We thank Colin Symons and James Wright for technical assistance. This work was supported by seed funding grant (WSU) to Y.B. and the innovation office at Western Sydney University. M.C. is supported by ARC fellowship (DECRA).

プロトコルは、以下のC57BL / 6及びC3H /彼が（retinally縮退）マウス神経組織の調製を記載するが、同様の技術が他の種にも適用することができます。すべての動物は健康で、温度、湿度、12時間の明/暗サイクルの標準的な条件で処理、食料と水に自由にアクセスし、任意の意図ストレス刺激なしでした。全ての実験は承認され、西シドニー大学の動物実験倫理委員会に従って実行し、動物使用とケアの指針（動物研究機関＃A9452、＃A10396と＃のA8967）に応じました。 1.脳スライスの準備<ol><li>イソフルラン（5％）の吸入によって動物を麻酔し、げっ歯類のギロチンを使用して首を切ります。以前に9に記載されているように 、すぐに脳を取り出して、氷冷生理溶液（aCSFの）（mM単位）を含むにそれを置く：125のNaCl、MgCl 2を、1.25のNaH 2 PO 4、2のCaCl 2、25 2.5のKCl、1NaHCO 3、25デキストロース、およびカルボゲン（95％O 2/5％CO 2の混合物; 310 mOsmで、pH7.4）で飽和しました。 </li><li>振動ミクロトームで厚さ300μm、関心領域で、脳スライスをカット。 </li><li>以前に10、11を説明したように、カルボゲンフロー、および温度-密接にpHレベルを監視し、制御し、カスタム構築されたインキュベーションシステム（7.4のpH 7.2）にスライスを転送します。 </li><li> 15のために35℃に初期チャンバー温度を設定- 30分、その後、ゆっくりと15に減らす- 図1Cに示すように、16°C。必要になるまで、どちらの電気生理学やイメージングのために、インキュベーションシステムでスライスをインキュベートします。 注：スライスがカルシウムイメージングのために使用される場合、RT下の組織を冷却する前に、以下の手順に従ってください。 </li></ol> 2.網膜ホールマウントの準備と内境界膜の除去<ol><li>通常のいずれかの下で網膜wholemountsを準備実験室の照明条件や暗赤色/赤外光。 </li><li>頸椎脱臼し、すぐに摘出するの目に動物を安楽死させます。 125のNaCl、25のNaHCO 3、3のKCl、2のCaCl 2、1のMgCl 2、10グルコース、0.5 L-グルタミン、および：小さな鋸状縁に沿ってカットし、（MM）を含むエイムズメディア、またはaCSFのいずれかで場所を作りますRTで、カルボゲン（pHが7.4;〜300mOsmで95％O 2/5％CO 2混合物）で飽和します。 </li><li>すぐに小さなはさみで鋸状縁に沿って切断し、ピンセットでレンズと硝子体を除去することにより、角膜、レンズ及び硝子体を除去します。 RTでのインキュベーションシステムに組織を配置します。 注：網膜組織は15にゆっくりと温度低下した後、アイカップに維持することができる - 必要になるまで培養システムにおける&gt; 24時間、16℃。 </li><li> ILMを削除するには、30 U / mLのパパイン、1 mMのL-シスチン、Earl&#39;s-で0.5 mMのEDTA及び0.005％DNアーゼを含む小さなガラスジャーに網膜を含むアイカップを転送37℃での平衡塩類溶液（BSS）で20分間。蓋を介した溶液に95％O 2/5％CO 2を適用したが、バブルがありません。若い動物（&lt;6週間）から組織を使用している場合、半強の溶液を希釈。 <ol><li>アールのBSSで10分間、オボムコイド（10ミリグラム/ mL）およびBSA（10 mg / mlで）溶液中で組織を配置することによって、酵素消化を停止します。インキュベーションシステムへの転送前にaCSFで徹底的に組織を洗浄し、15に温度を下げる - 16°C。 </li></ol></li><li>必要になるまでアイカップに網膜組織を維持します。顕微鏡に転送するために、アイカップから網膜を分離し、カミソリの刃を持つ4片に切断。網膜全体が必要な場合、それは平らにすることを可能にする網膜の周囲に4つの小さなカットを行います。 注：イメージング実験、インキュベーションシステムに転送する前に、カルシウム染料と負荷については、以下を参照してください。 </li></ol> 3.インキュベーターで組織を維持<ol><lipHおよび温度の測定のためのプローブを含むメインチャンバ内&gt;置き組織（ 図1A、B）。 </li><li>溶液中の浮遊菌を放射するために、（5W / 2P殺菌UVランプ、254 nm）の主室から単離し、UVC光W 1.1にさらされ（以前に12を説明したように構築された、UVC室）は、第2のチャンバを通してaCSFのを循環させる（ 図1A）。 aCSFのの過度の加熱を避けるために30分 - 15分ごとに15の間と26を様々な時間でONになり、ランダム機能を使用して、プログラマブルタイマを介して制御UVC光タイミング。 </li><li>以前に12を報告したように12ミリリットル/分UVCチャンバ内の流量を設定します。神経組織に損傷を与えることができ、チャンバの外側UVC照射を防止するためにアルミホイルでUVCチャンバを覆います。 注：暗順応網膜組織のために、光を排除するために主室にカスタムメイドのカバーを適用します。 </li><li> circulaに蠕動ポンプを使用してくださいTE 2室を通して溶液（aCSFの）と0の範囲内の所望の温度まで冷却するか、主チャンバを加熱のいずれかにペルチェクーラーの熱電冷却板 - 50°C。長期的な生存のために16°C - 最適な組織のインキュベーションのために、15を使用します。 </li></ol> 4.カルシウム色素添加<ol><li>個々の研究者の好みに基づいてカルシウム色素を選択します。ここでは、フラ - 2AM、フルオ8AMまたはのFluo-4AMを使用します。しかし、この方法は、他の色素にも適用することができる：50μL、10分間超音波処理の最終体積に1mM溶液と1％のブロックコポリマー（ 例えば 、プルロニック酸-127）にDMSO中のカルシウム色素を溶解します。 </li><li>網膜10μM、脳切片0.01％のブロックコポリマー、及び20μM（網膜）、0.02％のブロックコポリマーの最終濃度にaCSFの解決策を加えます。 F; 37°C（のFura-2 AM）または室温で（のFluo-4 AMで若い動物、45分間バスへの負荷から網膜（パパイン処理）と脳スライスで羅-午前8時）。 <ol><li>成体動物、（&gt; 12週）に直接脳スライス上に色素（50μL）をピペット、深い層への染料の良好な浸透を可能にするために75分間維持します。 </li><li>色素のインキュベーション中に水没スライスの十分な酸素化を確実にするために、aCSFの2.5mLの中に希釈したカルシウム色素と、閉じた蓋（直径2.5センチ、3.5センチメートルの高さの円形の瓶）を有するガラス装填室を準備します。 95％O 2/5％CO 2で連続的に含酸素。バブルしないでください。 </li></ol></li><li>色素負荷の後、インキュベーションシステムにaCSFの転送で組織を洗う、ゆっくりと15に温度を下げる - 実験的な使用まで、16°C。 </li></ol> 5.電気生理学的記録とイメージング<ol><li>顕微鏡下で浸漬記録チャンバー内の組織を置き、そして4の流量で酸素化aCSFので灌流 - 5ml /分のいずれかで、室温で（〜22℃）または生理的温度（〜35℃）。ホル延伸され、金や白金線のU字型のピース全体に接着されたナイロン又は金糸で作られた &#39;&#39;ハープ &#39;&#39;特注を使用して、代わりにD組織。 </li><li>電気生理学の場合： <ol><li> 5-6MΩの最後の抵抗を達成するためにマイクロピペットプラーを使用して、1.5ミリメートル（1.19ミリメートルのID）ホウケイ酸ガラスから記録ピペットを準備します。 </li><li>以前に13を説明したように、内部の溶液4μLとCCDカメラを用いた赤外線微分干渉コントラスト（IR-DIC）の下で細胞を可視化- 3でピペットを埋めます。細胞内液は慎重に実験的な成果を達成するために、各実験に合わせて調整する必要があります。 </li><li>ポジションピペットは、正圧を維持しながら、マイクロマニピュレーターを用いて細胞の膜上に、ピペットホルダーの吸引口を介して印加されます。 ILMは、網膜から削除されているので、事前膜削れは必要ありません。ピペットは、細胞になると、緩やかな負の適用ピペットへの圧力がギガオームのシールを達成します。その後、負圧の短い量の細胞膜を破裂。 </li><li>必要に応じて標準的な技術を用いて、全細胞の電流または電圧クランプ記録を行います。 </li></ol></li><li>カルシウムイメージング： <ol><li>フラ-2のレシオメトリックイメージングのために、340 nmおよび380 nmでの励起波長を提供するために、超高速波長スイッチャーを使用しています。 510±20nmの発光フィルターを介して個々の細胞から放出された光を通過し、高感度、高速デジタルカメラで取り込みます。 </li><li> 550 nmのバンドパスフィルタ - 515を介して、490 nmのバンドパスフィルタと、放出された光 - のFluo-4、フィルタ励起460を通過する光の単一励起波長のために。最速かつ最も感度の高い記録のために、このような高速デジタルカメラを使用しています。必要に応じて画像を取得します。 </li><li>単一波長（フルオ4）で、または波長比のいずれかを使用して、時間の関数としての蛍光の変化を測定します以前8、14に記載の方法（のFura-2）、。 </li></ol></li></ol>

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Yossi Buskila and Paul Breen declare that they are co-owners of PAYO Scientific Pty Ltd, a company specialized in building incubation systems for acute neural tissue. All other authors report no financial interests or potential conflicts of interest related to the current study.

この記事では、これにより、実験の目標を完了するために必要な動物の数を減らすこと、イメージングおよび電気生理学的実験のために急性神経組織の生存能力を拡張するために、インキュベーション方法が記載されています。二つの主要なプロセスは、時間をかけて神経組織の劣化を支配：ⅰ）増加した細菌レベル、および解放細菌内毒素それに伴う増加、および外傷性スライシング手順10を次のii）の興奮毒性。急性神経組織は、環境に無防備であるように、pH、温度および細菌レベルの綿密なモニタリングを通じて組織環境の厳しい規制は、細胞活性だけでなく、ネットワークの整合性を維持するために必須です。解剖し、組織治療（パパイン消化、カルシウム色素負荷）は、実験時間の短縮を引き起こし、完了するまでに2時間以上かかることがあります。しかし、組織は測定可能な損失なしで&gt; 24時間の培養系で維持することができるので、私nは生存率7、 図8は 、この調製物は、唯一の結果の&gt; 24時間を得るために、一度に完了する必要があります。動物16の倫理的な使用のための指針を提供することを目的とした3Rの戦略（置換、還元、改良）の一部として、この方法は、実験のこれらのタイプで使用される動物の数を減少させる上で大きな影響を与えます。 網膜ホールマウント組織のILMの消化は、パッチクランプ記録とバスアプリケーションによるユビキタスカルシウム色素負荷のためのGCL中の細胞の容易な標的化を可能にします。これらの技術は、ILMがはるかに厚いとガラスピペットでこすることによって違反が困難である縮退網膜のために特に有用です。さらに、パパイン調製物は、GCLにギャップジャンクション結合細胞から以前には不可能であったものを記録するために2つの電極を使用して対になった細胞記録を実行するための方法を提供します。しかしながらK +の受容体の発現をパパイン6と解離以下の光受容体で変更されることが示されているように、パパイン消化は、おそらく正常な網膜の生理学上のいくつかの効果を有します。網膜のアーキテクチャが影響されることも可能です。 Velteとマスランドは、いくつかのRGCのSOMAのと樹状突起がILMを除去するためのパパイン処理により被害を受けたものの、RGCは、ほとんどの神経細胞における細胞体から遠位樹状突起から、彼らは成功した細胞の構造的完全性を示し、記録することができることを示したと5を処理します 。重要なことには、上述したように、網膜色素上皮（RPE）および強膜に取り付けられた網膜を残し、パパイン拡散から外側の網膜を分離し、このプロトコルは、WT網膜に適用した場合、感光体外側セグメント上の任意の悪影響を低減することができます。両方のインスタンス、パパイン処理、またはILMのスクレイピングでは、いくつかの細胞の損傷が発生し、実験者はexperimへの適切な方法を選択する必要があります内部の質問。

電気生理学と機能イメージング（カルシウム、電位感受性色素）は、神経科学の中で最も一般的に使用される実験技術の2つです。ここで検討する脳スライス標本および網膜ホールマウントは、麻酔薬や筋弛緩からの汚染することなく、電気生理学的特性およびシナプスの接続性を調べるための手段を提供します。脳スライスおよび網膜ホールマウントは、特定の回路と脳ネットワーク1の研究を可能にする、培養物又は細胞ホモジネートとは異なり、その構造的完全性を維持します。単離された組織からの記録は、心拍や呼吸に関連した動きとしてin vivoでの録音に比べて利点が排除されています。また、直接可視化は、標的とする細胞の特定のクラス、および薬理学的ツール2、3の局所適用を可能にします。 パッチクランプ記録とカルクイウムをローディング染料網膜ホールマウントでは、網膜神経節細胞（RGC）層をカバーし、細胞への直接アクセスを防止膜（ILM）を、制限内の存在によって複雑になります。通常、この膜は、単一のセルにギガオームシールのパッチピペットと形成の直接適用を可能にするために、ガラスピペットで削り取られています。また、浴適用カルシウム色素は、ILMと交差しないとのいずれか逆行視神経5で次の注射を輸送または組織6を介して電気穿孔し、この膜4の下に注射しなければなりません。網膜色素変性症、RD / rdマウスのげっ歯類モデルを利用する場合また、ILMは厚く、より不可解です。ここでは、両方のユビキタスカルシウム色素ローディングを可能にするために、酵素消化7でILMを除去する技術、およびパッチクランプrecordiのための網膜神経節細胞への直接アクセスを使用しますNGS 8。 脳スライスまたは網膜ホールマウントのいずれかから成功した記録は、生存可能な神経組織の切開およびインキュベーションに依存します。一般的に、組織は、実験の朝に抽出し、それを記録するために使用されるまで、人工脳脊髄液（aCSFの）中でインキュベートされます。この時間ウィンドウ以下の重大な劣化で、8時間 - 通常、組織は、6のための実行可能なままです。しかし、脳スライスとホールマウント網膜の準備の両方は、通常、この短い期間の中から記録することができるよりも多くの組織を作り出します。したがって、組織は、多くの場合、一日の終わりに廃棄され、切開は、その後の日に再び終了します。これは、別の動物を利用し、セットアップおよび解剖/繰り返し染色の〜2時間されていることを意味します。次のプロトコルが利用されている少数の動物を意味し、24時間以上のために神経組織の寿命を延長するための方法を説明し、より多くの実験時間が利用可能です。組織の生存率ワット電気生理学的特性およびカルシウム動態を記録を通じて評価し、これらのプロパティは、&lt;4時間及び&gt; 24時間postdissection間の区別がつかなかったよう。 これらの結果は、カルシウムイメージングと電気生理学的記録により評価されるように、長時間のインキュベーション後、無傷で機能的単一細胞の特性であるが、ネットワーク活動だけでなくことを示し、&gt; 24時間postdissection変更されません。さらに、我々は、カルシウム色素は、任意の有害な効果を引き起こすことなく、長期間の細胞内に残ることができることを示しています。このプロトコルの適用は、外部環境を高度に調節された後、急性神経組織における神経細胞の機能的活性は、長期間維持することができることを示しています。組織の生存率が異なるインキュベーションプロトコルによる実験室間で大きく変化する。また、この方法は、急性neuの健康状態の変動を低減するために適用されるべき理想的なパラメータのゴールドスタンダードを確立しますRONAL組織。

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich VETEC</td><td>V800372</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-D-glucamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2554</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Papain Dissociation System</td><td>Worthington&amp;nbsp;</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide anhydrous</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 Low UV absorbance*</td><td>Life technologies</td><td>P-6867</td><td>20% solution in DMSO&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fura-2 AM&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Anaspec</td><td>84017</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>F23917</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8 AM</td><td>Abcam</td><td>Ab142773</td><td></td></tr><tr><td>Vibrating blade microtome&amp;nbsp;</td><td>Leica Biosystem</td><td>VT1200 S</td><td>Equiped with Leica&amp;rsquo;s Vibrocheck&amp;trade; measurement device&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Antivibration table</td><td>Kinetic Systems Vibraplane&amp;nbsp;</td><td>Vibraplane 9100/9200&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fixed Stage Upright Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Objective</td><td>Olympus</td><td>XLUMPlanFLN 20x/1.00w</td><td>20X&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microscope Objective</td><td>Olympus</td><td>LUMPlanFLN 60x/1.00w</td><td>60X</td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Andor</td><td>Ixon +</td><td></td></tr><tr><td>High speed wavelength switcher</td><td>Sutter instrument</td><td>Lambda DG-4&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition system</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&amp;reg; System</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>BF150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrode puller</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Flaming/Brown type micropipette puller</td></tr><tr><td>Recording/perfusion chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-40LP</td><td>Low Profile Open Bath Chambers</td></tr><tr><td>Software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Andor iQ Live Cell Imaging Software</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>Braincubator</td><td>Payo Scientific</td><td>BR26021976</td><td>www.braincubator.com.au</td></tr><tr><td>Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler</td><td>TE Technology</td><td>CP-121</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Controller</td><td>TE Technology</td><td>TC-36-25 RS232</td><td></td></tr></tbody></table>

prolonged incubation of acute neuronal tissue for electrophysiology and calcium-imaging

切開後8時間 - 急性神経組織標本、脳スライスおよび網膜ホールマウントは、通常は6維持することができます。これは、実験時間を制限し、研究ごとに使用されている動物の数を増加させます。このような浴適用染料との長時間のプレインキュベーションを必要とするカルシウムイメージングとしてこの制限は、具体的な影響のプロトコルを。 3内の指数関数的な細菌の成長 - スライス後の4時間は、しっかり組織の健康の低下と相関しています。本研究では、成長因子を含む抗生物質、滅菌手順、または組織培養培地を必要とせずに長時間（&gt; 24時間）のために実行可能な神経組織を維持するために、急性の製剤中の細菌の増殖を制限するための方法が記載されています。 UV照射による細胞外液を循環し、15でカスタム保持室で組織を維持することによって - 16°C、組織には電気生理学的特性の違い、またはカルシウムのsiを示しません&gt; 24時間postdissectionにおける細胞内カルシウム色素を通してgnaling。これらの方法は、急性神経組織を使用してそれらのための実験時間を延長するだけでなく、実験的な目標を完了するために必要な動物の数を減らすことができますし、急性神経組織の培養のためのゴールドスタンダードを設定します。

インキュベーション中にaCSFの細菌負荷と温度の厳密な調節は、神経組織の生存率を維持することが不可欠です。 16°C（ 図1） -これは、UVC光を照射し、15でaCSFの温度を維持することにより最適化することができます。環境条件の記録と実験者を提供し、続く場合は、間の変動を減少させる神経組織を、インキュベート時にこのようなパラメータのゴールドスタンダードを提供し、さらに、aCSFの切手（ 図1C APS）はパラメータ（pHおよび温度）実験。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55396/55396fig1.jpg" /> 組織環境の厳しい規制を有効にします。図1】インキュベーションシステム。インキュベーションシステムの概略図では、冷却ペルチェプレート、メインチャンバ、蠕動ポンプおよびUVCチャンバから成ります。 B、aCSFのの入口と出口のポイントだけでなく、カルボゲン入口、温度およびpHプローブを示す主室の側面図。示されるように、組織は、メッシュ上に配置されます。すべての測定プローブは、構造的安定性を可能にするために、蓋に取り付けられています。インキュベーション中にaCSFの温度およびpHを記述するC、aCSFのパラメータスタンプ。 D、測定プローブ用の取り付け穴を示す主室の平面図。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55396/55396fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 組織の生存率は、ネットワーク活動の手段（ 図2）、並びにカルシウム応答（ 図2B、C）を含む様々なイメージング法によって測定することができます。 、局所的に、ネットワークのアクティビティを監視するために、我々はaCSFのは塩化カリウム（30mMの塩化カリウム）を高濃度に含む適用しましたその適用のK +の近傍内のニューロンとグリアの脱分極につながりました。この脱分極は、細胞生存率のための生理的な指標となるカルシウムトランジェント（ 図2B、C）及びスパイク活動（ 図 2D）の増加によって観察することができます。我々の結果は、培養系で&gt; 24時間インキュベートした切片において活性をスパイクする「新鮮な」スライスがより短い期間（; 図2D&gt; 4時間）インキュベートしたと同様であったことを示しています。また、静止膜電位、入力抵抗、時定数、および活動電位を含むパッシブとアクティブの両方の膜特性の細胞内電気生理学的記録を通じて監視した個々のニューロンの生存率は、文献15に報告されたパラメータに匹敵した（ 図2E、F ）。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55396/55396fig2.jpg" /> 長時間のインキュベーション後の脳切片の図2.電気生理学的およびカルシウムのプロパティ。ネットワーク活動を測定するために使用される2つの細胞外の記録電極をスライスした後、28時間に採取脳切片の、イメージ。第3の電極が（アスタリスク）のKCl、30mMのパフに使用されます。 B、塩化カリウムの浴適用後の細胞内カルシウムトランジェントの増加を示した&gt; 24時間のFluo-4AMを搭載したスライスのタイムラプス画像、。 C、簡単なのKClのアプリケーション（30 mMの、1秒）以下の細胞内カルシウムトランジェント。レッド-平均信号、グレー- Bに示すように、単一の細胞中のカルシウムトレース。 D、塩化カリウム（赤矢印）の適用前と後のネットワーク活動の細胞外生理的記録は、「新鮮な」スライス（&lt;4時間postdissectionの間に大きく変化しませんでした）、インキュベーター中で&gt; 24時間インキュベートしたもの。脱分極と[K +]の増大に応える実行可能なニューロンを示すのKClアプリケーションの直後に活動をスパイクの増加に注意してください。 E＆F、パッシブ（E）、およびインキュベーションシステムにおける2時間のインキュベーション（青トレース）または26時間（黒のトレース）以下の錐体ニューロンの活性（F）膜特性。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55396/55396fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> retinally縮重RD / rdマウスのホールマウント網膜の神経節細胞層の細胞への直接アクセスを提供するために、ILMは、酵素パパイン7,8により消化しました。消化後、RGCを変位アマクリン細胞が明らかにウント可視化することができますER DIC照明（ 図3A）、および細胞がILMの事前削れせずにパッチクランプ記録の対象とすることができます。 RGCからの代表的な電流クランプ記録は、 図3Bに示されています。パッチピペットを介して細胞の脱分極は、パパイン処理した後の細胞の生存率を示し、用量依存性の活動電位発生を引き起こしました。 ILMの除去はまた、大規模なを意味する、のFura-2AM（ 図3D）とF 0へ340/380 nmの比相対の大幅な増加と30のKClアプリケーションに応答した細胞と神経節細胞層（GCL）のユビキタス染色を許可しました細胞内カルシウム濃度（ 図3E）に増加。カルシウムレベルはその後、同様の振幅応答を生成するように刺激することができ、刺激と細胞以下のベースラインに戻りました。さらに、これらの応答は、Rと区別できませんでしたetinaeは&lt;4時間及び&gt; 24時間postdissection（ 図3F、G）で記録します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55396/55396fig3.jpg" /> 図3：網膜ホールマウントにおける電気生理学的およびカルシウムレコーディング。パパイン消化後のGCLにおける網膜神経節細胞からパッチクランプ記録の、微分干渉コントラスト画像。それぞれ50、100、150 pAので脱分極したときBは 、細胞は、用量依存性のスパイク応答を保持しています。 C＆D、フラ- 2AMの浴適用前の内境界膜の除去は、網膜神経節細胞のユビキタス読み込み、画像は380 nm励起で撮影できます。 Eは 、30mMのKClをASCFが印加されると、染色された細胞の85％が340/380比の増加に応答しました。 F＆G、30のKCl適用後のベースラインに340/380比リターンの増加（赤いバー）細胞は、その後の刺激に対して解剖以下両方&lt;4時間及び&gt; 24時間反応します。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55396/55396fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

8時間 - 身体から取り出されると、神経組織を大幅に6後の組織の最終的な劣化につながる、環境条件によって影響されます。密接に監視し、組織の細胞外の環境を調節する独特の培養方法を用いて、組織生存率を有意に&gt; 24時間延長することができます。

電気生理学およびカルシウムイメージングのための急性神経組織の長期のインキュベーション

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

prolonged-incubation-acute-neuronal-tissue-for-electrophysiology

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K ビュー.  Western Sydney University.  8時間 - 身体から取り出されると、神経組織を大幅に6後の組織の最終的な劣化につながる、環境条件によって影響されます。密接に監視し、組織の細胞外の環境を調節する独特の培養方法を用いて、組織生存率を有意に> 24時間延長することができます。 

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Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., homosynaptic facilitation) 1. These hypotheses can be tested by simultaneously monitoring changes in intracellular calcium and alterations in synaptic efficacy. We demonstrate how this can be accomplished by combining calcium imaging with intracellular recording techniques. Our experiments are conducted in a buccal ganglion of the mollusc Aplysia californica. This preparation has a number of experimentally advantageous features: Ganglia can be easily removed from Aplysia and experiments use adult neurons that make normal synaptic connections and have a normal ion channel distribution. Due to the low metabolic rate of the animal and the relatively low temperatures (14-16 &deg;C) that are natural for Aplysia, preparations are stable for long periods of time. 
To detect changes in intracellular free calcium we will use the cell impermeant version of Calcium Orange 2 which is easily 'loaded' into a neuron via iontophoresis. When this long wavelength fluorescent dye binds to calcium, fluorescence intensity increases. Calcium Orange has fast kinetic properties 3 and, unlike ratiometric dyes (e.g., Fura 2), requires no filter wheel for imaging. It is fairly photo stable and less phototoxic than other dyes (e.g., fluo-3) 2,4. Like all non-ratiometric dyes, Calcium Orange indicates relative changes in calcium concentration. But, because it is not possible to account for changes in dye concentration due to loading and diffusion, it can not be calibrated to provide absolute calcium concentrations. 
An upright, fixed stage, compound microscope was used to image neurons with a CCD camera capable of recording around 30 frames per second. In Aplysia this temporal resolution is more than adequate to detect even a single spike induced alteration in the intracellular calcium concentration. Sharp electrodes are simultaneously used to induce and record synaptic transmission in identified pre- and postsynaptic neurons. At the conclusion of each trial, a custom script combines electrophysiology and imaging data. To ensure proper synchronization we use a light pulse from a LED mounted in the camera port of the microscope. Manipulation of presynaptic calcium levels (e.g. via intracellular EGTA injection) allows us to test specific hypotheses, concerning the role of intracellular calcium in mediating various forms of plasticity.

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

We demonstrate how changes in the intracellular free calcium concentration and synaptic efficacy can be simultaneously monitored in a ganglion preparation of Aplysia. We image intracellular calcium using a fluorescent dye, Calcium Orange, and induce and monitor synaptic transmission with sharp (intracellular) electrodes.

軟体​​動物細胞内カルシウム濃度とシナプス伝達効率での変更のモニタ<em&gt;アメフラシ</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

神経科学

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

CA1錐体ニューロンにおけるグルタミン酸のUV媒介焦点アンケージングと組み合わせることで、多光子細胞内ナトリウムイメージング

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

膠様質ニューロンの細胞パッチク ランプ記録のため急性脊髄スライスの準備

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of homeostasis, undergo rapid morphological changes. For example, a laser lesion induces in a few minutes an oriented growth of microglial processes, also called &#34;directional motility&#34;, toward the site of injury. A similar effect can be obtained by delivering locally ATP or serotonin (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In this article, we describe a protocol to induce a directional growth of microglial processes toward a local application of ATP or 5-HT in acute brain slices of young and adult mice and to image this attraction over time by multiphoton microscopy. A simple method of quantification with free and open-source image analysis software is proposed. A challenge that still characterizes acute brain slices is the limited time, decreasing with age, during which the cells remain in a physiological state. This protocol, thus, highlights some technical improvements (medium, air-liquid interface chamber, imaging chamber with a double perfusion) aimed at optimizing the viability of microglial cells over several hours, especially in slices from adult mice.

Microglia, the resident immune cells of the brain, respond quickly with morphological changes to modifications of their environment. This protocol describes how to use two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward serotonin or ATP in acute brain slices of mice.

ATP または急性脳スライスにおけるセロトニンに対するミクログリアのプロセスの魅力の二光子励起イメージング

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Establishing a Whole-Cell Configuration for Two-Photon Calcium Imaging of Brain Slices

Source: Camir&#233;, O., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/56776">Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates a protocol for whole-cell patch-clamp recording and two-photon calcium imaging in brain hippocampal slices. This method allows to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of different neuronal types in acute brain slices.

脳切片の2光子カルシウムイメージングのための全細胞構成の確立

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review.
1. Preliminary Preparation (Optional: ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

Measuring Neural Activity in a Mouse Brain Slice after Prolonged Incubation

Source: Cameron, M. A., et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/55396">Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging.</a> J. Vis. Exp. (120), (2017)
This video demonstrates a technique for measuring neuronal activity in mouse brain slices using calcium imaging and electrophysiological recordings. By perfusing the tissue with potassium ions and recording intracellular calcium changes through high-speed digital imaging, this method reveals real-time neuronal responses.

長期インキュベーション後のマウス脳スライスの神経活動の測定

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Calcium Dye Loading

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A Technique for the Prolonged Incubation of Neuronal Tissue of the Retina

Source: Cameron, M. A., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/55396">Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a method for prolonged incubation of neuronal tissue of the retina. Eyecups containing retina are obtained from a mouse eye; the inner limiting membrane (ILM) is enzymatically digested to expose the neuronal cells of the retina, and either the treated eyecup or the isolated retina is transferred to a specialized incubator for prolonged incubation at a low temperature.

網膜の神経組織の長期インキュベーション技術

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Retinal Wholemount Preparation ...

電気生理学およびカルシウムイメージングのための急性神経組織の長期のインキュベーション

要約

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軟体動物細胞内カルシウム濃度とシナプス伝達効率での変更のモニタ

同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

CA1錐体ニューロンにおけるグルタミン酸のUV媒介焦点アンケージングと組み合わせることで、多光子細胞内ナトリウムイメージング

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウムイメージング

膠様質ニューロンの細胞パッチクランプ記録のため急性脊髄スライスの準備

ATP または急性脳スライスにおけるセロトニンに対するミクログリアのプロセスの魅力の二光子励起イメージング

脳切片の2光子カルシウムイメージングのための全細胞構成の確立

長期インキュベーション後のマウス脳スライスの神経活動の測定

網膜の神経組織の長期インキュベーション技術

電気生理学およびカルシウムイメージングのための急性神経組織の長期のインキュベーション

要約

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軟体​​動物細胞内カルシウム濃度とシナプス伝達効率での変更のモニタ

同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

CA1錐体ニューロンにおけるグルタミン酸のUV媒介焦点アンケージングと組み合わせることで、多光子細胞内ナトリウムイメージング

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

膠様質ニューロンの細胞パッチク ランプ記録のため急性脊髄スライスの準備

ATP または急性脳スライスにおけるセロトニンに対するミクログリアのプロセスの魅力の二光子励起イメージング

脳切片の2光子カルシウムイメージングのための全細胞構成の確立

長期インキュベーション後のマウス脳スライスの神経活動の測定

網膜の神経組織の長期インキュベーション技術

軟体動物細胞内カルシウム濃度とシナプス伝達効率での変更のモニタ

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウムイメージング

膠様質ニューロンの細胞パッチクランプ記録のため急性脊髄スライスの準備