Name: prolonged incubation of acute neuronal tissue for electrophysiology and calcium-imaging
Uploaded: 2017-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
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We thank Colin Symons and James Wright for technical assistance. This work was supported by seed funding grant (WSU) to Y.B. and the innovation office at Western Sydney University. M.C. is supported by ARC fellowship (DECRA).

Das Protokoll unten beschreibt die Herstellung von C57BL / 6 und C3H / He (retinally degeneriert) Maus neuronalem Gewebe, aber ähnliche Techniken können auf andere Arten angewendet werden. Alle Tiere gesund und Umgang mit Standardbedingungen von Temperatur, Feuchtigkeit, 12 h Hell / Dunkel-Zyklus, den freien Zugang zu Futter und Wasser waren, und ohne beabsichtigte Stressreize. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den westlichen Sydney University Animal Care und Ethikkommission und nach der Nutzung von Tieren und Pflegerichtlinien (Animal Research Authority # A9452, # A10396 und # A8967) genehmigt und durchgeführt. 1. Gehirn Scheibe Vorbereitung <ol><li> Anesthetize das Tier durch Inhalation von Isofluran (5%) und enthaupten ein Nagetier Guillotine verwenden. Entfernen Sie schnell das Gehirn, wie zuvor 9 beschrieben und legen Sie sie in eiskalter physiologischer Lösung (aCSF) enthält (in mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 2 CaCl 2, 25NaHCO 3, 25 Dextrose und gesättigt mit Carbogen (95% O 2/5% CO 2 -Gemisch; 310 mOsm, pH 7,4). </li><li> Schneiden Sie Hirnschnitten, in der Region von Interesse, 300 &amp; mgr; m dick mit einem vibrierenden Mikrotom. </li><li> Übertragen Scheiben zu einem speziell angefertigten Inkubationssystems , die eng überwacht und steuert pH - Werte (pH 7,2 bis 7,4), Carbogen Strömung und Temperatur wie zuvor 10 beschrieben, 11. </li><li> Eingestellten Anfangskammertemperatur auf 35 ° C für 15 - 30 min, und dann reduzieren langsam auf 15 - 16 ° C , wie in 1C gezeigt. Dann inkubieren Scheiben in Inkubationssystems bis sie benötigt werden, entweder für die Elektrophysiologie oder Bildgebung. HINWEIS: Wenn Scheiben werden für Calcium-Bildgebung verwendet werden, unter Schritte folgen, bevor Gewebe unterhalb RT abgekühlt wird. </li></ol> 2. Retinal Wholemount Vorbereitung und Membrana limitans Removal <ol><li> Bereiten Sie retinalen wholemounts entweder unter normalenLaborlichtverhältnissen oder schwach rot / Infrarot-Licht. </li><li> Euthanize Tier durch Genickbruch und sofort enucleate Augen. Machen Sie einen kleinen Schnitt entlang der Ora serrata und Ort entweder in Ames Medien oder aCSF enthält (mM): 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 3 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 10 Glucose, 0,5 L-Glutamin und sättigen mit Carbogen (95% O 2/5% CO 2 -Gemisch; ~ 300 mOsm, pH 7,4) bei RT. </li><li> Entfernen Sie unverzüglich die Hornhaut, Linse und Glaskörper durch entlang der Ora serrata mit einer kleinen Schere schneiden und die Linse und Glaskörper mit einer Pinzette entfernen. Platzieren Gewebe im Inkubationssystem bei RT. HINWEIS: Retinal Gewebe kann in der Augenbecher, nach langsamer Temperaturabsenkung bis 15 gehalten werden - 16 ° C, für&gt; 24 h in Inkubationssystems bis benötigt. </li><li> Um die ILM entfernen, übertragen Sie die Augenmuschel die Netzhaut zu einem kleinen Glas mit 30 U / ml Papain, 1 mM L-Cystin, 0,5 mM EDTA und 0,005% DNase in Earl&#39;s- enthältBalanced Salt Solution (BSS) bei 37 ° C für 20 min. Anwenden 95% O 2/5% CO 2 in die Lösung durch den Deckel , aber nicht Blase. Wenn Gewebe von jungen Tieren (&lt;6 Wochen) verwenden, verdünnen die Lösung auf halber Stärke. <ol><li> Stoppen enzymatischen Verdau, durch das Gewebe in einer Ovomucoid Plazieren (10 mg / ml) und BSA (10 mg / ml) -Lösung für 10 min in Earl BSS. Wash Gewebe gründlich mit aCSF vor dem Transfer zum Inkubationssystems und reduzieren Temperatur auf 15 - 16 ° C. </li></ol></li><li> Pflegen Netzhautgewebe im Auge Schale, bis sie benötigt. Für die Übertragung an das Mikroskop, isolieren die Netzhaut aus dem Auge-Tasse und schneiden in 4 Stücke mit einer Rasierklinge. Wenn die gesamte Netzhaut erforderlich ist, machen vier kleine Schnitte in der Peripherie der Netzhaut, es zu ermöglichen, flach zu liegen. HINWEIS: Für die Bildgebung Experimente, Belastung mit Calcium-Farbstoffe vor dem Transfer zum Inkubationssystems, siehe unten. </li></ol> 3. Erhaltung von Gewebe im Inkubator <ol><li&gt; Platz Gewebe in der Hauptkammer Sonden für pH und Temperaturmessungen (1A, B) enthält. </li><li> Zirkulieren aCSF durch eine zweite Kammer (UVC Kammer, aufgebaut wie zuvor 12 beschrieben) , isoliert aus der Hauptkammer und ausgesetzt zu 1,1 W UVC - Licht (254 nm, 5W / 2P Sterilisator UV - Lampe), um Bakterien zu eradiate in der Lösung schwebenden (Abbildung 1A). Steuer UVC Licht Timing über einen programmierbaren Zeitgeber ein zufälliges-Funktion, die zu Zeiten schaltet variierend zwischen 15 und 26 min alle 15 - 30 min eine übermäßige Erwärmung des aCSF zu vermeiden. </li><li> Stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit in der Kammer UVC bis 12 mL / min , wie zuvor berichtet , 12. Decken Sie die UVC-Kammer mit Aluminiumfolie zu UVC Beleuchtung außerhalb der Kammer zu verhindern, die das neuronale Gewebe schädigen können. HINWEIS: Für die dunkeladaptierten Netzhautgewebe, tragen Sie eine maßgeschneiderte Abdeckung mit der Hauptkammer Licht auszuschließen. </li><li> Verwenden Sie eine peristaltische Pumpe zu Circulate die Lösung (aCSF) durch die beiden Kammern und eine Platte thermo kalten Peltier-Kühler entweder kühlen oder die Hauptkammer im Bereich von 0 bis die gewünschten Temperaturen erhitzen - 50 ° C. Für eine optimale Gewebe Inkubation verwenden 15 - 16 ° C für die langfristige Rentabilität. </li></ol> 4. Calcium Farbstoffbeladung <ol><li> Wählen Calcium Farbstoffe basierend auf der Präferenz des einzelnen Forscher. Hier verwenden wir Fura-02.00, Fluo-08.00 Uhr oder Fluo-04.00. Jedoch kann dieses Verfahren auf andere Farbstoffe verwendet werden wie auch: Man löst Calcium Farbstoffe in DMSO auf eine 1 mM - Lösung und 1% Blockcopolymere (beispielsweise Pluronsäure-127) bis zu einem Endvolumen von 50 ul und beschallen für 10 min. </li><li> Hinzufügen Lösung aCSF bis zu einer Endkonzentration von 10 uM, 0,01% Blockcopolymere für Hirnschnitten und 20 uM (Netzhaut), 0,02% Blockcopolymere für die Netzhaut. In Retinae (Papain behandelt) und Hirnschnitten von jungen Tieren, Last auf das Bad für 45 min bei 37 ° C (Fura-2 AM) oder bei RT (Fluo-04.00; Fluo-08.00 Uhr). <ol><li> Für erwachsene Tiere, (&gt; 12 Wochen) pipettieren die Farbstoffe (50 ul) direkt auf die Hirnschnitten und pflegen 75 min eine bessere Durchdringung des Farbstoffs in die tiefen Schichten zu ermöglichen. </li><li> Um eine ausreichende Sauerstoffversorgung des untergetauchten Scheibe während der Farbstoff Inkubation sicherzustellen, bereiten eine Glasladeraum mit einem geschlossenen Deckel (Kreis Glas mit einem Durchmesser von 2,5 cm, 3,5 cm Höhe) mit Calcium-Farbstoffe, verdünnt in 2,5 ml aCSF. Oxygenat kontinuierlich mit 95% O 2/5% CO 2. Nicht Blase. </li></ol></li><li> Nach Farbstoffbeladung, waschen Sie die Gewebe mit aCSF und Transfer zum Inkubationssystems, reduzieren die Temperatur langsam auf 15 - 16 ° C bis zum experimentellen Einsatz. </li></ol> 5. Recordings und Imaging Elektrophysiologische <ol><li> Platzieren Gewebe in einem untergetauchten Aufnahmekammer unter einem Mikroskop und perfundieren mit oxygeniertem aCSF mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 4 - 5 ml / min entweder bei RT (~ 22 ° C) oder physiologischer Temperatur (~ 35 ° C). Hold das Gewebe an Ort und Stelle durch Verwendung eines benutzerdefinierten gemacht &#39;&#39; Harfe &#39;&#39;, aus Nylon oder Goldfäden gestreckt und über ein U-förmiges Stück Gold oder Platindraht geklebt. </li><li> Für die Elektrophysiologie: <ol><li> Bereiten Sie Aufnahme Pipetten von 1,5 mm (1,19 mm ID) Borosilicatglas mit einer Mikro Abzieher mit einem Endwiderstand von 5-6 MOhm zu erreichen. </li><li> Füllen Sie die Pipette mit 3 bis 4 &amp; mgr; l der internen Lösung wie zuvor 13 beschrieben und zu visualisieren Zellen unter Infrarot - Differential - Interferenz - Kontrast (IR-DIC) mit einer CCD - Kamera. Die intrazelluläre Lösung sollte sorgfältig jedem Experiment zugeschnitten werden experimentelle Ergebnisse zu erzielen. </li><li> Position Pipette, während positive Druck aufrechterhalten wird aufgebracht durch eine Ansaugöffnung auf der Pipettenhalter an der Membran einer Zelle eines Mikromanipulators verwenden. Da die ILM von der Netzhaut entfernt wurde, keine vorherige Membran Abschaben erforderlich ist. Sobald die Pipette auf die Zelle ist, gelten sanft negativDruck auf die Pipette eine Gigaohm Dichtung zu erreichen. Dann reißt die Zellmembran mit einer kurzen Menge von Unterdruck. </li><li> Machen Sie mit ganzen Zellen Strom- oder Spannungs-Clamp Messungen mit Standardtechniken als angemessen. </li></ol></li><li> Calcium-Bildgebung: <ol><li> Für ratiometrisch Bildgebung von Fura-2, eine Ultrahochgeschwindigkeits-Wellenlängenumschalter verwenden, um Anregungswellenlängen von 340 nm und 380 nm bereitzustellen. Passieren emittierte Licht von einzelnen Zellen durch ein Emissionsfilter von 510 ± 20 nm, und erfassen mit einer hohen Empfindlichkeit, Hochgeschwindigkeits-Digitalkamera. </li><li> Für einen einzelnen Anregungswellenlänge von Fluo-4, Filteranregungslicht durch einen 460-490 nm Bandpassfilter und emittiert Licht durch eine 515-550 nm Bandpassfilter. Für die schnellste und empfindlichste Aufnahme eine so hohe Geschwindigkeit Digitalkamera verwenden. Erwerben Sie Bilder nach Bedarf. </li><li> Messung der Veränderungen in der Fluoreszenz als Funktion der Zeit entweder bei einer einzigen Wellenlänge (Fluo-4) oder der Wellenlängen-Verhältnis unter Verwendung vonVerfahren (Fura-2), wie zuvor beschrieben , 8, 14. </li></ol></li></ol>

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Yossi Buskila and Paul Breen declare that they are co-owners of PAYO Scientific Pty Ltd, a company specialized in building incubation systems for acute neural tissue. All other authors report no financial interests or potential conflicts of interest related to the current study.

Dieser Artikel beschreibt eine Inkubation Methode, um die Lebensfähigkeit von akuten neuronalen Gewebe für die Bildgebung und elektrophysiologischen Experimenten zu verlängern, wodurch die Anzahl der Tiere zu reduzieren erforderlich, um experimentelle Ziele abzuschließen. Zwei Hauptprozesse regeln die Verschlechterung der neuronalen Gewebe im Laufe der Zeit: i) erhöhte Keimbelastung und die damit einhergehende Erhöhung der bakterielles Endotoxin freigesetzt, und ii) Exzitotoxizität , die das traumatische Slicing Verfahren 10 folgt. Als akute neuronale Gewebe umwelt wehrlos ist, ist strenge Regulierung der Gewebeumgebung durch eine enge Überwachung der pH-Wert, Temperatur und Bakterien Ebenen von wesentlicher Bedeutung für die Zellaktivität sowie die Integrität des Netzwerks erhalten bleibt. Dissection und Gewebebehandlung (Papainverdau, Calcium Farbstoffbeladung) über 2 h nehmen eine Verringerung der Versuchszeit abgeschlossen ist, verursacht. Da jedoch das Gewebe ohne messbaren Verlust für&gt; 24 h in Inkubationssystems gehalten werden in Lebensfähigkeit 7, 8, diese Vorbereitung muss nur einmal abgeschlossen werden erhalten&gt; 24 h der Ergebnisse. Im Rahmen der 3R - Strategie (Replacement, Reduction, Refinement) 16 auf die Bereitstellung Leitlinien für ethische Verwendung von Tieren ausgerichtet, haben diese Methode einen großen Einfluss auf die Zahl der Tiere in diesen Arten von Experimenten verwendet zu reduzieren. Die Verdauung der ILM von retinalen Gewebe Wholemount ermöglicht eine einfache Ausrichtung der Zellen in der GCL für Patch-Clamp-Aufnahmen und allgegenwärtige Kalzium Farbstoffbeladung von Bad Anwendung. Diese Techniken sind besonders nützlich für die degenerierte Retinae in dem das ILM ist viel dicker und härter, indem sie mit einer Glaspipette Abkratzen zu durchbrechen. Weiterhin stellt die Papain Zubereitung eine Weise zusammengepaßt Zellen Aufnahmen von Spalt-Übergang gekoppelt Zellen in der GCL, etwas aufzuzeichnen unter Verwendung von zwei Elektroden durchzuführen, die vorher nicht möglich war. aberPapain Verdauung hat wahrscheinlich einige Auswirkungen auf die normalen retinalen Physiologie als K + Rezeptorexpression mit Papain in Photorezeptoren folgende Dissoziation werden geändert 6 gezeigt wurde. Es ist auch möglich, dass Netzhautarchitektur beeinflusst wird. Velte und Masland zeigten , dass , obwohl einige RGC somas und Dendriten durch Papain - Behandlung beschädigt wurden die ILM zu entfernen, sie erfolgreich von RGC zum soma Dendriten in den meisten Neuronen distalen aufnehmen könnte, um die strukturelle Integrität der Zellen anzeigt und verarbeitet 5. Wichtig ist, angebracht, um die Netzhaut zu verlassen mit dem retinalen Pigmentepithel (RPE) und Sklera, wie oben beschrieben, isoliert die äußeren Netzhaut von Papain Diffusion und kann schädliche Auswirkungen auf die Photorezeptoraußensegmenten zu reduzieren, wenn dieses Protokoll zu WT retinae angewendet wird. In beiden Fällen, Papain-Behandlung oder Kratzen der ILM, werden einige Zellschäden auftreten, muss der Experimentator nach der Methode für die Experim wählenental Frage.

Elektrophysiologie und funktionelle Bildgebung (Calcium, spannungsempfindliche Farbstoffe) sind zwei der am häufigsten verwendeten experimentellen Techniken in den Neurowissenschaften. Hirnschnittpräparaten und retinale Wholemount, die hier untersucht werden, ein Mittel zur Prüfung der elektrophysiologischen Eigenschaften und synaptischer Verbindungen ohne Kontamination von Anästhetika oder Muskelrelaxantien. Hirnschnitte und Retina - Wholemount ihre strukturelle Integrität aufrechtzuerhalten, im Gegensatz zu Kulturen oder Zellhomogenisate, so dass die Untersuchung spezifischer Schaltungen und Gehirn Netzwerke 1. Aufnahmen von isolierten Gewebe haben Vorteile gegenüber in vivo Aufnahmen als Bewegungen mit dem Herzschlag und Atmung verbunden sind eliminiert. Darüber hinaus ermöglicht die direkte Visualisierung bestimmte Klassen von Zellen 2, 3 gezielte und lokale Anwendung von pharmakologischen Werkzeugen werden. Patch-Clamp-Aufnahmen und Calcium Farbstoffbeladung in retinalen Wholemount wird durch die Existenz der inneren Grenzmembran (ILM), die deckt die retinalen Ganglienzellen (RGC) Schicht kompliziert und direkten Zugang zu den Zellen verhindert. Typischerweise wird diese Membran mit einer Glaspipette abgeschabt direkte Anwendung eines Patch-Pipette und die Bildung eines Gigaohm Dichtung an einer einzigen Zelle zu ermöglichen. Darüber hinaus Bade angewendet Kalzium Farbstoffe nicht kreuzen die ILM und müssen entweder unter dieser Membran 4, retrograden Transport nach der Injektion an den Sehnerv 5 oder durch Elektroporation durch das Gewebe 6 injiziert werden. Wenn darüber hinaus ein Nagetiermodell von Retinitis pigmentosa verwendet wird , die rd / rd Maus, ist die ILM dicker und undurchdringlich. Hier verwenden wir eine Technik , um die ILM mit enzymatischen Aufschluss 7 zu entfernen , sowohl allgegenwärtige Calcium - Farbstoff-Beladung und den direkten Zugang zu retinalen Ganglionzellen für Patch-Clamp - recordi zu ermöglichenNGS 8. Erfolgreiche Aufnahmen von beiden Hirnschnitten oder retinalen Wholemount hängen von Präparation und Inkubation von lebenden Nervengewebe. Typischerweise wird Gewebe am Morgen des Experiments entnommen und in künstlichen Cerebrospinalflüssigkeit (aCSF) inkubiert, bis sie für die Aufnahmen verwendet wird. Normalerweise bleibt Gewebe lebensfähig für 6 - 8 h, mit signifikanten Abbau nach diesem Zeitfenster. beide Gehirnscheiben und Präparate jedoch in der Regel Wholemount retinae produzieren mehr Gewebe als kann innerhalb dieser kurzen Zeitspanne aufgezeichnet werden. Folglich wird Gewebe oft am Ende des Tages verworfen und die Präparation wird wieder an den nachfolgenden Tagen abgeschlossen. Das bedeutet, ein anderes Tier wird verwendet, und ~ 2 h Setup und Dissektion / Färbung wiederholt. Das folgende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Verlängerung der Lebensdauer von neuronalem Gewebe für mehr als 24 h, was bedeutet weniger Tiere verwendet werden, und Versuchszeit zur Verfügung steht. Gewebeviabilität wwie beurteilt durch elektrophysiologischen Eigenschaften der Aufnahme und Kalziumdynamik, und diese Eigenschaften waren nicht zu unterscheiden zwischen &lt;4 h und&gt; 24 h postdissection. Diese Ergebnisse zeigen, dass nicht nur einzelne Zelleigenschaften intakt und funktionsfähig nach längerer Inkubation, aber Netzwerk-Aktivität, wie durch Calcium-Bildgebung und elektrophysiologischen Ableitungen beurteilt, ist unverändert&gt; 24 h postdissection. Darüber hinaus zeigen wir, dass Calcium Farbstoffe in Zellen über einen längeren Zeitraum, ohne dass irgendwelche nachteiligen Effekte bleiben kann. Anwendung dieses Protokolls veranschaulicht, dass die funktionelle Aktivität von Neuronen in akuten neuronalen Gewebe können für lange Zeiträume aufrechterhalten werden, sobald die äußere Umgebung stark reguliert ist. Außerdem ist, wie die Lebensfähigkeit des Gewebes aufgrund unterschiedlicher Inkubationsprotokolle stark zwischen den Labors variiert, stellt dieses Verfahren einen Goldstandard für die idealen Parameter, die Variabilität in der Gesundheit der akuten neu zu reduzieren angewendet werden sollteronal Gewebe.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich VETEC</td><td>V800372</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-D-glucamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2554</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Papain Dissociation System</td><td>Worthington&amp;nbsp;</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide anhydrous</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 Low UV absorbance*</td><td>Life technologies</td><td>P-6867</td><td>20% solution in DMSO&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fura-2 AM&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Anaspec</td><td>84017</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>F23917</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8 AM</td><td>Abcam</td><td>Ab142773</td><td></td></tr><tr><td>Vibrating blade microtome&amp;nbsp;</td><td>Leica Biosystem</td><td>VT1200 S</td><td>Equiped with Leica&amp;rsquo;s Vibrocheck&amp;trade; measurement device&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Antivibration table</td><td>Kinetic Systems Vibraplane&amp;nbsp;</td><td>Vibraplane 9100/9200&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fixed Stage Upright Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Objective</td><td>Olympus</td><td>XLUMPlanFLN 20x/1.00w</td><td>20X&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microscope Objective</td><td>Olympus</td><td>LUMPlanFLN 60x/1.00w</td><td>60X</td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Andor</td><td>Ixon +</td><td></td></tr><tr><td>High speed wavelength switcher</td><td>Sutter instrument</td><td>Lambda DG-4&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition system</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&amp;reg; System</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>BF150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrode puller</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Flaming/Brown type micropipette puller</td></tr><tr><td>Recording/perfusion chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-40LP</td><td>Low Profile Open Bath Chambers</td></tr><tr><td>Software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Andor iQ Live Cell Imaging Software</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>Braincubator</td><td>Payo Scientific</td><td>BR26021976</td><td>www.braincubator.com.au</td></tr><tr><td>Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler</td><td>TE Technology</td><td>CP-121</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Controller</td><td>TE Technology</td><td>TC-36-25 RS232</td><td></td></tr></tbody></table>

prolonged incubation of acute neuronal tissue for electrophysiology and calcium-imaging

8 Stunden nach der Präparation - neuronaler Gewebepräparate Akut, Hirnschnitten und Retina-Wholemount, können in der Regel nur für 6 gehalten werden. Dies begrenzt die Versuchszeit und erhöht die Anzahl der Tiere, die pro Studie verwendet werden. Diese Einschränkung speziell Auswirkungen Protokolle wie Kalzium-Imaging, die verlängerte Vorinkubation erfordern mit Bad aufgetragen Farbstoffe. Exponential Bakterienwachstum in 3 - 4 h nach dem Schneiden ist eng mit einer Abnahme der Gewebegesundheit korreliert. Diese Studie beschreibt ein Verfahren für die Vermehrung von Bakterien in acute Zubereitungen Begrenzung für längere Zeiträume (&gt; 24 h) ohne die Notwendigkeit von Antibiotika, sterile Verfahren oder Gewebekulturmedien, enthaltend Wachstumsfaktoren tragfähige neuronalem Gewebe zu halten. Durch Radfahren Kammer die extrazelluläre Flüssigkeit durch UV-Bestrahlung und halten das Gewebe in einem benutzerdefinierten Halte bei 15 - 16 ° C, zeigt das Gewebe keinen Unterschied in der elektrophysiologischen Eigenschaften, oder Calcium-signaling durch intrazelluläres Calcium Farbstoffe bei&gt; 24 h postdissection. Diese Methoden werden nicht nur verlängern experimentelle Zeit für diejenigen, mit akuten neuronalen Gewebe, sondern die Zahl der Tiere zu reduzieren erforderlich, um experimentelle Ziele abzuschließen, und wird eine Goldstandard für die akute neuronale Gewebe Inkubation gesetzt.

Strenge Regulierung der Bakterienlast und der Temperatur der aCSF während der Inkubation ist wesentlich neuronalem Gewebe Lebensfähigkeit zu erhalten. 16 ° C (Abbildung 1) - dies kann mit UVC - Licht und Aufrechterhalten der Temperatur des aCSF bei 15 durch Bestrahlung optimiert werden. Des Weiteren Parameter der aCSF Stempel (APS; 1C) stellt die Experimentator mit einem Rekord von den Umgebungsbedingungen (pH - Wert und Temperatur.), So dass ein Goldstandard für die Parameter anbieten , wenn neuronale Gewebe inkubiert, die, wenn sie befolgt, Variabilität zu reduzieren zwischen Experimente. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55396/55396fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ein Inkubationssystems , dass die enge Regulierung der Gewebeumgebung ermöglicht. A, Schematische Darstellung der Inkubation System , bestehend aus einer Kühl Peltier - Platte, Hauptkammer, peristaltische Pumpe und UVC - Kammer. B,Seitenansicht der Hauptkammer, die Ein- und Austrittsstellen des aCSF sowie die Carbogen Einlass, Temperatur und pH-Sonden zeigt. Gewebe wird auf dem Gitter angeordnet, wie angegeben. Alle Messsonden sind an dem Deckel befestigt strukturelle Stabilität zu ermöglichen. C, aCSF Parameter Stamp die Temperatur und den pH - Wert der aCSF während der Inkubation zu beschreiben. D, Draufsicht auf die Hauptkammer die Befestigungslöcher für den Messsonden zeigen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55396/55396fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55396/55396fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Gewebelebensfähigkeit kann durch die Netzwerkaktivität (Figur 2), sowie verschiedene Abbildungsverfahren, einschließlich Calciumantworten (2B, C) gemessen werden. Um die Netzwerkaktivitäten zu überwachen wir angewendet aCSF eine hohe Konzentration an Kaliumchlorid (KCl; 30 mM) lokal,was zu Depolarisation von Neuronen und Gliazellen in der Nähe der applizierten K +. Diese Depolarisation kann durch die Zunahme der Calcium Transienten (2B, C) und Spiking - Aktivität (Figur 2D) beobachtet werden, die auch als physiologische Indikator für die Lebensfähigkeit der Zellen dient. Unsere Ergebnisse zeigen , dass Spiking - Aktivität in Scheiben , die für&gt; 24 h im Inkubationssystem inkubiert wurden , war ähnlich zu &quot;frisch&quot; Scheiben für kürzere Zeiträume inkubiert (&gt; 4 h; 2D). Weiterhin einzelnen Neurons Lebensfähigkeit, die durch intrazelluläre elektrophysiologische Aufzeichnungen von passiven und aktiven Membraneigenschaften, einschließlich der Ruhemembranpotential, Eingangswiderstand, Zeitkonstante und Aktionspotential war vergleichbar mit Parametern in der Literatur 15 (2E, F verfolgt ). <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55396/55396fig2.jpg" /> Abbildung 2. Elektrophysiologische und Calcium Eigenschaften von Hirnschnitten nach längerer Inkubation. A, Bild einer Gehirnschnitt 28 h genommen , nachdem er mit zwei extrazellulären Aufzeichnungselektroden Schneiden zur Messung der Netzwerkaktivität verwendet. Eine dritte Elektrode (mit Sternchen markiert) wird verwendet, 30 mM KCl zu paffen. B, Zeitraffer Bilder von Scheiben beladen mit Fluo-04.00&gt; 24 h, eine Erhöhung der intrazellulären Calcium - Transienten folgende Badanwendung KCl zeigt. C, intrazelluläres Calcium Transienten folgende kurze Anwendung von KCl (30 mM; 1 s). Rot - durchschnittliche Signal, Grey - Calcium Spuren in einzelnen Zellen , wie in B gezeigt. D, extrazelluläre physiologische Aufzeichnung der Netzwerkaktivität vor und nach der Anwendung von KCl (rote Pfeile) waren weitgehend unverändert zwischen &quot;frisch&quot; Scheiben (&lt;4 h postdissection), Und diejenigen, die für&gt; 24 h im Brutschrank inkubiert wurden. Beachten Sie die Erhöhung Aktivität unmittelbar nach der KCl - Anwendung anzeigt , tragfähige Neuronen in Spick , die reagieren in [K +] mit Depolarisation zu erhöhen. E &amp; F, Passive (E) und aktive (F) Membraneigenschaften von pyramidalen Neuronen folgenden 2 h (blau Spuren) oder 26 h (schwarze Spuren) Inkubation im Inkubationssystem. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55396/55396fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55396/55396fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Um einen direkten Zugriff auf die Zellen des Ganglion Zellschicht der Netzhaut von Wholemount retinally entartet rd / rd Mäusen wurde die ILM durch das Enzym Papain 7, verdaut 8. Nach der Verdauung deutlich und sichtbar gemacht werden, RGCs und Vertriebene Amakrinzellener DIC Beleuchtung (3A), und die Zellen können ohne vorherige Kratzen der ILM für Patch-Clamp - Aufnahmen ausgerichtet sein. Representative Current-Clamp - Aufnahmen von einem RGC sind in 3B gezeigt. Depolarisation der Zelle über die Patch-Pipette verursacht eine dosisabhängige Aktionspotentialerzeugung, die Lebensfähigkeit der Zellen nach Papain-Behandlung anzeigt. Entfernen der ILM erlaubt auch ubiquitären Anfärbung der Ganglienzellschicht (GCL) mit Fura-2AM (3D) und reagierten Zellen 30 mM KCl Anwendung mit einem großen Anstieg in 340/380 nm - Verhältnis relativ zu F 0, was bedeutet , eine große Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration (Abbildung 3E). Kalziumspiegel wieder nach Stimulation und Zellen auf den Ausgangswert könnte anschließend eine ähnliche Amplitudengang zu erzeugen stimuliert. Darüber hinaus wurden diese Reaktionen nicht zu unterscheiden zwischen retinae aufgezeichnet bei &lt;4 h und&gt; 24 h postdissection (3F, G). <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55396/55396fig3.jpg" /> Abbildung 3: Elektrophysiologische und Calcium Recordings in Retinal Wholemount. A, Differentialinterferenzkontrastbild eines Patch-Clamp - Aufzeichnung von einer Zelle retinalen Ganglien in der GCL nach Papainverdau. B, Die Zellen behalten dosisabhängige Reaktionen spiking , wenn die jeweils mit 50, 100 und 150 pA depolarisiert. C &amp; D, Entfernen der inneren Grenzmembran vor dem Bad Anwendung von Fura-2AM ermöglicht ubiquitären Beladung von retinalen Ganglionzellen, Bild mit 380 nm Anregung aufgenommen. E, wenn sie 30 mM KCl ASCF aufgetragen wird, 85% der gefärbten Zellen reagierten mit einer Erhöhung des Verhältnisses 340/380. F &amp; G, Der Anstieg der 340/380 Verhältnis kehrt zum Ausgangswert nach 30 mM KCl Anwendung (rote Balken), Und die Zellen auf nachfolgende Stimulation reagieren beide &lt;4 h und&gt; 24 h nach der Präparation. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55396/55396fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55396/55396fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Sobald aus dem Körper entfernt wird neuronalem Gewebe stark durch Umweltbedingungen beeinflusst, den späteren Abbau des Gewebes führt nach 6 - 8 h. Unter Verwendung einer einzigartigen Inkubationsverfahren, die eng überwacht und reguliert die extrazelluläre Umgebung des Gewebes kann Gewebeviabilität deutlich&gt; 24 h ausgedehnt werden.

Längerer Inkubation von Akute neuronales Gewebe für Elektrophysiologie und Calcium-Bildgebung

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

prolonged-incubation-acute-neuronal-tissue-for-electrophysiology

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K Aufrufe.  Western Sydney University.  Sobald aus dem Körper entfernt wird neuronalem Gewebe stark durch Umweltbedingungen beeinflusst, den späteren Abbau des Gewebes führt nach 6 - 8 h. Unter Verwendung einer einzigartigen Inkubationsverfahren, die eng überwacht und reguliert die extrazelluläre Umgebung des Gewebes kann Gewebeviabilität deutlich> 24 h ausgedehnt werden. 

Serie: Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., homosynaptic facilitation) 1. These hypotheses can be tested by simultaneously monitoring changes in intracellular calcium and alterations in synaptic efficacy. We demonstrate how this can be accomplished by combining calcium imaging with intracellular recording techniques. Our experiments are conducted in a buccal ganglion of the mollusc Aplysia californica. This preparation has a number of experimentally advantageous features: Ganglia can be easily removed from Aplysia and experiments use adult neurons that make normal synaptic connections and have a normal ion channel distribution. Due to the low metabolic rate of the animal and the relatively low temperatures (14-16 &deg;C) that are natural for Aplysia, preparations are stable for long periods of time. 
To detect changes in intracellular free calcium we will use the cell impermeant version of Calcium Orange 2 which is easily 'loaded' into a neuron via iontophoresis. When this long wavelength fluorescent dye binds to calcium, fluorescence intensity increases. Calcium Orange has fast kinetic properties 3 and, unlike ratiometric dyes (e.g., Fura 2), requires no filter wheel for imaging. It is fairly photo stable and less phototoxic than other dyes (e.g., fluo-3) 2,4. Like all non-ratiometric dyes, Calcium Orange indicates relative changes in calcium concentration. But, because it is not possible to account for changes in dye concentration due to loading and diffusion, it can not be calibrated to provide absolute calcium concentrations. 
An upright, fixed stage, compound microscope was used to image neurons with a CCD camera capable of recording around 30 frames per second. In Aplysia this temporal resolution is more than adequate to detect even a single spike induced alteration in the intracellular calcium concentration. Sharp electrodes are simultaneously used to induce and record synaptic transmission in identified pre- and postsynaptic neurons. At the conclusion of each trial, a custom script combines electrophysiology and imaging data. To ensure proper synchronization we use a light pulse from a LED mounted in the camera port of the microscope. Manipulation of presynaptic calcium levels (e.g. via intracellular EGTA injection) allows us to test specific hypotheses, concerning the role of intracellular calcium in mediating various forms of plasticity.

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

We demonstrate how changes in the intracellular free calcium concentration and synaptic efficacy can be simultaneously monitored in a ganglion preparation of Aplysia. We image intracellular calcium using a fluorescent dye, Calcium Orange, and induce and monitor synaptic transmission with sharp (intracellular) electrodes.

Überwachen von Änderungen in der intrazellulären Calcium-Konzentration und Synaptic Wirksamkeit in der Muschel<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

Forschung

Neurowissenschaften

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

Multi-Photonen-Intrazelluläre Sodium Imaging Kombination mit UV-vermittelten Brenn Uncaging von Glutamat in CA1 Pyramidenzellen

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

Vorbereitung der akuten Rückenmark Scheiben auf Whole-Cell Patch-Clamp-Aufnahme in den Neuronen der Substantia Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of homeostasis, undergo rapid morphological changes. For example, a laser lesion induces in a few minutes an oriented growth of microglial processes, also called &#34;directional motility&#34;, toward the site of injury. A similar effect can be obtained by delivering locally ATP or serotonin (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In this article, we describe a protocol to induce a directional growth of microglial processes toward a local application of ATP or 5-HT in acute brain slices of young and adult mice and to image this attraction over time by multiphoton microscopy. A simple method of quantification with free and open-source image analysis software is proposed. A challenge that still characterizes acute brain slices is the limited time, decreasing with age, during which the cells remain in a physiological state. This protocol, thus, highlights some technical improvements (medium, air-liquid interface chamber, imaging chamber with a double perfusion) aimed at optimizing the viability of microglial cells over several hours, especially in slices from adult mice.

Microglia, the resident immune cells of the brain, respond quickly with morphological changes to modifications of their environment. This protocol describes how to use two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward serotonin or ATP in acute brain slices of mice.

Zwei-Photon Imaging der Mikroglia Prozesse Anziehung in Richtung ATP oder Serotonin im akuten Gehirnscheiben

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Establishing a Whole-Cell Configuration for Two-Photon Calcium Imaging of Brain Slices

Source: Camir&#233;, O., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/56776">Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates a protocol for whole-cell patch-clamp recording and two-photon calcium imaging in brain hippocampal slices. This method allows to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of different neuronal types in acute brain slices.

Etablierung einer Ganzzellkonfiguration für die Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung von Hirnschnitten

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review.
1. Preliminary Preparation (Optional: ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

Measuring Neural Activity in a Mouse Brain Slice after Prolonged Incubation

Source: Cameron, M. A., et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/55396">Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging.</a> J. Vis. Exp. (120), (2017)
This video demonstrates a technique for measuring neuronal activity in mouse brain slices using calcium imaging and electrophysiological recordings. By perfusing the tissue with potassium ions and recording intracellular calcium changes through high-speed digital imaging, this method reveals real-time neuronal responses.

Messung der neuronalen Aktivität in einem Maushirnschnitt nach längerer Inkubation

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Calcium Dye Loading

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A Technique for the Prolonged Incubation of Neuronal Tissue of the Retina

Source: Cameron, M. A., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/55396">Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a method for prolonged incubation of neuronal tissue of the retina. Eyecups containing retina are obtained from a mouse eye; the inner limiting membrane (ILM) is enzymatically digested to expose the neuronal cells of the retina, and either the treated eyecup or the isolated retina is transferred to a specialized incubator for prolonged incubation at a low temperature.

Eine Technik zur verlängerten Inkubation von neuronalem Gewebe der Netzhaut

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Retinal Wholemount Preparation ...

Längerer Inkubation von Akute neuronales Gewebe für Elektrophysiologie und Calcium-Bildgebung

Zusammenfassung

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Überwachen von Änderungen in der intrazellulären Calcium-Konzentration und Synaptic Wirksamkeit in der Muschel