The authors have no Acknowledgements.

1.細胞の調製<ol><li> 成長する細胞 <ol><li> D.を育てます組織培養プレート中の光下に23℃でAX培地中discoideumの細胞。 75％の密集度以上の高い密度で細胞を維持することは避けてください。 注：最適な応答はストレスを加熱するために、細胞が指数増殖期にあることが必要と定常期に達していてはいけません。 </li><li>撮影前日、1×10 4細胞/ mlに低い蛍光媒体（LFM）に分割細胞。 注：このステップは、AX媒体に起因するバックグラウンド蛍光を低減する必要があります。インキュベーション時間は、2時間を最小限に抑えることができます。しかし、AX媒体に取り小胞は、依然として2時間後にいくつかのバックグラウンドシグナルを生成することができます。 </li></ol></li><li> 顕微鏡用細胞を準備 <ol><li>撮影前に、LFMにおける組織プレートから収穫細胞とは、ガラス底皿に細胞の十分な数を転送します。 注：通常、1×10 5細胞/ mlで十分です。実験は、（8時間以上）、長い撮像期間を必要とする場合は、細胞数を慎重D.として、調整する必要がありますdiscoideumの細胞が発達サイクルに移行し、栄養素が低い一方で細胞数が高い場合にストリーミングと集計を開始します。 </li><li>細胞は、20分間沈降することを可能にします。慎重に新鮮な培地で使用した培地を交換することにより、非定住細胞を除去します。 </li></ol></li></ol> 2.イメージング注意：このプロトコルは広視野システムに同様に共焦点顕微鏡のセットアップに使用することができます。目的をカバーする温度制御インキュベーションボックスと顕微鏡ステージの使用は人、まだ温度制御のために必須ではありません。熱応力が行われた場合、インキュベーションボックスの温度を40℃に、 例えば 、実験に使用される最高温度に設定されます。そうでなければ、温度は25に設定されています6; C。温度変化は、撮像時の温度の変化が焦点に影響を与えることができるように、システムが適応できるようにするために事前になされるべきです。 注記：画像化の間、温度は冷却室を使用して制御されます。非ストレス細胞を画像化するための初期温度は23℃です。熱ストレス条件下では、温度を所望のレベルに応じて増加します。冷却室でピエゾ素子は、温度変化に非常に迅速に対応することができます。しかし、画像の焦点は、（それが温度変化に応じて、最大で20μmであることが逸脱する可能性が）わずかに変化します。使用顕微鏡は、ハードウェアのオートフォーカスが装備されていない限り、このようにマニュアルリフォーカスは、画像取得の最初の数分以内に必要とされます。 <ol><li> 非ストレス条件下での画像取得 <ol><li> 23℃での非ストレス条件下での画像セルは、ビューの6分野（のFOV）の最小値を取得します。 注：非ストレス条件はvisualizすることができます短い時間経過（5月30日分）又は代表静止画の取得を記録することにより、いずれかのエド。各条件または細胞株の場合はビューの6分野（のFOV）の最小値を取得します。 注：個々の細胞が関心がある場合には、FOVの中央に各セルを配置し、中央に目的の細胞を含むFOVと3×3のタイルのシリーズを記録D.。 discoideumの細胞は運動性であり、FOVの外に移動することがあります。しかし、3×3のタイルシリーズは、潜在的に、目的の細胞によって探求面積を増加させ、それは〜6時間の時間経過期間の追跡可能のまま。 </li><li>セルの全体積をキャプチャするために1から0.25ミクロンのステップで最大7ミクロンのzスタックを取得します。 </li><li>細胞の総数を評価するための基準明視野像を取得します。 </li></ol></li><li> 熱ストレスのための画像取得 <ol><li>製造者の指示に従って30℃まで冷却室の温度を調整します。&lt;/李&gt; <li>温度表示が所望の値に達した後、明視野チャンネルに手動で再集束し、時間経過を開始する前に、すべての記録のFOVをご確認ください。 </li><li>時点間の5〜10分の時間間隔で熱ストレスの4時間の時間経過を開始します。最初の2つの時点の取得中に焦点を当て、正しいかどうかを確認します。 </li></ol></li><li> 回復中の画像取得 <ol><li>熱ストレスの後、戻って23℃まで温度を下げ、調整して、手動で再び焦点を合わせるために温度表示を待ちます。 </li><li> 10-20分の時間間隔で8-10時間の回復期に記録しタイムラプスムービー。最初の時点の取得中に焦点を当て、正しいかどうかを確認します。 </li></ol></li></ol> 3.画像解析注：細胞質の病巣を保有する細胞の数を定量化するためには、各時間における細胞の総数および細胞質病巣を有する細胞の数を評価しますフレーム。明視野画像から細胞を分割することの難しさを、定量化を手動で実行する必要があります。以下では、データ分析は、フリーの画像処理パッケージ（（http://fiji.sc/Fiji）について記載されている。それは、「セルカウンター」（http://fiji.sc/Cell_Counter）プラグインが必要です。 <ol><li> 細胞の総数を評価 <ol><li> 「ファイル」と「開く」をクリックすることにより、明視野画像スタック（XYT）をロードします。 </li><li> 「セルカウンター」プラグイン（ - &quot;セルカウンター」「プラグイン」）を開きます。 「初期化」をクリックすることで、画像スタックをロードします。 </li><li>適切なボックスを刻むことにより、カウンタの適切なタイプを選択します。 注：全細胞の数および細胞質病巣を有する細胞のためのカウンタとしてタイプ2用のカウンタとして使用するタイプ1。すべてのセルを数えます。 </li><li> 「保存マーカー」をクリックしてマーカーを保存します。 </li></ol></li><li> 細胞質の病巣を有する細胞の数を評価します <ol> &lt;LI&gt;蛍光画像hyperstack（XZYT）（「ファイル」 - 「開く」）をロードし、「Z-プロジェクター」（画像/スタック）を使用して、最大値投影を行います。 </li><li> 「セルカウンター」プラグインを開きます。 「初期化」をクリックすることにより、得られた画像スタック（XYT）をロードします。 </li><li> 「ロード・マーカー」をクリックしてマーカーをロードします。 注意：参照画像と蛍光スタックのファイル名が同一である必要があります。必要に応じて、画像スタックを初期化する前にそれに応じて変更します。 </li><li>適切なマーカーの種類を選択します（3.1.3を参照）および細胞質病巣で細胞を数えます。既存のマーカーは個々の細胞の位置のためのガイダンスとして使用することができます。 </li><li> 「結果」をクリックすることで、スライスあたりのカウント数を取得し、さらに計算のために他の場所でカウントを保存します。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bonner, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+Formation+of+Cell+Aggregates+by+Chemotaxis+in+the+Development+of+the+Slime+Mold+Dictyostelium+Discoideum.">Evidence for the Formation of Cell Aggregates by Chemotaxis in the Development of the Slime Mold Dictyostelium Discoideum.</a> Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 1-26 (1947).</li><li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+during+development+of+Dictyostelium.">Cell signaling during development of Dictyostelium.</a> Developmental Biology. 391 (1), 1-16 (2014).</li><li>Nichols, J. M. E., Veltman, D., Kay, R. 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The authors have nothing to disclose.

ここで説明するプロトコルは、熱誘発ストレスに応答して、目的の特定のタンパク質の挙動を研究するために使用することができます。 30°DのCは、熱ストレス応答を誘発することが報告されており、これらの条件下で生存能力の温度上昇discoideumのが著しく低減されます。 修正 プロトコルは、同じストレス条件下で異なるタンパク質の挙動を比較するために修飾することができます。このため、同一の蛍光タグを有する異なるタンパク質を発現する細胞は、四室皿（セクション1.3.1）のように、マルチウェルディッシュに移します。プロトコルはまた、GFPまたはRFPなどの異なるマーカーを有するタンパク質を同時発現する細胞に適用することができます。これは、タンパク質の品質管理（PQC）システムのさまざまなコンポーネントの動作を監視するために使用される例であることができます。 GFPタグ付き凝集マーカーおよび異なるRFPタグPCQ成分を発現する細胞は、マルチウエルを用いて観察することができイメージングのために皿。これは、同じストレス条件（温度上昇/低下の速度、温度上昇/低下の持続時間）を保証し、比較研究が可能になります。 また、プロトコルは、熱ストレス応答のPQCシステムの影響を研究するために使用することができます。成分の活性は、ノックアウトまたは過剰発現などの遺伝子ツールを使用して、発現レベルを変化させることによって、または市販の特異的阻害剤6を使用することによって調節することができます。プロテアソームは、増殖培地にMG132（100μM）またはラクタシスチン（10μM）を添加することにより抑制することができます。シャペロンHsp90は、ゲルダナマイシン（6μM）またはラディシコール（10μM）を用いて阻害することができます。我々はこれまでの我々の実験設定で、阻害の有効性を確認することができませんでしたが、シャペロンHsp70が、VER-155088に抑制することができます。阻害剤は、イメージングの前に一日を追加する必要があり、細胞を14時間インキュベートします。 Criti<html>プロトコル内のCALのステップ 熱による摂動を評価するための重要なステップは、イメージング実験に先立って、細胞の状態です。酵母での研究は、細胞が定常期13の間に環境ストレスの様々な耐性を獲得することを示しました。 D.あれば我々はまた、かかる熱応力を最小限の応答性を観察しましたdiscoideumの細胞は、イメージング前に定常期に達しました。したがって、一定の細胞数&lt;5×10 5細胞/ mlを維持することが重要です。 また、高い細胞数はDの栄養サイクルからの移行を誘導することができますこのようにストレスを加熱するために異なる応答につながるかもしれない飢餓経路を、トリガ、発達サイクルにdiscoideumの 。高い細胞数は、熱ストレス、ストリーミング後の回復期に到達すると、細胞が焦点から外れるように凝集細胞は、データ分析を妨害し得る場合（ 図4参照）。 コンテンツ &quot;&gt;テクニックの制限 焦点の損失は、プロトコルのボトルネックです。温度変化の間、焦点面はすぐに温度を変更した後の時間の手動再収束を必要とする、大幅に移行することができます。焦点のジャンプは時々時点間の時間が長い場合は特に、ソフトウェアのオートフォーカスにより克服することにはあまりにも極端なことができます。使用される顕微鏡は、ハードウェアオートフォーカスが装備されている場合は、このボトルネックを回避することができます。 既存の方法に関して技術の意義 このような目標や顕微鏡ステージや温度制御ステージと客観襟をカバーするエアコン付きの客室、温度制御インキュベーションボックスの使用など、既存のセットアップと比較して、冷却室の使用は、周囲のより正確な制御を提供します温度。冷却室でのペルチェ素子は、一定かつ均一テムを維持することができます実験を通してたは温度。古典的なセットアップでは、局所的な温度差は、異なる観測成果につながる可能性があります。古典的なセットアップは、特に温度を下げ、誘導された温度変化に非常にゆっくりと適応しながら、また、それは、温度誘導性の変化に迅速かつ迅速に対応することができます。冷却室でペルチェ素子はまた、15℃または40℃のような温度に到達すると、古典的なセットアップよりも広い温度範囲（15〜40°C）を覆うことができることは非常に困難です。 細胞性粘菌は、光毒性に特に敏感です。以前の研究では、光毒性を低減するために捕捉剤としてアスコルビン酸を使用します。しかし、長い撮影期間は追加の補充を必要とします。また、アスコルビン酸の使用が関心のメカニズムは抗酸化サプリメントの影響を受けていない研究に限定されています。我々は、温度制御されたイメージング代替APPRとして使用できることを提案しますoachは、光毒性を最小限にし、さらに、毒性を減少させるために、アスコルビン酸の添加と組み合わせることができます。 光毒性効果は、冷却室を使用して23℃の一定かつ均一な温度を提供することによって最小限に抑えることができます。温度制御を使用して画像化する細胞は、より長い期間のための光毒性は、そのような細胞の丸みの少ない徴候を示します。これはまた、より高い強度、より小さな時間間隔またはビュー（FOVの）の複数のフィールドでイメージングを可能にします。 一般的適用 高温での熱応力は、異なる熱ストレス応答14を誘発することが示されています。従って、34℃又は37℃に温度を上げると、異なる応答を誘導する可能性があります。適用温度ストレスに加えて、特定のストレス状態の持続時間は、応力を加熱するため、即時応答または長期適応を研究するために修飾することができます。 一般に、記載されたプロトコルをすることができますアプリケーションの広いセットに拡大しました。正確な温度制御がかなり光毒性効果を減少するため、プロトコルは、高い露光時間および/またはより高い励起光強度を必要とする設定などで、低い発現レベルでタンパク質を可視化するために、または短い時間間隔と組み合わせて使用することができますタイムラプスイメージングの間、 例えば 、イメージングの間。これらの設定は、光のzセクションの多数を必要とすることも、セル全体にわたるイメージング・オブジェクト、 例えば 、微小管のために有利であり得ます。

細胞性粘菌食作用によって取り込まれる細菌や他の微生物を餌孤独な土壌生活アメーバ、です。それは、その発見以来、1研究の主要な分野となっているユニークで顕著なライフサイクルを有します。多細胞の開発2および走化性3の分子基盤の初期の関心はすぐに細胞運動、細胞極性、先天性免疫に焦点を当てた研究によって補完されました。また、D. discoideumのは、生物医学研究の4,5のためのモデルシステムとして導入されました。 最近、我々はDを設立しましたdiscoideumのタンパク質品質管理（PQC）システム6,7を研究するための新たなシステムとして。そのプロテオームは、タンパク質品質管理8への課題となって凝集しやすいプリオン様タンパク質、に富んでいます。 D.かどうかを調べるために、 discoideumのは、その高度AGを制御するために、特別な分子機構を開発しましたgregationが発生しやすいプロテオーム、我々は通常の成長条件の下で、ストレス時の両方で凝集しやすいマーカータンパク質の挙動を研究しました。このような熱応力等の応力条件は、タンパク質ミスフォールディング9の速度を増加させるために使用することができます。したがって、我々は、温度変化を誘導し、同時にマーカータンパク質の挙動をたどることができ、システムを探していました。この目的のために、我々は、熱ステージインサート（冷却室）を用いてペルチェ制御加熱生細胞イメージングを組み合わせました。この方法では、我々は、一定で均一な温度を維持するだけでなく、迅速な、まだ正確な温度変化を誘発させました。 生細胞イメージングはDの生物学的プロセスの多様な研究するために使用されますdiscoideumの 。しかしながら、このアプローチは、2つの主要な制約に直面しています。最初に、細胞は、このように個々の細胞の追跡は、多くの場合、大面積の画像化を必要とする、高い運動性を表示し、視野の外に移動する傾向があります。セルの移動することができます寒天オーバーレイ10によって減少させることが、しかしながら、これらの条件は、生存率の減少に起因する長期的イメージングのために適していません。第二に、D. discoideumの細胞は、細胞の丸めと有糸分裂停止11その結果フォト毒性、特に高い感度を示します。前のプロトコルは、ラジカルスカベンジャーと露光時間12の減少としてアスコルビン酸を添加することによって、この問題を取り上げました。関心対象のタンパク質を低レベルで発現され、弱い蛍光信号を示している場合、後者は重要であることができます。著者らはまた、エアコン付きの部屋で撮影したり、客観的かつ顕微鏡ステージ12をカバーする温度制御インキュベーションボックスを使用してのいずれか21℃の一定温度を提供することを示唆しています。 ここでは、23℃に設定した冷却チャンバを使用することにより改善された温度制御を備えた方法を記載しています。大幅に私たちのセットアップを撮像中に光毒性に対する耐性を向上させます。それより高い露光時間およびより高い励起光強度の使用を可能にします。時間間隔は、撮像された位置の数および使用される露光時間に対して慎重にバランスをとる必要があり、これは、タイムラプス撮影中に特に重要です。画像形成された位置の数を増加させる可能性も広い撮像領域のカバレッジを可能にし、より長い期間にわたって個々の細胞の追跡を容易にします。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="587">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AX Medium</td>
			<td style="width:85px;">ForMedium</td>
			<td style="width:119px;">AXM0102</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LoFlo medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>LF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MG132</td>
			<td style="width:85px;">Sigma</td>
			<td>C2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lactacystin</td>
			<td style="width:85px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L6785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Geldanamycin</td>
			<td style="width:85px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-200617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Radicicol</td>
			<td style="width:85px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-200620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MatTek disch 35 mm</td>
			<td style="width:85px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td>glass bottom imaging dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CellViell cell culture dish</td>
			<td style="width:85px;">Greiner</td>
			<td align="right" style="width:119px;">627870</td>
			<td>4-compartments glass bottom imaging dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thermal Stage Heater/Cooler Insert</td>
			<td style="width:85px;">Warner Istruments</td>
			<td style="width:119px;">TB-3/CCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bipolar temperature controller</td>
			<td style="width:85px;">Warner Istruments</td>
			<td style="width:119px;">CL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Liquid cooling System</td>
			<td style="width:85px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:119px;">LCS-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the protein quality control system of d. discoideum using temperature-controlled live cell imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

記載の撮像プロトコルは、アメーバD.で凝集しやすいプリオン様タンパク質の挙動を分析するために使用することができます熱ストレス中discoideumの 。 図1は、30℃（ 図1B）での熱ストレスの2時間後ストレス回復の6時間後に、通常の増殖条件（ 図1A）の下での細胞中のGFPタグ付きポリグルタミンタンパクQ103の分布を示して通常の成長条件（ 図1C）での成長。 30℃〜23℃の温度上昇時には、Q103-GFPマーカーは、点状構造に拡散分布から合体します。常温で応力解放と成長すると、これらの構造が溶解します。 Q103-GFPの再分配および熱ストレスによって誘導される細胞質ゾル病巣の形成は、画像解析を用いて定量することができる。 図2Aは、フィジー、プラグイン「Cを使用して、個々のFOVの分析を示しますエルカウンター」。 図2Bは、熱ストレス応答の定量化を示す。これは継続的な熱ストレスとの数の細胞質ゾルQ103-GFP病巣の増加が。熱ストレス時には、タンパク質の品質管理（PQC）システムは、このようにaggregation-、圧倒されていることを示していますこのようなプリオン様タンパク質Q103としてやすいタンパク質がサイトゾル病巣ますます集合溶解状態に維持することができない。細胞はまた、特徴的な丸めを示し、 図1Bに示すように、応力除去後のサイトゾル病巣の減少は、凝集していることを示唆していますタンパク質が溶解されています。 結像品質は、最初の細胞密度に敏感である。 図3は、適切な初期細胞密度（ 図3A）と高い初期細胞密度（ 図3B）を比較して、ストレス回復後の細胞の一例を示しています。初期細胞密度が高すぎる場合、細胞の星テッド図3bに示すようにストリームを形成します。細胞などのその後の定量化に困難を課しているこれは、焦点面の外に移動しました。 記載された方法は、上述したように温度による変化を監視するために使用することができます。生理的な成長温度で撮影。 図4は、空調室内の温度制御なしで撮像された冷却室（ 図4A）で、23℃で撮像された細胞の比較および細胞を示しているときにセット、光毒性を低減するためにも使用することができます25°C（ 図4B）へ。励起光に対する一定の曝露の際に、細胞は、温度制御された条件下で撮像されていないときに切り上げます。細胞の形状の変化は、ストレスを示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig1.jpg" /> 図1： <strong&gt;凝集しやすいプリオン様タンパク質は、熱ストレスの間にそれらの細胞分布を変更します。GFPタグ付きポリグルタミンが豊富なハンチンチンエクソン1（Q103）が恒常AX2-214 D.で表現されていますdiscoideumの細胞（反転グレースケールルックアップテーブルに示されたGFPシグナル）。 （A）は 23℃で通常の増殖条件下で、Q103-GFPは、拡散細胞質に分布しています。 （B）30℃での熱ストレスの2時間後、Q103-GFPは細胞質ゾル病巣（赤い矢印）に合体します。細胞は特徴的な形状変化を示し、切り上げます。 23℃での応力解放及び成長時（C）は 、サイトゾル病巣が溶解します。 6時間後、何のサイトゾル病巣は観察されないことができます。スケールバー=10μmである。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54730/54730fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図2： 熱誘導サイトゾル病巣形成の定量無料の画像処理パッケージフィジーとプラグインの「セルカウンター」を使用して、細胞の（A）の分析。細胞（1型、ブルーカウンターマーカー）の合計量は、明視野画像において決定されます。マーカーは、GFPチャネルにロードされ、細胞質のフォーカス（タイプ2、赤カウンタマーカー）を有する細胞の数が決定されます。 （B）30℃での熱ストレスの3時間および23℃での応力回復の3時間（N =ビュー、エラーバー= SDの4分野）後病巣の定量。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54730/54730fig2large.jpg" target="_blank">このの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。図。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig3.jpg" /> <stron<html>グラム&gt;図3： 長期的タイムラプスイメージング上の細胞密度の影響初期細胞密度&lt;10 5細胞/ mlで撮像された（A）細胞。 30℃での熱ストレスの3時間および23℃でのストレス回復の6時間後、細胞はまだ栄養サイクルと分裂に残ります。ごく少数の細胞が焦点面を終了します。 （B）細胞は、初期細胞密度&gt; 10 6細胞/ mlで画像化しました。イメージング（Aのように設定）の9時間後、細胞は、発達サイクルに入り、ストリーミングと集約開始しました。凝集体中の細胞を明確に区別することはできません。細胞の大部分は、焦点面から出て、分析することができません。スケールバー=10μmである。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54730/54730fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <html> .JPG &quot;/&gt; 図4： 光毒性効果に対する温度制御の効果 23℃の温度制御で10分間撮像された（A）細胞：6視野、zスタック（0.5μM間隔、試料の厚さ8μM）、時間経過（総時間10分経過し1分）、GFPチャンネル（0.07ミリ秒の露光時間、10％のレーザ強度）、RFPチャネル（0.1ミリ秒の露光時間、10％のレーザ強度）。細胞は光毒性ストレスに関連する特徴的な形態学的変化の兆候を示しません。温度制御せずに10分間画像形成された（B）細胞（Aと同じ条件）。細胞はストレスを示す、光毒性誘発される丸めの兆候を示します。 =10μmのスケールバー。細胞は、100×/ 1.4の開口数（NA）を目的とした顕微鏡に基づいて、システム上で画像化しました。画像は、1×1ビニングを用いて1,024×1024ピクセルファイルとしてCCDカメラを用いて収集しました。4large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

タンパク質の品質管理システムを学びます<em&gt; D。 discoideumの</em&gt;温度制御された生細胞イメージングを用い

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

6.1K ビュー.  Max-Planck Institute for Molecular Cell Biology and Genetics. The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

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Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

液相の回復と分子量ベース画用GELFREE 8100分別システムの使用

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

生物学

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

生細胞イメージングとの胚上皮細胞の定量分析アフリカツメガエル</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

開発ゼブラフィッシュの表皮から細胞の押出のライブイメージング

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

イメージングG -タンパク質共役受容体（GPCR）を介するシグナル伝達事象その制御走キイロタマホコリカビ</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

生細胞中のタンパク質凝集の4Dイメージング

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

アポトーシス細胞のクリアランスのイメージング中に生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

初期のオートファジーイベントの細胞イメージングライブOmegasomesを以降

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

マウス胎児腸全体培養システム<em&gt;生体外</em&gt;シグナル伝達経路の操作と絨毛開発の3次元ライブイメージング

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the formation of thrombi that occlude the vasculature and injure organs, with life-threatening consequences. This motivates scientific research on platelet function and the development of methods to track cell-biological processes as they occur under flow conditions.
A variety of flow models are available for the study of platelet adhesion and aggregation, two key phenomena in platelet biology. This work describes a method to study real-time platelet degranulation under flow during activation. The method makes use of a flow chamber coupled to a syringe-pump setup that is placed under a wide-field, inverted, LED-based fluorescence microscope. The setup described here allows for the simultaneous excitation of multiple fluorophores that are delivered by fluorescently labeled antibodies or fluorescent dyes. After live-cell imaging experiments, the cover glasses can be further processed and analyzed using static microscopy (i.e., confocal microscopy or scanning electron microscopy).

This work describes a fluorescence microscopy-based method for the study of platelet adhesion, spreading, and secretion under flow. This versatile platform enables the investigation of platelet function for mechanistic research on thrombosis and hemostasis.

流れの下での血小板の脱顆粒および分泌の生きた細胞イメージング

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

LDL コレステロールの取り込みアッセイ セルにライブセル イメージングを使用して正常性の監視

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...