Research reported in this publication was supported by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) of the NIH under award number R01AI114362 and Welch Foundation grant I-1782 to Iv&#225;n D'Orso.

1.めっきセル<ol><li>トランスフェクションの1日前に、10％（v / v）のウシ胎児血清（FBS）および1％（v / v）のペニシリン/ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）10mLに3.5×10 6 HEK293T細胞をプレート100ミリメートル皿当たり（10,000 U / mlのストック）。十分なタンパク質回収を確実にするために、実験/条件当たり5 100mm皿 - プレート3。 注意：プレートの数は、目的のタンパク質複合体の発現レベルおよび溶解度に依存するそれぞれの実験/条件に対して決定されなければなりません。より大規模な精製が必要な場合は別の方法として、細胞株は、スピナーフラスコ2に懸濁液中で増殖するように適合させることができますが、この方法は、一過性トランスフェクションのために動作しません。 </li></ol> 2.細胞をトランスフェクトまたは安定な細胞株を誘導<ol><li>翌日、細胞を顕微鏡下で確認してください。 proce前に、80％コンフルエント - 細胞は70でなければなりませんeding。 </li><li>プラスミドDNAの7μgの100 mmディッシュあたりのトランスフェクション試薬の21μlの総混合物で細胞をトランスフェクトします。トランスフェクション効率のコントロールとしてGFP（ 表1）を発現するベクターで細胞をトランスフェクトします。 注：HEK293-T-REXまたはドキシサイクリン14,15に応答して二つ以上の複合体のサブユニットの発現を誘導する同様の安定した細胞株を使用する場合、誘導物質を細胞に添加し、48時間インキュベートされなければなりません。同様に、誘導物質の添加時にGFPの発現を誘導する安定な細胞株はまた、検証目的のために必要とされるであろう。 2.7に進みます。 </li><li> 100ミリメートル皿当たりトランスフェクション混合物を準備します。 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブでは、（2以上のプラスミドに相当）総プラスミドDNAの7μgのと非補充DMEM500μlのを混ぜます。別々のマイクロ遠心チューブでは、未補充DMEMのwiの500μLを混ぜますトランスフェクション試薬の第21μlの。各トランスフェクション反応のために繰り返します。 </li><li>プラスミドDNA溶液へのトランスフェクション試薬溶液をピペットで（逆の順序でソリューションを混在させないでください）。少なくとも4回ピペッティングして混ぜます。 </li><li>もはや15分より15分、しかし - 10室温でこの混合物をインキュベートしていません。 </li><li>メディアリザーバーを作成して、慎重に細胞を乱すことなく、プレートの内側に滴下トランスフェクション混合物をピペットするためにプレートを傾けます。元の平らな位置に皿を返し、混合物を配布するために穏やかに旋回。 </li><li> （この条件は以下「組織培養インキュベーター」とも呼ばれる）、5％CO 2の加湿細胞培養インキュベーター中、37℃で細胞をインキュベートします。メディア5時間後、トランスフェクション（オプション）を交換してください。 </li></ol> 3.確認トランスフェクションまたは誘導効率<ol><li> 24時間後、トランスフェクションでは、インフルエンザの下で細胞を可視化orescent顕微鏡は、トランスフェクション効率（またはGFPを発現制御HEK293T-REX安定な細胞株の誘導）をチェックします。さらに24時間インキュベートします。 </li></ol> 4. STREPアフィニティー精製（STREP AP） <ol><li> 細胞を収集します <ol><li> 48時間トランスフェクション後に、培地を除去し、冷1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の8ミリリットルを追加します。プレートから細胞を剥離するために上下にピペット。 </li><li>収集し、15 mLのチューブに細胞懸濁液を移し、4℃で4分間、800×gで細胞をスピンダウン。 </li><li> PBS上清を取り除きます。任意の残留PBSを除去するために（4℃で1分間、800×gで）スピンダウン繰り返します。将来の使用のために-80℃で細胞ペレットを保存したり、タンパク質精製を続行するには、以下の手順に従ってください。 </li></ol></li><li> 細胞を溶解 <ol><li>受動溶解緩衝液の細胞ペレットの体積（プレート当たり〜250μl）を×5を使用して、細胞ペレットを再懸濁し（PLB：20mMトリス塩酸pH7.5で、150mMのNaCl、1.5mMのMgCl 2を、1mMのDTT、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠、5％（v / v）のグリセロール、1.0％NP-40）及び細胞懸濁液を転送します1.5ミリリットルマイクロチューブ。 </li><li>簡単に言うと4℃で30分間サスペンションとうなだれるをボルテックス。 </li><li> 4℃で10分間10,000×gで細胞懸濁液をスピンダウン。 </li><li>新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに可溶性溶解物を移し、細胞ペレットを捨てます。可溶性溶解物の最終体積の10％を保存」STREP AP入力。」 4℃で保存。 </li></ol></li><li> STREPビーズを平衡化 注：最初のAPのステップの使用STREPビーズ！複合体はSTREPビーズでプルダウンFLAGビーズでプルダウンものよりも有意に多くのタンパク質を回収。 <ol><li>アウトテイク（nは40μLを×）+ nは50％STREPビーズスラリーμlの（N =サンプル数）、4℃で2分間、1500×gでスピンダウン。 注：使用ワイドメートルピペットビーズにヒントをouthed。 </li><li>上清を除去し、ビーズにPLBの500μlを添加します。 4℃で5分間ビーズ混合物を章動。 4℃で2分間、1500×gでスピンダウン。 <ol><li>合計3回の洗浄のために繰り返します。 40μlの×n個の最終容量までPLB中のビーズを再懸濁します。 </li></ol></li><li> 4℃で2時間、各細胞溶解物のサンプルとうなだれるに50％STREPビーズスラリー40μlのを追加します。 </li></ol></li><li> STREP AP <ol><li> 4℃で2分間、1500×gでソリューションをスピンダウン。 </li><li> 4°Cで「STREP APフロースルー（FT）」と上清とストアを削除します。 </li><li>ビーズにSTREP AP洗浄緩衝液500μlのI（20mMのトリス塩酸pH7.5で、250mMのNaClを、1.5のMgCl 2、1mMのDTT、5％グリセロールおよび0.2％NP-40）を追加します。 5 4℃で分および4℃で2分間、1500×gで遠心分離するためのビーズ混合物を章動させます。上清を捨てます。 <ol><li> 4回の洗浄の合計のために繰り返します。 <br/&gt;注：第洗浄する前に、タンパク質のバックグラウンドを低減するために、新しい1.5ミリリットルのマイクロチューブにビーズ液を移します。このステップは必須です。 </li></ol></li><li> 500μlの洗浄緩衝液II（100 mMトリス塩酸pH8.0の、150mMのNaCl、および1mM EDTA）を加え、チューブを反転させてビーズを平衡化。 4℃で2分間、1500×gでスピンダウンし、上清を捨てます。 </li><li> STREP溶出緩衝液（100mMのトリス塩酸pH8.0の、150mMのNaCl、1mMのEDTA、および2.5 mMのデスチオビオチン）50μlの目的のタンパク質を溶出させます。 4℃で15分間、800rpmでボルテックス。 </li><li> 4℃で1分間、1500×gでビーズをスピンダウン。上清を収集します。この画分は、「STREP AP溶出」のサンプルに対応します。 </li><li>最初の溶出で得られたタンパク質の量の半分までをもたらし得る2回目の溶出、4℃でビーズ画分を保存します。銀染色および/またはウェスタンブロッティングのためにSTREP AP溶出の一定分量10％16。 </li></ol></li><li> FLAGビーズを平衡化 <ol><li> （NX 16μl）を取り出し+ n個μlのFLAGビーズの溶液（n個のサンプルの=数）と4℃で2分間、1500×gでスピンダウン。 注：ピペットのビーズに広口のヒントを参考にしてください。 </li><li>上清を除去し、FLAG洗浄緩衝液500μlを追加（100mMのトリス塩酸pH8.0の、150mMのNaCl、1mMのEDTA、および0.1％NP-40）ビーズへ。 4℃で2分間、1500×gでスピンダウン。合計3回の洗浄のために繰り返します。 </li><li> NX 16μlの最終体積にFLAG洗浄緩衝液でビーズを再懸濁します。 </li><li> 4℃で残りのSTREP AP溶出とうなだれる一晩にFLAGビーズスラリーの16μLを加えます。 </li></ol></li></ol> 5. FLAG IP <ol><li> 4℃で2分間、1500×gでFLAGビーズ懸濁液をスピンダウン。 4°Cで「FLAG IPフロースルー」（FT）として、上清とストアを保存します。 </li><li> 500を追加します。81;溶液へのFLAG洗浄緩衝液のリットル。 5 4℃で分および4℃で2分間、1500×gで遠心分離するための章動させます。 4回の洗浄の合計のために繰り返して、各洗浄後に上清を除去します。 注：第洗浄する前に、バックグラウンドを低減するために、新しい1.5ミリリットルのマイクロチューブにタンパク質ビーズのソリューションを転送します。このステップは必須です。 </li><li>最後のスピンから上清を除去し、ビーズにFLAGペプチドの200 ngの/μLを含むFLAG洗浄緩衝液の30μLを追加します。 4℃で2時間、800 rpmでボルテックス。 </li><li> 4℃で2分間、1500×gでサスペンションをスピンダウン。 4℃で上清とストアを収穫 &quot;FLAG IP溶出。」 注：溶出サンプルは、標準的なプロトコル16を使用して、銀染色および/またはウェスタンブロットによって確認し、さらにタンパク質アッセイのための準備ができていることができます。 （1）STREP AP入力、（2）STREP AP FT、（3）STREP AP Eluti：ウェスタンブロットを設定する場合は、以下のサンプルのすべてを実行します（4）FLAG IP FT、上、および（5）FLAG IP溶出。ロードされたボリュームは、各実験のために決定する必要があります。すべての収集されたサンプルとビーズは、短期記憶および長期保存のために-80℃で、4℃で保存することができます。 TAPサンプルは、その構成要素の身元を確認するための新規の翻訳後修飾（PTMを）を識別するために、および/または精製された複合体2、17を有する任意の新規なタンパク質相互作用を検出するために質量分析によって分析することができます。この目的のために、クマシーゲルまたは銀染色を実行した後、バンドはきれいなメスを用いてゲルから切り出すことができます。質量分析法を議論するいくつかの優れたレビューは、以前に18、19を発表しました。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

真核細胞からのタンパク質複合体の発現および単離のためにここに記載したプロトコルは、このような分子集合体の生化学的特徴付けに限定されるものではなく、それらの機能を調節することができ、新規な相互作用および翻訳後修飾の同定に利用することができます。親和性タグの使用は、このプロトコルに記載されているものに限定されるものではありません。しかし、我々の経験は、最初のAPステップとしてSTREPを使用して有意に最終タンパク質 - タンパク質複合体の収率を高めることを示唆しています。 STREPビーズへとから結合および溶出手順の両方が他のエピトープタグ（ 例えば 、FLAG）と比較して非常に効率的です。また、理論的に、TAPは、緩衝液条件、（両方の過渡的で安定した発現システム）実験あたりプレートの数、 等さらになどのいくつかのマイナーな最適化と他のタンパク質またはドメインに適用することができる、TAP法もすることができ適用されたトン他の細胞株O特異的タンパク質複合体は、それらの機能やユニークな要因との相互作用のための特別なシステムを必要とする場合。トラブルシューティングを容易にするために、非常に入力し、FTサンプルの両方が（ 表2）に保存することをお勧めします。予想されるタンパク質バンドが溶出に視覚化することができない場合、FTサンプルは実験のトラブルシューティング、サンプルが結合および/またはビーズから溶出させたか否かを判定するために使用することができます。 成功したTAPは、タンパク質の発現および回収の高レベルに厳密に依存しています。したがって、研究者は、ケースバイケースで、出発物質の量を最適化しなければなりません。一過性トランスフェクションは、タンパク質成分を発現させるために使用される場合、トランスフェクション効率は、TAPの第二段階に進む前に、少なくとも70％であるべきです。 （エピトープは、2つの餌間で交換されている）の逆数TAP法は、通常、どの実験戦略を決定するのに役立ちます最高の純度と収量を達成するために使用されるべきです。再び、これはケースバイケースで検討されなければなりません。重要なことには、また、相互TAPを行うことPPIを用いるアフィニティータグとは無関係であることを確認します。 本明細書に提示TAP法のいくつかの側面には限界があります。例えば、FLAG-とSTREPタグ付きタンパク質を過剰発現すると、異所的に発現タンパク質自体またはそれらの相互作用の成果物を生成することができます。異なるエピトープタグは、タンパク質発現レベル、タンパク質構造、および/または細胞内局在に影響を与え得ます。細胞株およびトランスフェクション効率の制約に加えて、精製される複合体の大きさが問題になる可能性があります。このTAP法は、マルチサブユニットタンパク質複合体に適しています。我々の経験からは、4つの成分は、銀染色によって検出することができる（データは示さず）。 2-タグ付きコンポーネントを使用している場合しかし、他の相互作用は、共精製された同一の化学量論的なレベルではないかもしれません。そのため、この特定の目的のために、複雑な成分の発現の低いレベルを誘導する細胞株の使用が推奨されます。別の制限は、PPIの強さだろう。相互作用が十分に安定していない場合は、一部のコンポーネントは、（特に最終FLAGのIP段階で）精製工程の間に失われる可能性があります。 TAP法は、以前に記載され、いくつかの異なったエピトープタグは、試験検証、および6を比較しました。しかし、この記事で紹介したTAP法は新規であり、PPIは、複雑なアセンブリを勉強し、タンパク質ネットワーク構成および機能を推測するために、簡単に効率的な、堅牢で、代替戦略を提供します。前のTAP法と比較して、このSTREP-FLAGのTAP戦略は複雑な組成、活性、または機能の予備知識がなくて、さらなる特徴付けのための複合体の迅速な精製を可能にします。及びタンパク質溶出のためのプロテアーゼ切断（ 例えば 、TEV）を必要とせず（WHICHは有意）タンパク質の収率を低下させることができます。が増加するためタンパク質複合体の回復のため、STREP-FLAGのTAP法はまた、タンデム質量分析法10、15を介して細胞内で目的のタンパク質複合体と会合するタンパク質の強固な同定を可能にします。その後、共焦点顕微鏡法、サイズ排除クロマトグラフィー、および共IPアッセイのような他の方法は、また、のPPIを検証するために利用することができます。最後に、我々はTAPプロトコルの代替バージョンは途方もなくRNA生物学の分野で研究者を助ける離散タンパク質-RNA複合体のアセンブリを浄化し、研究するために適合させることができることを提案します。 要約すると、我々は、精製および哺乳動物細胞株でのPPIを特徴付けるための方法を提示します。我々は、このメソッドは将来の特性評価および多くの新規タンパク質複合体の機能解析のための基礎を築くことを提案します。

<html>タンパク質間相互作用（PPIの）生物学的プロセス1の正確な調節のために重要であり、これらのPPIに関するさらなる研究は、それらの機能2をお知らせすることができます。いくつかのアプローチがのPPIの研究と特徴付けのためだけでなく、新たな規制のタンパク質成分のデノボ識別のために考案されています。 1989年、スタンリーフィールズらは、酵母ツーハイブリッド（Y2H）アッセイ3を報告しました 。このアプローチは、 サッカロマイセス・セレビシエの関心の定義されたタンパク質（ベイト）のための相互作用（獲物）の公正かつ包括的な同定を可能にします。 PPIを発見するために著しい有用性に加えて、Y2Hアッセイは、酵母細胞におけるタンパク質の組を特徴付ける最小相互作用ドメインを定義し、そのような相互作用を廃止突然変異を同定するために使用することができます。 Y2Hアッセイを改変することによって、のPPIはまた、哺乳動物細胞において研究することができますクラス= &quot;外部参照&quot;&gt; 4。 Y2Hアッセイ（ 例えば 、酵母スリーハイブリッドシステム）の変動は、細胞内タンパク質、RNAおよびタンパク質-小有機リガンド相互作用を研究するために適用することができます。 相同システムでのPPIを研究するための別の一般的に使用されるツールは、共免疫沈降（共-IP）アッセイ5です。関心対象のタンパク質を免疫沈降するために抗体を使用することにより、共IPアッセイは、研究者が様々な環境条件および実験の状況のた​​めに細胞中でのPPIを監視することを可能にします。親和性精製（AP）メソッド内のエピトープタグ付きタンパク質の使用（ 例えば 、FLAG、Mycを、STREP、およびとりわけHAは、）、銀染色をウェスタンブロットを含むいくつかの下流のアッセイのための複雑なタンパク質混合物からのタンパク質の単離を容易にしました、および酵素的分析。しかしながら、これらの従来のアプローチのいずれも、in vitroでの Aを含む、さらなる特徴付けのためのタンパク質複合体の大量の単離を可能にしませんssays、質量分析による調節サブユニットの発見、および翻訳後修飾の同定。 AP法の改良版は、2後続のAP 6、7を通して精製された2つのエピトープとの融合タンパク質を作成することでのPPIを研究するための精製技術であるタンデムAP（TAP）と呼ばれています。この記事では、二つのサブユニットは、異なるエピトープでタグ付けした後、2回の連続のAP（STREP AP FLAG IPが続く）を通して精製された精製タンパク質複合体のためのTAP方法のバリエーションを提示します。研究者が興味のあるタンパク質複合体に適用できるように、我々はまず、TAPのミニマル概要（ 図1）と、すべての実験工程（ 図2）の詳細な説明を提供します。 TAP法の適用性を実証するために、我々は、PTと呼ばれる（複雑なよく特徴付けサイクリンCDKを選ん調節サブユニット、サイクリンT1（CycT1）及びキナーゼ（CDK9）から構成され、RNAポリメラーゼII（Pol II）8、9、10による転写の調節に関与するEFBキナーゼ）。 P-TEFbはポルIIプロモーターで転写休止を軽減それに関連する負の伸長因子のC末端ドメインをリン酸化し、それによって転写伸長11、12、13を容易にします 。このことを念頭に置い既知の相互作用により、STREPタグ付きCycT1およびFLAGタグCDK9はHEK293T細胞で過剰発現しました。逆数TAP実験をさらにタンパク質相互作用を利用するエピトープとは無関係であることを検証するためにSTREPタグ付きCDK9およびFLAGタグCycT1を用いて行きました。細胞を48時間トランスフェクション後に回収し、溶解しました。可溶性溶解物をTAPにより精製した（STREP APは、FLAGが続きますIP）。入力および精製されたタンパク質は、ウェスタンブロットおよび銀染色（ 図3）によって分析しました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH30022FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP091670049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-478-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STREP-Tactin Superflow</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1208-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STREP-tag elution buffer</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1000-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLBQ1981V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 100mm &#215; 20 mm style Dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Lo-Bind Eppendorf</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-698-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>02-215-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 hole micro tube foam rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labquake shaker rotisserie&#160;</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>415110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tandem affinity purification of protein complexes from eukaryotic cells

活性なタンパク質-タンパク質およびタンパク質-核酸複合体の精製は、酵素活性および新規サブユニットおよび翻訳後修飾の新規同定の特徴付けのために重要です。細菌系は、単一のポリペプチドおよびタンパク質複合体の広範囲の発現および精製を可能にします。しかし、このシステムは、翻訳後修飾を含有タンパク質サブユニット（ 例えば 、リン酸化およびアセチル化）の精製、および唯一の存在である新規な調節サブユニットの識別を可能に/真核生物系で表現されません。ここでは、真核細胞から一過性または安定的に発現エピトープタグ付きタンパク質とタンパク質複合体の精製を容易に小説、堅牢、かつSTREP-を使用して効率的なタンデムアフィニティー精製（TAP）法およびFLAGタグ融合タンパク質の詳細な説明を提供します。このプロトコルはPROTを特徴付けるために適用することができますEIN複雑な機能、複雑なサブユニット上の翻訳後修飾を発見する、および質量分析によって新たな規制の複雑なコンポーネントを識別するために。特に、このTAP法は、このように下流の実験機会の広い配列を得、真核生物または病原性（ウイルス性および細菌性）成分により形成されるタンパク質複合体を研究するために適用することができます。我々は、タンパク質複合体を扱う研究者は、多くの異なる方法で、この方法を利用することができることを提案します。

この記事では、我々は（また、P-TEFbキナーゼとして知られている）は、複雑なよく特徴付けCycT1-CDK9にTAP法の適用性を実証します。 CDK9-FLAG（CDK9：F）、またはCDK9-STREP（CDK9：S）およびサイクリンT1-FLAG（CycT1：F）：サイクリンT1-STREP（S CycT1）をコードするプラスミド（ 表1）は 、HEK293T細胞にトランスフェクトしました。 （ それぞれ図3AおよびB）Fプラスミド：FまたはCycT1：ネガティブコントロールが空のベクター及びCDK9とのトランスフェクションが含まれていました。細胞を回収した前のタンパク質を48時間発現させました。細胞の複数のプレートは、タンパク質産生および回収率を増加させる（サンプルあたり5プレートは、図3に示されるデータのために使用した）実験毎に使用しました。細胞は、個々のマイクロ遠心チューブ内で溶解した後、同じ試料の細胞溶解物は、一microcentrifに合わせましたUGEチューブSTREPビーズを追加する前に。ビーズの一部とタンパク質サンプルを組み合わせて表現することが困難であるタンパク質からのタンパク質の回収率を向上させることができ、最終的なタンパク質濃度を増加させます。最初の溶出後、2回目の溶出は、フラグIPの総タンパク質の入力を増加させるために行うことができます。必要に応じて、将来のトラブルシューティング（ 表2）のためにビーズを添加する前に、各精製工程のために入力を保存することが重要です。 SおよびCDK9：F、ウェスタンブロットによって分析し、図3AのデータがCycT1ためのTAP法の結果を示しています。 CDK9：F CycT1で共溶出：STREPビーズからのSはなく、CycT1を欠く陰性対照APで：S、そのCDK9を示す：FとCycT1：Sは、タンパク質 - タンパク質複合体を形成します。予想通り、両方のタンパク質は、さらに複合体形成を確認したFLAG溶出、検出されました。 図3Bは、RESUを示しています（：SとCycT1：CDK9 F）の逆数のTAP 2つのタンパク質のエピトープタグが交換された方法、のLTS、およびウェスタンブロットによって分析しました。 図3Cおよび3Dは 、それぞれ、銀染色によって分析TAPと相反TAPの結果を示します。 F CycT1と共溶出した：Sを連鎖球菌ビーズの外ではなく、制御AP（レーン1）から、このようCDK9ことを示す：FとCycT1は：Sは、タンパク質-タンパク質複合体を形成し、図3Cのレーン2はCDK9であることを示しました。レーン4、CycT1に示すように、その後のFLAG溶出で：S CDK9で共溶出：F FLAGビーズのオフ。 F CDK9と共溶出：連鎖球菌ビーズの外ではなく、制御APからS、およびタンパク質-タンパク質複合体を効率的に第2のフラグのIP工程後に回収されたことを同様に、 図3Dは 、CycT1を示しました。どちらのウエスタンブロットおよび銀染色は、TAPプロトコルはpurificatioのために効率的に働いていたことを確認しました<html> nは、単離、および目的のタンパク質複合体の特徴付け。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55236/55236fig1.jpg" /> 図1：TAP 精製戦略の概要。 TAPのステップを説明する簡単な仕組み。 STREPまたはFLAGエピトープタグのいずれかを用いて目的のタンパク質をコードするプラスミドを哺乳動物細胞に同時トランスフェクトされます。 48時間の誘導後、細胞を回収し、溶解させます。他のタンパク質と一緒に、目的のタンパク質を含む可溶性細胞溶解物STREP AP用STREPビーズにロードされます。どちらかがSTREPタグを含むか、またはビーズに付着STREPタグ化タンパク質に結合しているタンパク質は、その後、溶出されます。 FLAGビーズは、次いで、連鎖球菌溶出に加えました。どちらかがFLAGタグを含むか、またはビーズに付着FLAG標識タンパク質に結合しているタンパク質は、その後、溶出されます。溶出は、示された方法によって分析することができます。TTP：//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55236/55236fig1large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55236/55236fig2.jpg" /> 図2：TAP戦略の概略図。 TAPの詳細なプロトコル。詳細は本文を参照してください。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55236/55236fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55236/55236fig3.jpg" /> 図3：TAP 精製のステップ・バイ・ステップの解析の例。 （A）TAPのウエスタンブロット分析（CycT1：SとCDK9：F）。 （B）の逆数TAP（CDK9：SとCycT1：F）のウェスタンブロット分析。あちこちメートル、全細胞溶解物の1ミリリットル、5μL（0.2％）は、以下のようにロードされた「STREP AP入力。」残りの全細胞溶解物975μlをSTREP APのための連鎖球菌ビーズに添加し、「STREP AP溶出」100μlを回収しました。このことから、5μL（2％）を充填しました。 「STREP AP溶出」の80μlをFLAG IPのFLAGビーズに加え、「FLAG IP溶出」の30μlを採取しました。 「FLAG IP溶出」を30μlから、7μlの（23.3％）がロードされました。 TAPの（C）銀染色分析（CycT1：SとCDK9：F）。 （D）の逆数TAP（CDK9：SとCycT1：F）の銀染色分析。 「STREP AP溶出」と「FLAG IP溶出」の7μlの（23.3％）を5μl（2％）を装填しました。アスタリスクを共溶出不純物を示しています。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55236/55236fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table fo:keEP-together.withinページ= &quot;1&quot;のfo：キープで-next.within-ページ= &quot;常に&quot;&gt; <tbody><tr><td> タンパク質 </td><td> 残基 </td><td> ベクター </td><td> タグ </td><td> クローニングサイト </td><td> 参照 </td></tr><tr><td> CycT1 </td><td> 1から708 </td><td> pcDNA / 4TO </td><td> STREP </td><td> HindIII -のEcoRI </td><td>マクナマラら。 、2013年10 </td></tr><tr><td> CycT1 </td><td> 1から708 </td><td> pcDNA / 4TO </td><td> FLAG </td><td> HindIII -のEcoRI </td><td>この記事</td></tr><tr><td> CDK9 </td><td> 1から372 </td><td> pcDNA / 4TO </td><td> STREP </td><td> HindIII -のXhoI </td><td>この記事</td></tr><tr><td> CDK9 </td><td> 1から372 </td><td> pcDNA / 4TO </td><td> FLアーゲー</td><td> HindIII -のXhoI </td><td>マクナマラら、2013年10 </td></tr><tr><td> GFP </td><td> 1-238 </td><td> pcDNA / 4TO </td><td> STREP-FLAG </td><td> BamHI - XhoIで </td><td>この記事</td></tr></tbody></table> 表1：本研究で使用したプラスミド。 CycT1とCDK9はをpcDNA / 4TO-STREPとのpcDNA / 4TO-FLAGプラスミドベクターに連結しました。これらの構築物をDH5αコンピテント細胞に形質転換し、LBアンピシリンプレート上にプレーティングしました。コロニーは、選択成長させ、スクリーニングしました。正常ライゲートクローンは、サンガー配列決定および制限消化し、アガロースゲル電気泳動の組み合わせにより確認しました。代わりの完全長（1から726）に富んで最後の18残基はPEST配列が含まれているため（ペプチド配列 - CycT1のために我々は短いバージョン（708 1）を使用しましたタンパク質分解20のためのシグナルペプチドとして機能する、プロリン、グルタミン酸、セリン、及びトレオニン）。 CDK9は、全長でした。次のようにタンデムSTREPタグの順序は次のとおりです。GGGGWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK。次のようにタンデムFLAGタグの順序は次のとおりです。GGGGDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK。 表2：トラブルシューティング表。トラブルシューティングを開始する前に、それぞれの本質的なステップが続いてきたことを確認するダブルチェック。このプロトコルにおけるいくつかのステップは、期待される結果を達成するために他のものより最適化が必要。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55236/Book2.xlsx">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a>

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Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

真核細胞からのタンパク質複合体のタンデムアフィニティー精製

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

tandem-affinity-purification-protein-complexes-from-eukaryotic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

14.8K ビュー.  The University of Texas Southwestern Medical Center. We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

ビデオ: Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

オリゴヌクレオチド指向溶出を用いて細胞から同族RNA-タンパク質複合体の単離

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

生化学

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 の 1: タンパク質・ タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

真核生物 mRNA 蛋白質複合体を回復するオリゴヌクレオチド系タンデム型 RNA の隔離プロシージャ

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the translocon at the outer (TOC) and inner (TIC) chloroplast membranes. The TOC and TIC complexes are multimeric and probably contain yet unknown components. One of the main goals in the field is to establish the complete inventory of TOC and TIC components. For the isolation of TOC-TIC complexes and the identification of new components, the preprotein receptor TOC159 has been modified N-terminally by the addition of the tandem affinity purification (TAP) tag resulting in TAP-TOC159. The TAP-tag is designed for two sequential affinity purification steps (hence "tandem affinity"). The TAP-tag used in these studies consists of a N-terminal IgG-binding domain derived from Staphylococcus aureus Protein A (ProtA) followed by a calmodulin-binding peptide (CBP). Between these two affinity tags, a tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site has been included. Therefore, TEV protease can be used for gentle elution of TOC159-containing complexes after binding to IgG beads. In the protocol presented here, the second Calmodulin-affinity purification step was omitted. The purification protocol starts with the preparation and solubilization of total cellular membranes. After the detergent-treatment, the solubilized membrane proteins are incubated with IgG beads for the immunoisolation of TAP-TOC159-containing complexes. Upon binding and extensive washing, TAP-TOC159 containing complexes are cleaved and released from the IgG beads using the TEV protease whereby the S. aureus IgG-binding domain is removed. Western blotting of the isolated TOC159-containing complexes can be used to confirm the presence of known or suspected TOC and TIC proteins. More importantly, the TOC159-containing complexes have been used successfully to identify new components of the TOC and TIC complexes by mass spectrometry. The protocol that we present potentially allows the efficient isolation of any membrane-bound protein complex to be used for the identification of yet unknown components by mass spectrometry.

We here present a proven and tested protocol for the purification of chloroplast protein import complexes (TOC-TIC complex) using the TAP-tag. The one-step affinity-isolation protocol can potentially be applied to any protein and be used to identify new interaction partners by mass spectrometry.

タップのタグを使用して葉緑体トランスロコン タンパク質複合体の親和性の浄化

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

式、可溶化、および真核生物ホウ酸輸送体の浄化

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis of transcriptome and gene expression by qPCR and RNA sequencing. Comprehensive transcriptome and gene expression analysis of specific cell types in complex tissues and organs will be critical to understand cellular and molecular mechanisms by which genes are regulated and their association with tissue homeostasis and organ functions. In this article, we demonstrate the methodology for isolation of ribosome-bound RNA directly in vivo in the vascular endothelia of animal lungs as an example. The specific materials and procedures for tissue processing and RNA purification will be described, including the assessment of RNA quality and yield as well as real time qPCR for arteriogenic gene assays. This approach, known as translating ribosome affinity purification (TRAP) technique, can be utilized for characterization of gene expression and transcriptome analysis of certain cell types directly in vivo in any specific type in complex tissues.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

We present an approach to purify ribosome-bound mRNA from vascular endothelial cells (ECs) directly in mouse brain, lung and heart tissues via EC-specific genetic tag of enhanced green fluorescence protein (EGFP)in ribosomes in combination with RNA purification.

生体内細胞からのRNA単離に対するリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, as well as interactions with several growth factors and cytokines. Overexpression of specific MMPs is responsible in several diseases such as cancer, neurodegenerative diseases, and cardiovascular disease. MMPs have been the center of attention recently as targets to develop therapeutics that can treat diseases correlated to MMP overexpression.
To study the MMP mechanism in solution, more facile and robust recombinant protein expression and purification methods are needed for the production of active, soluble MMPs. However, the catalytic domain of most MMPs cannot be expressed in Escherichia coli (E. coli) in soluble form due to lack of posttranslational machinery, whereas mammalian expression systems are usually costly and have lower yields. MMP inclusion bodies must undergo the tedious and laborious process of extensive purification and refolding, significantly reducing the yield of MMPs in native conformation. This paper presents a protocol using Rosetta2(DE3)pLysS (hereafter referred to as R2DP) cells to produce matrix metalloproteinase-3 catalytic domain (MMP-3cd), which contains an N-terminal His-tag followed by pro-domain (Hisx6-pro-MMP-3cd) for use in affinity purification. R2DP cells enhance the expression of eukaryotic proteins through a chloramphenicol-resistant plasmid containing codons normally rare in bacterial expression systems. Compared to the traditional cell line of choice for recombinant protein expression, BL21(DE3), purification using this new strain improved the yield of purified Hisx6-pro-MMP-3cd. Upon activation and desalting, the pro domain is cleaved along with the N-terminal His-tag, providing active MMP-3cd for immediate use in countless in vitro applications. This method does not require expensive equipment or complex fusion proteins and describes rapid production of recombinant human MMPs in bacteria.

His-tag purification, dialysis, and activation are employed to increase yields of soluble, active matrix metalloproteinase-3 catalytic domain protein expression in bacteria. Protein fractions are analyzed via SDS-PAGE gels.

アフィニティークロマトグラフィーを用いたヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ-3の細菌発現と精製

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...

Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as oxaloacetate decarboxylase in mitochondria. This article presents a series of methods for the extraction and purification of FAHD1 from swine kidney and mouse liver. Covered methods are ionic exchange chromatography with fast protein liquid chromatography (FPLC), preparative and analytical gel filtration with FPLC, and proteomic approaches. After total protein extraction, ammonium sulfate precipitation and ionic exchange chromatography were explored, and FAHD1 was extracted via a sequential strategy using ionic exchange and size-exclusion chromatography. This representative approach may be adapted to other proteins of interest (expressed at significant levels) and modified for other tissues. Purified protein from tissue may support the development of high-quality antibodies, and/or potent and specific pharmacological inhibitors.

This protocol describes how to extract fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) from swine kidney and mouse liver. The listed methods may be adapted to other proteins of interest and modified for other tissues.