The authors would like to thank Drs. Helene Salmon and Miriam Merad from Icahn School of Medicine at Mount Sinai for providing the B16-F10-YFP cells and for their expert advice on melanoma mouse models. The authors further thank the Animal Imaging Core Facility, the Radiochemistry and Molecular Imaging Probes Core Facility, and the Molecular Cytology Core Facility at Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) for their support. This work was supported by National Institutes of Health grants NIH 1 R01 HL125703 (W.J.M.M.), R01CA155432 (W.J.M.M.), K25 EB016673 (T.R.) and P30 CA008748 (MSK Center Grant). The authors also thank the Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (CMINT) at MSK for their financial support (T.R.).

手順は、ナノ粒子の二重の放射性及び蛍光標識、in vivoでの PET-CTイメージング、ex vivoでの生体内分布の測定、およびex vivo免疫染色で構成され、フローサイトメトリー分析します。全ての動物実験は、メモリアル・スローンケタリングがんセンターの施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 二重標識リポソームの調製注：同系B16メラノーマ腫瘍を2％イソフルラン含有酸素を吸入から麻酔下でC57BL / 6マウスの背面脇腹に30万B16-F10細胞を注射することによって誘導することができます。手術中に滅菌ワークスペースに無菌試薬およびツールを使用してください。手術後、慎重に麻酔からの回復するまで動物を観察します。彼らは完全な意識と機動性を回復する場合にのみ、そのケージに戻って動物を置きます。異種移植された腫瘍を有する動物のための無菌室でそれらを収容します。サイズの腫瘍300ミリメートル3のナノ粒子の蓄積を増加させることができ、その顕著な強化された透過性および保持効果によるナノ粒子のキャラクタリゼーション（EPR）に最適です。詳細なプロトコルを以下に提供します。 <ol><li>丸底フラスコに、1,2- dipalmitoyl- SN -glycero -3- phophocholine（DPPC）、コレステロール、1,2- disearoyl- SN -glycero-を含むクロロホルム2mLに脂質20 mgの混合物を溶解3-ホスホエタノールアミン-ポリ（エチレングリコール）2000（DSPE-PEG2000）、DSPE-デフェロキサミン（DSPE-DFO）8、及び1,1- diododecyl-3,3,3,3-tetramethylindodicarbocyanine -5,5-ジスルホン酸（ DiIC12 [5]は、それぞれ61.3％33.4％、5、0.2％、および0.1％のモル比で）-ds。 注：この脂質組成物は、現在、診療所2で使用したドキソルビシンのリポソーム製剤と非常に類似しています。私たちの手順から得られたリポソームは、密接に臨床nanomedicのin vivo性能を模倣しますINE。 </li><li>有機溶媒を除去し、室温で薄い脂質膜を形成し、ロータリーエバポレーターを使用して。氷上で十分に冷却して、3.8 mmの超音波処理チップと30 Wの振幅を用いて、リポソームナノ粒子を生成するために、20 mlのPBSと30分間超音波処理を追加します。 </li><li> 10分間4000×gで遠心分離リポソーム溶液凝集物を除去し、遠心濾過（分子量カットオフ（MWCO使用してPBSでナノ粒子を洗浄する：自由な脂質および残留有機溶媒を除去するために100キロダルトン）のリポソームを濃縮し、その意志上部チャンバー中に残り、新しいチューブに移す。リポソームは、後続のステップの前に最大1週間、PBS中の冷蔵庫に保存することができます。 </li><li>品質管理のために、動的光散乱（DLS）によりリポソームを特徴付けます。具体的には、PBSの950μLを有するリポソームの50μLを混合し、次にサイジングキュベットに混合物を移します。アナライザにキュベットを置き、粒子を測定サイズは、そのサイズ分布を示します。それぞれ0.2 - 120nmで0.1 - 粒子サイズとそのサイズ分布（多分散性指数（PDI））が90であることが期待されます。 </li><li>放射性標識のために、（1.5 mLチューブに2時間、37℃で1 mCiの89のZr-シュウ酸と6.9と7.1の間のpHで、総体積をPBS中の脂質の2ミリグラムに相当する精製されたリポソームを、ミックス：〜 100μL）。 1.3ステップと同様に、遠心濾過（MWCO = 100キロダルトン）によって自由、未反応の89のZrを削除します。滅菌PBSで保持物を洗浄し、所望の体積に希釈します。 95％ - 放射化学的収率は80でなければなりません。 注意！放射性物質を使って作業することを強く規制されています。機関が認定し、必要な設備、人材育成、および放射能の使用の厳格な監視を提供する必要があります。研究者は、適切な訓練を受け、放射能を取り扱うときは個人用保護具や線量測定リング/バッジを着用する必要があります。 </li><li&gt;一般的に98％を超える10でなければならないサイズ排除ラジオ-HPLCにより放射性標識したリポソームの放射化学的純度を決定します。放射化学は95％未満、ステップ1.5に不十分な洗浄を示すものである純度。 </li><li>放射性標識した後、動的光散乱法によりナノ粒子のサイズを決定します。サイズ及びPDIは、ステップ1.4 10での測定と同じ範囲内であることが期待されます。 注：放射性サンプルをフローサイトメーターまたは蛍光顕微鏡で許可されていない場合は、非放射性のnatのZr-シュウ酸塩は、ステップ1.5でリポソームを標識するために使用することができます。これらの非放射性リポソームは、それらの放射性類似体と同一の特性を有しています。この手順の描写を図2に提供されます。 </li></ol>二重標識リポソームのインビボ PET-CTイメージングと生体内分布2. <ol><li>ワット二重標識リポソームの約100μLを注入i番目の約300の放射能のμCiの抑制メラノーママウス（C57BL / 6、10の女性、 - 16週齢）に、その尾静脈を介して、約10 mCiの89のZr / kg体重で。 </li><li>半減期を決定するために、28-Gのインスリン注射器を使用して、2％イソフルラン含有酸素の下で麻酔した動物からの尾静脈から血液を描画します。 2分、15分、1時間、4時間、8時間、24時間、及び注射後48時間で、予め秤量したチューブ中 - （20μL10）血液を収集します。 、差によって血液を計量ガンマカウンターを用いて放射能量を決定し、グラムあたりの注射用量率（％ID / g）でのパーセンテージとして放射能濃度を計算します。 注：麻酔システム、回復ケージ、加熱、およびバイオハザードフードを装備した部屋の手順を実行します。動物が完全に回復してケージを保持するに回復ケージからそれらを転送する前に、手順の後に通常の移動性を得ることを確認します。ハウスで投与した動物に指定された部屋で、腫瘍を有する動物放射性物質。 </li><li>の注射後24時間または48時間 リポソーム、小動物マイクロPET-CTスキャナ10の画像マウス。その腹に水平に麻酔をかけた動物を配置し、麻酔し、それを維持します。ノーズコーンを介して2％イソフルラン酸素を管理します。乾燥からそれらを防ぐために、スキャンの前に、その眼に眼軟膏を適用します。 </li><li> 15分のおおよその期間で、全身PET静的スキャン記録少なくとも5000万一致イベントを実行します。それぞれ、350から700 keVの6ナノ秒でのエネルギーとの一致タイミングウィンドウを設定します。その後、5分間行う断層撮影（CT）スキャンを計算しました。 80 kVの500μAの電流の電圧にX線管を設定します。 CTスキャンは、フレーム10当たり約145ミリ秒で、220度の合計120回転のステップを使用しています。 </li><li> PET-CTスキャンの後、すぐに二酸化炭素窒息によりマウスを屠殺し、pinchiによって死亡を確認動物の足をngの。確認されると、子宮頸部転位を行います。 </li><li>最初の右心房を切開した後、左心室に20 mLのPBSを注入することによって、マウス組織に血液を除去し、その後、腫瘍、肝臓、脾臓、肺、腎臓、筋肉、その他16などの関連組織を収集します。 </li><li> 、組織を秤量8,9をカウントガンマによるその放射能含量を測定し、1g当たりの注射用量率（％ID / g）での割合などの組織の放射能蓄積を計算します。 </li></ol> 3. エクスビボフローサイトメトリーおよび免疫染色注：体重1kg当たり染料0.5mgの用量で尾静脈を介してメラノーママウスに蛍光リポソームの約100μLを注入。放射性サンプルは、フローサイトメーター、蛍光顕微鏡で許可されていない場合は、非放射性リポソームを使用する必要があります。 <ol><li>ステップ2.5のように、マウス24時間後に注射を生け贄に捧げる、冷PBS中に保存しなければならない腫瘍を収集します。 </li><li>フローサイトメトリーのために、手順17に従います。 <ol><li> 0.5％BSA及び1で（PBSバッファーフローサイトメトリーで精製されたコラゲナーゼIおよびII（4 U / mL）を、ヒアルロニダーゼ（60 U / mL）をDNアーゼI（60 U / mL）を混合物からなる酵素カクテルを調製mMのEDTA）。 </li><li> 1.5 mLチューブに酵素カクテル緩衝液200μLと腫瘍組織100mgを混合し、細かいハサミで小片に組織をダイシング。酵素カクテルの別の1.3 mLのチューブに追加し、6ウェルプレートにその内容を転送します。 </li><li> 60 rpmで60分間、37℃のオーブンの内部に配置され、水平シェーカー上で6ウェルプレートを振ります。 </li><li>単一細胞懸濁液を得るために、フローサイトメトリー緩衝液で3回組織ホモジネートを洗浄します。 </li><li> 、CD45、CD11bの、Ly6C、CD11cのを含むバイオマーカーに特異的な抗体のカクテルで細胞を染色CD64、CD3、MHCII、およびCD31（1：すべての抗体のための200希釈;クローン情報は、材料のスプレッドシートで提供されています）。関連する細胞の種類を識別し、（5）解析ソフトウェアサイトメトリーの適切な流れと各細胞集団に-dS DiIC12のそれらの平均蛍光強度（MFI）を決定します。 </li></ol></li><li>免疫染色のために、次の手順を実行します。 <ol><li>最適な切断媒体（OCT）を充填したカセットに腫瘍を置き、ドライアイス上で凍結します。 </li><li>腫瘍組織から6μmの凍結切片を作成し、組織学的ガラススライド上に置きます。セクションでは、組織上の最も代表的な情報を提供する、腫瘍の最大の断面を、カバーする必要があります。 </li><li>バイオマーカーを染色（ 例えば、内皮細胞に対してCD31）は、対応する抗体（ 例えば、抗CD31、クローンMEC13.3）との利益。パラホルムアルデヒドを持つセクションを修正しました。二次抗体の種起源と一致する血清でそれらをブロックします。 incub4℃で12時間、一次抗体で食べた後、2時間、二次抗体と;そして最後に、PBSで洗浄し、カバースリップでカバーしています。画像ライカ直立共焦点SP5顕微鏡13、16で染色したスライド。 </li></ol></li></ol>

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The authors have no disclosure to make.

プロトコル内の重要なステップ： 二重標識リポソームの高品質を長期間にわたって一貫性のある結果を生成するための鍵です。無料の蛍光色素または89のZrイオンは全く異なるターゲティングパターンを生成することができ、完全に精製工程の間に除去されなければなりません。免疫系が著しく実験的癌ナノメディシンの性能に影響を与える場合に加えて、免疫応答性マウスモデルを用いることが好ましいであるべきで、例えばこのプロトコルを通して使用されたC57BL / 6マウスにおけるB16-F10黒色腫モデルとして。腫瘍微小環境または遺伝的変異の特定の組み合わせが主な要因である場合には、患者由来の腫瘍異種移植片モデルは、理想的な選択肢であろう。 変更とトラブルシューティング： 私たちの手順は、担癌ANでnanomedicinesのin vivo性能を評価する簡単かつ信頼性の高い方法を提供しますimals。この手順は、異なるアプリケーションのためのがんnanomedicinesを特徴づけるために、特定の実験を構築するためのバックボーンとして機能します。例えば、研究者らは、PET-CTスキャンは、同じ動物17上の複数の時点で行われているナノ材料のin vivoでの定量的な薬物動態を決定することができます。他の刊行物に示されるように、それらは、例えば大腸、小腸、膵臓、脳、皮膚、胸腺、胃、又は唾液腺のような他の組織を分析することにより、ナノ物質の生体内分布情報を収集することができる18、19、20、21。または彼らはこのフローサイトメトリーおよび免疫染色プロトコルを適用することにより、腫瘍以外の関連組織におけるnanomedicinesの単一細胞と細胞内特異性を評価することができます。 テクニックの制限： このプロトコルはrをequiresいくつかの専門の研究インフラを含む放射性標識、小動物イメージング、および免疫学の放射化学およびイメージング施設、および技術的な専門知識。したがって、それは理想的に関連分野の専門知識を持つ研究者の学際的なチームによって実行されます。私たち自身の経験は、この手順の最適な実行は、慎重な計画と効率的なコラボレーションが必要であることを示しています。 この原稿で特定のプロトコルおよび提案された薬剤は、脂質ベースのナノ粒子を放射性標識に最も適していることは注目に値します。しかしながら、二重標識されたナノ粒子の概念は、例えば、金ナノ結晶、ポリマー、あるいはウイルス粒子に基づいている他のナノ粒子処方物を特徴づけるために使用することができます。これらのケースでは、異なる標識化戦略が必要とされます。 89のZr、18を含む、生物医学的イメージングで使用される放射性同位体の広範囲を強調することは重要です</suほんの数7名へのp&gt; F、64 Cuの、68 Gaおよび123 I、。放射性同位元素の選択は、後の時点で完全な特性を可能にするために、調査中のナノ材料の特定の特性、主にその血液循環半減期に基づいて行われなければなりません。しかしながら、そのような標識化学またはアイソトープの可用性などの他の要因は、最終的な選択に影響し得ます。この研究のために、89のZrは、その長い物理的半減期（t 1/2 = 78.4 h）は、リポソームの血中半減期に匹敵するために選ばれました。注目すべきは、このプロトコルは、市販されており、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（SPECT）による画像形成に適していることが、99m Tc で 、111において、または125 Iのような、他の同位体を用いて行うことができます。同様に、DilCは、その高い疎水性およびリポソームで、したがって高い積載効率のために選ばれました。不利な物理化学的propertiと他の蛍光色素エスは直接リン脂質17に結合させることができます。 技術の意義： この手順は、臨床試験でnanomedicinesを評価するようになって高い翻訳の可能性を提示します。 4キー技術は、すなわち、PET-CTイメージング、放射能測定は、フローサイトメトリー、および免疫組織化学-され、日常の患者で腫瘍学的診断に使用します。したがって、この前臨床手順を容易に臨床段階にnanomedicinesのインビボでの性能を評価するために翻訳することができます。また、マウスと比較して、ヒトの臓器のサイズが大きくなるナノメディシン蓄積の侵襲的な生検ベースの放射能測定を置き換えることができるPET-CTイメージング22、によって、より正確な分析を可能にします。この設定では、非侵襲的な、画像誘導プロトコールは、患者を層別化し、患者の転帰10を均質化を助けるために開発することができます。 DEVE放射性ナノ材料をlopingはまだ実質的なインフラ投資を必要とします。あるいは、磁気共鳴イメージング（MRI）に基づく非放射性画像化技術は、急速に過去10年間で進化してきています。例えば、磁性粒子イメージング（MPI）は、小鉄酸化物ナノ粒子（10〜20 nm）を使用して、現在のMRI技術23よりも生体内で酸化鉄ナノ粒子で標識されたnanomedicinesの一層定量的な評価を提供することができます。 MPIの臨床翻訳は、より多くの研究者ががんnanomedicinesのin vivo性能を評価するために、 生体内イメージング技術で堅牢使用することができるようになります。 将来のアプリケーション： 研究者はこれらのプロトコルをマスターしたら、彼らはなど、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、およびを含むほとんどの蛍光および放射性二重標識、新規材料を、特徴付けるために手続きを適用することができます。これらの手順科学者たちは徹底的に新規生体材料のin vivo性能を評価するために、素晴らしい翻訳可能性を秘めたものを同定するのに役立ちます。 結論として、我々は、全身、組織、単一細胞、および細胞下レベルのナノメディシンの蓄積情報を提供することができる総合的なナノメディシンの特性評価手続きを導入することを目指しています。現在、癌nanomedicinesの大半は、依然として、それらの次善の薬物動態、生体内分布、および毒性プロフィールに第I相臨床試験で失敗します。一方、ナノメディシンへの治療応答の大きな不均一性は、特にこれらの実験nanomedicinesから利益を得ることができる患者を選択するためのコンパニオンイメージング戦略を義務付け。また、臨床に役立つ可能性があり、この手順の採用は適切な修正を加えて、前臨床動物モデルにおいて高い翻訳可能性を秘めた有望なnanomedicinesを識別して、コミュニティを助けることができると信じていますナノ治療に適した患者を識別するために、研究者。

ナノメディシンは、癌治療の開発1のパラダイムをシフトしています。このようなリポソームおよびアルブミンベースnanotherapies 2、3のような以前のがんnanomedicines、膨大な臨床的影響に触発され、多くの新規製剤は、過去10年間で生産されています。しかし、これらの癌nanomedicinesの臨床翻訳の成功の最近の分析は、それらのほんの数は、臨床使用4、5のために承認されていることを示しています。新しいがんnanomedicinesの臨床翻訳するための一つの主要な障害は、無料の治療用化合物6の直接投与と比較して、治療指数の彼らの限られた改善です。このように、 インビボでの全身におけるnanomedicinesの性能、組織、および前臨床動物モデルにおける細胞レベルの正確な評価は、identifに不可欠ですyの将来の臨床翻訳のための最適な治療指数を有するもの。 ナノ材料は、すべての臨床イメージング様式7の間で優れた感度と再現性を持っている陽電子放射断層撮影（PET）イメージング、で生きている動物で定量的な特徴づけのために放射性標識することができます。例えば、89のZr標識長期循環nanomedicines癌8、9、10、ならびに他の疾患モデル11マウスモデルにおいて特徴付けられています。また、nanomedicinesの血中半減期および生体内分布が広く、個々の組織8にエクスビボ放射能の測定を用いて評価することができます。したがって、放射性標識は、全身および組織レベルでnanomedicinesを定量的に評価することができます。 重要なことは、radiolabeledはnanomedicinesは、一般的に、単一セルまたは放射性シグナルの限定された空間分解能に起因する細胞内レベルで分析することができません。したがって、蛍光標識は、例えば、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡12のような光イメージング技術を有するナノ粒子の評価のための補完的な様式であることが分かります。この目的のために、放射性同位体、蛍光タグで標識されたナノ粒子は、定量的放射能計数によって核イメージングおよびエクスビボによってインビボで評価することができ、それらはまた、広く光学イメージングにより、細胞レベルで特徴づけることができます。 以前、我々は、高密度リポタンパク質（HDL）11、リポソーム9、10、ポリマーナノ粒子、抗体フラグメント、およびnanoemuを含む様々なナノ粒子に放射性および蛍光標識を組み込むためにモジュール式の手順を開発しましたlsions 10、13。これらの標識されたナノ粒子は、それらの特定の用途のためにこれらのナノ材料の最適化を導いている、さまざまなレベルでの適切な動物モデルで定量的な特徴づけのために許可されています。現在の研究では、目的は、二重標識されたナノ粒子を生成するために、十分古典同系メラノーマB16-F10マウスモデル15でそれを特徴付けるために、包括的な手順を示すための例-asリポソームナノ粒子の最も確立されたナノ医療のプラットフォーム14を使用することです。結果から、我々は、このナノ粒子の特徴付けアプローチは、関連するマウスモデルにおいて他の癌nanomedicinesを評価するように構成することができる確信しています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="638">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPPC</td>
			<td style="width:136px;">Avantilipids</td>
			<td align="right" style="width:119px;">850355</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DSPE-PEG2000</td>
			<td style="width:136px;">Avantilipids</td>
			<td style="width:119px;">880120P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DSPE-DFO</td>
			<td style="width:136px;">Home made</td>
			<td align="right" style="width:119px;">110634</td>
			<td>Perez-Medina et al, JNM, 2014</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DiIC12[5]-DS</td>
			<td style="width:136px;">AAT Bioquest</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifugal filter</td>
			<td style="width:136px;">Vivaproducts</td>
			<td style="width:119px;">VS2061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotary evaporator</td>
			<td style="width:136px;">Buchi</td>
			<td style="width:119px;">R-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Radio-HPLC</td>
			<td style="width:136px;">Shimadzu HPLC with 2 LC-10AT pumps</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">89Zr-oxalate</td>
			<td style="width:136px;">MSKCC</td>
			<td style="width:119px;">Synthesized in house</td>
			<td>TR19/9 variable beam cyclotron (Ebco Industries Inc)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micro PET-CT</td>
			<td style="width:136px;">Siemens</td>
			<td style="width:119px;">Inveon Micro-PET/CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gamma counter</td>
			<td style="width:136px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">2470-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Flow cytometry</td>
			<td style="width:136px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">Fortessa</td>
			<td>Any multi-parametric flow cytometry analyzers would suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">C57BL/6 mice</td>
			<td style="width:136px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B16-YFP melanoma cells</td>
			<td style="width:136px;">Home made</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Salmon et al, Immunity, 2016</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ly6C (clone HK1.4)--APC-Cy7</td>
			<td align="right" style="width:136px;">128025</td>
			<td style="width:119px;">Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MHCII (M5/114/152)--APC</td>
			<td align="right" style="width:136px;">107613</td>
			<td style="width:119px;">Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD45 (30-F11)--BV510</td>
			<td align="right" style="width:136px;">103137</td>
			<td style="width:119px;">Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD64 (X54-5/7.1)--PE-Cy7</td>
			<td align="right" style="width:136px;">139313</td>
			<td style="width:119px;">Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11b (M1/70)--BV605</td>
			<td align="right" style="width:136px;">101237</td>
			<td style="width:119px;">Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD3 (17A2)--BV711</td>
			<td align="right" style="width:136px;">100241</td>
			<td style="width:119px;">Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD31 (13.3)--PE</td>
			<td align="right" style="width:136px;">561073</td>
			<td style="width:119px;">Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11c (M418)--PerCP-Cy5.5</td>
			<td align="right" style="width:136px;">117327</td>
			<td style="width:119px;">BD Biosciences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD31 (13.3) no fluorophore</td>
			<td align="right" style="width:136px;">550274</td>
			<td style="width:119px;">BD Biosciences</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a comprehensive procedure to evaluate the in vivo performance of cancer nanomedicines

クリニック内の前癌nanomedicinesの成功に触発され、研究者は、過去10年間で新規製剤を大量に生成しています。臨床開発中のnanomedicinesの大半は不本意な結果を生み出しているのに対し、しかし、nanomedicinesのほんの数は、臨床使用が承認されています。新しいがんnanomedicinesの成功の臨床翻訳するための一つの主要な障害は、それらのインビボ性能の正確な理解の欠如です。この記事では、陽電子放出断層撮影-コンピュータ断層撮影法（PET-CT）、放射能の定量法の統合を経て全身、組織、単一細胞、および細胞内レベルでの担癌マウスにおけるnanomedicinesのin vivoでの挙動を特徴付けるために厳格な手順を提供しています、フローサイトメトリー、および蛍光顕微鏡。このアプローチを使用して、研究者は、正確にcanceの関連するマウスモデルにおける新規なナノスケールの製剤を評価することができますrを。これらのプロトコルは、高翻訳可能性の最も有望な癌nanomedicinesを識別するか、将来の翻訳のための癌nanomedicinesの最適化を補助する機能を有していてもよいです。

図1は、手順の概要を示しています。 図2は、ステップ1 10に記載の二重標識リポソームの模式的な合成手順を提示します。 図では 、ステップ2で説明したように3ディスプレイ代表PET-CT画像（ 図3a）、PET画像（ 図3b）、血中半減期（ 図3c）、および放射性ナノ粒子の生体内分布（ 図3d）からの放射能の定量化を、 図3aは 、リポソームは、高度に図3bの撮像結果の定量化によって確認される腫瘍に蓄積します。さらに、リポソームは、 図3cに約10時間の血中半減期を示します。 ex vivoでの生体内分布は、リポソームの高い腫瘍蓄積を確認しました。最後に、 図4は、典型的なゲーティング広報を提供しますocedureは、ナノ粒子の蓄積の単一細胞レベルの分析のために腫瘍に関連する細胞を同定した （ 図4AおよびB）、腫瘍関連マクロファージ（TAM）でナノ粒子の優先的な蓄積を表示します。代表的な共焦点顕微鏡画像はまた、ナノ粒子及び内皮細胞（ 図4c）間の重複を示します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55271/55271fig1.jpg" /> インビボナノメディシン特徴付け手順の 1. 回路図の概要図 。この手順では、放射性、蛍光タグの両方を有するナノ粒子の標識を含んでいます。 PET-CTイメージング、血中半減期の測定、及び生体内分布の評価を有する放射性標識ナノ粒子の特徴付け。単セルとフローサイトメトリーと私による蛍光ナノ粒子のサブ細胞分析それぞれ、mmunostaining。技術は、左から右に、 生体内蓄積にナノ粒子の空間分解能を増加提供します。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55271/55271fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55271/55271fig2.jpg" /> 二重標識リポソームの 図2. 合成手順。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55271/55271fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55271/55271fig3.jpg" /> 放射性標識ナノ粒子のin vivo特性評価3.代表的な結果を 図 。 （A）tumoのPET-CT画像をナノ粒子注入後のR-軸受マウスおよび複数の組織における（b）の PET由来の取り込み値（N = 3）。 （C）血液放射能放射性標識ナノ粒子の半減期、並びに（D）24時間後の注射での生体内分布（N = 3）。エラーバーは標準偏差です。許可を得て、参照8から修正されました。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55271/55271fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55271/55271fig4.jpg" /> 蛍光ナノ粒子のインビボ特徴づけの代表的な結果 4.図 。 （A）腫瘍関連免疫細胞、腫瘍細胞、および内皮細胞（EC）、ならびにnanopartiの（b）の定量化を識別するための代表的なフローサイトメトリーゲーティング手順をこれらの細胞8でCLEの蓄積。 3生物学的反復の代表画像。 （c）は 、腫瘍13で内皮細胞にRGD共役ナノエマルジョンの特異的標的を示す代表的免疫蛍光画像。許可を得て、参考文献8および13から変更されました。腫瘍関連マクロファージ（TAM）。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55271/55271fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

The poor understanding of the in vivo performance of nanomedicines stymies their clinical translation. Procedures to evaluate the in vivo behavior of cancer nanomedicines at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels in tumor-bearing immunocompetent mice are described here. This approach may help researchers to identify promising cancer nanomedicines for clinical translation.

評価するための総合的な手順<em&gt;インビボ</em&gt;がんNanomedicinesのパフォーマンス

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

a-comprehensive-procedure-to-evaluate-vivo-performance-cancer

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

8.8K ビュー.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. The poor understanding of the in vivo performance of nanomedicines stymies their clinical translation. Procedures to evaluate the in vivo behavior of cancer nanomedicines at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels in tumor-bearing immunocompetent mice are described here. This approach may help researchers to identify promising cancer nanomedicines for clinical translation.

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Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish Danio Rerio

This method utilizes zebrafish embryos to efficiently test the vascular invasive ability of cancer cells. Fluorescent cancer cells are injected into the precardiac sinus or yolk sac of developing embryos. Cancer cell vascular invasion and extravasation is assessed via fluorescence microscopy of the tail region 24 to 96 hr later.

（ゼブラフィッシュにおける癌細胞の血管浸潤能をテストします<em&gt;ゼブラフィッシュ</em&gt;）

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression.  Traditional in vitro models of cancer cell invasion of ...

がん研究

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic probes to provide quantitative information on the chemical tumor microenvironment (TME), including pO2, pH, redox status, concentrations of interstitial inorganic phosphate (Pi), and intracellular glutathione (GSH). In particular, an application of a recently developed soluble multifunctional trityl probe provides unsurpassed opportunity for in vivo concurrent measurements of pH, pO2 and Pi in Extracellular space (HOPE probe). The measurements of three parameters using a single probe allow for their correlation analyses independent of probe distribution and time of the measurements.

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Low-field (L-band, 1.2 GHz) electron paramagnetic resonance using soluble nitroxyl and trityl probes is demonstrated for assessment of physiologically important parameters in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.

生体内でPH、 pO2、酸化還元状態とリン酸濃度および腫瘍微小環境におけるグルタチオンの EPR 評価

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human central nervous system (CNS). However, both the cytological origin and the evolutionary process of HBs (including neovascularization) remain controversial, and anti-angiogenesis for VHL-HBs, based on classic HB angiogenesis, have produced disappointing results in clinical trials. One major obstacle to the successful clinical translation of anti-vascular treatment is the lack of a thorough understanding of neovascularization in this vascular tumor. In this article, we present a comprehensive procedure to evaluate in vitro whether classic tumor angiogenesis exists in HBs, as well as its role in HBs. With this procedure, researchers can accurately understand the complexity of HB neovascularization and identify the function of this common form of angiogenesis in HBs. These protocols can be used to evaluate the most promising anti-vascular therapy for tumors, which has high translational potential either for tumors treatment or for aiding in the optimization of the anti-angiogenic treatment for HBs in future translations. The results highlight the complexity of HB neovascularization and suggest that this common form angiogenesis is only a complementary mechanism in HB neovascularization.

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

This paper presents a comprehensive procedure to evaluate in vitro whether classic tumor angiogenesis exists in hemangioblastomas (HBs) and its role in HBs. The results highlight the complexity of HB-neovascularization and suggest that this common form of angiogenesis is only a complementary mechanism in the HB-neovascularization.

発芽アッセイ回転楕円体を使用して推定される芽新生体外パフォーマンスを評価する包括的な手順

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction pathways and is tightly regulated by kinases and phosphatases. Therefore, characterizing the phosphoproteome may provide insights into identifying novel targets and biomarkers for oncologic therapy. Mass spectrometry provides a way to globally detect and quantify thousands of unique phosphorylation events. However, phosphopeptides are much less abundant than non-phosphopeptides, making biochemical analysis more challenging. To overcome this limitation, methods to enrich phosphopeptides prior to the mass spectrometry analysis are required. We describe a procedure to extract and digest proteins from tissue to yield peptides, followed by an enrichment for phosphotyrosine (pY) and phosphoserine/threonine (pST) peptides using an antibody-based and/or titanium dioxide (TiO2)-based enrichment method. After the sample preparation and mass spectrometry, we subsequently identify and quantify phosphopeptides using liquid chromatography-mass spectrometry and analysis software.

This protocol describes a procedure to extract and enrich phosphopeptides from prostate cancer cell lines or tissues for an analysis of the phosphoproteome via mass spectrometry-based proteomics.

前立腺癌におけるリン酸化プロテオームを調べる定量的ラベル無料質量と相まってリン酸化ペプチド濃縮

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ever-increasing number of studies have identified miRNAs as potential biomarkers for cancer diagnosis and prognosis, and also as therapeutic targets, adding an extra dimension to cancer evaluation and treatment. In the context of thyroid cancer, tumorigenesis results not only from mutations in important genes, but also from the overexpression of many miRNAs. Accordingly, the role of miRNAs in the control of thyroid gene expression is evolving as an important mechanism in cancer. Herein, we present a protocol to examine the effects of miRNA-inhibitor delivery as a therapeutic modality in thyroid cancer using human tumor xenograft and orthotopic mouse models. After engineering stable thyroid tumoral cells expressing GFP and luciferase, cells are injected into nude mice to develop tumors, which can be followed by bioluminescence. The in vivo inhibition of a miRNA can reduce tumor growth and upregulate miRNA gene targets. This method can be used to assess the importance of a determined miRNA in vivo, in addition to identifying new therapeutic targets.

This protocol describes xenograft and orthotopic mouse models of human thyroid tumorigenesis as a platform to test microRNA-based inhibitor treatments. This approach is ideal to study the function of non-coding RNAs and their potential as new therapeutic targets.

マウスの腫瘍増殖を減少させるマイクロRNAの生体内阻害

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a malignant brain tumor with no cure, has up to a half the tumor mass TAMs. TAMs can be pro-tumoral or anti-tumoral, depending on the activation of specific genes in the cells. Genetic mutations in the tumors, through regulating cytokine expression, can affect recruitment of TAMs to the tumor microenvironment. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess macrophage recruitment by the conditioned medium from the tumor cells. This assay uses the human macrophage cell line MV-4-11 to study macrophage attraction by the conditioned medium from glioblastoma, allowing for high reproducibility and low variability. Data generated with this assay can contribute to a better understanding of the interaction between the tumor and the tumor microenvironment. Similar assay can be used to assess interaction between the tumor cells and other immune cells, including T cells and natural killer (NK) cells.

This article represents a useful in vitro assay to evaluate the capability of conditioned medium from tumor cells to attract macrophages.

腫瘍マクロファージ相互作用を研究するインビトロアッセイ

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer growth and metastasis. Paracrine signals can involve cell-cell contact between different cell types, such as PD-L1 expressed on the surface of tumors interacting directly with PD-1 on the surface of T cells, or the secretion of ligands by a tumor cell to affect an immune cell. Here we describe a co-culture method to interrogate the effects of tumor-secreted ligands on immune cell (macrophage) activation. This straightforward procedure utilizes commercially available 0.4 &#181;m polycarbonate membrane permeable supports and standard tissue culture plates. In the process described, macrophages are cultured in the upper chamber and tumor cells in the lower chamber. The presence of the 0.4 &#181;m barrier allows for the study of intercellular signaling without the confounding variable of physical contact, because the two cell types share the same medium and exposure to paracrine ligands. This approach can be combined with others, such as genetic alterations of the macrophage (e.g., isolation from genetic knock-out mice) or tumor (e.g., CRISPR-mediated alterations) to study the role of specific secreted factors and receptors. The approach also lends itself to standard molecular biological analyses such as quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) or Western blot analysis, without the need for flow sorting to separate the two cell populations. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) can similarly be utilized to measure secreted ligands to better understand the dynamic interaction of cell signaling in the multiple cell type context. Duration of co-culture can also be varied for the study of temporally regulated events. This co-culture method is a robust tool that facilitates the study of tumor-secreted signals in the immune context.

Here, we present a method using permeable membrane supports to facilitate the study of non-contact paracrine signaling used by tumor cells to suppress the immune response. The system is amenable to studying the role of tumor-secreted factors in dampening macrophage activation.

透過性膜支持体との共培養を用いたマクロファージ活性化に及ぼす腫瘍分泌パラクリンリガンドの効果の研究

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

腫瘍細胞の横尾静脈注入後の肺転移の病理学的解析

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are particularly devastating, difficult to treat, and confer a poor prognosis. While the precise incidence of brain metastases in the United States remains hard to estimate, it is likely to increase as extracranial therapies continue to become more efficacious in treating cancer. Thus, it is necessary to identify and develop novel therapeutic approaches to treat metastasis at this site. To this end, intracranial injection of cancer cells has become a well-established method in which to model brain metastasis. Previously, the inability to directly measure tumor growth has been a technical hindrance to this model; however, increasing availability and quality of small animal imaging modalities, such as magnetic resonance imaging (MRI), are vastly improving the ability to monitor tumor growth over time and infer changes within the brain during the experimental period. Herein, intracranial injection of murine mammary tumor cells into immunocompetent mice followed by MRI is demonstrated. The presented injection approach utilizes isoflurane anesthesia and a stereotactic setup with a digitally controlled, automated drill and needle injection to enhance precision, and reduce technical error. MRI is measured over time using a 9.4 Tesla instrument in The Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Tumor volume measurements are demonstrated at each time point through use of ImageJ. Overall, this intracranial injection approach allows for precise injection, day-to-day monitoring, and accurate tumor volume measurements, which combined greatly enhance the utility of this model system to test novel hypotheses on the drivers of brain metastases.

Intracranial brain metastasis modeling is complicated by an inability to monitor tumor size and response to treatment with precise and timely methods. The presented methodology couples intracranial tumor injection with magnetic resonance imaging analysis, which when combined, cultivates precise and consistent injections, enhanced animal monitoring, and accurate tumor volume measurements.

頭蓋内注射と磁気共鳴画像による脳転移のモデル化

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory cytokine interleukin-1 alpha (IL-1&#945;) has been evaluated as an anticancer agent in several preclinical and clinical studies. However, dose-limiting toxicities, including flu-like symptoms and hypotension, have dampened the enthusiasm for this therapeutic strategy. Polyanhydride nanoparticle (NP)-based delivery of IL-1&#945; would represent an effective approach in this context since this may allow for a slow and controlled release of IL-1&#945; systemically while reducing toxic side effects. Here an analysis of the antitumor activity of IL-1&#945;-loaded polyanhydride NPs in a head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) syngeneic mouse model is described. Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells were injected subcutaneously into the right flank of C57BL/6J mice. Once tumors reached 3-4 mm in any direction, a 1.5% IL-1a - loaded 20:80 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane:1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPTEG: CPH) nanoparticle (IL-1&#945;-NP) formulation was administered to mice intraperitoneally. Tumor size and body weight were continuously measured until tumor size or weight loss reached euthanasia criteria. Blood samples were taken to evaluate antitumor immune responses by submandibular venipuncture, and inflammatory cytokines were measured through cytokine multiplex assays. Tumor and inguinal lymph nodes were resected and homogenized into a single-cell suspension to analyze various immune cells through multicolor flow cytometry. These standard methods will allow investigators to study the antitumor immune response and potential mechanism of immunostimulatory NPs and other immunotherapy agents for cancer treatment.

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

A standard protocol is described to study the antitumor activity and associated toxicity of IL-1&#945; in a syngeneic mouse model of HNSCC.

ポリ無水物IL-1αナノ粒子の 生体内 抗腫瘍活性の評価

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...