This work was financially supported by the Ministry of Science and Technology of Taiwan under Contract No. MOST 104-2311-B-002-026 (K. Y. Lo), No. MOST 104-2112-M-030-002 (Y. S. Sun), and National Taiwan University Career Development Project (103R7888) (K. Y. Lo). The authors also thank the Center for Emerging Material and Advanced Devices, National Taiwan University, for the use of the cell culture room.

1.チップ設計と製作<ol><li>描画パターンは、市販のソフトウェア24を使用して、PMMA基板と両面テープに切除されます。 <ol><li> 5培養領域（ 図1Aおよび1B）のそれぞれにおいて、その端部で変化する幅の「クリスマスツリー」パターンを描く、化学的濃度及びせん断応力の影響を研究するために。 </li><li>化学的濃度及び電界の影響を研究するために、塩橋のための2つ以上の流体チャネルとの「クリスマスツリー」パターン（ 図2Aおよび2B）を描きます。 </li></ol></li><li>スクライブPMMAシートまたはCO 2レーザースクライバーに対応するファイルをロードすることによって、両面テープ上の個々のパターン。 <ol><li>レーザースクライバーをオンにして、コンピュータとの接続を確認してください。市販のソフトウェアを使用して切除されるべきパターンを開きます。 </li><li> PMMAシートや両面テープOを配置スクライバーのステージのn個のトップ。キャリブレーションバーと可視He-Neレーザーを使用して、必要な場合、CO 2レーザーの焦点を調整します。 </li><li> PMMAシートまたはテープ上のアブレーションのためスクライバーにパターンをロードします。 </li><li> 、パターン化されたシートまたはテープを拾う不要な部分を削除し、窒素ブローで表面をきれいにします。 注：PMMAシートの厚さは1mmであり、両面テープの0.07 mm以上0.22 mmです。 </li></ol></li></ol> 2.チップ実装<ol><li>スーパー接着剤で、上部のねじ山と穴を整列させることにより、チップの最上層に（真ん中のねじ山付き長さ×幅×高さ= 10ミリメートル×10ミリメートル×5ミリメートル）アクリルアダプターを接続します - ほとんどの層。これらのアダプタは、入口/出口をと塩橋コネクタ媒体としての役割を果たす。 </li><li>層流フード内部のマイクロ流体チップを組み立てます。 </li><li>化学せん断応力マイクロ流体チップ（CSSチップ）を組み立てます。 <ol><li> Attachスクライブ両面テープの2枚を使用してスクライブPMMAシートの3枚。 （ 図1Aおよび1B）。 </li><li>チップの底に0.07ミリメートルの厚さの両面テープの1以上の部分を追加し、直径10cmのペトリ皿にチップを取り付けます。 </li><li>一晩のための真空チャンバー内のアセンブリのチップを置きます。 </li></ol></li><li>化学-電界チップ（CEFチップ）を構築するには、0.22ミリメートル（ 図2Aおよび図2B）=厚さの両面テープにPMMAシートを添付します。 <ol><li>テープのこの同じ部分を使用して、直径10cmのペトリ皿にスクライブPMMAシートと両面テープを取り付けます。 </li></ol></li><li>フードの内側に組み立てられたチップを残すと殺菌のために30分間UVにそれを公開します。 </li><li>プラスチックチューブと指締めナットを介して2つの3ミリリットル注射器への入口を接続します。プラスチックチューブと指締めナットを介して廃液チューブにコンセントを接続します。 注：オートクレーブ使用前に15分間、121℃で全てのチューブとナット。 </li><li>ゆっくりPBSでプライム流体チャネルに注射器のプランジャーを押し下げます。気泡を除去するために、前後にシリンジを押してください。 </li><li> 5％CO 2下、37℃で一晩培養器の内部にチップを置きます。 注：これらの2つのステップは、チップを洗浄し、チップ内の任意の残りの気泡を除去することを目的としています。 </li><li>インキュベーターからチップを取ります。 </li><li> CEFチップに電界を発生させるための寒天塩橋を準備します。 <ol><li>マイクロ波を用いて1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）緩衝液中の3％低融点アガロースを溶解します。 </li><li>塩橋チャンネルにアガロース溶液相化し注入し、その溶液が固化する前に電極を挿入します。 </li><li>筒状のナットに銀/塩化銀電極を配置します。 </li></ol></li><li>シリンジポンプにシリンジを接続し、連続的に培養液を流す（ダルベッコ変法EagleR17; PBSを交換する20μL/分の流速で10分間、流体チャネルへの培地、DMEM）。 </li></ol> 3.細胞の調製と実験のセットアップ注：前の暖かい1×PBS、培地（DMEMプラスFBS）、使用前に37℃の水浴中でトリプシン。 <ol><li>プレート2×10 5肺癌CL1-5細胞をDMEM + 10％ウシ胎児血清（FBS）が供給さ10 cmのペトリ皿中25,26。 90％コンフルエンスになるまで37℃で5％CO 2下で培養器内部の細胞をインキュベートします。 </li><li>培地を吸引し、予め温めておいた1×PBSで細胞を1回洗浄します。細胞に0.05％トリプシンバッファーの2ミリリットルを加え、細胞を剥離するために37℃で2〜3分間待ちます。 </li><li> 15ミリリットルの滅菌遠心チューブに細胞を移し、チューブに培養液の6ミリリットルを追加します。静かに混合するためにチューブを反転し、hemocytometeに細胞数をカウントするための細胞含有培地の5μLを取り出しますrを。 </li><li> 300 xでチューブを遠心 5分間G。培養液1ml中の10 6細胞を懸濁し、1 mlシリンジに細胞含有培地を配置します。 </li><li>コンセントからマイクロ流体チップに細胞含有培地を注入し、溶液を5培養領域を介してすべてを配布していることを確認してください。 2時間、37℃で5％CO 2下で培養器内部のチップをインキュベートします。 </li></ol> 4.実験のセットアップ<ol><li>インキュベーターからチップを取り、透明なインジウムスズ酸化物（ITO）ガラスヒーターの上部に置き。 注：ITOガラスは、熱カプラからのフィードバックを介して、37±0.5℃の温度を維持するために、比例積分微分（PID）コントローラに接続されているITOヒータとチップとの間でしっかりとクランプ。 </li><li>細胞移動または固定のXYステージを追跡するための倒立顕微鏡の電動XYステージの上にチップヒータアセンブリを置きますROSの産生を測定するための倒立蛍光顕微鏡。 </li><li> （培地中に溶解した）相対濃度0および1の化学溶液5mlで2つのシリンジを充填する、異なる化学濃度を生成し、所望の流速でチップにそれらをポンピングする：CSSチップに0.3 mlと流速で1時間/分;最初の20分間、20μL/分の流速でCEFチップ、および他の120分間（合計時間= 2時間）20μL/ hrの流量です。 </li><li>細胞移動を追跡するためのCEFチップ、プログラムでは、顕微鏡のXYステージは、2のための培養領域内のビュー（のFOV）の特定のフィールドの（DSLR）カメラ、デジタル一眼レフを経て、15分ごとに写真を撮って繰り返します時間。 </li><li> ROSの産生を測定するために、蛍光ベースインジケータ2&#39;-7&#39;- dichlorodihydrofluoresceジアセテート（2&#39;-7&#39;- DCFDA）を使用します。 <ol><li>分子生物学グレードジに10mMで2&#39;-7&#39;- DCFDAの株式を準備しますメチルスルホキシド（DMSO）。唯一の血清を含まないDMEM中DCFDA（DMEM中で5μM）を希釈します。潜在的な脱アセチル化酵素は、バックグラウンドシグナルを増加させ、細胞内シグナルを減少させる可能性があります。 </li><li> CSSチップ内またはCEFチップ内のEF刺激の2時間後のせん断応力刺激の1時間後、20μl/分の流速のためにチップに2&#39;-7&#39;- DCFDA（DMEM中で5μM）をポンプ最初の20分であり、さらに20分間、20μL/ hrの流速。洗浄のために、20分間、20μL/ hrの流速でチップにDMEMポンプ。 </li><li>蛍光強度を分析するための培養領域内の特定のFOVと、電荷結合素子（CCD）カメラを介して、写真を撮ります。 </li></ol></li></ol>化学濃度、せん断応力、および電場の5計算<ol><li> CSSチップとCEFチップの両方で、5培養領域において化学的な濃度を計算。例えば、concentrのH 2 O 2を注入しations 2つの入口から0と200μM、0の濃度が、25、100、175、および200μMが生成されます。 注：すべての液体がフォークの周りに円滑かつ均等に流れを分割すると仮定することにより、5培養分野での相対濃度は、それぞれ、0、1/8、1/2、7/8、および1です。 </li><li> CSSチップにおいて、用いた培養の各領域内の剪断応力（τ）を計算します <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/54397/54397eq1.jpg" /> Qは体積流量であり、27は 、ηは流体の粘度であり、Hは、チャネルの高さであり、Wはチャンネルの幅です。 注：各入口（Q = 0.12 ml /分各培養領域）において、Q = 0.3 ml /分に設定することによりη= 0.0008ペンシルバニア・sの培地、H = 1 mmであり、w = 1~4 mmのためのせん断応力は、0.0048 PA（幅4mm領域）から0.0192 PA（幅1mmの領域）の範囲であると計算されます。 </li><li>にCEFチップ、Iは培地の導電率であるσ流体チャネルに流れる電流であるE = I /（σAのEFF）（オームの法則）を用いて培養の各領域内EF強度を計算し、そしてeffはチャネルの有効断面積です。 注：σを使用して= 1.38Ω-1メートル-1培地とEFF = 0.22ミリメートル2（幅= 1ミリメートル、高さ= 0.22ミリメートル）のために、EF強度はE（MV / mm）となるように計算された= I（ A）3.3×10 6×。 <ol><li> 図2Dに示すように、4つの（8 + 35 + 8）セグメントと一つ（5 + 35 + 5）セグメントと5のC部の回路と同等の回路を扱います。 注：キルヒホッフの電圧法則とオームの法則に従って、この並列回路を分析することにより、5文化を横切って流れる電流があります私は下から上にI 1〜5は 、周りの0.49 I（エリア1）、0.25 I（エリア2）、0.13 I（エリア3）、0.08 I（エリア4）、および0.05 I（面積になるように計算されています5）、それぞれ、 どこ総直流（DC）です。 0.157ミリアンペア、254の排出係数、130、67、41、および26 MV / mmでの適用直流で5培養領域内で生成されます。 注：マイクロ流体ネットワークの単純化された電気的分析のために、すべての流体セグメントは、それらの長さに比例した抵抗の抵抗として考えられています。 </li></ol></li></ol> 6.データ解析注：データ解析は、ImageJソフトウェアを使用して行われます。 <ol><li> ROSの産生を分析します。 <ol><li> ImageJソフトウェアを実行します。蛍光画像をロードするために、「ファイル」→オープンに行くが分析されます。 </li><li>イムを変更するには、「イメージ」→「タイプ」→「16ビット」に移動しますグレースケールの年齢。 </li><li>セルを囲むポリゴンを描画します。細胞の平均蛍光強度を測定するために→「測定」を「分析」に進んでください。 </li><li> 3つの独立した実験の少なくとも50個の細胞からの強度を収集し、平均値の標準誤差（SEM）との平均強度を計算するために6.1.3を繰り返します。 </li><li>各実験条件について6.1.1-6.1.4を繰り返します。 </li></ol></li><li>細胞移動を分析します。 <ol><li> ImageJソフトウェアを実行します。時間= 0で撮影した画像をロードするために、「ファイル」→オープンに行くが分析されます。 </li><li>セルを囲むポリゴンを描画します。 （Y 1、×1）のような細胞の重心を測定するための「分析」→「測定」に移動します。 </li><li>別の画像から（Y 2、X 2）と同じセルの重心を測定するために6.2.1- 6.2.2を繰り返し、時間= tに取ります。 </li><li>の（ミクロン/時間で）移動速度を計算しますこのセルとして<img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/54397/54397eq2.jpg" /> 。 </li><li> 3つの独立した実験の少なくとも50個の細胞からの移行率を収集し、平均値の標準誤差（SEM）で、平均移動速度を計算するために6.2.1-6.2.4を繰り返します。 </li><li> 6.2.2と6.2.3から、コサインθとして、この細胞の遊走directednessを計算したり、 <img alt="式3" src="/files/ftp_upload/54397/54397eq3.jpg" />ここで、θは （正から負への）適用されたEFのベクトルと、開始からのセル（ 図2G）の終了位置へのベクトル間の角度です。 </li><li> 3つの独立した実験の少なくとも50個の細胞からの移行directednessを収集し、平均値の標準誤差（SEM）で平均移行directednessを計算するために6.2.6を繰り返します。 </li><li> SEMで平均移動速度と各実験条件についてSEMで平均移行directednessを計算します。 注：directedness1のすべてのセルをカソードに向かって移動することを示し、-1の値は、すべてのセルは、陽極に向かって移動することを示しています。ランダムに移動する細胞群のdirectednessは0に近いです。 </li></ol></li><li>セルの配置を分析します。 <ol><li> ImageJソフトウェアを実行します。分析する画像をロードするために、「ファイル」→「開く」に移動します。 </li><li>楕円のような細胞を治療し、細胞の長軸を示すために線を引きます。ラインと水平EF方向の間の角度βを測定するための「分析」→「測定」に移動します。 </li><li> 3つの独立した実験の少なくとも50個の細胞からβを収集し 、平均値の標準誤差（SEM）で平均余弦βを計算するために6.3.2を繰り返します。 </li><li>各実験条件について6.3.1-6.3.3を繰り返します。 注：1のβのcos Aは、すべての細胞が適用されたEFに平行に整列することを示し、0の値は、すべての細胞がperpendicularlを揃えることを示しています適用されたEFへのy。 </li></ol></li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turbulent+fluid+shear+stress+induces+vascular+endothelial+cell+turnover+in+vitro.">Turbulent fluid shear stress induces vascular endothelial cell turnover in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 2114-2117 (1986).</li><li>Zoro, B. J., Owen, S., Drake, R. A., Hoare, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+process+stress+on+suspended+anchorage-dependent+mammalian+cells+as+an+indicator+of+likely+challenges+for+regenerative+medicines.">The impact of process stress on suspended anchorage-dependent mammalian cells as an indicator of likely challenges for regenerative medicines.</a> Biotechnol Bioeng. 99, 468-474 (2008).</li><li>Chin, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+reactive+oxygen+species+in+endothelial+cells+under+different+pulsatile+shear+stresses+and+glucose+concentrations.">Production of reactive oxygen species in endothelial cells under different pulsatile shear stresses and glucose concentrations.</a> Lab Chip. 11, 1856-1863 (2011).</li><li>Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotaxis+of+oral+squamous+cell+carcinoma+cells+in+a+multiple-electric-field+chip+with+uniform+flow+field.">Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field.</a> Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

PMMAベースのチップは、より複雑なソフトリソグラフィを必要とするPDMSベースのチップに比べて安価かつ容易な方法であるレーザーアブレーションと書き込みを使用して製造されます。マイクロ流体チップを設計した後、製造および組立はわずか5分以内に行うことができます。注意が実験を行う際にに支払われるべきであることを、いくつかの重要なステップがあります。最初は「組み立て...

インビボで細胞は細胞外マトリックス（ECM）、炭水化物、脂質、および他の細胞を含む生体分子の様々な囲まれています。彼らは、このような種々の成長因子の化学的勾配にECMとの相互作用および応答としてマイクロ環境刺激に応答することによって官能基化。伝統的には、 インビトロの細胞研究は、細胞および試薬の消費量が大きく、細胞は、静的（非循環）環境で増殖細胞培養皿で行われます。最近では、流体コンポーネントと統合微細加工デバイスは、より制御方法で細胞研究のための代替プラットフォームを提供してきました。このような装置は、細胞および試薬の消費を最小限に抑えながら、化学的および物理的刺激の正確な微小環境を作り出すことが可能です。これらのマイクロ流体チップは、ガラス基板、シリコンウエハ、ポリジメチルシロキサン（PDMS）ポリマー、ポリメチルメタクリレート（PMMA）基板、またはpolyethylenetereで作ることができますフタレート（PET）は、1-3基質。 PDMSベースのデバイスは、長期細胞培養および研究に適してい、透明な生体適合性、およびガスに対して透過性です。 PMMA及びPET基板が安いとレーザーアブレーションと書き込みを使用して処理することが容易です。 マイクロ流体デバイスは、細胞が異なる化学的および物理的な刺激を受けやすい安定して制御可能な微小環境で細胞を提供する必要があります。例えば、マイクロ流体チップは、細胞の走化性を研究するために使用されます。代わりに、Boydenチャンバー及びキャピラリー4,5を採用する伝統的な方法でこれらの小型化流体デバイスは、細胞の行動1,6,7を研究するための正確な化学的勾配を生成することができます。別の例は、電界（EFS）の下のセルの方向性のある移動、走電性という名前の現象を研究することです。細胞のElectrotactic行動は、神経再生8、胚発生9に関連していることが報告されましたそして、10,11創傷治癒。そして、多くの研究は、癌細胞12,13を含む様々な細胞型の走電性を調査するために行われた、14,15リンパ球、白血病細胞11、及びセル16を生じます。従来から、ペトリ皿とカバーガラスは、排出係数17を生成するためelectrotacticチャンバを構築するために使用されます。このような簡単なセットアップは、媒体の蒸発と不正確な排出係数の問題を提起するが、彼 ​​らは囲まれた、明確に定義された流体チャネル12,18,19のマイクロ流体デバイスによって克服することができます。 体系的に正確な、制御可能な化学的および電気刺激下で細胞応答を研究するために、同時に複数の刺激を細胞に提供することができるマイクロ流体デバイスを開発するために非常に有用であろう。例えば、リーら 。単一または共存する化学勾配とのEF 20を作成するための PDMSベースのマイクロ流体デバイスを報告しました。花王ら 。 devのEF 6により肺癌細胞の走化性を調節するための同様のマイクロ流体チップを駆け落ち。また、スループット、侯らを増加させます。設計及び（2 EF強×4化学物質濃度）であり、8つの異なる複合刺激を細胞に提供するために、PMMAベースのマルチチャネルデュアル電界チップを作製した21。さらに全体で増加し、せん断応力刺激を追加するために、我々は、単一または共存化学/電気/せん断ストレス刺激下で細胞応答を研究するための2つのPMMAベースのマイクロ流体デバイスを開発しました。 ローら 22,23により報告され、これらのデバイスは、インビボ循環系を模倣する連続的な流体流動を受ける5つの独立した細胞培養チャネルを含みます。第1チップ（化学せん断応力チップまたはCSSチップ）、5相対0の濃度は、1/8、1/2、7/8、および1培養領域において生成され、せん断応力勾配があるれていますprodu5文化領域のそれぞれの内部をced。第2のチップ（化学電界チップまたはCEFチップ）において、電極2シリンジポンプの単一のセットを使用して、5 EF強度は、これらの培養領域に5つの異なる化学物質の濃度に加えて生成されます。数値計算とシミュレーションは、より良好な設計を行い、これらのチップを動作し、これらのデバイスの内部に培養肺癌細胞は、活性酸素種（ROS）の産生に対するそれらの応答を観察するための移動速度単一または共存刺激の対象とされていますそして、移動方向。これらのチップは、時間を節約する細胞は、種々の微小環境刺激に応答する方法を調査するため、高スループットと信頼性の高いデバイスであることが実証されています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1070">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:213px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td style="width:460px;">Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Trypsin</td>
			<td style="width:213px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td>detach cell from the dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:213px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10082147</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">10-cm cell culture Petri dish</td>
			<td style="width:213px;">Nunc</td>
			<td style="width:119px;">150350</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Bright-Line&#160;Hemacytometer</td>
			<td style="width:213px;">Sigma</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Cell Counting Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PMMA</td>
			<td style="width:213px;">Customized</td>
			<td style="width:119px;">Customized</td>
			<td>Microfluidic chip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Adaptor</td>
			<td style="width:213px;">Customized</td>
			<td style="width:119px;">Customized</td>
			<td>Microfluidic chip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.07/0.22 mm double-sided tape&#160;</td>
			<td>3M</td>
			<td>8018/9088</td>
			<td>Microfluidic chip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Low melting point agarose</td>
			<td style="width:213px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9414</td>
			<td>Salt bridge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2&#39;-7&#39;-dichlorodihydrofluoresce diacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D6883</td>
			<td>Intracellular ROS measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Indium tin oxide (ITO) glass</td>
			<td style="width:213px;">Merck</td>
			<td>300739</td>
			<td>Heater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proportional-integral-derivative controller&#160;</td>
			<td>JETEC Electronics Co.</td>
			<td>TTM-J4-R-AB</td>
			<td>Temperature controller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermal coupler</td>
			<td>TECPEL</td>
			<td style="width:119px;">TPK-02A</td>
			<td>Temperature controller</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CO2 laser scriber</td>
			<td>Laser Tools &#38; Technics Corp.</td>
			<td style="width:119px;">ILS2</td>
			<td>Microfluidic chip fabrication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe pumps</td>
			<td>New Era</td>
			<td style="width:119px;">NE-300</td>
			<td>Pumping medium and chemicals into the chip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Power supply</td>
			<td>Major Science&#160;</td>
			<td style="width:119px;">MP-300V</td>
			<td>Supplying direct currents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td>Monitoring cell migration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inverted fluorescent microscope</td>
			<td style="width:213px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">TS-100</td>
			<td>Monitoring cell migartion and fluorescencent signals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DSLR camera</td>
			<td>Canon</td>
			<td>60D</td>
			<td>Recording bright-field images&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:119px;">DS-Qi1</td>
			<td>Recording fluorescent images&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">super glue</td>
			<td style="width:213px;">3M Scotch</td>
			<td style="width:119px;">7004</td>
			<td>Attaching adaptors to PMMA substrates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AutoCAD</td>
			<td style="width:213px;">Autodesk Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Designing microfluidic chips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">DMSO</td>
			<td style="width:213px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td>Dissolving DCFDA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">ImgeJ</td>
			<td style="width:213px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Quantifying fluorescent intensities and cell migration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

designing microfluidic devices for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli

マイクロ流体デバイスは、pH、温度、塩濃度、および他の物理的又は化学的刺激の正確で制御可能な細胞の微小環境を作り出すことが可能です。彼らは一般的に、周囲のように生体内で提供することにより、in vitro細胞研究のために使用されています。これらの現象は、細胞の性質や機能を理解する上で重要であるため、特に、細胞は化学勾配、電界、およびせん断応力に応じどのように多くの関心を集めています。これらのマイクロ流体チップは、ガラス基板、シリコンウエハ、ポリジメチルシロキサン（PDMS）ポリマー、ポリメチルメタクリレート（PMMA）基板、またはポリエチレンテレフタレート（PET）基板を用いることができます。これらの材料のうち、PMMA基板は安価であり、容易にレーザーアブレーション及び書き込みを使用して処理することができます。いくつかのマイクロ流体デバイスは、化学的および電気的な刺激を共存、複数の生成のために設計され、製作されてきたが、それらのどれもが考慮されませんでしたスクリーニング目的のために特に、実験の繰り返しを低減するのに十分な効率的。本稿では、単一または共存化学/電気/せん断応力刺激の下で、活性酸素種の産生および遊走に、細胞応答を調査するための2つのPMMAベースのマイクロ流体チップの私達の設計および製造を説明します。最初のチップが一緒に、これらの各領域内部に発生するせん断応力勾配で、文化領域に0、1/8、1/2、7/8、および1の5相対濃度を生成します。第2のチップは、同じ相対濃度が生成されますが、各培養領域内に作成された五つの異なる電界強度を持ちます。これらのデバイスは、正確な、制御可能な微小環境で細胞を提供するだけでなく、非常に実験的なスループットを向上させるだけではなく。

化学せん断応力（CSS）チップ CSSチップは、二つの両面テープを介して貼り合わせ3 PMMAシート、厚さ1mmのそれぞれ、厚さ0.07ミリ（ 図1Aおよび1B）のそれぞれで構成されています。 「クリスマスツリー」構造は、5つの培養領域に0、1/8、1/2、7/8、および1の5相対濃度を生成します。体積流量、流体の?...

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Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

シングルまたは共存化学/電気/せん断応力刺激下で細胞応答を研究するためのマイクロ流体デバイスを設計

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

designing-microfluidic-devices-for-studying-cellular-responses-under

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.8K ビュー.  National Taiwan University. Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

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A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science. Methods for particle trapping based on optical, magnetic, electrokinetic, and acoustic techniques have led to major advancements in physics and biology ranging from the molecular to cellular level. In this article, we introduce a new microfluidic-based technique for particle trapping and manipulation based solely on hydrodynamic fluid flow. Using this method, we demonstrate trapping of micro- and nano-scale particles in aqueous solutions for long time scales. The hydrodynamic trap consists of an integrated microfluidic device with a cross-slot channel geometry where two opposing laminar streams converge, thereby generating a planar extensional flow with a fluid stagnation point (zero-velocity point). In this device, particles are confined at the trap center by active control of the flow field to maintain particle position at the fluid stagnation point. In this manner, particles are effectively trapped in free solution using a feedback control algorithm implemented with a custom-built LabVIEW code. The control algorithm consists of image acquisition for a particle in the microfluidic device, followed by particle tracking, determination of particle centroid position, and active adjustment of fluid flow by regulating the pressure applied to an on-chip pneumatic valve using a pressure regulator. In this way, the on-chip dynamic metering valve functions to regulate the relative flow rates in the outlet channels, thereby enabling fine-scale control of stagnation point position and particle trapping. The microfluidic-based hydrodynamic trap exhibits several advantages as a method for particle trapping. Hydrodynamic trapping is possible for any arbitrary particle without specific requirements on the physical or chemical properties of the trapped object. In addition, hydrodynamic trapping enables confinement of a "single" target object in concentrated or crowded particle suspensions, which is difficult using alternative force field-based trapping methods. The hydrodynamic trap is user-friendly, straightforward to implement and may be added to existing microfluidic devices to facilitate trapping and long-time analysis of particles. Overall, the hydrodynamic trap is a new platform for confinement, micromanipulation, and observation of particles without surface immobilization and eliminates the need for potentially perturbative optical, magnetic, and electric fields in the free-solution trapping of small particles.

In this article, we present a microfluidic-based method for particle confinement based on hydrodynamic flow. We demonstrate stable particle trapping at a fluid stagnation point using a feedback control mechanism, thereby enabling confinement and micromanipulation of arbitrary particles in an integrated microdevice.

単一粒子のためのマイクロ流体ベースの流体力学的トラップ

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

生物工学

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

のためのシンプルなマイクロ流体デバイス<em生体内で&gt;</emの&gt;イメージング<em&gt; Cエレガンス</em&gt;<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;とゼブラフィッシュ

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason for this is that folding takes place over a wide range of timescales, from nanoseconds to seconds or longer, depending on the protein1. Conventional stopped-flow mixers have allowed measurement of folding kinetics starting at about 1 ms. We have recently developed a microfluidic mixer that dilutes denaturant ~100-fold in ~8 &mu;s2. Unlike a stopped-flow mixer, this mixer operates in the laminar flow regime in which turbulence does not occur. The absence of turbulence allows precise numeric simulation of all flows within the mixer with excellent agreement to experiment3-4.
Laminar flow is achieved for Reynolds numbers Re &le;100. For aqueous solutions, this requires micron scale geometries. We use a hard substrate, such as silicon or fused silica, to make channels 5-10 &mu;m wide and 10 &mu;m deep (See Figure 1). The smallest dimensions, at the entrance to the mixing region, are on the order of 1 &mu;m in size. The chip is sealed with a thin glass or fused silica coverslip for optical access. Typical total linear flow rates are ~1 m/s, yielding Re~10, but the protein consumption is only ~0.5 nL/s or 1.8 &mu;L/hr. Protein concentration depends on the detection method: For tryptophan fluorescence the typical concentration is 100 &mu;M (for 1 Trp/protein) and for FRET the typical concentration is ~100 nM.
The folding process is initiated by rapid dilution of denaturant from 6 M to 0.06 M guanidine hydrochloride. The protein in high denaturant flows down a central channel and is met on either side at the mixing region by buffer without denaturant moving ~100 times faster (see Figure 2). This geometry causes rapid constriction of the protein flow into a narrow jet ~100 nm wide. Diffusion of the light denaturant molecules is very rapid, while diffusion of the heavy protein molecules is much slower, diffusing less than 1 &mu;m in 1 ms. The difference in diffusion constant of the denaturant and the protein results in rapid dilution of the denaturant from the protein stream, reducing the effective concentration of the denaturant around the protein. The protein jet flows at a constant rate down the observation channel and fluorescence of the protein during folding can be observed using a scanning confocal microscope5.

In this work we explain the fabrication and use of a microfluidic mixer capable of mixing two solutions in ~8 &mu;s. We also demonstrate the use of these mixers with spectroscopic detection using UV fluorescence and fluorescence resonance energy transfer (FRET).

タンパク質の折り畳みを研究するためのマイクロ流体ミキサー

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

複数の異なった株を勉強するためのマイクロ流体デバイス

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Microtissue安定化のためのマイクロ流体デバイスの層ごとのコラーゲン沈着

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

3Dペーパーマイクロ流体デバイスを構築するために接着剤パターニングを使用して、

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

A Method for Evaluating Timeliness and Accuracy of Volitional Motor Responses to Vibrotactile Stimuli

Artificial sensory feedback (ASF) systems can be used to compensate for lost proprioception in individuals with lower-limb impairments. Effective design of these ASF systems requires an in-depth understanding of how the parameters of specific feedback mechanism affect user perception and reaction to stimuli. This article presents a method for applying vibrotactile stimuli to human participants and measuring their response. Rotating mass vibratory motors are placed at pre-defined locations on the participant's thigh, and controlled through custom hardware and software. The speed and accuracy of participants' volitional responses to vibrotactile stimuli are measured for researcher-specified combinations of motor placement and vibration frequency. While the protocol described here uses push-buttons to collect a simple binary response to the vibrotactile stimuli, the technique can be extended to other response mechanisms using inertial measurement units or pressure sensors to measure joint angle and weight bearing ratios, respectively. Similarly, the application of vibrotactile stimuli can be explored for body segments other than the thigh.

This article describes a technique for applying vibrotactile stimuli to the thigh of a human participant, and measuring the accuracy and reaction time of the participant&#39;s volitional response for various combinations of stimulation location and frequency.

振動触覚刺激に随意運動反応の適時性と精度の評価方法

Artificial sensory feedback (ASF) systems can be used to compensate for lost proprioception in individuals with lower-limb impairments.  Effective design ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

バルブ付き多層マイクロ流体デバイスのための多段階可変高さのフォトリソグラフィ

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and directed within a layer of paper. Moreover, stacking multiple layers of patterned paper creates sophisticated three-dimensional microfluidic networks that can support the development of analytical and bioanalytical assays. Paper-based microfluidic devices are inexpensive, portable, easy to use, and require no external equipment to operate. As a result, they hold great promise as a platform for point-of-care diagnostics. In order to properly evaluate the utility and analytical performance of paper-based devices, suitable methods must be developed to ensure their manufacture is reproducible and at a scale that is appropriate for laboratory settings. In this manuscript, a method to fabricate a general device architecture that can be used for paper-based immunoassays is described. We use a form of additive manufacturing (multi-layer lamination) to prepare devices that comprise multiple layers of patterned paper and patterned adhesive. In addition to demonstrating the proper use of these three-dimensional paper-based microfluidic devices with an immunoassay for human chorionic gonadotropin (hCG), errors in the manufacturing process that may result in device failures are discussed. We expect this approach to manufacturing paper-based devices will find broad utility in the development of analytical applications designed specifically for limited-resource settings.

We detail a method to fabricate three-dimensional paper-based microfluidic devices for use in the development of immunoassays. Our approach to device assembly is a type of multilayer, additive manufacturing. We demonstrate a sandwich immunoassay to provide representative results for these types of paper-based devices.

イムノアッセイのための3次元紙ベースのマイクロ流体デバイスの作製

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under combinations of chemical and oxygen gradients. Both chemical and oxygen gradients can greatly affect cell migration in vivo; however, due to technical limitations, very little research has been performed to investigate their effects in vitro. The device developed in this research takes advantage of a series of serpentine-shaped channels to generate the desired chemical gradients and exploits a spatially confined chemical reaction method for oxygen gradient generation. The directions of the chemical and oxygen gradients are perpendicular to each other to enable straightforward migration result interpretation. In order to efficiently generate the oxygen gradients with minimal chemical consumption, the embedded PC thin film is utilized as a gas diffusion barrier. The developed microfluidic device can be actuated by syringe pumps and placed into a conventional cell incubator during cell migration experiments to allow for setup simplification and optimized cell culture conditions. In cell experiments, we used the device to study migrations of adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549, under combinations of chemokine (stromal cell-derived factor, SDF-1&#945;) and oxygen gradients. The experimental results show that the device can stably generate perpendicular chemokine and oxygen gradients and is compatible with cells. The migration study results indicate that oxygen gradients may play an essential role in guiding cell migration, and cellular behavior under combinations of gradients cannot be predicted from those under single gradients. The device provides a powerful and practical tool for researchers to study interactions between chemical and oxygen gradients in cell culture, which can promote better cell migration studies in more in vivo-like microenvironments.

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

垂直化学的酸素勾配の下で細胞移動研究のためのポリジメチルシロキサン - ポリカーボネートマイクロ流体デバイス

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...