그림 2B)와 같은 항 염증 제 (M2) 형와 강하게 연관 되는 유전자의 시연. 유사한 동향은 소화 흰색 adipose 조직 (그림 3)에서 고립 된 대 식 세포 인구에서 관찰 되었다. 프로-염증 성 서명으로 대 식 세포 인구 론 수용 체 (그림 3)의 감소 표면 표현을 했다. 결정적인 데이터를 더 론 수용 체 세포32대체 (M2) 활성화의 레 귤 레이 터로 확인 결과 결합 하 여 접근, 기본 cytometry 및 FACS. 이러한 바이어스는 항 염증 제 (M2) 형으로 개발 및 비만, 동맥 경화 및 steatohepatitis31의 진행에서 보호 역할을 보여줘 왔다.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55445/55445fig1.jpg"> 그림 1: 천연된 대동맥에서 고립 된 세포의 ApoE 코 마우스는 HCD 18 주 동안 유지에서 제거. (A) 셀 CD45에 문이 먼저 했다+ 백혈구, 세포질 파편을 제외 하 고. (B) CD45 세포를 것으로 추정 두 배 긍정적인 인구를 나타내는 데 f 4/80와 함께에서 얼룩. CD11c의 비율을 보여 주기 위해 사용 되었다 추가 게이팅+CD45+F4/80+ (M1)와 (C) 론+CD45++ (잠재적인 M2) f 4/80에 쥐에서 파생 된 aortas에서 대 식 세포 먹이 일반 차 또는 18 주에 대 한 높은 콜레스테롤 다이어트. (D) CD11c의 비율을 증가+CD45+F4/80+ (M1)+F4/80+ (잠재적인 M2) 론+CD45의 감소 비율 뿐 아니라 대 식 세포, 대 식 세포는 aortas에서 관찰 되었다 쥐 쥐 먹이 정상적인 차 다이어트에 비해 HCD 먹이에서 파생 된. (E) 유전자 표정 분석 정렬된 론+CD45의+F4/80+ 세포 증가 표현의 arginase 시연 나 (잘 알려진 murine M2 표식). 값 < 0.05를 통계적으로 중요 한 고려 되었다 학생의 t-검정 분석 통계 분석 소프트웨어를 사용 하 여 수행 하 고 의미 ± SEM. P로 표시를 사용 하 여 가져온 (* P < 0.05, * * * P < 0.001). 그림 유 외 에서 수정 되었습니다. (2016) 31. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55445/55445fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55445/55445fig2.jpg"> 그림 2: ApoE 코 마우스는 HCD 18 주 동안 유지에서 해 부 유전자 사본 Kupffer 세포 인구에서 소화 간 정렬의 프로 파일링. (A) 특성화 및 Kupffer 세포 인구를 정렬에 대 한 일반적인 제어 체계. (B) 정렬 론 (Ron+) 표현 및 비-표현 (Ron-) CD45 유전자 표정 분석++ F4/80 양적 RT PCR에 의해 세포. 스튜던트 t-검정 분석 통계 소프트웨어를 사용 하 여 수행 하 고 값 ± SEM. P < 0.05를 통계적으로 중요 한 고려 되었다 의미를 표현 했다 (* P < 0.05, * * * P < 0.001). 그림 유 외 에서 수정 되었습니다. (2016) 31 . <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55445/55445fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/55445/55445fig3.jpg"> 그림 3: 특성의 Atm에서 WT BL6 마우스 해 부 백색 지방이 많은 직물에서 고립 된 18 주 동안 한 HFD 먹이. 특성화 및 지방 조직 정렬 (A) 일반적인 제어 방식 파생 된 대 식 세포 인구 CD45 내의 셀 (B) 비율의 론 +++CD11c F4/80- 및 CD45++CD11c F4/80+ 와트에서 정렬 하는 대 식 세포 인구. 그림 유 외 에서 수정 되었습니다. (2016) 31 . <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55445/55445fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

이 프로토콜 수 있습니다 격리 하 고 특성화 연구원 조직 상주 다양 한 세포 특징 염증된 조직 변화 무질서의 다이어트 유발 모델에서 추출.

절연, 특성화 및 비만 관련 염증에 의해 영향을 받는 조직에서 세포의 정화

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

isolation-characterization-purification-macrophages-from-tissues

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

25.0K 조회수.  The Pennsylvania State University. 이 프로토콜 수 있습니다 격리 하 고 특성화 연구원 조직 상주 다양 한 세포 특징 염증된 조직 변화 무질서의 다이어트 유발 모델에서 추출.

비디오: Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

마우스 소장에서 돌기 세포 및 Macrophages의 분리 및 특성화

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

연구

면역학 및 감염병학

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

2D 전기 영동에 의한 대 식세포의 프로테옴 프로파일 링

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

산모 - 태아 인터페이스에서 쥐의 조직에서 백혈구의 분리

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells are therefore characterized as an innate T cell population capable of activating and steering adaptive immune responses. The development of improved techniques for the culture and expansion of murine iNKT cells facilitates the study of iNKT cell biology in in vitro and in vivo model systems. Here we describe an optimized procedure for the isolation and expansion of murine splenic iNKT cells.
Spleens from C57Bl/6 mice are removed, dissected and strained and the resulting cellular suspension is layered over density gradient media. Following centrifugation, splenic mononuclear cells (MNCs) are collected and CD5-positive (CD5+) lymphocytes are enriched for using magnetic beads. iNKT cells within the CD5+ fraction are subsequently stained with &#945;GalCer-loaded CD1d tetramer and purified by fluorescence activated cell sorting (FACS). FACS sorted iNKT cells are then initially cultured in vitro using a combination of recombinant murine cytokines and plate-bound T cell receptor (TCR) stimuli before being expanded in the presence of murine recombinant IL-7. Using this technique, approximately 108 iNKT cells can be generated within 18-20 days of culture, after which they can be used for functional assays in vitro, or for in vivo transfer experiments in mice.

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

마우스 비장에서 불변 자연 살해 T 세포를 분리하고 확장을위한 최적화 방법

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

We have established a technique for the isolation, phenotypic characterization and functional analysis of immune cells from murine gingiva.

절연, 특성화 및 잇몸 면역 세포 네트워크의 기능 시험

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the allograft early after transplantation, mount a graft reactive response against the transplanted organ, and initiate organ rejection2. Recent data suggest that suppressive macrophages facilitate successful long-term transplantation3 and are required for the induction of transplantation tolerance4. This suggests a multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation, and function, which demands a new roadmap for the isolation and analysis of macrophage function5. Due to the plasticity of macrophages, it is necessary to provide a methodology to isolate and characterize macrophages, depending on the tissue environment, and to define their functions according to different scenarios. Here, we describe a protocol for immune characterization of graft-infiltrating macrophages and the methods we used to functionally evaluate their capacity to inhibit CD8+ T proliferation and to promote CD4+Foxp3+ Treg expansion in vitro.

Macrophages are plastic cells of the hematopoietic system that have a crucial role in protective immunity and homeostasis. In this report, we describe optimized in vitro techniques to phenotypically and functionally characterize graft-infiltrating regulatory macrophages that accumulate in the transplanted organ under tolerogenic conditions.

이식 반응 면역을 억제하는 조절 성 마크로파지의 기능적 특성 규명

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

유동 세포 계측법에 의해 쥐의 신장에서 대 식세포의 표현형 특성

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of heterogeneous vesicles, whose size range between 40 and 1,000 nm. Accumulated evidence indicated that EVs play important regulatory roles in pathogen-host interactions. A deep understanding of schistosome EVs should provide insights into the mechanisms underlying schistosome-host interactions, enabling development of novel strategies against schistosomiasis. Here, we aim to further study EVs functions in schistosomes by presenting a protocol for the isolation and characterization of EVs from adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs were isolated from in vitro culture medium using centrifugation combined with a commercial exosome isolation kit. The isolated S. japonicum EVs (SjEVs) typically possess a diameter of 100 - 400 nm, and are characterized by transmission electronic microscopy and western blotting. The usage of PKH67 dye-labeled SjEVs has demonstrated that SjEVs are internalized by the recipient cells. Overall, our protocol provides an alternative method for isolating EVs from adult schistosomes; the isolated SjEVs may be suitable for functional analysis.

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Here, we present a protocol to describe extracellular vesicles (EVs) isolation in in vitro cultured medium from adult Schistosoma japonicum.

절연 및 Extracellular 소포 특성 성인 Schistosoma 나무 에서

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution of inflammation. Accumulation of apoptotic debris in the body may trigger chronic inflammatory responses that lead to systemic autoimmune diseases over time. Impaired apoptotic cell clearance has been implicated in a variety of autoimmune diseases. Apoptotic clearance is a complex process rarely detected under physiological conditions. It involves abundant surface receptors and signaling molecules. Studying the process of apoptotic cell clearance provides insightful molecular mechanisms and subsequent biological responses, which may lead to the development of new therapeutics. Here, we describe protocols for the induction of apoptotic thymocytes, the preparation of peritoneal macrophages, and the analysis of apoptotic cell clearance by flow cytometry and microscopy. All cells will undergo apoptosis at a certain stage, and many residential and circulating cells can uptake apoptotic debris. Therefore, the protocol described here can be used in many applications to characterize apoptotic cell binding and ingestion by many other cell types.

Here, we present a protocol to prepare apoptotic thymocytes and peritoneal macrophages and analyze the efficiency of efferocytosis and the specific inhibitor-mediated blocking of apoptotic thymocytes engulfment. This protocol has a broad application in cell-mediated clearance of other particles including artificial beads and bacteria.

대 식 세포에의 한 사 멸 티 모 세포 침 몰의 실험 분석

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