Name: building finite element models to investigate zebrafish jaw biomechanics
Uploaded: 2016-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 11 s
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LHBは、ウェルカム・トラスト動的セルの博士課程のプログラムによって資金を供給されました。 KARは、MRCプロジェクトの助成金によって賄われていたMR / L002566 / 1（EJR及びCLHに授与）とCLHは、我々はまた、イメージング・アドバイスウォルフソンバイオイメージング施設に感謝したいと思いARUKグラント19479.によって賄われていました。

プロトコル内のすべてのステップは、ブリストル大学の動物のケアの福祉ガイドラインや英国内務省のものに従ってください。 筋骨格解剖学の1可視化注：筋肉を定量化するために、筋肉の添付ファイルの正確な配置を識別するために、骨格要素の形状を可視化するために、免疫染色（セクション1.1）（筋肉を明らかにする）骨格筋ミオシンのための適切な年齢で魚やII型コラーゲン（可視化します軟骨）。筋肉の添付ファイル（1.2節）の位置を視覚化するために、GFP 15：軟骨と遅いミオシン重鎖レポーターsmyhcを可視化するためにmCherryを13,14：別の方法として、例えば、コラーゲンa1のレポーターCOL2A1トランスジェニック蛍光レポーターラインを使用して、筋骨格解剖学を視覚化します。 軟骨や筋肉をマーク代替行が等しく十分に仕事ができます。 <ol><li> 蛍光Immunostaining <ol><li> 1時間、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で、過剰の4％パラホルムアルデヒド（PFA）で幼虫を固定します。 0.1％のTween 20（PBT）を含むPBSで洗浄し、それぞれ5分間、PBT中の50％メタノール（MeOH）で100％MeOHに脱水。 注意：PFAは毒性があり、材料安全シートに従って処理する必要があります。 注：必要になるまで幼虫が100％MeOH中に格納することができます。 </li><li> 5分間PBTに50％MeOH中の幼虫を再水和。 5分間PBTで洗浄します。 </li><li> 5-6分間氷上でPBTで0.25％トリプシンで幼虫を透過性。 5分ごとに4倍PBTで洗います。 </li><li> PBTの5％血清中で2-3時間ブロックします。 </li><li>室温でまたは一晩4℃で1時間、PBT中の5％血清中のウサギ抗2型コラーゲンとマウスの推奨希釈抗ミオシン抗体で幼虫をインキュベートします。 注：推奨される希釈範囲は、抗体のデータシートに通常です。互いに異なる種に対して惹起されたとのこともdiffeされている抗体を選択してください組織に借ります。 </li><li> PBTで15分間幼虫の6倍を洗ってください。 </li><li> PBTの5％血清中で1〜2時間ブロックします。 </li><li>暗闇の中で二次抗体でインキュベートします。特定の抗体のための5％血清およびPBT中の適切な希釈で蛍光標識した抗マウス（550）および抗ウサギ（488）二次抗体を使用してください。 </li><li>できるだけ早く10X共焦点顕微鏡上のPBTと画像内の各10分間洗浄6X。 </li></ol></li><li> イメージング筋骨格ジオメトリ <ol><li> Danieauの溶液16中のぬるい0.3から0.5パーセントの低融点（LMP）アガロース中のカバースリップ上で腹側幼虫をマウントします。 注：トランスジェニック魚は、装着前と撮像中に0.02％MS222（トリカインメタンスルホン酸、pHが7）で鎮静される必要があります。 </li><li> 10倍対物レンズと、約2.5倍デジタルズームを使用して、関心領域の共焦点画像スタックしてください。 488 nmおよび561のnを使用して、緑と赤チャンネルの画像を用意mはそれぞれレーザーです。 1.3ミクロンと3ライン平均値のZ面の間の間隔が512×512ピクセルの解像度での画像。結果のスタックは約100 zのスライスで構成されます。 </li><li> tiffのシリーズとしてデータをエクスポートします。 5dpfゼブラフィッシュ幼虫から筋肉および軟骨の要素の最大投影は、図1に示されています。 </li></ol></li></ol> 2. 3Dサーフェスの生成<ol style="margin-left: 40px;"><li> 3、4、5、DPFの各時点での代表的なデータセットを選択してください（複数のサンプルの可視化の後に選択します）。 </li><li> 3次元tiffのスタックを開き、解析ソフトウェアのすべてのチャネルを選択します。右軟骨チャンネルをクリックして、画像フィルタと平滑化を選択：ガウス（ 図2B）。 </li><li>プロジェクトビューで右フィルタ処理された画像を上にクリックして、「画像分割」を選択し、「新しいラベルを編集します」。各材料、 すなわち、軟骨とjのための新しいラベルを作成します。OINT。魔法の杖ツールを使って画像の軟骨領域（ 図2C、白信号、紫色のアウトライン）を選択します。アウトラインからノイズを除去するブラシツールを使用してください。 注：魔法の杖ツールを使用している場合、「すべてのスライス」をクリックします。 </li><li>ブラシツールと共同で地域を選択して、関節構成要素に割り当てる（ 図2C、青のアウトライン） </li><li>トップメニューと滑らかなラベルでセグメンテーションを選択することにより、一度に滑らかな複数のスライス。右の画像をクリックして、3D表面は、コンポーネント（ 図2D）のレンダリング生成するために表面を生成する]を選択します。 </li><li>面をクリックして、メッシュ生成ソフトにインポートするhmasciiファイルとしてデータを保存します。 </li></ol> 3. FEモデルで使用される筋力の計算<ol style="margin-left: 40px;"><li> smyhcの共焦点画像からの筋線維の数を数える：GFPトランスジェニックゼブラフィッシュ（ 図1A、矢じり、1C）とDIAMを測定繊維の計は、その断面積を計算する（πR2）。 </li><li>文献からの筋肉単位面積あたりの適切な力を識別します。幼生ゼブラフィッシュ骨格筋（40 nNの個/μm2）の単位面積当たりに発生最大筋力17を使用しました。 </li><li>単位面積当たりの力によって繊維の数とその面積を乗じて各解剖学的筋肉群のための力を計算します。 表1を参照してください。 </li></ol> 4.メッシュの生成<ol style="margin-left: 40px;"><li>有限要素メッシュを生成することができるソフトウェアパッケージにセクション2（上記）で生成された3Dモデルをインポートします。 </li><li> 2Dメニューのシュリンクラップ・ツールを使用して、軟骨および接合面のA2Dメッシュを生成します。適切な要素サイズを選択します。 注：1.5から2.5の間の要素サイズを使用します。必要に応じて、異なるサイズの2次元面の範囲を生成する3次元メッシュ最適化（セクション4を行うことが噛合しています。4）。 </li><li> &#39;&gt; 2D&gt;ツール要素チェック]の下にあるメッシュ品質チェックを行うメッシュ内の重複した要素、挿入および貫通をチェックするためのパネルを。モデルツリーでユーティリティ]タブを使用して二面角を修正しました。 </li><li> 3D&gt; tetrameshをサブパネルを使用して、要素の大きさの異なる2次元表面メッシュから3Dメッシュを生成します。 注：異なるメッシュサイズの結果を比較し、さらにシミュレーション後に収束し、機能の定義を損なわない最低のメッシュサイズでFEモデルを選択します。 図3の例では、下顎軟骨のための150万四面体要素が含まれており、2.0の2D要素サイズを有していました。 </li><li>顎モデルはジオメトリ&gt;距離のサブパネルを用いた共焦点スタックごとにスケールすることですので、メッシュを変換します。 注：軟骨を確認して、関節構成要素がマージされたモデルをエクスポートすることにより、またはタイを使用してモデルに接続されています。 </li></ol> 5.有限要素のModエル建設<ol><li>商業有限要素（FE）ソフトウェアを使用して、FEモデルを作成します。ガイドとしてセクション1で生成された共焦点スタックをラベルされた3Dの筋肉や軟骨を使用して、筋肉の付着点に対応するノードを割り当てます。各筋肉（ 図3）の起源と挿入を表す2つのノード間のベクトルを作成します。 </li><li>各筋肉のための &#39;C・ロード」を適用するタイプの歴史」のロードコレクタを作成します。 （ステップ3.3で計算）ニュートンで大きさを指定し、関連するベクトルを割り当てる。 図3は、内転下顎（AM）、分度器hyoideus（PH）とintermandibularis（IM）のための接続点を示しています。 注：これらの顎の筋肉の場合、最大の収縮力は、各負荷の50％のみが、各サイトで適用されるように、原点と挿入の間に分配されます。 </li><li>文献によって決定されるような適切な弾性等方性材料特性を割り当てます。軟骨のためのヤング率このモデルではゾーン間はそれぞれ1.1 MPaの0.25 MPaであったとポアソン比は両方18,19のために0.25でした。 </li><li>モデルの初期の制約を適用するタイプ &#39;境界」のロードコレクタを作成します。タブの分析&gt;制約に移動して、作成サブパネルで、あなたが制約したいモデル上のノードを選択します。その動きの自然な範囲の最良の近似にモデルの動きを制限する自由（DOF）の度を選択します。 注： 図3のモデルは、動きの全ての軸に拘束したモデルでとで中間点に空間にそれを固定する舌骨角の時（DOF 1、2、3はそれぞれx、yおよびzを表します） palatoquadrateはゼブラフィッシュ頭蓋の残りの部分に接続する時点でy及びz軸（ 図3、 表1）。モデルは、1つ以上のノードにすべての3つの自由度に制限される必要があります。 </li><li>あなたはサイマルしたい運動の種類ごとに、「ロード・ステップ」を作成します。分析メニューの下で、（ すなわち、開口部、閉鎖を）食べて、この動きをシミュレートするために、（5.4節で行われた）と制約（セクション5.2で行われた）関連するすべての負荷を選択します。それが表示されたら、ドロップダウンメニューから「静的」を選択します。 </li><li>この場合には、メッシュ、荷重、拘束と適切なファイル形式の材料特性などの輸出モデル、「.INP」形式。 </li><li> FE解析ソフトウェアへの負荷モデル。ジョブモジュールを使用して、モデルの仕事を作成し、実行します。 </li><li>結果タブと可視化メニューにあるなど 、応力、ひずみ、変位、のための出力を分析した （ 図4および5）。 </li></ol>顎変形/変位距離の6検証<ol><li>トランスジェニックゼブラフィッシュ：3-6のTg（mCherryをCol2a1aBAC）を選択します 。 </li><li>彼らは触れることなく、彼らの心はまだ鼓動している回答するのをやめるまで軽く0.02％MS222との幼虫をanaesthetize。 </li><li>マウント横方向にぬるい1％LMPアガロースでカバースリップ上（麻酔をかけながら）（Danieauの溶液中に作られた）の幼虫。 </li><li>鉗子で頭とあごの周りからアガロースを削除してください。 </li><li>通常の口の動きが再開されるまで、パスツールピペットを使用して麻酔を除去するために、幼虫の頭の上（無MS222付き）新鮮Danieauのソリューションをフラッシュします。 </li><li>口の動きの明視野高速ビデオを撮影する動画キャプチャソフトウェアを使用してください。最も高いフレームレートで1分の持続時間の周りの映画を撮る、または十分な顎の開口部の複数のサイクルを記録します。 </li><li>その最大変位にオープンジョーを表示するフレームを選択してください。 μm単位でメッケル軟骨および上顎（篩骨プレートの先端）の前部先端との間の距離を測定します。 </li><li>複数の稚魚からの平均変位を計算します。 </li><li>モデルから変位データを抽出します。 （モデル変位の挙動を確認するために、6.8で算出した平均変位を使用します<stronグラム&gt;図4）。モデルが予想から外れる場合は、順次材料特性と筋肉の負荷を変化させることによって、感度分析を実行します。 </li></ol>

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	<li>Rayfield, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finite+Element+Analysis+and+Understanding+the+Biomechanics+and+Evolution+of+Living+and+Fossil+Organisms.">Finite Element Analysis and Understanding the Biomechanics and Evolution of Living and Fossil Organisms.</a> Annu. Rev. Earth Planet. Sci. 35, 541-576 (2007).</li><li>Rao, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Finite Element Method in Engineering: Fifth Edition. , (2010).</li><li>Taylor, M., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+decades+of+finite+element+analysis+of+orthopaedic+devices:+Where+are+we+now+and+what+are+the+opportunities.">Four decades of finite element analysis of orthopaedic devices: Where are we now and what are the opportunities.</a> J Biomech. 48, 767-778 (2015).</li><li>Button, D. J., Rayfield, E. J., Barrett, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+biomechanics+underpins+high+sauropod+diversity+in+resource-poor+environments.">Cranial biomechanics underpins high sauropod diversity in resource-poor environments.</a> Proc Royal Soc London B: Biol Sci. 281. 281, (2014).</li><li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+developmental+control.">Mechanobiology and developmental control.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 27-61 (2013).</li><li>Shwartz, Y., Farkas, Z., Stern, T., Aszodi, A., Zelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+contraction+controls+skeletal+morphogenesis+through+regulation+of+chondrocyte+convergent+extension.">Muscle contraction controls skeletal morphogenesis through regulation of chondrocyte convergent extension.</a> Dev biol. 370, 154-163 (2012).</li><li>Rolfe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mechanosensitive+genes+during+skeletal+development:+alteration+of+genes+associated+with+cytoskeletal+rearrangement+and+cell+signalling+pathways.">Identification of mechanosensitive genes during skeletal development: alteration of genes associated with cytoskeletal rearrangement and cell signalling pathways.</a> BMC genomics. 15, 48 (2014).</li><li>Roddy, K. A., Kelly, G. M., van Es, M. H., Murphy, P., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+patterns+of+mechanical+stimulation+co-localise+with+growth+and+cell+proliferation+during+morphogenesis+in+the+avian+embryonic+knee+joint.">Dynamic patterns of mechanical stimulation co-localise with growth and cell proliferation during morphogenesis in the avian embryonic knee joint.</a> J Biomech. 44, 143-149 (2011).</li><li>Haudenschild, D. R., Chen, J., Steklov, N., Lotz, M. K., D'Lima, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+chondrocyte+actin+cytoskeleton+in+living+three-dimensional+culture:+response+to+anabolic+and+catabolic+stimuli.">Characterization of the chondrocyte actin cytoskeleton in living three-dimensional culture: response to anabolic and catabolic stimuli.</a> Mol cell biomech. 6, 135-144 (2009).</li><li>Nowlan, N. C., Murphy, P., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+pattern+of+mechanical+stimulation+promotes+ossification+in+avian+embryonic+long+bones.">A dynamic pattern of mechanical stimulation promotes ossification in avian embryonic long bones.</a> J Biomech. 41, 249-258 (2008).</li><li>Giorgi, M., Carriero, A., Shefelbine, S. J., Nowlan, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiological+simulations+of+prenatal+joint+morphogenesis.">Mechanobiological simulations of prenatal joint morphogenesis.</a> J Biomech. 47, 989-995 (2014).</li><li>Heegaard, J. H., Beaupre, G. S., Carter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+modulated+cartilage+growth+may+regulate+joint+surface+morphogenesis.">Mechanically modulated cartilage growth may regulate joint surface morphogenesis.</a> J Ortho Res. 17, 509-517 (1999).</li><li>Hammond, C. L., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+populations+of+endochondral+osteoblasts+with+differential+sensitivity+to+Hedgehog+signalling.">Two populations of endochondral osteoblasts with differential sensitivity to Hedgehog signalling.</a> Development. 136, 3991-4000 (2009).</li><li>Mitchell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish.">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarth Res Soc. 21, 269-278 (2013).</li><li>Elworthy, S., Hargrave, M., Knight, R., Mebus, K., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+multiple+slow+myosin+heavy+chain+genes+reveals+a+diversity+of+zebrafish+slow+twitch+muscle+fibres+with+differing+requirements+for+Hedgehog+and+Prdm1+activity.">Expression of multiple slow myosin heavy chain genes reveals a diversity of zebrafish slow twitch muscle fibres with differing requirements for Hedgehog and Prdm1 activity.</a> Development. 135, 2115-2126 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danieau's+solution+(30&#215;).">Danieau's solution (30&#215;).</a> Cold Spring Harb Prot. , (2011).</li><li>Iorga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+function+of+myofibrils+isolated+from+skeletal+and+cardiac+muscles+of+the+zebrafish.">Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish.</a> J Gen physiol. 137, 255-270 (2011).</li><li>Tanck, E., Blankevoort, L., Haaijman, A., Burger, E. H., Huiskes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+muscular+activity+on+local+mineralization+patterns+in+metatarsals+of+the+embryonic+mouse.">Influence of muscular activity on local mineralization patterns in metatarsals of the embryonic mouse.</a> J Ortho Res. 18, 613-619 (2000).</li><li>Tanck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+consequences+of+mineralization+in+embryonic+bone.">The mechanical consequences of mineralization in embryonic bone.</a> Bone. 35, 186-190 (2004).</li><li>Brunt, L. H., Norton, J. L., Bright, J. A., Rayfield, E. J., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finite+element+modelling+predicts+changes+in+joint+shape+and+cell+behaviour+due+to+loss+of+muscle+strain+in+jaw+development.">Finite element modelling predicts changes in joint shape and cell behaviour due to loss of muscle strain in jaw development.</a> J Biomech. 48, 3112-3122 (2015).</li><li>Roddy, K. A., Prendergast, P. J., Murphy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+influences+on+morphogenesis+of+the+knee+joint+revealed+through+morphological,+molecular+and+computational+analysis+of+immobilised+embryos.">Mechanical influences on morphogenesis of the knee joint revealed through morphological, molecular and computational analysis of immobilised embryos.</a> PloS one. 6, e17526 (2011).</li><li>Cuff, A. R., Bright, J. A., Rayfield, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+experiments+on+finite+element+models+of+an+ostrich+(Struthio+camelus)+cranium.">Validation experiments on finite element models of an ostrich (Struthio camelus) cranium.</a> Peer J. 3, 1294 (2015).</li><li>Schilling, T. F., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Musculoskeletal+patterning+in+the+pharyngeal+segments+of+the+zebrafish+embryo.">Musculoskeletal patterning in the pharyngeal segments of the zebrafish embryo.</a> Development. 124, 2945-2960 (1997).</li><li>Dowthwaite, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+underlying+the+movement+requirement+for+synovial+joint+cavitation.">A mechanism underlying the movement requirement for synovial joint cavitation.</a> Matrix biol. 22, 311-322 (2003).</li><li>Nia, H. T., Han, L., Li, Y., Ortiz, C., Grodzinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poroelasticity+of+cartilage+at+the+nanoscale.">Poroelasticity of cartilage at the nanoscale.</a> Biophys J. 101, 2304-2313 (2011).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。 図3-5のいくつかのデータはJ.Biomech、48（12）、ブラントらから再版された、有限要素モデリングが原因で顎の開発、3112から22で筋肉の緊張の損失に接合形状と細胞の挙動の変化を予測します。 2015年、エルゼビア15からの許可を得て。

有限要素モデルは、骨形成10を受けるものと緊張下にある骨格要素の領域を関連付けるために、ならびに軟骨内骨化や関節の形態形成8,12,21時のひずみの下の領域をマッピングするために使用されてきました。他の研究はまた、共同開発11,12の間に変更を複製するための理論的な成長モデルを適用することができました。ここでは、比較的単純なシステム、ゼブラフィッシュ顎20のためのFEモデルを構築するためのプロトコルを示します。複数の組織を研究するために、このようなCTスキャン22、トランスジェニック系統の共焦点イメージングまたは免疫染色ゼブラフィッシュなどのFEモデルのための生の画像を収集する別の方法とは異なりできます。それは、したがって、軟骨に関連する筋肉の接続点に直接情報を提供することができます。脊椎動物のモデルの中ではゼブラフィッシュは、遺伝的および薬理学的操作に特に適しています。ゼブラフィッシュのためのFEモデルの生成頭蓋顔面の軟骨は現在、関節の形態形成におけるバイオメカニクスと遺伝学の間の相互作用のさらなる研究の可能性を開きます。 FEモデルを作成するプロセスの重要なステップの数があります。まず、システムの正確な三次元表現を生成しています。これは明らかに境界を定義するために十分な高解像度で撮影する必要があります。でも、高分解能イメージングとの良好な一面は、いくつかの領域を平滑化する必要があるかもしれ作ることに注意してください。もう一つの重要なステップは、負荷と正しい制約の正しい配置を定義しています。不十分な制約モデルは、解決に失敗し、負荷の不正確な配置は、異常な動きの原因となります。 生データから生成された表面（ 図2B）をメッシュすることが困難であるように、生データのいくつかの処理（ 図2）が必要です。我々は、ガウスフィルタを使用してデータ（ 図2Cを濾過しました</strong&gt;）、我々は3D表面に変換することができるきれいなアウトラインのセットを生成するために、曲線のいくつかの手動の平滑化を行いました。あまりにも多くの平滑化は、その機能の多くを失った「溶融」表面を生成することができます。小さすぎる要素サイズを選択すると、計算集約的である大きすぎるメッシュを作成するように正しい要素サイズを選択すると、反復的なプロセスです。しかし、あまりにも大きな要素サイズを選択すると、構造の正確な形状を再現するために失敗したメッシュを生成します。正しいメッシュは顎の正確な形状を捕獲し、正解に収束、顎の変位を用いて検証最小の要素サイズを有していました。また、異なる年齢及び種は実質的に異なる特性を有するように、より良い正確な変位をエミュレートするために、材料特性や負荷の計算を変更する必要があるかもしれません。 常に仮説モデルであり、aには限界があることを覚えておくことが重要ですssumptionsはFEモデルを実行するために作られました。 1つまたは少数のサンプルをモデル化する際には、個人間の小さな変動である可能性があるように代表的なサンプルが選択されることを確実にするために重要です。唯一の顎要素と筋肉の一部が含まれていたように、モデルは、ゼブラフィッシュ頭蓋顔面筋骨格系の簡易版です。そのため、制約は、モデル化された顎要素が頭蓋骨の残りの部分と接続する場所を考慮して配置されるように持っていたモデルは、人工的に「スペース」でそれを修正するために中央に拘束されました。この人工的な制約は、それ自体が分析されていなかった舌骨角のようなモデルから引き出された解釈に影響を与えませんでした。頭蓋顔面構造のより多くを含めることは、そのようなsternohyals及びその添付軟骨23、として特に他方のジョー開く筋肉がモデルに追加されたかもしれないが、制限は、有限要素ソフトウェアで実行する大きなモデルの機能が含まれています。 S = &quot;jove_contentは&quot;&gt;別の制限は、これは、ばね8を挿入することによって達成することができるものの、我々は、靭帯の挿入をモデル化していないことです。この場合には作られたもう一つの仮定は、モデルが直線的に振る舞うというものでした。モデルの株の大きさは、発行されたモデルのものと同等であったと株が3500を下回ると制約と筋肉の付着点から離れ-5000μɛの上にあることで、in vitroでの細胞10,24に適用されます。したがって、モデルの関連領域での株は線形モデルの許容範囲内にあると考えられました。軟骨は、線形材料として完全に動作しないと、以前のモデル25内の流体挙動の分析を可能に多孔質弾性材料としてモデル化されています。ローカルノードのクラスタ間で筋肉の付着点を拡散することは、ピーク力を分配し、より正確に特定の筋肉のための筋肉の挿入を表すことになります。 ENT &quot;&gt; FEの使用は、構造に作用するひずみと応力の評価を可能にする。それは頻繁に整形外科、古生物学、より最近では発生生物学を含む多くの生物科学分野で用いられている技術として。ここでは、ゼブラフィッシュのためのFEを構築する方法について説明します下顎。将来的にはこれらのモデルは、口蓋を含め、全体の顎を見て拡張することができる。同様の技術は、現在までにほとんどが動によって研究されてきた魚で脊椎の生体力学をモデル化するために使用することができます。

有限要素（FE）モデリングは、計算構造体1に作用するひずみの大きさと位置を計算し、マッピングすることができ工学的手法です。このモデルは、「有限要素」のメッシュで表される立体構造で構成され、分析の最終結果は、メッシュ、機械の大きさや位置の要素の構造及び数を含む多くの因子によって支配されます負荷や材料特性。材料特性は、負荷の与えられたタイプの下で、材料の挙動の特定の側面を説明します。試料を延伸したときポアソン比は、その長さの材料の幅の比例的減少を説明しながら、ヤング率（E）は、材料の弾性を記述する。 FEモデルは、「アカウントに構造に関する固有の入力データを取ることによって、モデルに作用する変位、応力、圧力、歪みなどの変数のさまざまを計算することができます; sの形状、位置、および負荷の大きさと特定の材料特性。 FEモデルは、広く工学2にますます3整形外科及び古生物学アプリケーション4のために使用されます。開発中の生体力学的力は、細胞応答5-8を活性化する多くの細胞における刺激として作用することが知られており、臓器システムを開発中での相対的な位置および機械的刺激の大きさの両方を予測するために有用であるが、現在、FEモデルはほとんど使用されていますゼブラフィッシュの開発のため。 軟骨および骨の両方が機械受容性材料であることが示されています。例えば、 インビトロでの圧縮は、張力が骨形成9のために必要であることが示されている一方で、軟骨形成経路を活性化することが見出されています。 FE解析（FEA）は、foの骨の間に骨格要素に作用するものを含め、生物試料に作用する菌株をモデル化するために利用されてきましたrmation 10。他の開発アプリケーションは、それが理論的な生体力学的な力11,12にさらされた後の関節の形状を予測するとひよこ膝関節の形態形成8の間に存在する株のパターンを表示するために、その使用を含みます。 このプロトコルは、開発組織の力学を理解することを視野に入れて共焦点画像から3次元サーフェス、メッシュおよび有限要素モデルを生成するの経験を共有することを目的としています。我々はまた、 生体内での実関節変位情報を取り込むのにFEモデルを検証する方法を示しています。我々は模範としてゼブラフィッシュ顎を使用しながら、同じ技術は筋骨格系の構造の3次元情報を、共焦点又は多光子イメージングにより得ることができるため、任意の小さな生物学的システムで使用することができます。

<table><tbody><tr><td>Coll2</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td>Type II collagen antibody - stains all cartilage</td></tr><tr><td>A4.1025 / MF20</td><td>Developmental studies hybridoma bank</td><td>A4.1025</td><td>Skeletal mysoin antibody - marks all skeletal muscle&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A9414-5G</td><td>For mounting zebrafish</td></tr><tr><td>MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate )</td><td>Sigma</td><td>E10521-10G</td><td>To make anesthetic</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Fisher</td><td>T/3760/48</td><td>sample permeablilisation</td></tr><tr><td>Dylight 488 Mouse IgG</td><td>Thermofisher</td><td>35502</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>Dylight 550 Rabbit IgG</td><td>Thermofisher&amp;nbsp;</td><td>84541</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>SP8/SP5 or SPE confocal</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td>For imaging&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LAS Leica capture software</td><td>Leica</td><td></td><td>Imaging software</td></tr><tr><td>Aviso (version 7.0.0)</td><td>FEI Visualization Science Group</td><td></td><td>3D image analysis software (Section 2)</td></tr><tr><td>Hypermesh part of the Hyperworks package (version 10)</td><td>Altair Engineering</td><td></td><td>FE model generating software (Section 4-5)</td></tr><tr><td>Abaqus (version 6.14)</td><td>SIMULIA</td><td></td><td>FE analysis software (Section 5.7-5.8)</td></tr></tbody></table>

building finite element models to investigate zebrafish jaw biomechanics

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical strain. Skeletal joints are subjected to dynamic mechanical loading. Finite element analysis (FEA) is a computational method, frequently used in engineering that can predict how a material or structure will respond to mechanical input. By dividing a whole system (in this case the zebrafish jaw skeleton) into a mesh of smaller 'finite elements', FEA can be used to calculate the mechanical response of the structure to external loads. The results can be visualized in many ways including as a 'heat map' showing the position of maximum and minimum principal strains (a positive principal strain indicates tension while a negative indicates compression. The maximum and minimum refer the largest and smallest strain). These can be used to identify which regions of the jaw and therefore which cells are likely to be under particularly high tensional or compressional loads during jaw movement and can therefore be used to identify relationships between mechanical strain and cell behavior. This protocol describes the steps to generate Finite Element models from confocal image data on the musculoskeletal system, using the zebrafish lower jaw as a practical example. The protocol leads the reader through a series of steps: 1) staining of the musculoskeletal components, 2) imaging the musculoskeletal components, 3) building a 3 dimensional (3D) surface, 4) generating a mesh of Finite Elements, 5) solving the FEA and finally 6) validating the results by comparison to real displacements seen in movements of the fish jaw.

筋肉（ 図1A）および軟骨（ 図1B）、またはトランスジェニックレポーター（ 図1C）のイメージングのための免疫染色は、顎の3D構造は、関連する筋肉組織とともに、可視化することを可能にします。高解像度で画像化することにより、顎の三次元形状（ 図2）と位置と負荷の配置（ 図3）の両方を捕捉するモデルを構築することが可能でした。高速ビデオキャプチャを通して見たin vivoでの変位（ 図4） に活用し、我々は、モデルの動きの範囲が現実的な範囲内であったことを確認しました。 実行するとFEモデルは、このような応力（ 図5A）、最小および最大主ひずみ（ - K 図5B）のようなデータの範囲を表示するために使用することができます。これらの結果は、3次元のあります<html> 5I、5I &#39;、&#39; &#39;、5E&#39;（図5E関連するビュー（ 図5F、5G、5J、5K） を得るために回転させ、デジタル切片（ 図 5E、5I）モデルは、細部の微細パターンを見るために拡大することができますので、ensional &#39;&#39;）を表示する方法を説明したモデルを通じて、応力、ひずみや圧力変化のパターン。モデル（図示せず）からの定量的データを抽出することも可能です。モデルを検証し、最も正確な材料特性を使用することにより、負荷および形状をメッシュFEモデルの開発の窓の間に細胞によって経験される機械的な環境の最良の推定値を探索するために使用することができます。モデルの結果は、直接細胞挙動と遺伝子発現の20の変化と比較することができます。 <html> 1再 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 54811 / 54811fig1.jpg &quot;/&gt; 図1：5 DPFでのゼブラフィッシュ下顎の筋骨格系の要素の代表的な画像 5dpf幼虫の下顎の代表的な共焦点スタックは、すべてのすべての骨格筋ミオシンを染色A4.1025の免疫染色トップに前方（A）（B）で示しますトランスジェニック記者のCOL2A1を表現するライブ幼虫からすべての軟骨（C）スタックをマークII型コラーゲンの免疫染色：GFP遅筋（緑）：mCherryを軟骨（赤）とsmyhcをマーク。 IA：intermandibularis前部、PH：分度器hyoideus、AM：転下顎、HI：hyoideus HI、劣っ：hyoideus優れ、CH：胸骨舌骨筋、MC：メッケル軟骨、PQ：Palatoquadrate、CH：舌骨角のは、 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54811/54811fig1large.jpg" target="_blank">拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の。</a> 「FO：キープtogether.withinページ= &quot;1&quot;&gt; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig2.jpg" /> 図2： 共焦点データから3D表面の世代接合部の高倍率とゼブラフィッシュ下顎のための3D表面への共焦点データから遷移を示す画像。 （A）生共焦点データ。ガウシアンフィルタの適用後（B）データセット。 （C）フィルタ処理概要; （D）3D表面が。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54811/54811fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig3.jpg" /> 図3： 制約と力のベクトルを示す代表的メッシュ （A）、口閉鎖と5 DPFの幼虫のための代表的なメッシュ。（B）口の開口部。白丸は、モデルが制約された場所を表し、ここでの寸法（ 例えば、XおよびYまたはX、YおよびZ）。白い線が白い矢印で示される筋力のベクターを用いて、筋肉の位置を示します。レッドは、軟骨やイエローゾーン間を示します。この図は、以前ブラントら 15に発表された補足資料から変更されている。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54811/54811fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig4.jpg" /> 図4： 感度試験 FE-モデルが異なる軟骨およびゾーン間のヤング率のため5dpfゼブラフィッシュで顎変位をシミュレートします。 （ミクロンで閉じに開放）顎変位が顎にマークされています。カラーキーを使用して記録しました。各モデル（- L）が異なる軟骨の組み合わせ（C = 1.1、3.1、または6.1メガパスカル）またはゾーン間（0.25、0.5、0.75、または1 MPaでのI =）特性を有しています。 、すなわち 、水平方向の黒い矢印が（黒い縦の矢印で示す）メッケル軟骨の先端に顎変位の値を強調しています。5のビデオからMとNの静止画幼虫示す最小DPF、すなわち、顎は（M）を閉鎖し、最大重ね合わせた2（O）と（N）は、完全にオープンジョー- O上の白い線は（43ミクロンの）変位を表します。この場合、0.25（A）ベストマッチのゾーン間で1.1の相対的な軟骨特性活魚（O）で見られる変位。 ALこの図のパネルは、以前ブラントら 15で公開されている。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54811/54811fig4large.jpg" target="_blank">より大きな輸出自主規制を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>この図のイオン。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig5.jpg" /> 図5：FEモデルからの代表的なデータ 5 DPFの幼虫に適用されるすべての筋肉のFE-モデルシミュレーション（A - C）。 （A）ミーゼス（EMaxmin）（B）最小主ひずみ（E最小P、μɛ）（C）最大主歪（Eマックス。P.、μɛ）。顎の開口部の間の最大値と最小主ひずみのFE-モデルシミュレーション。 （D - K）：最大主歪（EマックスP.、μɛ）（D）腹側顎図、（E）腹側ジョイントビュー（E）内はメッケル軟骨を通して近位-遠位セクションの位置を示しジョイントとゾーン間（E &#39;）及び（E&#39; &#39;）において、それぞれ。 （F）：横顎ビュー。 （G）：横方向の関節ビュー。 （H - K）：最小主ひずみ（EミンP、μɛ。）中の（H）腹側顎図、（I）腹側ジョイントビュー。 （ 私は ）メッケル軟骨ジョイントを介して近位-遠位セクションの位置を示しており、（I &#39;）および（I&#39; &#39;）は、それぞれ（J）でのゾーン間：横顎ビューを。 （K）：横方向の関節ビュー。この図は、以前ブラントらに掲載されました。15。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54811/54811fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td>筋線維の数</td><td>筋線維面積（ 平方 μm） </td><td>筋肉群の面積（μmで2） </td><td>力（N） </td></tr><tr><td> 5 DPF intermandibularis前方</td><td> 5 </td><td> 23.8 </td><td> 119 </td><td> 4.76e-6 </td></tr><tr><td> 5 DPF分度器hyoideus </td><td> 6 </td><td> 23.8 </td><td> 142.8 </td><td> 5.71e-6 </td></tr><tr><td> 5 DPF内転筋下顎</td><td> 9 </td><td> 23.8 </td><td> 214.2 </td><td> 8.57e-6 </td></tr></tbody></table> 表1： 筋肉の定量化。40 nNの個/μm2（参照17から採取された単位面積あたりの値）を使用して、DPF 5でIntermandibularis前部、転下顎と分度器Hyoideusの平均筋力を計算。 （Lorga ら 、2011）（n = 3）でした。

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ゼブラフィッシュの顎の生体力学を調査するための有限要素モデルの構築 |発生生物学 |ビデオ

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw.

ゼブラフィッシュジョーバイオメカニクスを調査するために有限要素モデルの構築

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

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9.2K ビュー.  University of Bristol. Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw. 

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Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

ゼブラフィッシュ胚におけるマイクロビーズの移植

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

発生生物学

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

薬物治療と<em&gt;インビボ</em&gt;メダカ骨粗鬆症モデルにおける骨芽細胞破骨細胞の相互作用のイメージング

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be difficult to study, and can lead to confounding results. The protocol described here is a straightforward breeding paradigm to increase and decrease penetrance in lethal zebrafish skeletal mutants. Because lethal mutants cannot be selectively bred directly, the classic selective breeding strategy of progeny testing is employed. This method also includes protocols for Kompetitive Allele Specific PCR (KASP) genotyping zebrafish and staining larval zebrafish cartilage and bone. Applying the husbandry strategy described here can increase the penetrance of an interesting skeletal phenotype enabling more reproducible results in downstream applications. In addition, decreasing the mutant penetrance through this selective breeding strategy can reveal the developmental processes that most crucially require the function of the mutated gene. While the skeleton is specifically considered here, we propose that this methodology will be useful for all zebrafish mutant lines.

The goal of this protocol is to alter the penetrance of lethal skeletal mutant phenotypes in zebrafish by selective breeding. Lethal mutants cannot be grown to adulthood and bred themselves, therefore this protocol describes a method for tracking and selecting penetrance through multiple generations by progeny testing.

テストの子孫によるゼブラフィッシュ致死の骨格変異の浸透度をシフト

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

骨組織の再生にプレドニゾロンの効果を研究する大人のゼブラフィッシュ傷害モデル

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians. The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal pair and a longer maxillary pair. Barbel tissue contains cells of ectodermal, mesodermal and neural crest origin, including skin cells, glands, taste buds, melanocytes, circulatory vessels and sensory nerves. Unlike most adult tissue, the maxillary barbel is optically clear, allowing us to visualize the development and maintenance of these tissue types throughout the life cycle. 
This video shows early development of the maxillary barbel (beginning approximately one month post-fertilization) and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration in the adult appendage (&gt;3 months post-fertilization). Briefly, the left maxillary barbel of an anesthetized fish is elevated with sterile forceps just distal to the caudal edge of the maxilla. A fine, sterile spring scissors is positioned against the forceps to cut the barbel shaft at this level, establishing an anatomical landmark for the amputation plane. Regenerative growth can be measured with respect to this plane, and in comparison to the contralateral barbel. Barbel tissue regenerates rapidly, reaching maximal regrowth within 2 weeks of injury.
Techniques for analyzing the regenerated barbel include dissecting and embedding matched pairs of barbels (regenerate and control) in the wells of a standard DNA electrophoresis gel. Embedded specimens are conveniently photographed under a stereomicroscope for gross morphology and morphometry, and can be stored for weeks prior to downstream applications such as paraffin histology, cryosectioning, and/or whole mount immunohistochemistry. These methods establish the maxillary barbel as a novel in vivo tissue system for studying the regenerative capacity of multiple cell types within the genetic context of zebrafish.

The zebrafish maxillary barbel is an integumentary sense organ containing ectodermal, mesodermal and neural crest derivatives. Importantly, the adult barbel can regenerate after proximal amputation. This video introduces maxillary barbel development and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration, followed by collection, embedding and downstream imaging of barbel specimens.

ゼブラフィッシュ上顎バーベルの研究のための方法

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

生物学

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish with fluorescently-marked plasma membranes can be scanned in a confocal laser scanning microscope in order to determine the volume of muscle tissue and the number of muscle fibers present. Efficient approaches for the measurement of cell number and size in live animals over time are described and validated against more arduous segmentation methods. Methods are described that permit the control of muscle electrical, and thus contractile, activity. Loss of skeletal muscle contractile activity greatly reduced muscle growth. In larvae, a protocol is described that allows reintroduction of patterned electrical-evoked contractile activity. The described methods minimize the effect of inter-individual variability and will permit analysis of the effect of electrical, genetic, drug, or environmental stimuli on a variety of cellular and physiological growth parameters in the context of the living organism. Long-term follow-up of the measured effects of a defined early-life intervention on individuals can subsequently be performed.

Optical clarity is a major advantage for cell biological and physiological work in zebrafish. Robust methods for measurement of cell growth in individual animals are described that permit novel insights into how growth of skeletal muscle and neighboring tissues are integrated with whole body growth.

電気的活動の変化を受けた個々の生きたゼブラフィッシュの骨格筋成長のリアルタイムおよび反復測定

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

<meta charset="utf8"></head><body>ゼブラフィッシュの鱗屑の除去による培養および骨生物学研究

In Vitro Culturing Technique for Studying Cellular Dynamics in Zebrafish Scales

Zebrafish scales offer a variety of advantages for use in standard laboratories for teaching and research purposes. Scales are easily collected without the need for euthanasia, regenerate within a couple of weeks, and are translucent and small, allowing them to be viewed using a standard microscope. Zebrafish scales are especially useful in educational environments, as they provide a unique opportunity for students to engage in hands-on learning experiences, particularly in understanding cellular dynamics and in vitro culturing methods. The main objective of this protocol is to describe a method for collecting and maintaining zebrafish scales in culture for use in a variety of biological studies using basic laboratory equipment. Additionally, the protocol details their use in understanding bone homeostasis by examining the activity of bone cells involved in bone resorption and deposition. It also includes additional protocols for general techniques, such as the visualization of nuclei and apoptotic cells. The in vitro culturing protocol produces reliable results with minimal reagents and equipment. This article discusses the benefits of using in vitro cultures of zebrafish scales to foster scientific inquiry and outlines the resources needed to support their integration into educational settings.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:ゼブラフィッシュの鱗による骨細胞活動研究の進展

This protocol offers a method to study cellular dynamics using a simple in vitro culture technique. It provides an opportunity for zebrafish researchers and educators to study cellular processes, such as those related to bone homeostasis and basic cell biology, by visualizing fluorescent nuclei and apoptotic cells within the scales.

ゼブラフィッシュのカイガラムシの細胞動態を研究するためのin vitro培養技術

Zebrafish scales offer a variety of advantages for use in standard laboratories for teaching and research purposes. Scales are easily collected without ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

4D共焦点顕微鏡を用いたゼブラフィッシュにおける顔面形態形成を分析する

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

ゼブラフィッシュジョーバイオメカニクスを調査するために有限要素モデルの構築

要約

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ゼブラフィッシュ胚におけるマイクロビーズの移植

薬物治療と

テストの子孫によるゼブラフィッシュ致死の骨格変異の浸透度をシフト

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ゼブラフィッシュ上顎バーベルの研究のための方法

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ゼブラフィッシュのカイガラムシの細胞動態を研究するためのin vitro培養技術

ゼブラフィッシュのカイガラムシの細胞動態を研究するためのin vitro培養技術

ゼブラフィッシュのカイガラムシの細胞動態を研究するためのin vitro培養技術

4D共焦点顕微鏡を用いたゼブラフィッシュにおける顔面形態形成を分析する