The authors would like to thank Drs. Helene Salmon and Miriam Merad from Icahn School of Medicine at Mount Sinai for providing the B16-F10-YFP cells and for their expert advice on melanoma mouse models. The authors further thank the Animal Imaging Core Facility, the Radiochemistry and Molecular Imaging Probes Core Facility, and the Molecular Cytology Core Facility at Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) for their support. This work was supported by National Institutes of Health grants NIH 1 R01 HL125703 (W.J.M.M.), R01CA155432 (W.J.M.M.), K25 EB016673 (T.R.) and P30 CA008748 (MSK Center Grant). The authors also thank the Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (CMINT) at MSK for their financial support (T.R.).

Das Verfahren besteht aus dem Dual - radioaktive und fluoreszierende Markierung von Nanopartikeln in vivo PET-CT - Bildgebung, ex vivo Bioverteilung Messungen und ex vivo - Immunfärbung und Durchflusszytometrie analysiert. Alle Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee von Memorial Sloan Kettering Cancer Center genehmigt. 1. Herstellung von zweifach markierten Liposome HINWEIS: Syngene B16 Melanomtumoren kann durch Einspritzen von 300.000 B16-F10-Zellen in den hinteren Flanken von C57BL / 6-Mäusen unter Narkose durch das Einatmen von 2% -Isofluran haltigen Sauerstoff induziert werden. Verwenden Sie sterile Reagenzien und Werkzeuge in einem sterilen Arbeitsbereich während der Operation. Nach der Operation sorgfältig beobachten die Tiere bis zu ihrem Erwachen aus der Narkose. Setzen Sie die Tiere wieder in ihren Käfigen nur dann, wenn sie die volle Bewusstsein und Mobilität wiederzuerlangen. Haus sie in sterilen Räumen für Tiere mit xenografted Tumoren. Tumoren mit einer Größevon 300 mm sind 3 für Nanopartikel - Charakterisierung ideal aufgrund ihrer ausgeprägten erhöhte Permeabilität und Retention Effekte (EPR), die Nanopartikel - Akkumulation zu erhöhen. Die detaillierten Protokolle sind unten angegeben. <ol><li> In einem Rundkolben wurde ein Gemisch aus 20 mg der Lipide in 2 ml Chloroform , enthaltend 1,2-Dipalmitoyl- sn - glycero-3-phophocholine (DPPC) auflösen, Cholesterol, 1,2-sn - glycero disearoyl- 3-phosphoethanolamin-poly (ethylenglykol) 2000 (DSPE-PEG2000), DSPE-Deferoxamin (DFO-DSPE) 8, und 1,1-diododecyl-3,3,3,3-tetramethylindodicarbocyanine-5,5-disulfonsäure ( DiIC12 [5] -DS) bei molaren Verhältnissen von 61,3%, 33,4%, 5, 0,2% und 0,1% betragen. ANMERKUNG: Diese Lipidzusammensetzung ist sehr ähnlich zu der liposomalen Formulierung von Doxorubicin verwendet wird derzeit in der Klinik 2. Die resultierenden Liposomen aus unserem Verfahren wird eng imitieren die in vivo - Wirksamkeit der klinischen nanomedicine. </li><li> Verwenden eines Rotationsverdampfers das organische Lösungsmittel zu entfernen und eine dünne Lipidfilm bei Raumtemperatur bilden. 20 ml PBS und beschallen für 30 min zur liposomalen Nanoteilchen erzeugen, indem ein 3,8-mm Beschallungsspitze und einer Amplitude von 30 W verwendet, wobei eine ausreichende Kühlung auf Eis. </li><li> Zentrifugieren Sie die Liposom-Lösung bei 4.000 × g für 10 min die Aggregate zu entfernen und zu waschen, die Nanopartikel mit PBS unter Verwendung von Zentrifugenfiltration (Molekulargewicht cut-off (MWCO:. 100 kDa) freie Lipide und restliche organische Lösungsmittel zu entfernen, konzentrieren sich die Liposomen, die wird bleiben in der oberen Kammer, und übertragen sie in ein neues Röhrchen. die Liposome können, bevor die nachfolgenden Schritte für bis zu 1 Woche in PBS in einem Kühlschrank gelagert werden. </li><li> Für die Qualitätskontrolle, charakterisieren die Liposomen durch dynamische Lichtstreuung (DLS). Genauer gesagt, mit 950 &amp; mgr; l PBS, 50 &amp; mgr; l Liposomen mischen und dann die Mischung in die Schlichte Küvette übertragen. Setzen Sie die Küvette in den Analysator und messen den PartikelGrößen und deren Größenverteilung. Die Teilchengrößen und deren Größenverteilung (Polydispersitätsindex (PDI)) erwartet 90 zu sein - jeweils 0,2, - 120 nm und 0,1. </li><li> Zur radioaktiven Markierung, mischen die gereinigten Liposomen, entsprechend 2 mg von Lipiden, in PBS bei einem pH - Wert zwischen 6,9 und 7,1 mit 1 mCi 89 Zr-Oxalat bei 37 ° C für 2 h in einem 1,5-ml - Röhrchen, (Gesamtvolumen: ~ 100 &amp; mgr; l). Entfernen Sie die freie, nicht umgesetzten 89 Zr durch Zentrifugenfiltration (MWCO = 100 kDa), ähnlich zu Schritt 1.3 umgesetzt. Waschen des Retentats mit sterilem PBS und verdünne sie auf das gewünschte Volumen. 95% - Die radiochemische Ausbeute sollte 80 sein. VORSICHT! Arbeiten mit radioaktiven Stoffen ist stark reguliert. Die Institute müssen die notwendigen Einrichtungen, Personal Training zertifiziert und bieten werden, und eine strenge Überwachung der Radioaktivität Einsatz. Forscher müssen eine angemessene Ausbildung zu erhalten und persönliche Schutzausrüstung und Dosimetrie Ringe / Abzeichen tragen, wenn die Radioaktivität der Handhabung. </li><liBestimmen&gt; , um die radiochemische Reinheit der radiomarkierten Liposomen durch Grßenausschluß-HPLC Radio, die typischerweise mehr als 98% betragen sollte 10. Die radiochemische Reinheiten von weniger als 95% weisen auf unzureichendes Waschen auf Schritt 1.5. </li><li> Nach radioaktiven Markierung, um die Größe der Nanopartikel durch dynamische Lichtstreuung bestimmen. Die Größe und die PDI werden voraussichtlich innerhalb der gleichen Größenordnung wie die Messungen in Schritt 1.4 10 zu sein. HINWEIS: Wenn radioaktive Proben nicht im Flow Cytometer erlaubt oder Fluoreszenzmikroskop, nicht-radioaktive nat Zr-Oxalat verwendet werden können Liposomen in Schritt 1.5 zu etikettieren. Diese nicht-radioaktiven Liposome haben identische Eigenschaften ihrer radioaktiven Analoga. Eine Beschreibung dieses Verfahrens ist in Figur 2 zur Verfügung gestellt. </li></ol> 2. In - vivo - PET-CT Bildgebung und Biodistribution Dual-markierten Liposome <ol><li> Injizieren etwa 100 &amp; mgr; l doppelt markierte Liposomen with etwa 300 &amp; mgr; Ci von Radioaktivität in gezügelt Melanom - Mäuse (C57BL / 6, weiblich, 10 - 16 Wochen alt) durch ihre Schwanzvenen, bei etwa 10 mCi 89 Zr / kg Körpergewicht. </li><li> Um die Halbwertszeit bestimmen, ziehen Blut aus der Schwanzvene von narkotisierten Tieren unter 2% Isofluran-Sauerstoff enthält, unter Verwendung von 28-G Insulinspritzen. Sammeln Blut (10 bis 20 &amp; mgr; l) in vorgewogenen Röhrchen bei 2 min, 15 min, 1 h, 4 h, 8 h, 24 h und 48 h nach der Injektion. Wiegen Sie das Blut durch den Unterschied bestimmen Radioaktivität Inhalt eines Gammazählers verwendet, und berechnen die Radioaktivität Konzentration als Prozentsatz der injizierten Dosis pro Gramm (% ID / g). HINWEIS: Führen Sie das Verfahren in einem Raum mit einem Anästhesiesystem ausgestattet, Erholungskäfigen, eine Heizung und ein Biohazard Kapuze. Stellen Sie sicher, dass die Tiere vollständig zu erholen und normale Beweglichkeit nach dem Verfahren gewinnen, bevor sie von Erholungskäfigen zu halten Käfige zu übertragen. Haus der tumortragenden Tiere in Räumen für Tiere bezeichnet, verabreicht mitradioaktive Materialien. </li><li> 24 oder 48 h nach der Injektion des Liposomen, Bild die Mäuse in einem Kleintier - microPET-CT - Scanner 10. Platzieren Sie den narkotisierten Tier horizontal auf dem Bauch und halten Sie sie narkotisiert. Verwalten 2% Isofluran-Sauerstoff durch einen Nasenkegel. Bewerben Augensalbe auf seine Augen vor dem Scan zu verhindern, dass sie vor dem Austrocknen. </li><li> Führen Sie eine Ganzkörper-PET statischen Scan-Aufnahme mindestens 50 Millionen übereinstimmend Ereignisse, mit einer Dauer von etwa 15 min. Stellen Sie die Energie und Koinzidenzzeitfenster bei 350-700 keV und 6 ns sind. Danach führen Sie eine 5-min-Computertomographie (CT). Stellen Sie die Röntgenröhre mit einer Spannung von 80 kV und einem Strom von 500 uA; die CT - Abtastung verwendet 120 Rotationsschritte für insgesamt 220 Grad, mit ca. 145 ms pro Rahmen 10. </li><li> Nach dem PET-CT-Scan, opfern sofort die Mäuse durch Ersticken mit Kohlendioxid und bestätigen den Tod von pinching die Pfoten der Tiere. Sobald zervikalen Versetzungen bestätigt, führen. </li><li> Entfernen Sie die Blut in Geweben der Maus durch das erste offene rechte Atrium Schneiden und dann Einspritzen von 20 ml PBS in den linken Ventrikel und anschließend die relevanten Geweben sammeln wie Tumor, Leber, Milz, Lunge, Niere, Muskel und andere 16. </li><li> Wiegen Sie das Gewebe messen ihre Radioaktivität Gehalt durch Gammazählung 8, 9, und berechnen die Radioaktivität Gewebeakkumulation als Prozentsatz der injizierten Dosis pro g (% ID / g). </li></ol> 3. Ex - vivo - Durchflusszytometrie und Immunostaining HINWEIS: Injizieren etwa 100 &amp; mgr; l von fluoreszierenden Liposomen in Melanom-Mäuse durch ihre Schwanzvene in einer Dosis von 0,5 mg Farbstoff pro kg Körpergewicht. Wenn radioaktive Proben werden in dem Durchflusszytometer und Fluoreszenzmikroskop nicht erlaubt, nicht radioaktiven Liposome verwendet werden. <ol><li> Opfern, um die Mäuse 24 Stunden nach der Injektion, wie in Schritt 2.5, und sammeln die Tumoren, die in kaltem PBS gelagert werden müssen. </li><li> Für die Durchflusszytometrie folgendermaßen vor 17: <ol><li> Vorbereiten eines Enzymcocktail aus einer Mischung von gereinigtem Kollagenase I besteht, und II (4 U / ml), Hyaluronidase (60 U / ml) und DNase I (60 U / ml) in Durchflusszytometrie-Puffer (PBS mit 0,5% BSA und 1 mM EDTA). </li><li> Mischungs 100 mg von Tumorgewebe mit 200 &amp; mgr; l Enzymcocktail-Puffer in einem 1,5-ml-Röhrchen und würfeln das Gewebe in kleine Stücke mit einer feinen Schere. Einen weiteren hinzufügen 1,3 ml Enzymcocktail in das Rohr und übertragen seinen Inhalt auf eine 6-Well-Platte. </li><li> Schütteln Sie die 6-Well-Platte auf einem horizontalen Schüttler in einem C-Ofen 37 ° gelegt für 60 min bei 60 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Waschen Sie das Gewebehomogenat mit Durchflusszytometrie-Puffer 3 mal eine Einzelzellsuspension zu erhalten. </li><li> Beflecken die Zellen mit einem Cocktail von Antikörpern, die spezifisch an Biomarkern einschließlich CD45, CD11b, Ly6C, CD11c,CD64, CD3, MHCII und CD31 (1: 200-Verdünnung für alle Antikörper, Klon Informationen werden im Materialkalkulationstabelle zur Verfügung gestellt). Identifizierung relevanten Zelltypen und bestimmen deren mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von DiIC12 (5) -DS in jeder Zellpopulation mit einem entsprechenden Durchflusscytometrie-Analyse-Software. </li></ol></li><li> Für die Immunfärbung, gehen Sie folgendermaßen vor: <ol><li> Legen Sie einen Tumor in eine Kassette mit einer optimalen Schneidmedium (OCT) gefüllt und frieren sie auf Trockeneis. </li><li> Machen Sie 6 um gefrorene Schnitte von Tumorgewebe und legen sie auf die Histologie Glasobjektträger; die Abschnitte sollten die größten Querschnitte des Tumors Abdeckung, die den repräsentativsten Informationen auf dem Gewebe bereitzustellen. </li><li> Stain die Biomarker (zB CD31 für Endothelzellen) von Interesse mit den entsprechenden Antikörpern (zB anti-CD31, Klon MEC13.3). Befestigen Sie die Abschnitte mit Paraformaldehyd; blockieren sie mit Serum der Spezies Ursprung der Sekundärantikörper übereinstimmt; incubaß mit primären Antikörpern für 12 h bei 4 ° C und anschließend mit Sekundärantikörper für 2 h; und schließlich waschen mit PBS und Deckel mit Deckel rutscht. Bild die gefärbten Objektträger mit einem Leica aufrechten konfokalen Mikroskop SP5 13, 16. </li></ol></li></ol>

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The authors have no disclosure to make.

Kritische Schritte im Protokoll: Die hohe Qualität der dual-markierte Liposomen ist der Schlüssel konsistente Ergebnisse über einen langen Zeitraum zu erzeugen. Freie Fluoreszenzfarbstoffe oder 89 Zr - Ionen können völlig unterschiedliche Targeting - Muster erzeugen und müssen vollständig während der Reinigungsschritt entfernt werden. Darüber hinaus deutlich, wenn das Immunsystem experimentellen Krebsnano Leistung beeinflusst, sollte die Verwendung von immunkompetenten Mausmodelle bevorzugt sein, wie die B16-F10-Melanom-Modell in C57BL / 6-Mäuse, die in diesem Protokoll verwendet wurde. Wenn der Tumor-Mikroumgebung oder eine bestimmte Kombination von genetischen Mutationen, ein wichtiger Faktor ist, Patienten stamm Modelle Tumorxenotransplantates würde ideal Wahl. Umbau und Fehlerbehebung: Unser Verfahren eine einfache und zuverlässige Art und Weise stellt die in - vivo - Leistung von Nanomedizin in tumortragenden eine zu bewertenimals. Dieses Verfahren dient als Rückgrat spezifische Experimente zu bauen Krebsnanomedizin für verschiedene Anwendungen zu charakterisieren. Zum Beispiel können die Forscher quantitative in vivo pharmakokinetischen Eigenschaften des Nanomaterials bestimmen , wenn PET-CT - Scans zu mehreren Zeitpunkten an den gleichen Tieren 17 durchgeführt werden; sie können durch die Analyse anderer Gewebe, wie beispielsweise den Dickdarm, Dünndarm, Pankreas, Gehirn, Haut, Thymus, Magen oder Speicheldrüsen Bioverteilung Informationen der Nanomaterialien zu sammeln, wie es in anderen Veröffentlichungen 18 gezeigt, 19, 20, 21; oder sie können durch die Anwendung dieser Durchflusszytometrie und Immunofärbungsprotokoll die Einzelzelle und subzellulärer Spezifität von Nanomedizin in relevanten anderen Geweben als Tumoren zu bewerten. Einschränkungen der Technik: Dieses Protokoll requires einige spezialisierte Forschungsinfrastruktur einschließlich Radiochemie und Imaging-Einrichtungen-und technisches Know-how in die radioaktive Markierung, Kleintier-Bildgebung und Immunologie. Daher wäre es im Idealfall von einem multidisziplinären Team von Forschern mit Know-how in den relevanten Bereichen durchgeführt werden. Unsere eigene Erfahrung zeigt, dass die optimale Durchführung dieses Verfahrens eine sorgfältige Planung und eine effiziente Zusammenarbeit erfordert. Es ist erwähnenswert, dass die spezifischen Protokolle und vorgeschlagenen Mitteln in diesem Manuskript am besten für die radioaktive Markierung von lipidbasierten Nanopartikeln geeignet sind. Jedoch kann das Konzept der dual-markierte Nanopartikel eingesetzt werden, um andere Nanopartikel Formulierungen zu charakterisieren, die sich zum Beispiel auf Basis von Gold-Nanokristalle, Polymere, oder auch Viruspartikel. In diesen Fällen werden verschiedene Markierungsstrategien erforderlich. Es ist wichtig , die Vielzahl von radioaktiven Isotopen in der biomedizinischen Bildgebung verwendet hervorzuheben, einschließlich 89 Zr, 18 </sup&gt; F, 64 Cu, 68 Ga und 123 I, um nur ein paar 7. Die Wahl des Radioisotops muss basierend auf den spezifischen Eigenschaften des Nanomaterials unter Untersuchung gemacht werden, vor allem seine Blutzirkulation Halbwertszeit für die vollständige Charakterisierung zu späteren Zeitpunkten zu ermöglichen. Aber auch andere Faktoren, wie Markierungschemie oder Isotop Verfügbarkeit, kann die endgültige Auswahl beeinflussen. Für diese Studie wurde 89 Zr gewählt , weil seine langen Halbwertszeit (t 1/2 = 78,4 h) ist vergleichbar mit dem Bluthalbwertszeit von Liposomen. Bemerkenswerterweise kann dieses Protokoll auch mit anderen Isotopen, wie 99m Tc, 111 In oder 125 I, das sind im Handel erhältlich und eignen sich für Bildgebung mit Einzelphotonenemission - Computertomographie (SPECT) durchgeführt werden. Ebenso DILC wurde aufgrund seiner hohen Hydrophobizität gewählt und damit eine hohe Beladungseffizienz in Liposomen. Andere fluoreszierende Farbstoffe mit ungünstigen physikochemischen properties kann direkt an die Phospholipide 17 konjugiert werden. Bedeutung der Techniken: Dieses Verfahren stellt hohe translationale Potenzial, wenn Nanomedizin in klinischen Studien zur Bewertung angepasst. Die 4 wichtigsten Techniken, nämlich PET-CT-Bildgebung, Radioaktivitätsmessung, Durchflusszytometrie und Immunhistochemie-für onkologische Diagnose bei Patienten routinemäßig eingesetzt. Daher kann dieses Verfahren leicht die präklinische in - vivo - Leistung der Nanomedizin in der klinischen Phase auszuwerten übersetzt werden. Weiterhin ermöglicht die größere Größe von menschlichen Organen im Vergleich zu Mäusen , für eine genauere Analyse von PET-CT - Bildgebung 22, die die invasive Biopsie-basierte Messung von Radioaktivität Nanoakkumulations ersetzen kann. In dieser Einstellung nicht-invasive, bildgesteuerte Protokolle können Patienten zu stratifizieren entwickelt und Patienten Ergebnis 10 homogenisieren zu helfen. Deveradioaktive Nanomaterialien loping erfordert immer noch eine erhebliche Investitionen in die Infrastruktur. Alternativ können nicht-radioaktiven Bildgebungsverfahren basierend auf der Magnetresonanztomographie (MRI) haben sich schnell wurden in den letzten zehn Jahren entwickelt. Zum Beispiel verwendet Magnetic Particle Imaging (MPI) kleine Eisenoxid - Nanoteilchen (10 bis 20 nm) und kann viel mehr quantitative Bewertung der Nanomedizin , markiert mit Eisenoxid - Nanopartikel in vivo als die derzeitigen MRI - Techniken 23 bereitzustellen. Klinische Übersetzung von MPI würde mehr den Forschern ermöglichen , in - vivo - Bildgebungsverfahren robust zu verwenden , um die in vivo - Wirksamkeit von Krebsnanomedizin zu bewerten. Zukünftige Anwendungen: Sobald Forscher diese Protokolle beherrschen, können sie die Verfahren in den meisten fluoreszierenden und radioaktiven dual-markierte, neue Materialien zu charakterisieren, einschließlich Peptiden, Proteinen, Antikörpern, Antikörperfragmenten, und so weiter. Diese VerfahrenWissenschaftler können helfen , die in vivo - Wirksamkeit von neuartigen biomedizinischen Materialien gründlich zu bewerten und solche mit großen translationale Potenzial zu identifizieren. Abschließend wollen wir eine umfassende Charakterisierung der Nanomedizin Verfahren einzuführen, die systemische zur Verfügung stellen kann, Gewebe, Single-Cell und subzellulärer Ebene den Bereich Nanomedizin Anhäufung Informationen. Derzeit scheitern die meisten Krebsnanomedizin noch in der Phase I der klinischen Studien aufgrund ihrer suboptimal Pharmakokinetik, Bioverteilungen und Toxizitätsprofile. Auf der anderen Seite, beauftragt die große Heterogenität der Therapie als Reaktion auf den Bereich Nanomedizin ein Begleiter Imaging-Strategie für die Auswahl der Patienten, die vor allem aus diesen experimentellen Nanomedizin profitieren können. Wir glauben, dass die Annahme dieses Verfahren, um die Gemeinschaft helfen könnte, viel versprechende Nanomedizin mit hohem translationalen Potenzial in präklinischen Tiermodellen und mit der richtigen Modifikation zu identifizieren, könnte auch klinische helfenForscher Patienten zugänglich nanotherapy zu identifizieren.

Nano verschiebt sich das Paradigma der Krebsbehandlung Entwicklung 1. Inspiriert durch die enorme klinische Auswirkungen früherer Krebs Nanomedizin, wie liposome- und Albumin-basierte nanotherapies 2, 3, haben viele neue Formulierungen wurden in den letzten zehn Jahren hergestellt. Jüngsten Analysen der klinischen Übersetzungs Erfolg dieser Krebsnanomedizin zeigen jedoch, dass nur einige von ihnen sind für die klinische Anwendung 4, 5 zugelassen. Ein großes Hindernis für die klinische Umsetzung von neuen Krebsnanomedizin ist ihre begrenzte Verbesserung des therapeutischen Index im Vergleich mit der direkten Verwaltung der freien therapeutischen Verbindungen 6. Als solche genaue Auswertung der in vivo - Leistung Nanomedizin bei systemischer, Gewebe und zellulärer Ebene in vorklinischen Tiermodellen ist wesentlich für identifdiejenigen y mit optimalen therapeutischen Indizes für zukünftige klinische Übersetzung. Nanomaterialien können in lebenden Tieren , die mit der Positronen - Emissions - Tomographie (PET) Bildgebung für die quantitative Charakterisierung radioaktiv markiert werden, die 7 hervorragende Sensitivität und Reproduzierbarkeit bei allen klinischen Bildgebungsverfahren hat. Zum Beispiel 89 Zr-markierte lange Zirkulationsnanomedizin haben in Mausmodellen für Krebs 8, 9, 10, wie auch in anderen Krankheitsmodellen 11 charakterisiert. Darüber hinaus kann der Bluthalbwertszeit und biologische Verteilung der Nanomedizin extensiv durch Verwendung ex vivo Messungen der Radioaktivität in einzelnen Geweben 8 ausgewertet werden. Daher ermöglicht die radioaktive Markierung für die quantitative Bewertung von Nanomedizin bei einer systemischen und Gewebespiegel. Wichtig ist, dass radiolabeled Nanomedizin allgemein kann nicht auf Einzelzell oder subzellulären Ebenen aufgrund der begrenzten räumlichen Auflösung des radioaktiven Signals analysiert werden. Daher Fluoreszenzmarkierung erweist sich für die Beurteilung von Nanopartikeln mit optischen Abbildungstechniken wie Durchflußzytometrie und Fluoreszenzmikroskopie 12 eine komplementäre Modalität sein. Zu diesem Zweck markiert Nanopartikel mit Radioisotopen und Fluoreszenzmarkierungen kann quantitativ in vivo durch nukleare Bildgebung ausgewertet werden und ex vivo durch Radioaktivität Zählen, und sie können auch ausgiebig auf zellulärer Ebene durch die optische Abbildungs charakterisiert werden. Zuvor haben wir modular Verfahren entwickelt radioaktive und fluoreszierende Markierungen in verschiedene Nanopartikel einzuarbeiten, einschließlich High-Density - Lipoprotein (HDL) 11, Liposome 9, 10, polymere Nanopartikel, Antikörperfragmente und nanoemulsions 10, 13. Diese markierten Nanopartikel wurden zur quantitativen Charakterisierung in relevanten Tiermodellen auf verschiedenen Ebenen erlaubt, die die Optimierung dieser Nanomaterialien für ihre spezifischen Anwendungen geführt. In der aktuellen Studie ist es das Ziel 14 liposomalen Nanopartikel-die meisten etablierten Nano Plattform -wie ein Beispiel zu verwenden , umfassende Verfahren zu demonstrieren , einen Dual-markierte Nanopartikel zu erzeugen , und um es gründlich zu charakterisieren in einem klassischen syngenen Melanom B16-F10 - Maus - Modell 15 . Aus den Ergebnissen können wir diese Nanopartikel Charakterisierung Ansatz überzeugt, angepasst werden kann andere Krebsnanomedizin in relevanten Mausmodellen zu bewerten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="638">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPPC</td>
			<td style="width:136px;">Avantilipids</td>
			<td align="right" style="width:119px;">850355</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DSPE-PEG2000</td>
			<td style="width:136px;">Avantilipids</td>
			<td style="width:119px;">880120P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DSPE-DFO</td>
			<td style="width:136px;">Home made</td>
			<td align="right" style="width:119px;">110634</td>
			<td>Perez-Medina et al, JNM, 2014</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DiIC12[5]-DS</td>
			<td style="width:136px;">AAT Bioquest</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifugal filter</td>
			<td style="width:136px;">Vivaproducts</td>
			<td style="width:119px;">VS2061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotary evaporator</td>
			<td style="width:136px;">Buchi</td>
			<td style="width:119px;">R-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Radio-HPLC</td>
			<td style="width:136px;">Shimadzu HPLC with 2 LC-10AT pumps</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">89Zr-oxalate</td>
			<td style="width:136px;">MSKCC</td>
			<td style="width:119px;">Synthesized in house</td>
			<td>TR19/9 variable beam cyclotron (Ebco Industries Inc)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micro PET-CT</td>
			<td style="width:136px;">Siemens</td>
			<td style="width:119px;">Inveon Micro-PET/CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gamma counter</td>
			<td style="width:136px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">2470-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Flow cytometry</td>
			<td style="width:136px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">Fortessa</td>
			<td>Any multi-parametric flow cytometry analyzers would suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">C57BL/6 mice</td>
			<td style="width:136px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B16-YFP melanoma cells</td>
			<td style="width:136px;">Home made</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Salmon et al, Immunity, 2016</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ly6C (clone HK1.4)--APC-Cy7</td>
			<td align="right" style="width:136px;">128025</td>
			<td style="width:119px;">Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MHCII (M5/114/152)--APC</td>
			<td align="right" style="width:136px;">107613</td>
			<td style="width:119px;">Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD45 (30-F11)--BV510</td>
			<td align="right" style="width:136px;">103137</td>
			<td style="width:119px;">Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD64 (X54-5/7.1)--PE-Cy7</td>
			<td align="right" style="width:136px;">139313</td>
			<td style="width:119px;">Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11b (M1/70)--BV605</td>
			<td align="right" style="width:136px;">101237</td>
			<td style="width:119px;">Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD3 (17A2)--BV711</td>
			<td align="right" style="width:136px;">100241</td>
			<td style="width:119px;">Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD31 (13.3)--PE</td>
			<td align="right" style="width:136px;">561073</td>
			<td style="width:119px;">Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11c (M418)--PerCP-Cy5.5</td>
			<td align="right" style="width:136px;">117327</td>
			<td style="width:119px;">BD Biosciences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD31 (13.3) no fluorophore</td>
			<td align="right" style="width:136px;">550274</td>
			<td style="width:119px;">BD Biosciences</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a comprehensive procedure to evaluate the in vivo performance of cancer nanomedicines

Inspiriert durch den Erfolg der bisherigen Krebsnanomedizin in der Klinik haben die Forscher eine große Anzahl von neuen Formulierungen in den letzten zehn Jahren generiert. Jedoch nur eine geringe Anzahl von Nanomedizin wurden für die klinische Verwendung zugelassen, während die Mehrzahl der Nanomedizin in der klinischen Entwicklung enttäuschenden Ergebnissen geführt haben. Ein wesentliches Hindernis für die erfolgreiche klinische Übersetzung des neuen Krebsnanomedizin ist der Mangel an einem genauen Verständnis ihrer in vivo Leistung. Dieser Artikel enthält ein rigoroses Verfahren das in vivo Verhalten der Nanomedizin in tumortragenden Mäusen bei einer systemischen, Gewebe, single-cell und subzellulären Ebenen über die Integration der Positronen - Emissions - Tomographie-Computertomographie (PET-CT), Radioaktivität Quantifizierungsverfahren zur Charakterisierung fließen, Zytometrie und Fluoreszenzmikroskopie. Mit diesem Ansatz können die Forscher auswerten genau neuartigen nanoskaligen Formulierungen in relevanten Mausmodellen der cancer. Diese Protokolle können die Fähigkeit haben, die vielversprechendsten Krebs Nanomedizin mit hohem translationalen Potenzial zu identifizieren oder bei der Optimierung von Krebs Nanomedizin für die zukünftige Übersetzung zu helfen.

1 zeigt einen Überblick über das Verfahren. Figur 2 zeigt den schematischen Syntheseverfahren der dual-markierte Liposomen in Schritt 1 beschrieben 10. Abbildung 3 zeigt eine repräsentative PET-CT - Bild (Abbildung 3a), Radioaktivität Quantifizierung von PET - Bildgebung (Abbildung 3b), Bluthalbwertszeit (Abbildung 3c) und biologische Verteilung (Abbildung 3d) von radioaktiven Nanopartikel, wie in Schritt 2 beschrieben in Figur 3a, die Liposomen ansammeln hoch in den Tumor, der durch die Quantifizierung der Abbildungsergebnisse in Figur 3b bestätigt wird. Weiterhin zeigen Liposomen eine Bluthalbwertszeit von etwa 10 h in Figur 3c. Die ex vivo Bioverteilung bestätigt die hohe Tumor Akkumulation von Liposomen. Schließlich 4 stellt eine typische Gating - procedure zu relevanten Zellen in einem Tumor für die Einzelzellebene Analyse der Nanopartikel - Akkumulation (Abbildung 4a und b) zu identifizieren, die die bevorzugte Akkumulation der Nanopartikel in Tumor-assoziierten zeigt Makrophagen (TAM). Eine repräsentative konfokalen Mikroskopiebild zeigt auch die Überlappung zwischen Nanopartikeln und Endothelzellen (Figur 4c). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55271/55271fig1.jpg" /> 1. Schematische Übersicht über die In - vivo - Nanocharakterisierungsverfahren Abbildung. Dieses Verfahren umfasst die Kennzeichnung von Nanopartikeln mit sowohl radioaktive und fluoreszierende Markierungen; die Charakterisierung von radiomarkiertem Nanopartikel mit PET-CT-Bildgebung, Bluthalbwertszeit-Messungen und biologische Verteilung Bewertungen; und die Einzelzellen-und subzellulären Analyse von fluoreszierenden Nanopartikeln mittels Durchflusszytometrie und immunostaining, respectively. Die Techniken, von links nach rechts, bieten räumliche Auflösung von Nanopartikel in vivo Akkumulation zu erhöhen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55271/55271fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55271/55271fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55271/55271fig2.jpg" /> Abbildung 2. Syntheseverfahren Dual-markierten Liposome. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55271/55271fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55271/55271fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55271/55271fig3.jpg" /> 3. Repräsentative Ergebnisse von In - vivo - Charakterisierung von radiomarkiertem Nanopartikel Abbildung. (a) PET-CT - Bilder eines tumor-tragenden Maus nach der Nanopartikel Injektion und (b) PET-derived Aufnahmewerte in mehreren Geweben (n = 3). (c) Blutradioaktivität Halbwertszeit eines radiomarkierten Nanoteilchen, sowie (d) seine Bioverteilung bei 24 h nach der Injektion (n = 3). Die Fehlerbalken sind die Standardabweichung. Geändert von Referenz 8, mit freundlicher Genehmigung. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55271/55271fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55271/55271fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55271/55271fig4.jpg" /> 4. Repräsentative Ergebnisse der in vivo Charakterisierung von fluoreszierenden Nanopartikeln Abbildung. (a) Ein typisches Durchflusszytometrie Gating Verfahren tumorassoziierten Immunzellen, Tumorzellen und Endothelzellen (EC), sowie (b) die Quantifizierung der nanoparti zu identifizierenCLE Akkumulation in diesen Zellen 8. Ein repräsentatives Bild von 3 biologischen Wiederholungen. (c) Repräsentative Immunofluoreszenz Bild der spezifischen Ausrichtung eines RGD-konjugierten Nanoemulsion 13 zeigt Zellen in Tumoren an Endothelzellen. Geändert von Referenzen 8 und 13, mit freundlicher Genehmigung. Tumor-assoziierte Makrophagen (TAM). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55271/55271fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55271/55271fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

The poor understanding of the in vivo performance of nanomedicines stymies their clinical translation. Procedures to evaluate the in vivo behavior of cancer nanomedicines at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels in tumor-bearing immunocompetent mice are described here. This approach may help researchers to identify promising cancer nanomedicines for clinical translation.

Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung der<em&gt; In Vivo</em&gt; Performance von Krebs Nanomedizin

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

8.8K Aufrufe.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. The poor understanding of the in vivo performance of nanomedicines stymies their clinical translation. Procedures to evaluate the in vivo behavior of cancer nanomedicines at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels in tumor-bearing immunocompetent mice are described here. This approach may help researchers to identify promising cancer nanomedicines for clinical translation.

Serie: A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish Danio Rerio

This method utilizes zebrafish embryos to efficiently test the vascular invasive ability of cancer cells. Fluorescent cancer cells are injected into the precardiac sinus or yolk sac of developing embryos. Cancer cell vascular invasion and extravasation is assessed via fluorescence microscopy of the tail region 24 to 96 hr later.

Testen des Vascular Invasive Fähigkeit von Krebszellen in Zebrabärbling (<em&gt; Danio rerio</em&gt;)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression.  Traditional in vitro models of cancer cell invasion of ...

Forschung

Krebsforschung

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic probes to provide quantitative information on the chemical tumor microenvironment (TME), including pO2, pH, redox status, concentrations of interstitial inorganic phosphate (Pi), and intracellular glutathione (GSH). In particular, an application of a recently developed soluble multifunctional trityl probe provides unsurpassed opportunity for in vivo concurrent measurements of pH, pO2 and Pi in Extracellular space (HOPE probe). The measurements of three parameters using a single probe allow for their correlation analyses independent of probe distribution and time of the measurements.

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Low-field (L-band, 1.2 GHz) electron paramagnetic resonance using soluble nitroxyl and trityl probes is demonstrated for assessment of physiologically important parameters in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.

In Vivo EPR-Bewertung der pH, pO2, Redox-Status, und Konzentrationen von Phosphat und Glutathion in der Tumor-Mikroumgebung

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human central nervous system (CNS). However, both the cytological origin and the evolutionary process of HBs (including neovascularization) remain controversial, and anti-angiogenesis for VHL-HBs, based on classic HB angiogenesis, have produced disappointing results in clinical trials. One major obstacle to the successful clinical translation of anti-vascular treatment is the lack of a thorough understanding of neovascularization in this vascular tumor. In this article, we present a comprehensive procedure to evaluate in vitro whether classic tumor angiogenesis exists in HBs, as well as its role in HBs. With this procedure, researchers can accurately understand the complexity of HB neovascularization and identify the function of this common form of angiogenesis in HBs. These protocols can be used to evaluate the most promising anti-vascular therapy for tumors, which has high translational potential either for tumors treatment or for aiding in the optimization of the anti-angiogenic treatment for HBs in future translations. The results highlight the complexity of HB neovascularization and suggest that this common form angiogenesis is only a complementary mechanism in HB neovascularization.

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

This paper presents a comprehensive procedure to evaluate in vitro whether classic tumor angiogenesis exists in hemangioblastomas (HBs) and its role in HBs. The results highlight the complexity of HB-neovascularization and suggest that this common form of angiogenesis is only a complementary mechanism in the HB-neovascularization.

Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung der In-vitro- Leistung von der vermeintlichen Hämangioblastom Neovaskularisation mit den Sphäroid sprießen Assay

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction pathways and is tightly regulated by kinases and phosphatases. Therefore, characterizing the phosphoproteome may provide insights into identifying novel targets and biomarkers for oncologic therapy. Mass spectrometry provides a way to globally detect and quantify thousands of unique phosphorylation events. However, phosphopeptides are much less abundant than non-phosphopeptides, making biochemical analysis more challenging. To overcome this limitation, methods to enrich phosphopeptides prior to the mass spectrometry analysis are required. We describe a procedure to extract and digest proteins from tissue to yield peptides, followed by an enrichment for phosphotyrosine (pY) and phosphoserine/threonine (pST) peptides using an antibody-based and/or titanium dioxide (TiO2)-based enrichment method. After the sample preparation and mass spectrometry, we subsequently identify and quantify phosphopeptides using liquid chromatography-mass spectrometry and analysis software.

This protocol describes a procedure to extract and enrich phosphopeptides from prostate cancer cell lines or tissues for an analysis of the phosphoproteome via mass spectrometry-based proteomics.

Phosphopeptide Bereicherung gepaart mit quantitativen markierungsfreie Massenspektrometrie zu untersuchen, die Phosphoproteome bei Prostatakrebs

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ever-increasing number of studies have identified miRNAs as potential biomarkers for cancer diagnosis and prognosis, and also as therapeutic targets, adding an extra dimension to cancer evaluation and treatment. In the context of thyroid cancer, tumorigenesis results not only from mutations in important genes, but also from the overexpression of many miRNAs. Accordingly, the role of miRNAs in the control of thyroid gene expression is evolving as an important mechanism in cancer. Herein, we present a protocol to examine the effects of miRNA-inhibitor delivery as a therapeutic modality in thyroid cancer using human tumor xenograft and orthotopic mouse models. After engineering stable thyroid tumoral cells expressing GFP and luciferase, cells are injected into nude mice to develop tumors, which can be followed by bioluminescence. The in vivo inhibition of a miRNA can reduce tumor growth and upregulate miRNA gene targets. This method can be used to assess the importance of a determined miRNA in vivo, in addition to identifying new therapeutic targets.

This protocol describes xenograft and orthotopic mouse models of human thyroid tumorigenesis as a platform to test microRNA-based inhibitor treatments. This approach is ideal to study the function of non-coding RNAs and their potential as new therapeutic targets.

In Vivo Hemmung von MicroRNA zur Verringerung des Tumorwachstums bei Mäusen

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a malignant brain tumor with no cure, has up to a half the tumor mass TAMs. TAMs can be pro-tumoral or anti-tumoral, depending on the activation of specific genes in the cells. Genetic mutations in the tumors, through regulating cytokine expression, can affect recruitment of TAMs to the tumor microenvironment. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess macrophage recruitment by the conditioned medium from the tumor cells. This assay uses the human macrophage cell line MV-4-11 to study macrophage attraction by the conditioned medium from glioblastoma, allowing for high reproducibility and low variability. Data generated with this assay can contribute to a better understanding of the interaction between the tumor and the tumor microenvironment. Similar assay can be used to assess interaction between the tumor cells and other immune cells, including T cells and natural killer (NK) cells.

This article represents a useful in vitro assay to evaluate the capability of conditioned medium from tumor cells to attract macrophages.

In Vitro-Assay zur Untersuchung der Tumor-Makrophage-Interaktion

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer growth and metastasis. Paracrine signals can involve cell-cell contact between different cell types, such as PD-L1 expressed on the surface of tumors interacting directly with PD-1 on the surface of T cells, or the secretion of ligands by a tumor cell to affect an immune cell. Here we describe a co-culture method to interrogate the effects of tumor-secreted ligands on immune cell (macrophage) activation. This straightforward procedure utilizes commercially available 0.4 &#181;m polycarbonate membrane permeable supports and standard tissue culture plates. In the process described, macrophages are cultured in the upper chamber and tumor cells in the lower chamber. The presence of the 0.4 &#181;m barrier allows for the study of intercellular signaling without the confounding variable of physical contact, because the two cell types share the same medium and exposure to paracrine ligands. This approach can be combined with others, such as genetic alterations of the macrophage (e.g., isolation from genetic knock-out mice) or tumor (e.g., CRISPR-mediated alterations) to study the role of specific secreted factors and receptors. The approach also lends itself to standard molecular biological analyses such as quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) or Western blot analysis, without the need for flow sorting to separate the two cell populations. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) can similarly be utilized to measure secreted ligands to better understand the dynamic interaction of cell signaling in the multiple cell type context. Duration of co-culture can also be varied for the study of temporally regulated events. This co-culture method is a robust tool that facilitates the study of tumor-secreted signals in the immune context.

Here, we present a method using permeable membrane supports to facilitate the study of non-contact paracrine signaling used by tumor cells to suppress the immune response. The system is amenable to studying the role of tumor-secreted factors in dampening macrophage activation.

Untersuchung der Auswirkungen von tumorgeheimen Parakrinliganden auf die Makrophagenaktivierung mit Co-Culture mit permeableMembranen unterstützt

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are particularly devastating, difficult to treat, and confer a poor prognosis. While the precise incidence of brain metastases in the United States remains hard to estimate, it is likely to increase as extracranial therapies continue to become more efficacious in treating cancer. Thus, it is necessary to identify and develop novel therapeutic approaches to treat metastasis at this site. To this end, intracranial injection of cancer cells has become a well-established method in which to model brain metastasis. Previously, the inability to directly measure tumor growth has been a technical hindrance to this model; however, increasing availability and quality of small animal imaging modalities, such as magnetic resonance imaging (MRI), are vastly improving the ability to monitor tumor growth over time and infer changes within the brain during the experimental period. Herein, intracranial injection of murine mammary tumor cells into immunocompetent mice followed by MRI is demonstrated. The presented injection approach utilizes isoflurane anesthesia and a stereotactic setup with a digitally controlled, automated drill and needle injection to enhance precision, and reduce technical error. MRI is measured over time using a 9.4 Tesla instrument in The Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Tumor volume measurements are demonstrated at each time point through use of ImageJ. Overall, this intracranial injection approach allows for precise injection, day-to-day monitoring, and accurate tumor volume measurements, which combined greatly enhance the utility of this model system to test novel hypotheses on the drivers of brain metastases.

Intracranial brain metastasis modeling is complicated by an inability to monitor tumor size and response to treatment with precise and timely methods. The presented methodology couples intracranial tumor injection with magnetic resonance imaging analysis, which when combined, cultivates precise and consistent injections, enhanced animal monitoring, and accurate tumor volume measurements.

Modellierung von Hirnmetastasen durch intrakranielle Injektion und Magnetresonanztomographie

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory cytokine interleukin-1 alpha (IL-1&#945;) has been evaluated as an anticancer agent in several preclinical and clinical studies. However, dose-limiting toxicities, including flu-like symptoms and hypotension, have dampened the enthusiasm for this therapeutic strategy. Polyanhydride nanoparticle (NP)-based delivery of IL-1&#945; would represent an effective approach in this context since this may allow for a slow and controlled release of IL-1&#945; systemically while reducing toxic side effects. Here an analysis of the antitumor activity of IL-1&#945;-loaded polyanhydride NPs in a head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) syngeneic mouse model is described. Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells were injected subcutaneously into the right flank of C57BL/6J mice. Once tumors reached 3-4 mm in any direction, a 1.5% IL-1a - loaded 20:80 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane:1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPTEG: CPH) nanoparticle (IL-1&#945;-NP) formulation was administered to mice intraperitoneally. Tumor size and body weight were continuously measured until tumor size or weight loss reached euthanasia criteria. Blood samples were taken to evaluate antitumor immune responses by submandibular venipuncture, and inflammatory cytokines were measured through cytokine multiplex assays. Tumor and inguinal lymph nodes were resected and homogenized into a single-cell suspension to analyze various immune cells through multicolor flow cytometry. These standard methods will allow investigators to study the antitumor immune response and potential mechanism of immunostimulatory NPs and other immunotherapy agents for cancer treatment.

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

A standard protocol is described to study the antitumor activity and associated toxicity of IL-1&#945; in a syngeneic mouse model of HNSCC.

Bewertung der in vivo Antitumoraktivität von Polyanhydrid IL-1α Nanopartikeln

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...