The authors thank Scott Longwell for helpful comments and edits to the manuscript and Robert Puccinelli for device photography. The authors acknowledge generous support from a Beckman Institute Technology Development Grant. K.B. is supported by a NSF GFRP fellowship and the TLI component of the Stanford Clinical and Translational Science Award to Spectrum (NIH TL1 TR 001084); P.F. acknowledges a McCormick and Gabilan Faculty Fellowship.

<ol>
	<li>Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+reframing+biological+enquiry.">Microfluidics: reframing biological enquiry.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 16 (9), (2015).</li><li>Squires, T. M., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+Fluid+physics+at+the+nanoliter+scale.">Microfluidics: Fluid physics at the nanoliter scale.</a> Rev.Mod. Phys. 77 (3), (2005).</li><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442 (7101), (2006).</li><li>Kalisky, T., Blainey, P., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Analysis+at+the+Single-Cell+Level.">Genomic Analysis at the Single-Cell Level.</a> Ann. Rev. of Genetics. 45 (1), (2011).</li><li>Finkel, N. H., Lou, X., Wang, C., He, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peer+Reviewed:+Barcoding+the+Microworld.">Peer Reviewed: Barcoding the Microworld.</a> Anal. Chem. 76 (19), (2004).</li><li>Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+single+cell+analysis:+from+promise+to+practice.">Microfluidic single cell analysis: from promise to practice.</a> Curr. Opin. in Chem. Bio. 16 (3-4), (2012).</li><li>White, A. K., Heyries, K. A., Doolin, C., VanInsberghe, M., Hansen, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Microfluidic+Single-Cell+Digital+Polymerase+Chain+Reaction.">High-Throughput Microfluidic Single-Cell Digital Polymerase Chain Reaction.</a> Anal. Chem. 85 (15), (2013).</li><li>Hansen, C. L., Classen, S., Berger, J. M., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microfluidic+Device+for+Kinetic+Optimization+of+Protein+Crystallization+and+In+Situ+Structure+Determination.">A Microfluidic Device for Kinetic Optimization of Protein Crystallization and In Situ Structure Determination.</a> J. Am. Chem. Soc. 128 (10), (2006).</li><li>Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Systems+Approach+to+Measuring+the+Binding+Energy+Landscapes+of+Transcription+Factors.">A Systems Approach to Measuring the Binding Energy Landscapes of Transcription Factors.</a> Science. 315 (5809), (2007).</li><li>Fordyce, P. M., Gerber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+identification+and+biophysical+characterization+of+transcription-factor+binding+sites+with+microfluidic+affinity+analysis.">De novo identification and biophysical characterization of transcription-factor binding sites with microfluidic affinity analysis.</a> Nat. Biotech. 28 (9), (2010).</li><li>Fan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+barcode+chips+for+rapid,+multiplexed+analysis+of+proteins+in+microliter+quantities+of+blood.">Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood.</a> Nat. Biotech. 26 (12), (2008).</li><li>Kovarik, M. L., Gach, P. C., Ornoff, D. M., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro+total+analysis+systems+for+cell+biology+and+biochemical+assays.">Micro total analysis systems for cell biology and biochemical assays.</a> Anal. Chem. , (2011).</li><li>Stroock, A. D., Dertinger, S. K. W., Ajdari, A., Mezi&#263;, I., Stone, H. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaotic+Mixer+for+Microchannels.">Chaotic Mixer for Microchannels.</a> Science. 295 (5555), 647-651 (2002).</li><li>Unger, M. A., Chou, H. -. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolithic+Microfabricated+Valves+and+Pumps+by+Multilayer+Soft+Lithography.">Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography.</a> Science. 288 (5463), 113-116 (2000).</li><li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Large-Scale+Integration.">Microfluidic Large-Scale Integration.</a> Science. 298 (5593), (2002).</li><li>Li, N., Sip, C., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Chips+Controlled+with+Elastomeric+Microvalve+Arrays.">Microfluidic Chips Controlled with Elastomeric Microvalve Arrays.</a> JoVE. (8), e296 (2007).</li><li>Kim, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+for+microfluidics:+a+review.">Soft lithography for microfluidics: a review.</a> Biochip. J. 2 (1), 1-11 (2008).</li><li>Studer, V., Hang, G., Pandolfi, A., Ortiz, M., Anderson, W. F., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+properties+of+a+low-actuation+pressure+microfluidic+valve.">Scaling properties of a low-actuation pressure microfluidic valve.</a> J. Appl. Phys. 95 (1), 393-398 (2004).</li><li>Kartalov, E. P., Scherer, A., Quake, S. R., Taylor, C. R., Anderson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimentally+validated+quantitative+linear+model+for+the+device+physics+of+elastomeric+microfluidic+valves.">Experimentally validated quantitative linear model for the device physics of elastomeric microfluidic valves.</a> J. Appl. Phys. 101 (6), 064505 (2007).</li><li>Gerver, R. E., G&#243;mez-Sj&#246;berg, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+microfluidic+synthesis+of+spectrally+encoded+microspheres.">Programmable microfluidic synthesis of spectrally encoded microspheres.</a> Lab. Chip. 12 (22), 4716-4723 (2012).</li><li>Fordyce, P. M., Diaz-Botia, C. A., DeRisi, J. L., G&#243;mez-Sj&#246;berg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+characterization+of+feature+dimensions+and+closing+pressures+for+microfluidic+valves+produced+via+photoresist+reflow.">Systematic characterization of feature dimensions and closing pressures for microfluidic valves produced via photoresist reflow.</a> Lab. Chip. 12 (21), 4287-4295 (2012).</li><li>Li, C. -. W., Cheung, C. N., Yang, J., Tzang, C. H., Yang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS-based+microfluidic+device+with+multi-height+structures+fabricated+by+single-step+photolithography+using+printed+circuit+board+as+masters.">PDMS-based microfluidic device with multi-height structures fabricated by single-step photolithography using printed circuit board as masters.</a> The Analyst. 128 (9), 1137-1142 (2003).</li><li>Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+production+of+single+core+double+emulsions+in+a+parallelized+microfluidic+device.">High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device.</a> Lab. Chip. 12 (4), 802-807 (2012).</li><li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+multi-layer+SU-8+microstructures.">Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures.</a> JMM. 16 (2), 276 (2006).</li><li>. Rafael's Microfluidics Site Available from: <a target="_blank" href="https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers">https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers</a> (2016)</li><li>Wanat, S., Plass, R., Sison, E., Zhuang, H., Lu, P. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Thick+Film+Processing+for+Bumping+Layers.">Optimized Thick Film Processing for Bumping Layers.</a> Proc. SPIE. , 1281-1288 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

この作品は、私たちのオンラインツール26と製造元の指示25に基づき、製造パラメータへの簡単な変更を加えて任意のアプリケーションのために調整することができ、バルブと高さが可変ジオメトリーを備えた多層マイクロ流体デバイスのための完全なマルチステップフォトリソグラフィプロトコルを示しています。このプロトコルは、単純なパッシブ1層の金型を超えてマイクロ流体デバイスを構築することを望む研究者多層フォトリソグラフィ法を分かりやすく説明することを意図しています。 多層マイクロ流体デバイスは、高スループット生化学アッセイ1に単一細胞分析に至るまでのアプリケーション「ラボオンチップ」のための単一のソフトポリマーデバイス内の高度な機能の追求を可能にします。ここで構築されたビーズシンセサイザ装置は、そのCヒドロゲル液滴を生成するために単一の流れ層との両方の完全密封可能とふるいバルブ形状を有する複数の高さを実証しますビーズをポリマーに重合すること。バルブの存在は、簡単に任意のスクリプト言語で実現することができるチップの機能の上に自動化され、プログラム可能な制御を可能にする（ すなわち 、MATLAB、LabVIEWややPython）ラボのフロー制御モジュール（ すなわち 、シリンジポンプおよび/または圧力調整器とのインタフェース）。このデモでは、カスタムMATLABソフトウェア（参照28内に設けられたコード）は、デバイス上の流体を加圧するために、カスタム空気圧セットアップ28とMFCSの流量制御システムでのModbus-制御電磁弁アレイと通信しますが、フロー制御のための多くの他のオプションは、商業的にされています利用可能。デザインと追加の提案は初めてのマイクロ流体技術者のための成功を最大限に活用するために含まれています。 ここに示した製造工程は、マイクロ流体デバイスのためのフォトリソグラフィパターニングの広い配列に一般的に適応可能なことを証明する必要があります。工程（フロー高）のいずれか、30でμmの特徴は、85ミクロンの複合高さを作成するために、下部のフォトレジスト層（フロー低、55ミクロン）に追加されました。このステップは、（で動作することがより困難である）より粘性フォトレジストを必要とせずに厚い機能を行うために使用することができます。別のステップ（ヘリンボーン）で、特徴は、レプリカがPDMSに成形したときに、マイクロチャネルの底部にパターン化された溝を作成し、以前に架橋されたチャンネルの上に製造されています。希望する場合は、このステップは、よく内のウェルのアーキテクチャを含む複雑な形状を作成することによって適合させることができます。 この製造プロセスの成功は、PEGジアクリレートの液滴からのポリマービーズを製造するために、ビーズ合成装置を用いて実証されます。異なる流れ圧力を探る異なるサイズのビーズを生成する液滴政権を調節することができます。さらに、添加剤は、ポリマー混合物の中に容易に含ませることができます。これらのヒドロゲルビーズを含む、様々な目的のために使用することができます表面機能を経由して分光蛍光または発光蛍光体の取り込みを通じてエンコーディング、薬物送達、または細胞アッセイ。 このプロトコルは、ここに提示ビーズ合成異なるマイクロ流体デバイスを構築するために採用されている場合は、特定のステップは第1の製造の試みの成功の高い可能性を達成するために重要であるに留意すべきです。我々と他の人は、速度をソフトベーク温度、時間を最適化するとランプが29（露光中にトラップされた窒素ガスのバブリングにつながることができます）地殻の形成を介してレジスト膜中の残留溶剤の滞留を防止することが重要であることを観察しました。加えて、一晩再水和ステップが厚いAZ50 XT層のために必要な露光時間の再現性を向上させ、ウェハ全体の発展の速度の空間的なばらつきを低減します。最後に、長い（14-15時間）スローランプで露光後ベークは、VAを形成するために、長方形のフォトレジストの機能を丸め試験されたフォトレジストの厚さの多種多様な弁の形状を変形させることなくLVES。 ネガ型フォトレジストからの層を製造するためにここに提示手順のいくつかは、製造元の説明書からの小さな違いがあります。私たちは、65℃、95℃、および65℃に設定したホットプレートの間にウェーハを移動させる3段階のソフトベークプロセスを示唆しています。我々は、ウエハの段階的な温暖化はソフトベーキング中に「クラスト」の形成を介してフォトレジスト内に捕捉された気泡の破裂に起因する露光時の欠陥の発生を減少させることを見出しました。逆に、ソフトベーク後のウェハの徐冷は、フォトレジスト割れを減らすことができます。最後に、フォトレジストの緩和時間を増加させること〜20分がウェハ全体の高さのレジストの小さな変動を低減することを見出しました。 これにより、製造プロトコルの柔軟性に、我々はそれがしつけ間で異なるデバイスのための広範な有用性を有することを期待しますエス。このような3Dプリント、ガラスエッチングやエンボス加工などの代替案はまた、マイクロ流体製造を達成することができますが、リソグラフィパターニングは、他の方法がまだスケールで達成していないこと、などの弁として、より複雑な機能を実現することができます。このプロトコルの主な制限は、（丸みを帯びたバルブを製造するために必要な手順が主な原因）〜3日かかる設計からテスト時間、です。 我々は、特に複雑なフォトリソグラフィ工程に関連するマイクロ流体におけるプロトコルのオープン普及は、フィールドで継続的な技術革新を奨励し、この概念実証デモは、ユーザーが製造上の問題のトラブルシューティングを行ううえで助けとなることをすることを願っています。

<html>過去15年間、フィールドとしてマイクロフルイディクスは、マイクロメートルスケール1での流体の操作を可能にする新技術の爆発で、急速な成長を遂げています。少量が同時に劇的にスループットが向上し、スケール2、3の経済を活用することでコストを低減しつつ、高速化と感度を実現する可能性を有するので、マイクロ流体システムは、湿式実験室機能の魅力的なプラットフォームです。多層マイクロ流体システムは、単一細胞分析4、5、6、単一分子分析（ 例えば、デジタルPCR 7）、タンパク質結晶8、転写因子結合アッセイなどのハイスループット生化学分析の用途において特に重要な影響を作っていますF &quot;&gt; 9、10、及び細胞スクリーニング11。 マイクロフルイディクスの中心となる目標は、総生化学分析12のために、単一のデバイス内で複雑な流体操作を行うことが可能なデバイス「ラボオンチップ」の開発です。多層ソフトリソグラフィ技術の開発は、ミキサー、オンチップバルブの作成を可能にすることによって、この目標を実現する助けと積極的に小さな容積内の流体13、14、15を制御するためのポンプいます。その利点と実証されたアプリケーションにもかかわらず、これらのマイクロ流体技術の多くは、非専門家のユーザーによって大部分が未利用のまま。広く採用が原因微細加工施設へのアクセスが制限さに一部挑戦するだけでなく、製造技術の不十分な通信のためにされています。これは、FO特にそうですRバルブや複雑な形状のための構造を備えた多層マイクロ流体デバイス：重要な設計パラメータと製造技術の詳細、実用的な情報の不足は、多くの場合、これらのデバイスの設計と作成に関わるプロジェクトに着手から新たな研究者を抑止します。 この記事では、バルブ、高さ可変機能を備えた多層マイクロ流体デバイスを製造する設計パラメータから開始し、すべての製造工程を経て移動するための完全なプロトコルを提示することによって、この知識のギャップに対処することを目的とします。製造の最初のフォトリソグラフィ工程に着目し、このプロトコルは、金型からデバイスをキャストし、具体的な実験を実行するの下流の手順を説明し、他のマイクロフルイディクス・プロトコル16を補完します。 モノリシックチップ上の弁を持つマイクロ流体デバイスは、2層で構成されています。興味のある流体は、マイクロに操作される「フロー」層を、チャネル、空気または水を含むマイクロチャネルを選択的流動層14内の流体の流れを調節することができる「制御」層、。これら二つの層は、それぞれのその後呼ばれるプロセスにおいてポリジメチルシロキサン（PDMS）、レプリカ成形に使用される別個のシリコンモールドマスタ上に製造されている「ソフトリソグラフィ17。 &quot;多層デバイスを形成するために、PDMSの各層は、それぞれの成形マスター上にキャストした後、互いに整列し、それにより各層のチャネルを有する複合PDMSデバイスを形成しています。バルブは、フローチャネル及び制御チャネルが互いに交差するだけ薄い膜によって分離された位置に形成されています。コントロールチャネルの加圧は、流路を閉塞し、局所的に流体（ 図1）を変位させる、この膜を偏向させます。 アクティブオンチップバルブは、所望の最終用途に応じて、複数の方法で製造することができます。バルブ制御層は、流動層（ 図1）15の上または下であるかに応じて、いずれかの「プッシュダウン」または「押し上げる」幾何学で構成することができます。フローチャネルは、貼り合わせ基板と直接接触するようにするための「プッシュダウン」ジオメトリは、基板表面の選択的官能基化またはパターニングの利点を付与する、許可しながら形状は、下の閉鎖圧力および剥離に対する高いデバイスの安定性を可能にする「押し上げ」後で機能18、19用。 バルブはまた、流路の断面形状に応じて、「ふるい」バルブ意図的に漏出性または完全に密閉可能ないずれかになります。篩バルブは、ビーズ、細胞または他のmacroanalytes 1を捕捉するために有用であり、典型的なネガ型フォトレジスト（ 例えば、SU-8シリーズ）、HAを使用することにより製造されます長方形のプロファイルをVEの。制御チャネルは、これらの弁の領域の上に加圧されると、制御フロー層とPDMS膜は、角部を封止する流体の流れを許容するが、マクロスケールの粒子（ 図1）を捕捉することなく、バルブの矩形プロファイルに等方的に偏向します。逆に、完全に密封可能なマイクロ流体バルブは、バルブの位置で丸みを帯びたフォトレジストの小さなパッチを含むことによって製造されます。この幾何学的形状と、制御チャネルの加圧は、流体の流れを停止、完全にチャネルを密封する丸みを帯びた流動層に対して膜を偏向させます。流動層内の丸みを帯びたプロファイルは、典型的なフォトリソグラフィ工程の後にポジ型フォトレジストの溶融およびリフロー（ 例えば、AZ50 XTまたはSPR 220）を介して生成されます。我々は以前に、弁領域のリフロー後の高さは、選択されたフィーチャ寸法21に依存することを実証しました。このプロトコルには、双方のバルブ形状の製造を実証しますビーズ合成装置です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55276/55276fig1.jpg" /> 図1：多層マイクロ流体バルブジオメトリ。ふるいのための典型的な「プッシュアップ」デバイスアーキテクチャおよび（上）と後（下）加圧の前に完全に密封可能なバルブ。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55276/55276fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> デバイスはまた、単一の流れ層内の複数の異なる高さの特徴を必要とするカオスミキサー13及びオンチップ抵抗器20のような複雑な受動的な特徴を含むことができます。可変高フロー層を達成するために、別のグループは、22をエッチングし 、プリント回路基板、多層PDMSレリーフアラインメント23、または多段階Pを含む多くの方法を採用していますhotolithography 24。当社グループは、効果的かつ再現性のある方法であることを、単一の成形マスターに多段階のフォトリソグラフィを発見しました。これを行うために、それぞれの層の適用の間に開発することなく、層に負のフォトレジスト（ 例えば、SU-8シリーズのフォトレジスト）の厚さのチャネルを構築する単純なフォトリソグラフィ技術が用いられます。それぞれの層は、シリコンマスター上製造元の指示25を使用して、その厚さに応じてネガ型フォトレジストでスピンされます。この高さの特徴は、特定の透明マスク（ 図2）ガラスマスク板に固定され、露光前以前スパン層に位置合わせを使用して層上にパターン化されます。多段階フォトリソグラフィでは、層間の正確な位置合わせは、完全な可変高さの流路を形成するのに重要です。整列後、各層は厚みに依存する露光後ベークに付されます。開発することなく、次の層はシムですilarlyパターン化。このようにして、背の高い機能は、複数のマスクの使用を介して単一の流れウェハ上に層ごとに構築することができます。各ステップの間に開発をスキップすることにより、以前のフォトレジスト層24（ すなわち 、2つの 25μmの層が50μmの機能を行うことができる）複合高機能を生成するために使用することができます。さらに、カオスミキサーヘリングボーン溝13とチャネルフロア機能は、以前に露出機能を有する層を用いて作製することができます。最終的な現像工程は、可変の高さ（ 図3）の機能を有する単一の流れウェハを作成する処理を終了します。 ここでは、オンチップバルブおよび複数の高さの流路を作製するのに必要なすべての手順の例を含む多段階フォトリソグラフィのための完全なプロトコルが提供されます。この製造プロトコルは、バルブとvariabを必要とする多層マイクロ流体ビーズシンセサイザーの文脈で提示されますル高さは、その機能のために備えています。この装置は、複数の試薬を含む自動化されたワークフローを可能にするためにポアズイユ性、液滴の成分を均質化するためのカオス混合器を制御し、両方が完全に密封し、篩バルブを介して流量を調節するために、油シースに水滴を生成するためのオンチップ抵抗器をTジャンクションを含みます入力。多段階フォトリソグラフィを用いて、これらの機能は、それぞれ高さまたはフォトレジストに応じて別の層の上に製造されます。以下の層は、このプロトコルで構成されている：（1）フローラウンドバルブ層（55μmで、AZ50 XTを）（2）フロー低層（55μmで、SU-8 2050）（3）フローの高層（85μmで、SU- 8 2025年、30μmの添加剤高さ）、および（4）ヘリンボーン溝（125μmで、SU-8 2025、40μmの添加剤高さ）（ 図3）。 ヒドロゲルビーズは、下流アッセイのための選択的な表面機能、薬物のカプセル化、ラディなどの様々な用途に使用することができますotracing撮像アッセイ、および細胞取り込み;我々は以前にランタニドナノ蛍光体20を含むスペクトル符号化されたPEGヒドロゲルビーズを製造するために、これらのデバイスのより複雑なバージョンを使用していました。ここで説明する設計が必要であれば、それらの研究努力で使用する任意の研究室のための参考資料に含まれています。私たちは、このプロトコルは、専門家やマイクロフルイディクスのエントリへの障壁を低くし、製造の成功の可能性を高めるために、バルブや複雑な形状で多層マイクロ流体デバイスを製造するのに似て興味非専門家のためのオープンなリソースを提供することを期待しています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1709">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:459px;">Materials</td>
			<td style="width:332px;"></td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td style="width:659px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mylar Transparency Masks, 5&#34;</td>
			<td>FineLine Plotting</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#34; Quartz Plates</td>
			<td>United Silica&#160;</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#34; Silicon Wafers, Test Grade</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SU8 2005, 2025, 2050 photoresist</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y111045, Y111069, Y111072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Az50XT&#160;</td>
			<td>Integrated Micromaterials</td>
			<td>AZ50XT-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SU8 Developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AZ400K 1:3 Developer</td>
			<td>Integrated Micromaterials</td>
			<td>AZ400K1:3-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyrex 150 mm glass dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3140150-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wafer Petri Dishes, 150 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wafer Tweezers&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>78410-2W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOTS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2&#34; x 3&#34; glass slides</td>
			<td>Thomas Scientific&#160;</td>
			<td>6686K20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RTV 615 elastomeric base and curing agent PDMS set</td>
			<td>Momentive&#160;</td>
			<td>RTV615-1P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tygon Tubing, 0.02&#34; O.D.&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific&#160;</td>
			<td>14-171-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Capillary PEEK tubing,&#160; 510 um OD, 125 um ID</td>
			<td>Zeus</td>
			<td>Custom</td>
			<td>360 um PEEK is readily available by Idex (catalog number: 1571)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cyro 4 mL tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>127279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epoxy, 30-minute</td>
			<td>Permatex</td>
			<td>84107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metal Pins, 0.025&#34; OD, .013&#34; ID</td>
			<td>New England Small Tube</td>
			<td>NE-1310-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly(ethylene glycol) diacrylate, Mn 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>455008-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate photoinitator&#160;</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry Co.</td>
			<td>L0290</td>
			<td>We typically synthesize LAP in-house.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>330779-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Span-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ABIL EM 90</td>
			<td>UPI Chem</td>
			<td>420095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:459px;">Equipment</td>
			<td>Equivalent equiptment or homebuilt setups will work equally as well</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mask Aligner</td>
			<td>Karl Suss</td>
			<td>MA6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Profilometer</td>
			<td>KLA-Tencor</td>
			<td>Alpha-Step D500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spin Coater</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>WS-650-23</td>
			<td>Any spincoater can be used that accepts 100 mm wafers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vacuum Dessicator, Bell-Jar Style</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>420100000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oven</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>WU-52120-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UV Spot Curing System with 3 mm LLG option</td>
			<td>Dymax</td>
			<td>41015</td>
			<td>UV LEDs, Xenon Arc Lamps, or other UV sources of the same intensity work equally as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MFCS Microfluidic Fluid Control System</td>
			<td>Fluidgent</td>
			<td>MFCS-EZ</td>
			<td>Syringe pumps, custom pneumatics or other control systems can also be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automated control scripting</td>
			<td>MATLAB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hotplate</td>
			<td>Tory Pines Scientific</td>
			<td>HP30</td>
			<td>Any hotplate with uniform heating (i.e. aluminum or ceramic plates) will suffice.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

ここでは、液滴からポリエチレングリコール（PEG）ヒドロゲルビーズを生成することができる装置を作ることによって弁付き、可変高さの多層マイクロ流体の金型の製造を実証します （ 図2）。完全な製造工程の概要は前作のデザイン要素を使用して図3に含まれている、ビーズシンセサイザは、その流れの層を含む4の高さを使用する（1）層流変調（55μm）と（2）フローにAZ50 XTバルブを丸めPEGを混合するための低高抵抗で試薬を導入するための流路（55μm）と（3）の出口とミキサー（85ミクロン）に低抵抗で流れを導くための高いチャンネルを流れ、および（4）ヘリンボーン移流ミキサー（125ミクロン）均質な溶液に架橋剤（ 図4Aおよび4B）。この構築に使用される設計パラメータと推奨設計制約の表デザインは表1の設計ファイルとマスク転送ファイルに含まれているが、 材料 表に含まれています。 このプロトコルは、フローバルブを丸め、各ステップ（ 表2）との間に開発することなく、タンデムフォトリソグラフィ工程を経て同じフローのウエハー上の複数の高さを構築する実証しています。プロフィル及び我々のバルブのステレオスコープ画像リフロー後の典型的なリフロー後バルブ丸めプロファイルは、 図5Aおよび5Bに示されています。当社の複合高さのフォトリソグラフィーから得られる測定された製造の高さは表に記載されている3ハイツは、デバイス・デバイスへとウェハ間ばらつきを両方評価する、単一の流れウェハ内のすべてのデバイス間で各層ごとに10箇所で測定しました。すべての機能は、ウェハ全体&lt;2％のCVを観察しました。 メーカーフォトレジストのデータシートは、典型的な高さを示唆しています多層機能を構築するときに、このプロトコルは、異なる設計のために調整されている場合は±5％のばらつきがあるため、この公差は考慮されるべきです。 このような回転速度や露光等の製造パラメータは、所望のパターンの高さおよび形状のために最適化されていない場合、任意の製造プロセスと同様に、誤差は各ステップで生じ得ます。多くのリソースは、私たちの施設は27を維持し 、ウェブサイトを含む、適切な露光、現像時間をトラブルシューティングするために利用可能です。提案したソフトとハードベーク時間、温度、およびランプ速度からの逸脱は、クラック、気泡や不完全な機能を生成することができます。また、露光前にAZ50 XTポジ型フォトレジストの再水和は重要です。適切な再水和なしのウエハが割れたり、バルブエリア内の気泡を含んで表示されることがあります。これはwafeを収容する「湿ったボックス」（脱イオン水を含む皿で密閉箱）を使用して、発生した場合一晩再水和のためのRSは助けることができます。短い再水和時間（〜5-6時間）は、同様の結果で50μmの下AZ50 XT機能に使用することができますが、背の高い機能には、露光、現像時の機能の損失の可能性を減らすために一晩再水和を必要とします。新しい正は一晩再水和のための必要性を排除することができる代替手段（ 例えば 、AZ40XT）に抵抗します。しかし、我々はこれらの製剤をテストしていません。 概念実証としては、PEGジアクリレートヒドロゲル液滴がビーズシンセサイザ装置（ 図6A）から製造しました。バルブを加減圧時5Cおよび5Dは 、デバイス上のバルブ操作とクロージャの代表的な画像を示しています。バルブの加圧のための一般的なエラーモードは、次のとおりです。不十分な圧力（食用色素を流すことによって確認することができ、バルブます完全に閉じていない）の使用を、入口チューブ挿入（フローがあれば阻害されますチューブまたは金属ピンは（チャネルが閉塞され得るか、またはデバイスが剥離することができる）すぎ押下され、​​デバイスの層間剥離が生じ得る）、および製造プロセス中のダストまたは繊維を組み込みます。これらのエラーモードのトラブルシューティングを行うには、ユーザーが製造中にクリーンルーム条件を維持し、体系的にデバイスの実行に進む前に各バルブをテストする必要があります。デバイスの剥離が実験における共通の問題として提示した場合、これはより低い圧力（&lt;15プサイ）のいずれかで実行しているデバイスによって改善またはシラン化時間の短縮することができます。 図6Aは、T接合液滴発生器の油エマルジョン中にヒドロゲル液滴を生成する操作でビーズシンセサイザ装置を示し、 図6Bは、オンチップ篩バルブによって捕捉ビーズを示しています。重合が成功しない場合、ビーズを篩バルブを通過します。このような場合、デバイスからのUV光源強度と高さMODできます<html>重合を改善するためにified。ヒドロゲルビーズは直径重合領域5ミリ（ 図6Cおよび6D）以上〜100ミリワット/ cm 2の電力を用いて10 PSI（油）及び9 PSI（試薬混合物）の流量で製造しました。得られたビーズは52.6±1.6μmで（STD平均±）を測定しました。サイズは、ハフ±3 STD（28外れ値、ビーズ0.94％）の課されたサイズのフィルタを用いて明視野像（ 図6Cおよび6D）で（MATLAB）を形質転換を用いて2,992ビーズを分析しました。液滴の生成のための私達の全体のハードウェア構成は、図7に示されています。 表2： マルチステップフォトリソグラフィパラメータ 。スピン速度、ソフトベーク時間、露光エネルギー及びハードベーク時間を含む適用可能なパラメータを持つフォトリソグラフィ工程のすべての表形式。<html> 2.xlsx &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この表をご覧になるにはこちらをクリックしてください。（ダウンロードするには、右クリックします。） <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" width="568"><tbody><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:215px;"> フローレイヤ機能 </td><td style="width:353px;"> 機能の高さ </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:215px;">丸みを帯びたバルブ（フロー・ラウンド） </td><td style="width:353px;"> 54.43ミクロン（1.05ミクロンのstd。、1.9％のCV） </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:215px;">フローチャンネル（フロー低） </td><td style="width:353px;"> 84.22ミクロン（0.91ミクロンのstd。、1.1％のCV） </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:215px;">フローチャンネル（フローハイ） </td><td style="width:353px;"> 54.10ミクロン（1.24ミクロンのstd。、2.3％のCV） </td></tr><html> 2 &quot;&gt; <td height="22" style="height:22px;width:215px;">ヘリンボーン溝（ミキサー） </td><td style="width:353px;"> 124.19マイクロメートル（1.89ミクロンのstd。、1.5％CV） </td></tr></tbody></table> 表3： プロフィルハイツ製造後 。多段階のフォトリソグラフィを経て製造された層のそれぞれの合計機能の高さ、製造後。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55276/55276fig2.jpg" /> 図2：製造プロセスの概要。デバイスのテスト設計から多層デバイスの製造に含まれる工程を示す概略図。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55276/55276fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <html> 5276 / 55276fig3.jpg &quot;/&gt; 図3：マルチステップフォトリソグラフィの概略図。バルブ丸めと多層マイクロ流体デバイスを作成するためのフォトリソグラフィにおける高さ可変機能製造の概要。ビーズシンセサイザ装置の製造のための手順は、ここに含まれます。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55276/55276fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55276/55276fig4.jpg" /> 図4：ビーズシンセサイザーのデバイス設計と画像 。異なる色で示される層を有するビーズシンセサイザーデバイスの（A）のCAD設計。 （B）PDMS多層ビーズシンセサイザーデバイスのイメージ。制御線がオレンジ色で表示され、フローチャネルは、青と緑で表示されます。JPG &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/55276/55276fig5.jpg" /> 図5：バルブプロファイルと画像。 （A）プロフィロメータによって評価される代表的な弁の高さプロファイル。 （B）バルブの代表的な画像とシリコンモールドマスタ流ウェハで周囲のチャネル。 （C、D）多層PDMSデバイスの最終的なバルブ操作の写真。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55276/55276fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/55276/55276fig6.jpg" /> 図6：PEGジアクリレートヒドロゲル液滴の生産。 （A）ヒドロゲル液滴のprodの画像T字路の液滴発生器でuction。 （B）バルブが加圧されたときに後重合は篩バルブで捕捉されたビーズのイメージ。 （C）ビーズシンセサイザ（4X）で製造されるハイドロゲルビーズの明視野像。 （D）ヒドロゲルビーズのサイズ分布。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55276/55276fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/55276/55276fig7.jpg" /> 図7：デバイス動作設定。デバイスの動作に必要なすべてのハードウェアの注釈付のイメージ。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55276/55276fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

バルブ付き多層マイクロ流体デバイスのための多段階可変高さのフォトリソグラフィ

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

multi-step-variable-height-photolithography-for-valved-multilayer

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.2K ビュー.  Stanford University. Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads. 

ビデオ: Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting and counting cells. However, manipulating the cell within the fluidic domain remains a challenge and requires complicated fabrication protocols for forming valves and electrodes, or demands specialty equipment like optical tweezers. Here, we demonstrate that conventional printed circuit boards (PCB) can be used for the non-contact manipulation of cells by employing dielectrophoresis (DEP) for bead and cell manipulation in laminar flow fields for bioactuation, and for cell and bead separation in multichannel microfluidic devices. First, we present the protocol for assembling the DEP electrodes and microfluidic devices, and preparing the cells for DEP. Then, we characterize the DEP operation with polystyrene beads. Lastly, we show representative results of bead and cell separation in a multichannel microfluidic device. In summary, DEP is an effective method for manipulating particles (beads or cells) within microfluidic devices.

Dielectrophoresis (DEP) is an effective method to manipulate cells. Printed circuit boards (PCB) can provide inexpensive, reusable and effective electrodes for contact-free cell manipulation within microfluidic devices. By combining PDMS-based microfluidic channels with coverslips on PCBs, we demonstrate bead and cell manipulation and separation within multichannel microfluidic devices.

誘電泳動と層流を用いたマルチチャネルマイクロ流体デバイスの分離ビーズと細胞

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

生物工学

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the need for 3D environments to represent in vitro experiments which better mimic in vivo qualities 1-3. Studies in fields such as cancer research 4, neural engineering 5, cardiac physiology 6, and cell-matrix interaction7,8have shown cell behavior differs substantially between traditional monolayer cultures and 3D constructs.
Hydrogels are used as 3D environments because of their variety, versatility and ability to tailor molecular composition through functionalization 9-12. Numerous techniques exist for creation of constructs as cell-supportive matrices, including electrospinning13, elastomer stamps14, inkjet printing15, additive photopatterning16, static photomask projection-lithography17, and dynamic mask microstereolithography18. Unfortunately, these methods involve multiple production steps and/or equipment not readily adaptable to conventional cell and tissue culture methods. The technique employed in this protocol adapts the latter two methods, using a digital micromirror device (DMD) to create dynamic photomasks for crosslinking geometrically specific poly-(ethylene glycol) (PEG) hydrogels, induced through UV initiated free radical polymerization. The resulting "2.5D" structures provide a constrained 3D environment for neural growth. We employ a dual-hydrogel approach, where PEG serves as a cell-restrictive region supplying structure to an otherwise shapeless but cell-permissive self-assembling gel made from either Puramatrix or agarose. The process is a quick simple one step fabrication which is highly reproducible and easily adapted for use with conventional cell culture methods and substrates.
Whole tissue explants, such as embryonic dorsal root ganglia (DRG), can be incorporated into the dual hydrogel constructs for experimental assays such as neurite outgrowth. Additionally, dissociated cells can be encapsulated in the photocrosslinkable or self polymerizing hydrogel, or selectively adhered to the permeable support membrane using cell-restrictive photopatterning. Using the DMD, we created hydrogel constructs up to ~1mm thick, but thin film (&lt;200 &mu;m) PEG structures were limited by oxygen quenching of the free radical polymerization reaction. We subsequently developed a technique utilizing a layer of oil above the polymerization liquid which allowed thin PEG structure polymerization.
In this protocol, we describe the expeditious creation of 3D hydrogel systems for production of microfabricated neural cell and tissue cultures. The dual hydrogel constructs demonstrated herein represent versatile in vitro models that may prove useful for studies in neuroscience involving cell survival, migration, and/or neurite growth and guidance. Moreover, as the protocol can work for many types of hydrogels and cells, the potential applications are both varied and vast.

Simple techniques are described for the rapid production of microfabricated neural culture systems using a digital micromirror device for dynamic mask projection lithography on regular cell culture substrates. These culture systems may be more representative of natural biological architecture, and the techniques described could be adapted for numerous applications.

動的なマスク投影リソグラフィーを用いたニューラル培養システムのためのマイクロパターンハイドロゲルの作製

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

のためのシンプルなマイクロ流体デバイス<em生体内で&gt;</emの&gt;イメージング<em&gt; Cエレガンス</em&gt;<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;とゼブラフィッシュ

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Multi-step Preparation Technique to Recover Multiple Metabolite Compound Classes for In-depth and Informative Metabolomic Analysis

Metabolomics is an emerging field which enables profiling of samples from living organisms in order to obtain insight into biological processes. A vital aspect of metabolomics is sample preparation whereby inconsistent techniques generate unreliable results. This technique encompasses protein precipitation, liquid-liquid extraction, and solid-phase extraction as a means of fractionating metabolites into four distinct classes.&#160;Improved enrichment of low abundance molecules with a resulting increase in sensitivity is obtained, and ultimately results in more confident identification of molecules. This technique has been applied to plasma, bronchoalveolar lavage fluid, and cerebrospinal fluid samples with volumes as low as 50 &#181;l. &#160;Samples can be used for multiple downstream applications; for example, the pellet resulting from protein precipitation can be stored for later analysis. The supernatant from that step undergoes liquid-liquid extraction using water and strong organic solvent to separate the hydrophilic and hydrophobic compounds. Once fractionated, the hydrophilic layer can be processed for later analysis or discarded if not needed. The hydrophobic fraction is further treated with a series of solvents during three solid-phase extraction steps to separate it into fatty acids, neutral lipids, and phospholipids. This allows the technician the flexibility to choose which class of compounds is preferred for analysis. It also aids in more reliable metabolite identification since some knowledge of chemical class exists.

The reliability of results in metabolomics experiments depends on the effectiveness and reproducibility of the sample preparation. Described is a rigorous and in-depth method that enables extraction of metabolites from biological fluids with the option of subsequently analyzing up to thousands of compounds, or just the compound classes of interest.

綿密かつ有益な代謝解析のための複数の代謝化合物のクラスを回復するために多段階調製技術

Metabolomics is an emerging field which enables profiling of samples from living organisms in order to obtain insight into biological processes. A vital ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

フォトリソグラフィ法により高分子マイクロニードルアレイの作製

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Microtissue安定化のためのマイクロ流体デバイスの層ごとのコラーゲン沈着

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

3Dペーパーマイクロ流体デバイスを構築するために接着剤パターニングを使用して、

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other physical or chemical stimuli. They have been commonly used for in vitro cell studies by providing in vivo like surroundings. Especially, how cells response to chemical gradients, electrical fields, and shear stresses has drawn many interests since these phenomena are important in understanding cellular properties and functions. These microfluidic chips can be made of glass substrates, silicon wafers, polydimethylsiloxane (PDMS) polymers, polymethylmethacrylate (PMMA) substrates, or polyethyleneterephthalate (PET) substrates. Out of these materials, PMMA substrates are cheap and can be easily processed using laser ablation and writing. Although a few microfluidic devices have been designed and fabricated for generating multiple, coexisting chemical and electrical stimuli, none of them was considered efficient enough in reducing experimental repeats, particular for screening purposes. In this report, we describe our design and fabrication of two PMMA-based microfluidic chips for investigating cellular responses, in the production of reactive oxygen species and the migration, under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli. The first chip generates five relative concentrations of 0, 1/8, 1/2, 7/8, and 1 in the culture regions, together with a shear stress gradient produced inside each of these areas. The second chip generates the same relative concentrations, but with five different electric field strengths created within each culture area. These devices not only provide cells with a precise, controllable micro-environment but also greatly increase the experimental throughput.

Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

シングルまたは共存化学/電気/せん断応力刺激下で細胞応答を研究するためのマイクロ流体デバイスを設計

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and directed within a layer of paper. Moreover, stacking multiple layers of patterned paper creates sophisticated three-dimensional microfluidic networks that can support the development of analytical and bioanalytical assays. Paper-based microfluidic devices are inexpensive, portable, easy to use, and require no external equipment to operate. As a result, they hold great promise as a platform for point-of-care diagnostics. In order to properly evaluate the utility and analytical performance of paper-based devices, suitable methods must be developed to ensure their manufacture is reproducible and at a scale that is appropriate for laboratory settings. In this manuscript, a method to fabricate a general device architecture that can be used for paper-based immunoassays is described. We use a form of additive manufacturing (multi-layer lamination) to prepare devices that comprise multiple layers of patterned paper and patterned adhesive. In addition to demonstrating the proper use of these three-dimensional paper-based microfluidic devices with an immunoassay for human chorionic gonadotropin (hCG), errors in the manufacturing process that may result in device failures are discussed. We expect this approach to manufacturing paper-based devices will find broad utility in the development of analytical applications designed specifically for limited-resource settings.

We detail a method to fabricate three-dimensional paper-based microfluidic devices for use in the development of immunoassays. Our approach to device assembly is a type of multilayer, additive manufacturing. We demonstrate a sandwich immunoassay to provide representative results for these types of paper-based devices.

イムノアッセイのための3次元紙ベースのマイクロ流体デバイスの作製

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under combinations of chemical and oxygen gradients. Both chemical and oxygen gradients can greatly affect cell migration in vivo; however, due to technical limitations, very little research has been performed to investigate their effects in vitro. The device developed in this research takes advantage of a series of serpentine-shaped channels to generate the desired chemical gradients and exploits a spatially confined chemical reaction method for oxygen gradient generation. The directions of the chemical and oxygen gradients are perpendicular to each other to enable straightforward migration result interpretation. In order to efficiently generate the oxygen gradients with minimal chemical consumption, the embedded PC thin film is utilized as a gas diffusion barrier. The developed microfluidic device can be actuated by syringe pumps and placed into a conventional cell incubator during cell migration experiments to allow for setup simplification and optimized cell culture conditions. In cell experiments, we used the device to study migrations of adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549, under combinations of chemokine (stromal cell-derived factor, SDF-1&#945;) and oxygen gradients. The experimental results show that the device can stably generate perpendicular chemokine and oxygen gradients and is compatible with cells. The migration study results indicate that oxygen gradients may play an essential role in guiding cell migration, and cellular behavior under combinations of gradients cannot be predicted from those under single gradients. The device provides a powerful and practical tool for researchers to study interactions between chemical and oxygen gradients in cell culture, which can promote better cell migration studies in more in vivo-like microenvironments.

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

垂直化学的酸素勾配の下で細胞移動研究のためのポリジメチルシロキサン - ポリカーボネートマイクロ流体デバイス

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...