The authors thank Scott Longwell for helpful comments and edits to the manuscript and Robert Puccinelli for device photography. The authors acknowledge generous support from a Beckman Institute Technology Development Grant. K.B. is supported by a NSF GFRP fellowship and the TLI component of the Stanford Clinical and Translational Science Award to Spectrum (NIH TL1 TR 001084); P.F. acknowledges a McCormick and Gabilan Faculty Fellowship.

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Diese Arbeit zeigt eine komplette mehrstufigen photolithographischen Protokoll für eine mehrschichtige Mikrofluidik - Vorrichtung mit Ventilen und variabler Höhe Geometrie , die für jede Anwendung mit einfachen Änderungen an Fertigungsparameter auf der Basis unserer Online - Tool 26 und die Anweisungen des Herstellers 25 abgestimmt werden kann. Dieses Protokoll soll mikrofluidischen Geräte über einfache, passive Schichtformen zu konstruieren wollen, mehrschichtige Photolithographie für die Forscher zu entmystifizieren. Mehrlagige Mikrofluidik - Geräte ermöglichen die Ausübung der fortgeschrittenen Funktionalität innerhalb einer einzigen weichen Polymer - Gerät für &quot;lab - on - Chip&quot; Anwendungen , die von Einzelzellanalyse mit hohem Durchsatz biochemischen Assays 1. Die Sicke Synthesizervorrichtung hier konstruiert zeigt mehrere Höhen mit einem einzigen Strömungsschicht und beide voll verschließbaren und Sieb Ventilgeometrien Hydrogel Tröpfchen zu erzeugen, cein an Polymerkügelchen polymerisiert werden. Das Vorhandensein von Ventilen ermöglicht automatische, programmierbare Steuerung über Chip - Funktion , die sich leicht mit jeder Skriptsprache implementiert werden kann (dh, MATLAB, LabView oder Python) , die mit einer Durchflusssteuerungsmodule Labor - Schnittstellen (dh Spritzenpumpen und / oder Druckregler ). In dieser Demonstration, kundenspezifische Software MATLAB (Code in Referenz zur Verfügung gestellt 28) kommuniziert mit Modbus-Magnetventil - Arrays in einem benutzerdefinierten pneumatische Einrichtung 28 und einem MFCS Flusssteuerungssystem unter Druck zu setzen Flüssigkeiten auf dem Gerät, sondern auch viele andere Optionen für die Ablaufsteuerung sind im Handel verfügbar. Designs und weitere Vorschläge sind enthalten Erfolg mikrofluidischen Ingenieure für die erstmalige maximieren zu helfen. Die Herstellungsschritte hier sollte in der Regel anpassungsfähig an eine breite Palette von photolithographischen Strukturierung für mikrofluidische Geräte beweisen gezeigt. In einem der Schritte (Flow High), 30um Eigenschaften wurden auf die untere Photoresistschicht (Flow Low, 55 &amp; mgr; m) gegeben, um eine zusammengesetzte Höhe von 85 um zu schaffen. Dieser Schritt kann verwendet werden, dicke Features viskoser Photolacke, ohne die Notwendigkeit zu machen (die schwieriger zu handhaben sind). In einem weiteren Schritt (Herringbone), wurden Funktionen auf einem vorher vernetzt Kanal hergestellt, gemusterte Nuten auf der Unterseite eines Mikrokanals zu schaffen, wenn replica in PDMS geformt. Dieser Schritt kann von Benutzern angepasst werden, um komplexe Geometrien zu schaffen, einschließlich der gut innerhalb-well-Architekturen, falls gewünscht. Der Erfolg dieses Herstellungsverfahrens wird durch die Verwendung des Wulstes Synthesizervorrichtung herzustellen Perlpolymerisat aus PEG-Diacrylat Tröpfchen demonstriert. unterschiedlichen Strömungsdruck Exploring können die Tröpfchen Regime modulieren Perlen unterschiedlicher Größe zu erzeugen. Darüber hinaus können Zusätze leicht in der Polymermischung enthalten sein. Diese Hydrogel-Kügelchen können für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden, einschließlichspektrale Codierung durch den Einbau von fluoreszierenden oder lumineszenten Leuchtstoffe, Arzneimittelabgabe oder zellulären Assays über Oberflächenfunktionalisierung. Wenn dieses Protokoll hier vorgestellten angenommen wird, eine andere Mikrofluidik-Vorrichtung als der Wulst Synthesizer zu bauen, sollte es bestimmte Schritte sind entscheidend darauf hingewiesen, eine hohe Chance auf Erfolg auf der ersten Fertigungsversuch zu erreichen. Wir und andere haben beobachtet , dass weiche Backtemperatur zu optimieren, die Dauer und Rampenrate entscheidend ist Retention von Restlösemittel in der über Krustenbildung Lackschicht zu verhindern (die sprudelnde von eingeschlossenen Stickstoffgas während der Exposition führen kann) 29. Darüber hinaus verbessert eine über Nacht Rehydrierung Schritt, um die Reproduzierbarkeit der Belichtungszeiten für dicke Schichten XT AZ50 erforderlich und reduziert räumliche Variabilität in der Rate der Entwicklung über den Wafer. Schließlich ist eine lange (14-15 h) Einbrennen nach der Belichtung mit einer langsamen Rampe rundet rechteckigen Photoresist-Features va zu bildenLves ohne für eine Vielzahl von getesteten Photoresistdicken Ventil Geometrien zu verformen. Einige der Verfahren hier vorgestellten für Schichten von negativen Photoresist umfassen kleine Unterschiede aus den Anweisungen des Herstellers hergestellt wird. Wir schlagen vor, einen dreistufigen weichen Bake-Verfahren, das bei 65 ° C eingestellt Wafer zwischen heißen Platten bewegt, 95 ° C und 65 ° C. Wir haben herausgefunden, dass eine allmähliche Erwärmung von Wafern das Auftreten von Fehlern während der Belichtung reduziert von Bruch von Gasblasen im Photoresist über die Bildung einer &quot;Kruste&quot; während der weichen Backen gefangen führt. Im Gegensatz dazu allmähliche Abkühlung der Wafer nach dem weichen Backen kann Photoresist-Cracken reduzieren. Schließlich haben wir festgestellt, dass die Zeiten Photoresist zunehmender Entspannung zu ~ 20 min in der Höhe über den Wafer wider kleine Schwankungen reduziert. Durch die Flexibilität dieses Herstellungsprotokoll, erwarten wir, wird es für verschiedene Geräte über Disziplin breiten Nutzen habenes. Während Alternativen wie 3D-Druck, Glas Ätzen und Prägen auch mikrofluidische Fertigung erreichen können, können lithographische Strukturierung komplexer Funktionalität, wie zum Beispiel Ventile zu erreichen, dass andere Verfahren noch nicht in großem Umfang erreicht. Die wesentliche Einschränkung dieses Protokolls ist Design-to-Testzeit, die dauert 3 Tage ~ (hauptsächlich wegen Schritte erforderlich, um abgerundete Ventile herzustellen). Wir hoffen, dass offene Verbreitung von Protokollen in der Mikrofluidik, insbesondere auf komplizierte Photolithographieschritte beziehen, werden kontinuierliche Innovationen auf dem Gebiet fördern und dass dieser Proof-of-Concept-Demonstration unterstützen wird helfen Benutzern Fertigung Probleme zu beheben.

<html> In den letzten 15 Jahren Mikrofluidik als Feld hat mit einer Explosion von neuen Technologien , die die Manipulation von Flüssigkeiten im Mikrometer - Maßstab 1 schnelles Wachstum erlebt. Mikrofluidik - Systeme sind attraktive Plattformen für Nasslabor Funktionalität , weil die kleinen Volumina das Potential haben , eine erhöhte Geschwindigkeit und Empfindlichkeit zu realisieren , während gleichzeitig die Durchsatz dramatisch steigern und Kosten reduziert werden durch Skalen 2, 3 nutzen. Mehrlagige Mikrofluidik - Systeme gemacht haben besonders erhebliche Auswirkungen in Hochdurchsatz - biochemische Analyse - Anwendungen wie Einzelzellanalyse 4, 5, 6, Analyse einzelner Moleküle (zB digitale PCR - 7), Proteinkristallographie 8, Transkriptionsfaktor - Bindungsassaysf &quot;&gt; 9, 10, und zelluläre Screening - 11. Ein zentrales Ziel von Mikrofluidik - Geräte die Entwicklung von &quot;auf einem Chip - Labor&quot; war für die gesamte biochemische Analyse 12 in einem einzigen Gerät komplexe fluidische Manipulationen durchführen kann. Die Entwicklung von Mehrschicht - Weich - Lithographie - Techniken hat dazu beigetragen , dieses Ziel zu erreichen , indem die Schaffung von On-Chip - Ventile ermöglichen, Mischer und Pumpen für die aktive Flüssigkeiten in kleinen Mengen 13, 14, 15 zu steuern. Trotz ihrer Vorteile und Anwendungen aufweist, bleiben viele dieser mikrofluidischen Technologien weitgehend ausgespannt durch Nicht-Fachmann-Nutzer. Die weit verbreitete Annahme ist teilweise aufgrund der begrenzten Zugang zu Mikrofabrikationsanlagen, aber auch durch unzureichende Kommunikation von Herstellungstechniken eine Herausforderung gewesen. Dies gilt insbesondere, for mehrschichtige mikrofluidischen Vorrichtungen mit Strukturen für Ventile oder komplexe Geometrien: der Mangel an detaillierten, praktischen Informationen über wichtige Designparameter und Herstellungstechniken oft abschreckt neue Forscher aus sie sich auf Projekte, die Gestaltung und Erstellung dieser Geräte beteiligt sind. Dieser Artikel zielt darauf ab, diese Wissenslücke zu adressieren, indem ein komplettes Protokoll für die Herstellung von mehrschichtigen mikrofluidischen Vorrichtungen mit Ventilen und variabler Höhe Features präsentiert, ausgehend von Konstruktionsparametern und Bewegen durch alle Fertigungsschritte. Durch die Fokussierung auf den ersten Photolithographieschritte der Fertigung, ergänzt dieses Protokoll andere Mikrofluidik - Protokolle 16 , die nachfolgenden Schritte von Geräten aus den Formen beschreiben Gießen und spezifische Experimente ausgeführt wird . Mikrofluidik-Vorrichtungen mit monolithischer on-chip Ventile bestehen aus zwei Schichten: einer &quot;flow&quot; Schicht, wobei die interessierende Fluid in Mikro manipuliertKanäle und eine &quot;Kontrolle&quot; Schicht, in der Mikrokanäle Luft oder Wasser , das wahlweise eine Fluidströmung in dem Strömungsschicht 14 modulieren können. Diese beiden Schichten werden jeweils hergestellt auf einem separaten Siliziumform Master, der anschließend für Polydimethylsiloxan (PDMS) Replik Form in einem Prozess namens verwendet wird &quot;Softlithographie 17.&quot; Um einen mehrschichtigen Vorrichtung zu bilden, werden jede der PDMS Schichten gegossen auf ihren jeweiligen Form Mastern und dann miteinander ausgerichtet, wodurch eine zusammengesetzte PDMS Vorrichtung mit Kanälen in jeder Schicht bildet. Ventile sind an Stellen gebildet, wo Strömungs- und Steuerkanäle einen kreuzen seitig und sind nur durch eine dünne Membran getrennt sind; Druckbeaufschlagung des Steuerkanals lenkt diese Membran den Strömungskanal und lokal verdrängt die Flüssigkeit (1) zu verschließen. Aktive on-chip Ventile können auf verschiedene Weise hergestellt werden, abhängig von der gewünschten Endanwendung. Ventilekann entweder in einer &quot;nach unten drücken&quot; oder &quot;Push - up&quot; Geometrie konfiguriert werden, abhängig davon , ob die Steuerschicht oberhalb oder unterhalb der Strömungsschicht (Abbildung 1) ist 15. &quot;Push-up&quot; Geometrien für untere Schließdrücke und höhere Stabilität der Vorrichtung gegen Delamination erlauben, während &quot;nach unten drücken&quot; Geometrien ermöglichen die Strömungskanäle in direktem Kontakt mit dem gebundenen Substrat zu sein, den Vorteil, selektive Funktionalisierung oder Strukturierung der Substratoberfläche zu verleihen für die spätere Funktionalität 18, 19. Die Ventile können auch entweder absichtlich undicht &quot;Sieb&quot; Ventile oder vollständig verschließbar sein, abhängig von der Querschnittsprofil des Strömungskanals. Sieve Ventile sind nützlich für die Perlen, Zellen oder andere macroanalytes Trapping 1, und über die Verwendung von typischen negativen Photolacke hergestellt (dh SU-8 - Serie), die have Rechteckprofile. Wenn ein Steuerkanal über diese Ventilbereiche unter Druck gesetzt wird, lenkt der PDMS - Membran zwischen der Kontroll- und Strömungsschicht isotrop in das Rechteckprofil des Ventils , ohne die Ecken Dichtungsfluidströmung zulässt , aber Makro Kalkpartikel Trapping (Abbildung 1). Im Gegensatz dazu vollständig verschließbaren mikrofluidische Ventile werden, indem ein kleines Stück abgerundet Photoresist an Ventilplätzen hergestellt. Mit dieser Geometrie Druckbeaufschlagung des Steuerkanals lenkt die Membran gegen die gerundete Strömungsschicht vollständig um den Kanal abzudichten, Anhalten Fluidströmung. Abgerundete Profile in der Strömungsschicht über das Schmelzen und Reflow von positiven Photoresist (zB AZ50 XT oder SPR 220) nach typischen Photolithographieschritte erzeugt. Wir haben bereits gezeigt , dass die Post-Reflow Höhen der Ventilbereiche ist abhängig vom gewählten Merkmalabmessungen 21. Dieses Protokoll zeigt die Herstellung beider Ventilgeometrien mitin einer Perlmühle Synthesevorrichtung. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55276/55276fig1.jpg" /> Abbildung 1: Mehrschichtige Mikroventil Geometries. Typische &quot;Push-up&quot; Gerätearchitekturen für Sieb und vollständig verschließbaren Ventilen vor (oben) und nach (unten) unter Druck. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55276/55276fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55276/55276fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Die Geräte können auch komplexe passive Funktionen wie chaotischen Mischern 13 und On-Chip - Widerstände 20 , die innerhalb einer Strömungsschicht Merkmale von mehreren unterschiedlichen Höhen erfordern. Um das zu erreichen haben eine variable Höhe Strömungsschicht, verschiedene Gruppen , darunter viele Verfahren eingesetzt Leiterplatte Ätzen 22, mehrschichtige PDMS Relief Ausrichtung 23 oder mehrstufiges photolithography 24. Unsere Gruppe hat mehrstufigen Photolithographie auf einem einzigen Form Master gefunden ein effektives und reproduzierbares Verfahren zu sein. Um dies zu tun, eine einfache Photolithographietechnik zu bauen dicke Kanäle negativer Photoresist (zB SU-8 - Serie Photolacke) in Schichten ohne Entwicklung zwischen dem Aufbringen jeder Schicht verwendet. Jede Schicht wird in negativer Photoresist gemäß seiner Dicke mit den Anweisungen des Herstellers 25 auf dem Silizium - Master gesponnen. Merkmale dieser Höhe werden dann auf die Schicht strukturiert , um eine bestimmte Transparenzmaske (Abbildung 2) befestigt unter Verwendung von auf eine Glasmaskenplatte und auf die zuvor gesponnenen Schicht vor der Belichtung ausgerichtet sind . In mehreren Schritten Photolithographie ist eine präzise Ausrichtung zwischen den Schichten kritisch an, um einen vollständigen variablen Höhe Strömungskanal bildet. Nach der Ausrichtung wird jede Schicht in einer Dicke abhängige post-exposure bake unterzogen. Ohne Entwicklung ist die nächste Schicht simlich wie strukturiert. Auf diese Weise können hohe Funktionen auf einem einzelnen Strömungs Wafer Schicht-für-Schicht durch die Verwendung von mehreren Masken aufgebaut werden. Durch Überspringen Entwicklung zwischen jedem Schritt können vorherigen Photoresistschichten verwendet werden , zusammengesetzte Höhenmerkmale zu erzeugen , 24 (dh zwei Schichten 25 um eine 50 &amp; mgr; m - Funktion zu machen). Zusätzlich Kanalboden Features wie chaotisch Mischer Fischgrät - Nuten 13 können unter Verwendung von Schichten mit zuvor belichteten Funktionen vorgenommen werden. Eine letzte Entwicklungsschritt schließt den Prozess, einen Einstrom Wafer mit Merkmalen von variabler Höhe (Abbildung 3) zu schaffen. Hier wird ein komplettes Protokoll für mehrstufige Photolithographie, die Beispiele aller erforderlichen Verfahren zur Herstellung On-Chip-Ventile und Strömungskanäle mit mehreren Höhen enthält, wird zur Verfügung gestellt. Dieses Herstellungsprotokoll wird in Zusammenhang mit einer Mehrschicht-Mikrofluidik-bead-Synthesizers vorgelegt, die Ventile und variab erfordertle-Höhe bietet für seine Funktionalität. Diese Vorrichtung umfasst T-Junctions in einem Ölmantel Wassertröpfchen zu erzeugen, On-Chip-Widerständen Strömungsraten durch Steuerung Poiseuille Widerstand, ein chaotisches Mischer zum Homogenisieren Tröpfchen Komponenten und beide dicht abschließende und Sieb Ventile automatisierte Abläufe zu ermöglichen, zu modulieren mehrere Reagenz Einbeziehung Eingänge. Verwendung mehrstufiger photolithographischen werden diese Merkmale jeweils hergestellt auf einer anderen Schicht gemäß Höhe oder Photoresist; die folgenden Schichten sind in diesem Protokoll aufgebaut: (1) Durchflussrundventilschicht (55 &amp; mgr; m, AZ50 XT) (2) Durchfluss Low-Schicht (55 &amp; mgr; m, SU-8 2050) (3) Durchflusshoch Schicht (85 &amp; mgr; m, SU- 8 2025 30 um additive Höhe) und (4) mit Fischgrätmuster Grooves (125 &amp; mgr; m, SU-8 2025 40 um additive Höhe) (Abbildung 3). Hydrogelperlen können für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich selektive Oberflächenfunktionalisierung für Downstream-Assays, Wirkstoffverkapselung verwendet werden, radiotracing und Imaging-Assays und Zell Inkorporation; Bislang hatten wir eine komplexere Version dieser Geräte spektral codierten PEG Hydrogelperlen Nanoleuchtstoffen enthält , Lanthanid - 20 herzustellen. Die Entwürfe hier diskutiert werden Zusätzliche Ressourcen enthalten für jedes Labor in ihre Forschungsanstrengungen zu verwenden, falls gewünscht. Wir gehen davon aus, dass dieses Protokoll wird eine offene Ressource für Spezialisten und Nicht-Fachleute gleichermaßen daran interessiert, Mehrlagige Mikrofluidik-Geräte mit Ventilen oder komplexen Geometrien stellen die Barriere für den Eintritt in die Mikrofluidik zu senken und die Chancen der Fertigung Erfolg erhöhen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1709">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:459px;">Materials</td>
			<td style="width:332px;"></td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td style="width:659px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mylar Transparency Masks, 5&#34;</td>
			<td>FineLine Plotting</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#34; Quartz Plates</td>
			<td>United Silica&#160;</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#34; Silicon Wafers, Test Grade</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SU8 2005, 2025, 2050 photoresist</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y111045, Y111069, Y111072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Az50XT&#160;</td>
			<td>Integrated Micromaterials</td>
			<td>AZ50XT-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SU8 Developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AZ400K 1:3 Developer</td>
			<td>Integrated Micromaterials</td>
			<td>AZ400K1:3-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyrex 150 mm glass dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3140150-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wafer Petri Dishes, 150 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wafer Tweezers&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>78410-2W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOTS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2&#34; x 3&#34; glass slides</td>
			<td>Thomas Scientific&#160;</td>
			<td>6686K20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RTV 615 elastomeric base and curing agent PDMS set</td>
			<td>Momentive&#160;</td>
			<td>RTV615-1P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tygon Tubing, 0.02&#34; O.D.&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific&#160;</td>
			<td>14-171-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Capillary PEEK tubing,&#160; 510 um OD, 125 um ID</td>
			<td>Zeus</td>
			<td>Custom</td>
			<td>360 um PEEK is readily available by Idex (catalog number: 1571)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cyro 4 mL tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>127279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epoxy, 30-minute</td>
			<td>Permatex</td>
			<td>84107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metal Pins, 0.025&#34; OD, .013&#34; ID</td>
			<td>New England Small Tube</td>
			<td>NE-1310-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly(ethylene glycol) diacrylate, Mn 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>455008-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate photoinitator&#160;</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry Co.</td>
			<td>L0290</td>
			<td>We typically synthesize LAP in-house.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>330779-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Span-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ABIL EM 90</td>
			<td>UPI Chem</td>
			<td>420095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:459px;">Equipment</td>
			<td>Equivalent equiptment or homebuilt setups will work equally as well</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mask Aligner</td>
			<td>Karl Suss</td>
			<td>MA6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Profilometer</td>
			<td>KLA-Tencor</td>
			<td>Alpha-Step D500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spin Coater</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>WS-650-23</td>
			<td>Any spincoater can be used that accepts 100 mm wafers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vacuum Dessicator, Bell-Jar Style</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>420100000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oven</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>WU-52120-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UV Spot Curing System with 3 mm LLG option</td>
			<td>Dymax</td>
			<td>41015</td>
			<td>UV LEDs, Xenon Arc Lamps, or other UV sources of the same intensity work equally as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MFCS Microfluidic Fluid Control System</td>
			<td>Fluidgent</td>
			<td>MFCS-EZ</td>
			<td>Syringe pumps, custom pneumatics or other control systems can also be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automated control scripting</td>
			<td>MATLAB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hotplate</td>
			<td>Tory Pines Scientific</td>
			<td>HP30</td>
			<td>Any hotplate with uniform heating (i.e. aluminum or ceramic plates) will suffice.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Hier zeigen wir die Herstellung von mit Ventil versehenen, variable Höhe mehrschichtigen mikrofluidischen Formen durch Vorrichtungen, die Erzeugung von Poly ethylenglykol (PEG) Hydrogelperlen aus Tröpfchen Herstellung (Abbildung 2). Eine Übersicht über das komplette Herstellungsprozess in Abbildung enthalten ist 3. Design unter Verwendung von Elementen aus früheren Arbeiten beschäftigt die Perle Synthesizer 4 Höhen in seiner Strömungsschicht einschließlich (1) abgerundet AZ50 XT Ventile für Laminar - Flow - Modulation (55 &amp; mgr; m) (2) fließen niedrige Kanäle für Reagenzien bei höheren Widerstand (55 &amp; mgr; m) (3) fließen hohe Kanäle zum leiten von Strömung bei niedrigeren Widerstand zu den Auslässen und Mischer (85 &amp; mgr; m) und (4) eine Fischgrät Advektion Mischer (125 &amp; mgr; m) zum Mischen des PEG Einführung und Vernetzer in eine homogene Lösung (4A und 4B). Eine Tabelle der Design-Parameter und vorgeschlagenen Designeinschränkungen verwendet diese bei der KonstruktionDesign ist in Tabelle 1. Design - Dateien und Maske die Übertragung von Dateien enthalten sind in der Material Tabelle enthalten. Dieses Protokoll demonstriert Strömungsventile Rundungs und mehreren Höhen auf der gleichen Strömungs Wafer über tandem photolithographischen Schritten ohne Entwicklung zwischen jedem Schritt (Tabelle 2) zu konstruieren. Ein typisches Post-Reflow Ventilprofil von einem Profilometer und Stereoskop - Bilder unserer Ventile Post-Reflow Rundung ist in den 5A und 5B gezeigt. Resultierende gemessene Fertigungshöhen von unserer Multi-Höhe photolithographischen sind in Tabelle 3 aufgeführt Heights auf allen Geräten in einem einzigen Strom Wafer an 10 Standorten pro jeder Schicht gemessen wurden, sowohl von Gerät zu Gerät zu bewerten und über Wafer Variation. Alle Funktionen beobachtet &lt;2% CV über den Wafer. Hersteller Photoresist-Datenblätter vorschlagen typische HöheAbweichungen von ± 5%, wenn Mehrschicht-Eigenschaften der Konstruktion, so sollte diese Toleranz berücksichtigt werden, wenn dieses Protokoll für ein anderes Design eingestellt wird. Wie bei jedem Herstellungsprozess können Fehler bei jedem Schritt resultieren, wenn Herstellungsparameter, wie beispielsweise Schleuderdrehzahl oder die Belichtung nicht für die gewünschte Musterhöhe und Geometrie optimiert. Es sind viele Quellen für die richtige Belichtung und Entwicklungszeiten zur Fehlerbehebung, einschließlich einer Website unserer Einrichtung 27 hält. Abweichungen von vorgeschlagenen weichen und harten backen Zeiten, Temperaturen und Rampenraten können Risse, Blasen oder unvollständige Funktionen erzeugen. Zusätzlich Rehydrierung des AZ50 XT positiven Photoresist vor der Belichtung ist kritisch. Die Wafer ohne richtige Rehydrierung geknackt erscheinen oder enthalten Blasen innerhalb der Ventilbereiche. Wenn dies der Fall ist, eine &quot;nasse Box&quot; (eine geschlossene Box mit einer Schale mit VE-Wasser) unter Verwendung von zu Haus wafers für die über Nacht Rehydrierung kann helfen. Kürzere Rehydratation Zeiten (~ 5-6 Stunden) für AZ50 XT Merkmale unter 50 um mit ähnlichen Ergebnissen verwendet werden, aber größer Funktionen erfordern über Nacht Rehydratation die Möglichkeit von Merkmalsverlust während der Belichtung und Entwicklung zu reduzieren. Neuere positiven Resist Alternativen (zB AZ40XT) kann die Notwendigkeit einer über Nacht Rehydrierung beseitigen; jedoch haben wir diese Formulierungen nicht getestet. Als proof-of-concept, PEG-Diacrylat - Hydrogel - Tröpfchen wurden von dem Wulst Synthesizervorrichtung (6A) hergestellt. 5C und 5D zeigen repräsentative Bilder des Ventilbetriebs und Schließung auf dem Gerät , wenn es unter Druck und Druckablassventile. Häufige Fehlerarten für die Ventildruck umfassen: die Verwendung von nicht genügend Druck (Ventile nicht vollständig schließen, die durch fließende Lebensmittelfarbstoff überprüft werden kann), Zulaufschlauch Insertion (Fluss gehemmt werden, wennSchlauch oder Metallstifte sind zu weit nach unten gedrückt und die Vorrichtung Delamination führen kann), und der Einbau von Staub oder Fasern während des Herstellungsprozesses (Kanäle oder die Vorrichtung kann delaminieren okkludiert werden kann). Um diese Fehlerarten zu beheben, sollten Benutzer Reinraumbedingungen während der Herstellung erhalten und systematisch jedes Ventil zu testen, bevor zu einem Gerät laufen fortfahren. Wenn das Gerät Delaminierung als gemeinsames Problem in Experimenten zeigt, kann dies entweder durch Lauf Vorrichtungen bei niedrigeren Drücken (&lt;15 psi) oder reduzierenden Silanisierung Zeiten beseitigt werden. 6A zeigt den Wulst Synthesizervorrichtung in Betrieb Herstellung Hydrogel - Tröpfchen in einem Öl - Emulsion bei der T - Kreuzung Tröpfchengenerator und 6B zeigt eingeschlossene Kügelchen durch die On-Chip - Sieb Ventil. Wird die Polymerisation nicht erfolgreich ist, Perlen wird ein Sieb Ventil passieren. Wenn dies auftritt, UV Quellenintensität und die Höhe von der Vorrichtung kann mod werden<html> ified Polymerisation zu verbessern. Hydrogele Perlen wurden bei Flussraten von 10 psi (Öl) und 9 psi (Reagenzmischung) unter Verwendung von ~ 100 mW / cm 2 Leistung über einen Polymerisationsbereichs 5 mm im Durchmesser (6C und 6D) erzeugt. Resultierende Perlen 52,6 ± 1,6 &amp; mgr; m gemessen (Mittelwert ± std). Größen wurden für 2992 Perlen analysiert eine Hough - Transformation (MATLAB) in Hellfeldbilder (Figuren 6C und 6D) mit einer auferlegten Größenfilter von ± 3 std (28 Ausreißer, 0,94% der Kügelchen) verwendet wird . Unsere gesamte Hardware - Setup für Tröpfchenproduktion ist in 7 gezeigt. Tabelle 2: Multi-Step Lithografie - Parameter. Ein Tabellenformat aller von der Photolithographieschritte mit entsprechenden Parametern einschließlich Umdrehungsgeschwindigkeit, Weichbacken mal, Belichtungsenergien und Hardbake Zeiten.<html> 2.xlsx &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um diese Tabelle zu sehen. (Rechtsklick zum Download bereit.) <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" width="568"><tbody><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:215px;"> Flow Schichtmerkmal </td><td style="width:353px;"> Feature - Höhe </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:215px;"> Abgerundete Ventile (Flow-Runde) </td><td style="width:353px;"> 54,43 &amp; mgr; m (1,05 &amp; mgr; m std., 1,9% CV) </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:215px;"> Strömungskanäle (Flow Low) </td><td style="width:353px;"> 84,22 &amp; mgr; m (0,91 &amp; mgr; m std., 1,1% CV) </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:215px;"> Strömungskanäle (Flow High) </td><td style="width:353px;"> 54,10 &amp; mgr; m (1,24 &amp; mgr; m std., 2,3% CV) </td></tr><html> 2 &quot;&gt; <td height="22" style="height:22px;width:215px;"> Herringbone Grooves (Mixer) </td><td style="width:353px;"> 124,19 &amp; mgr; m (1,89 &amp; mgr; m std., 1,5% CV) </td></tr></tbody></table> Tabelle 3: Profilometer Heights nach der Herstellung. Insgesamt Feature Höhe nach der Herstellung für jede der über mehrstufige Photolithographie hergestellt Schichten. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55276/55276fig2.jpg" /> Abbildung 2: Überblick über die Herstellungsverfahren. Eine schematische Schritte bei der Herstellung mehrschichtigen Vorrichtung angibt, vom Entwurf bis zur Geräteprüfung. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55276/55276fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55276/55276fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <html> 5276 / 55276fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3: Schematische Darstellung der mehrstufigen Photolithographie. Überblick über Ventil Rundungs- und variabler Höhe Merkmal Herstellung in der Photolithographie zur Erzeugung einer mehrschichtigen Mikrofluidikvorrichtung. hier sind nur wenige Schritte zur Herstellung der Sicke Synthesizervorrichtung enthalten. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55276/55276fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55276/55276fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55276/55276fig4.jpg" /> Abbildung 4: Bead Synthesizer Gerätedesign und Bilder. (A) CAD - Konstruktion des Bead Synthesizer - Gerät mit Schichten mit unterschiedlichen Farben gekennzeichnet. (B) Bild des PDMS mehrschichtigen Korn Synthesizer - Gerät. Die Steuerleitungen erscheinen in orange, Strömungskanäle erscheinen in blau und grün.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/55276/55276fig5.jpg" /> Abbildung 5: Ventilprofile und Bilder. (A) Repräsentative Ventilhöhenprofil als mit einem Profilometer bewertet. (B) Repräsentative Bilder von Ventilen und die umliegenden Kanäle in dem Silizium - Form Master - Fließ Wafer. (C, D) Bilder der endgültigen Ventilbetrieb auf dem Mehrschicht PDMS Gerät. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55276/55276fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55276/55276fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/55276/55276fig6.jpg" /> Abbildung 6: Herstellung von PEG-Diacrylat - Hydrogel - Tröpfchen. (A) Bild von Hydrogel - Tröpfchen production an der Tröpfchengenerator T-Kreuzung. (B) Bild von Perlen nach der Polymerisation auf dem Sieb Ventil gefangen , wenn das Ventil unter Druck gesetzt wird. (C) Hell Bild von Hydrogel - Kügelchen in der Perle Synthesizer erzeugt (4X). (D) Größenverteilung von Hydrogel - Kügelchen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55276/55276fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55276/55276fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="7" src="/files/ftp_upload/55276/55276fig7.jpg" /> Abbildung 7: Gerätebetrieb Setup. Bild mit Anmerkung der gesamten Hardware für Gerätebetrieb erforderlich. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55276/55276fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55276/55276fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Mehrstufige Höhenverstellbarem Lithografie für Valved Mehrschichtige Mikrofluidiksysteme

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

multi-step-variable-height-photolithography-for-valved-multilayer

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.2K Aufrufe.  Stanford University. Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads. 

Serie: Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting and counting cells. However, manipulating the cell within the fluidic domain remains a challenge and requires complicated fabrication protocols for forming valves and electrodes, or demands specialty equipment like optical tweezers. Here, we demonstrate that conventional printed circuit boards (PCB) can be used for the non-contact manipulation of cells by employing dielectrophoresis (DEP) for bead and cell manipulation in laminar flow fields for bioactuation, and for cell and bead separation in multichannel microfluidic devices. First, we present the protocol for assembling the DEP electrodes and microfluidic devices, and preparing the cells for DEP. Then, we characterize the DEP operation with polystyrene beads. Lastly, we show representative results of bead and cell separation in a multichannel microfluidic device. In summary, DEP is an effective method for manipulating particles (beads or cells) within microfluidic devices.

Dielectrophoresis (DEP) is an effective method to manipulate cells. Printed circuit boards (PCB) can provide inexpensive, reusable and effective electrodes for contact-free cell manipulation within microfluidic devices. By combining PDMS-based microfluidic channels with coverslips on PCBs, we demonstrate bead and cell manipulation and separation within multichannel microfluidic devices.

Die Trennung Beads und Zellen in Multi-Kanal-Mikrofluidiksysteme Mit Dielektrophorese und Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Forschung

Biotechnik

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the need for 3D environments to represent in vitro experiments which better mimic in vivo qualities 1-3. Studies in fields such as cancer research 4, neural engineering 5, cardiac physiology 6, and cell-matrix interaction7,8have shown cell behavior differs substantially between traditional monolayer cultures and 3D constructs.
Hydrogels are used as 3D environments because of their variety, versatility and ability to tailor molecular composition through functionalization 9-12. Numerous techniques exist for creation of constructs as cell-supportive matrices, including electrospinning13, elastomer stamps14, inkjet printing15, additive photopatterning16, static photomask projection-lithography17, and dynamic mask microstereolithography18. Unfortunately, these methods involve multiple production steps and/or equipment not readily adaptable to conventional cell and tissue culture methods. The technique employed in this protocol adapts the latter two methods, using a digital micromirror device (DMD) to create dynamic photomasks for crosslinking geometrically specific poly-(ethylene glycol) (PEG) hydrogels, induced through UV initiated free radical polymerization. The resulting "2.5D" structures provide a constrained 3D environment for neural growth. We employ a dual-hydrogel approach, where PEG serves as a cell-restrictive region supplying structure to an otherwise shapeless but cell-permissive self-assembling gel made from either Puramatrix or agarose. The process is a quick simple one step fabrication which is highly reproducible and easily adapted for use with conventional cell culture methods and substrates.
Whole tissue explants, such as embryonic dorsal root ganglia (DRG), can be incorporated into the dual hydrogel constructs for experimental assays such as neurite outgrowth. Additionally, dissociated cells can be encapsulated in the photocrosslinkable or self polymerizing hydrogel, or selectively adhered to the permeable support membrane using cell-restrictive photopatterning. Using the DMD, we created hydrogel constructs up to ~1mm thick, but thin film (&lt;200 &mu;m) PEG structures were limited by oxygen quenching of the free radical polymerization reaction. We subsequently developed a technique utilizing a layer of oil above the polymerization liquid which allowed thin PEG structure polymerization.
In this protocol, we describe the expeditious creation of 3D hydrogel systems for production of microfabricated neural cell and tissue cultures. The dual hydrogel constructs demonstrated herein represent versatile in vitro models that may prove useful for studies in neuroscience involving cell survival, migration, and/or neurite growth and guidance. Moreover, as the protocol can work for many types of hydrogels and cells, the potential applications are both varied and vast.

Simple techniques are described for the rapid production of microfabricated neural culture systems using a digital micromirror device for dynamic mask projection lithography on regular cell culture substrates. These culture systems may be more representative of natural biological architecture, and the techniques described could be adapted for numerous applications.

Herstellung von mikrostrukturierten Hydrogele für Neural Kultur-Systeme mit Dynamic Mask Projektion Photolithographie

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Einfache mikrofluidischen Systemen für<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging der<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Und Zebrafisch

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Multi-step Preparation Technique to Recover Multiple Metabolite Compound Classes for In-depth and Informative Metabolomic Analysis

Metabolomics is an emerging field which enables profiling of samples from living organisms in order to obtain insight into biological processes. A vital aspect of metabolomics is sample preparation whereby inconsistent techniques generate unreliable results. This technique encompasses protein precipitation, liquid-liquid extraction, and solid-phase extraction as a means of fractionating metabolites into four distinct classes.&#160;Improved enrichment of low abundance molecules with a resulting increase in sensitivity is obtained, and ultimately results in more confident identification of molecules. This technique has been applied to plasma, bronchoalveolar lavage fluid, and cerebrospinal fluid samples with volumes as low as 50 &#181;l. &#160;Samples can be used for multiple downstream applications; for example, the pellet resulting from protein precipitation can be stored for later analysis. The supernatant from that step undergoes liquid-liquid extraction using water and strong organic solvent to separate the hydrophilic and hydrophobic compounds. Once fractionated, the hydrophilic layer can be processed for later analysis or discarded if not needed. The hydrophobic fraction is further treated with a series of solvents during three solid-phase extraction steps to separate it into fatty acids, neutral lipids, and phospholipids. This allows the technician the flexibility to choose which class of compounds is preferred for analysis. It also aids in more reliable metabolite identification since some knowledge of chemical class exists.

The reliability of results in metabolomics experiments depends on the effectiveness and reproducibility of the sample preparation. Described is a rigorous and in-depth method that enables extraction of metabolites from biological fluids with the option of subsequently analyzing up to thousands of compounds, or just the compound classes of interest.

Multi-Schritt-Technik zur Vorbereitung mehrere Metabolite Verbindungsklassen für In-Tiefe und Informative Metabolomic Analyse Recover

Metabolomics is an emerging field which enables profiling of samples from living organisms in order to obtain insight into biological processes. A vital ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Polymeren Mikronadelanordnung Fabrication durch Photolithographie

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Schicht-für-Schicht der Kollagenabscheidung in Mikrofluidik-Vorrichtungen zum Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Mit Adhesive Patterning 3D Paper Mikrofluidik-Vorrichtungen bauen

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other physical or chemical stimuli. They have been commonly used for in vitro cell studies by providing in vivo like surroundings. Especially, how cells response to chemical gradients, electrical fields, and shear stresses has drawn many interests since these phenomena are important in understanding cellular properties and functions. These microfluidic chips can be made of glass substrates, silicon wafers, polydimethylsiloxane (PDMS) polymers, polymethylmethacrylate (PMMA) substrates, or polyethyleneterephthalate (PET) substrates. Out of these materials, PMMA substrates are cheap and can be easily processed using laser ablation and writing. Although a few microfluidic devices have been designed and fabricated for generating multiple, coexisting chemical and electrical stimuli, none of them was considered efficient enough in reducing experimental repeats, particular for screening purposes. In this report, we describe our design and fabrication of two PMMA-based microfluidic chips for investigating cellular responses, in the production of reactive oxygen species and the migration, under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli. The first chip generates five relative concentrations of 0, 1/8, 1/2, 7/8, and 1 in the culture regions, together with a shear stress gradient produced inside each of these areas. The second chip generates the same relative concentrations, but with five different electric field strengths created within each culture area. These devices not only provide cells with a precise, controllable micro-environment but also greatly increase the experimental throughput.

Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

Entwerfen Mikrofluidiksysteme für ein Studium zellulären Reaktionen Unter Einzel- oder Coexisting Chemie / Elektro / Schubspannung Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and directed within a layer of paper. Moreover, stacking multiple layers of patterned paper creates sophisticated three-dimensional microfluidic networks that can support the development of analytical and bioanalytical assays. Paper-based microfluidic devices are inexpensive, portable, easy to use, and require no external equipment to operate. As a result, they hold great promise as a platform for point-of-care diagnostics. In order to properly evaluate the utility and analytical performance of paper-based devices, suitable methods must be developed to ensure their manufacture is reproducible and at a scale that is appropriate for laboratory settings. In this manuscript, a method to fabricate a general device architecture that can be used for paper-based immunoassays is described. We use a form of additive manufacturing (multi-layer lamination) to prepare devices that comprise multiple layers of patterned paper and patterned adhesive. In addition to demonstrating the proper use of these three-dimensional paper-based microfluidic devices with an immunoassay for human chorionic gonadotropin (hCG), errors in the manufacturing process that may result in device failures are discussed. We expect this approach to manufacturing paper-based devices will find broad utility in the development of analytical applications designed specifically for limited-resource settings.

We detail a method to fabricate three-dimensional paper-based microfluidic devices for use in the development of immunoassays. Our approach to device assembly is a type of multilayer, additive manufacturing. We demonstrate a sandwich immunoassay to provide representative results for these types of paper-based devices.

Herstellung von dreidimensionalen Papierbasis Microfluidic Devices für Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under combinations of chemical and oxygen gradients. Both chemical and oxygen gradients can greatly affect cell migration in vivo; however, due to technical limitations, very little research has been performed to investigate their effects in vitro. The device developed in this research takes advantage of a series of serpentine-shaped channels to generate the desired chemical gradients and exploits a spatially confined chemical reaction method for oxygen gradient generation. The directions of the chemical and oxygen gradients are perpendicular to each other to enable straightforward migration result interpretation. In order to efficiently generate the oxygen gradients with minimal chemical consumption, the embedded PC thin film is utilized as a gas diffusion barrier. The developed microfluidic device can be actuated by syringe pumps and placed into a conventional cell incubator during cell migration experiments to allow for setup simplification and optimized cell culture conditions. In cell experiments, we used the device to study migrations of adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549, under combinations of chemokine (stromal cell-derived factor, SDF-1&#945;) and oxygen gradients. The experimental results show that the device can stably generate perpendicular chemokine and oxygen gradients and is compatible with cells. The migration study results indicate that oxygen gradients may play an essential role in guiding cell migration, and cellular behavior under combinations of gradients cannot be predicted from those under single gradients. The device provides a powerful and practical tool for researchers to study interactions between chemical and oxygen gradients in cell culture, which can promote better cell migration studies in more in vivo-like microenvironments.

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

Polydimethylsiloxanhaltigen Polycarbonat Mikrofluidiksysteme für Zellmigrationsstudien unter Perpendicular Chemische und Sauerstoff Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...