Funding was provided by State Water Resources Control Board (Agreements No. 10-096-250 and 14-090-270). We thank S. Abbasi, M. Connor, S. Engelage, K. North, J. Armstrong, S. Asato, M. Dojiri, D. Schlenk, S. Snyder, S. Westerheide, B. Escher, F. Leusch, G. Pelanek, K. Bi, and J. Printen. The authors declare no conflict of interest, and reference to trade names does not imply endorsement.

1.収集し、プロセス水サンプル（エッシャーらから変更された。9） <ol><li>関心の水試料でトップに1グラムのアジ化ナトリウムおよび50mgのアスコルビン酸を含む清浄な1 Lアンバーガラスボトルを埋めます。 72時間内のショップ4°Cでのサンプルおよびプロセス。 注：アジ化ナトリウムは非常に毒性があり、慎重に取り扱わなければなりません。保護具（目/顔、手袋、衣服）を使用し、適切に機能してヒュームフード内で重量を量ります。計量のための金属へらを使用しないでください。 </li><li> 1.6μmのガラス繊維フィルターを通して試料を通過した後、5-10 ml /分の流速で前処理固相抽出（SPE）カートリッジを通して。流量を制御するために、真空ポンプの圧力を調整します。 </li><li>真空を15分間カートリッジを乾燥させます。 </li><li>ヘキサン（1：1、v / v）のアセトン10ml、続いてメタノール10mlでカートリッジを溶出します。 </li><li>高純度窒素の穏やかな流れの下で〜1mlに溶出液を濃縮します。溶媒ジメチルスルホキシド（DMSO）500μlのを追加し、ダウンを500μlの抽出液を蒸発させることによって交換。 </li><li>アンバーガラスオートサンプラーバイアルに抽出液を転送します。 -20℃で保管してください。 </li></ol> 2.アッセイ特定の参照化学物質の希釈液と水抽出物を準備します<ol><li> 検量線用の9希釈液を調製します。 <ol><li> 100％DMSO中のアッセイ特定の参照化学物質の原液を作ります。最終濃度は、ERアッセイのために2μM17βエストラジオール、およびGRアッセイのために、100μMデキサメタゾンでなければなりません。 -20℃でストック溶液を保管してください。 </li><li> （チューブ＃1）滅菌チューブにアッセイ培地285μlに適切な参照化学株式の15μLを加えます。上下にピペッティングすることによって、サンプルを混ぜます。 </li><li> 8追加のチューブ（チューブ＃2-9）でアッセイ培地中で5％のDMSO溶液200μlを追加します。 </li><li>浴槽を通してチューブ＃2にチューブ＃1からの100μlのアリコートを転送E＃9は、3倍希釈系列を実行します。各希釈サンプルは、一定分量を取り、次のチューブに追加する前に、ピペットで十分に混合しなければなりません。 </li></ol></li><li>アッセイ培地190μlのDMSOを10μlを混合することにより、溶媒対照サンプルを準備します。 </li><li>各水抽出するための4つの希釈液を調製します。 <ol><li>第1のチューブでは、アッセイ培地の95μLの水抽出物の5μLを加え、よく混ぜます。 3他のチューブにアッセイ培地中で5％のDMSO 50μLを加えます。 </li><li>次へ1管から溶液50μlを転送することにより2倍希釈を行います。 </li></ol></li></ol> 3. FRETバイオアッセイを実施するために細胞懸濁液を準備します<ol><li>製造元の指示に従ってアッセイ特定のメディアを準備します。アッセイ培地は4℃​​で保存し、使用前に水浴中で37℃に温めなければなりません。 </li><li>極低温自由のうち、ERまたはGR分裂停止細胞のバイアルを取りますZERは、穏やかに攪拌しながら2分間、37℃の水浴中でバイアルを配置することによって、迅速に細胞を解凍し、。 70％エタノールでバイアルを除染し、クラスII生物学的安全キャビネットに入れてください。 </li><li>無菌技術を使用して、バイアルを開き、アッセイ培地10mlに細胞を移します。 </li><li> 5分間200×gで遠心分離します。 </li><li>滅菌ガラスピペットを用いて上清を吸引し、アッセイ培地6ml中に細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>生体染色溶液5μlの細胞懸濁液の5μLを混合し、計数室にアリコートを追加します。 </li><li>光学顕微鏡または自動細胞カウンターを使用して生細胞の数をカウントし、細胞懸濁液中の生細胞の密度を推定します。アッセイ培地1ml当たり55万生細胞の最終濃度を得るために、必要に応じて希釈します。 </li></ol> 4.プレート96ウェル黒壁透明底プレート中の細胞と希釈し、水エキスを追加します。 <ol><li>プレートを作成します。各水抽出物についての較正曲線、QA / QCサンプルと複数の希釈特定9ポイントアッセイを含むレイアウト。 96ウェルプレートのレイアウトの例が図1に示されています。 </li><li>複製細胞を含まない対照ウェルにアッセイ培地90μlのを追加します。 </li><li>無菌分注容器内の細胞懸濁液を注ぎ、マルチチャンネルピペットを使用して他のウェルに細胞懸濁液90μlを添加します。 </li><li>適切なウェルへのステップ2の間に調製した希釈サンプルの10μlのを追加します。ウェル当たりDMSOの最終濃度は0.5％、最大でなければなりません。 </li><li>蓋付きのプレートをカバーし、16時間、37℃で5％CO 2インキュベーターに入れてください。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54725/54725fig1.jpg" /> 図1：96ウェルプレートのレイアウトの例のマルチウェルプレートは、3種類のアッセイ特定の較正曲線を含むように設計されています。QA / QCコントロールのと水抽出物あたり4希釈（メディアのみ、DMSO中のきれいな培地中の細胞と細胞が培地をスパイクしました）。各制御および水抽出物の希釈は三連ウェルで分析されている。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54725/54725fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 5.ローディング溶液を準備し、各ウェルに追加<ol><li>インキュベーション後、プレートを室温に平衡化することができます。このFRETバイオアッセイのために、5.6を介して5.2が直接光の不存在下で行われるべきであるステップ。 </li><li>製造元の指示に従って6×ローディング溶液を準備します。 </li><li>各ウェルに6×ローディング溶液20μlを追加します。 </li><li>希釈した水抽出物の細胞毒性を評価するために、各ウェルに細胞生存性試薬10μlのを追加します。 </li><li>アルミニウム接着フィルムでプレートを密封します。 </li><li> 2時間室温で暗所でプレートをインキュベートします。 </li></ol> 6.メジャーの細胞毒性および内分泌活動レスポンス<ol><li>製造業者の指示に従って下読み取り機能を備えたマイクロプレートリーダーを設定します。 </li><li> FRETトランスバイオアッセイのために、青色の蛍光（460分の409 nmの励起（例）/発光（EM）波長）と緑（409例/ 530エムnm）のチャネルを測定します。 </li><li>細胞傷害性アッセイのために、560例/ 590エムnmで蛍光を測定します。 </li></ol> 7.データの品質を決定するために、QA / QCチェックを評価します<ol><li>平均生の無細胞（専用メディア）の蛍光および細胞のみ（きれいなアッセイ培地中の細胞）を対照と比較します。メディアのみのバックグラウンド蛍光は、細胞のみの対照の応答よりも少なくとも25％低いことが必要です。 </li><li>生FRETデータを処理します。 「青」と「グリーン」データセットの両方について、よく含むすべての細胞からの細胞を含まない対照ウェルの平均蛍光を引きます。計算各実験ウェルについての青/緑比。 </li><li> DMSOコントロールを持つ唯一の細胞 - 細胞の青/緑比を比較してください。これらのコントロールの蛍光値は、15％相対標準偏差（RSD）の範囲内でなければなりません。 </li><li>ログ分子量（Mをログ）として表現試料濃度に対する青/緑比などのアッセイ特定の較正曲線をプロットします。スロープ、R 2を計算し、EC 50（50％影響濃度）を記録します。較正パラメータは、 表1に記載予想範囲内であるべきです。 </li><li>すべての三連のウェルのためのRSDを計算します。レプリケート間のばらつきが20％未満であるべきです。 </li><li>細胞毒性データ（560例/ 590エムnm）のために、すべての細胞を含むウェルからの細胞を含まない対照の平均（すなわち、メディアの背景を）引きます。 </li><li>各サンプルの平均バックグラウンドを差し引いた蛍光を計算します。 DMSO対照のパーセントとして得られる蛍光データをプロットします。サンプル希釈はいけません細胞のみで、DMSO対照と比較して20％以上の細胞死を示します。 </li></ol> 8.データ分析<ol><li>最小キャリブレーション応答に加えて、その応答の平均値の2標準偏差として検出（LOD）の測定限界を計算します。 </li><li>用量反応を示す試料について、EC 50を導出します &#160;基準化学物質の10と50％効果濃度と較正曲線の線形回帰の傾きを用いて、水抽出物。 </li><li> / EC水サンプルの50参照化学物質のBEQ = EC 50：式を使用して、バイオアナリティカル当量濃度（BEQ）を計算します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Dix, D. J., Houck, K. A., Martin, M. T., Richard, M. A., Setzer, R. W., Kavlock, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ToxCast+program+for+prioritizing+toxicity+testing+of+environmental+chemicals.">The ToxCast program for prioritizing toxicity testing of environmental chemicals.</a> Toxicol. Sci. 95 (1), 5-12 (2007).</li><li>Reif, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+profiling+and+prioritization+of+environmental+chemicals+using+ToxCast+data.">Endocrine profiling and prioritization of environmental chemicals using ToxCast data.</a> Environ. Health Perspect. 118 (12), 1714-1720 (2010).</li><li>Maruya, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tiered,+integrated+biological+and+chemical+monitoring+framework+for+contaminants+of+emerging+concern+(CECs)+in+aquatic+ecosystems.">A tiered, integrated biological and chemical monitoring framework for contaminants of emerging concern (CECs) in aquatic ecosystems.</a> Integr. Environ. Assess. Manag. , (2015).</li><li>Van der Linden, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+multiple+hormonal+activities+in+wastewater+effluents,+surface+water,+using+a+panel+of+steroid+receptor+CALUX+bioassays.">Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents, surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays.</a> Environ. Sci. Technol. 42 (15), 5814-5820 (2008).</li><li>Leusch, F. D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+five+in+vitro+bioassays+to+measure+estrogenic+activity+in+environmental+waters.">Comparison of five in vitro bioassays to measure estrogenic activity in environmental waters.</a> Environ. Sci. Technol. 44 (10), 3853-3860 (2010).</li><li>Jarosova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Europe-wide+survey+of+estrogenicity+in+wastewater+treatment+plant+effluents:+the+need+for+effect-based+monitoring.">Europe-wide survey of estrogenicity in wastewater treatment plant effluents: the need for effect-based monitoring.</a> Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (18), 10970-10982 (2014).</li><li>Sonneveld, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+in+vitro+and+in+vivo+screening+models+for+androgenic+and+estrogenic+activities.">Comparison of in vitro and in vivo screening models for androgenic and estrogenic activities.</a> Toxicol. Sci. 89 (1), 173-187 (2006).</li><li>Piersma, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+alternative+in+vitro+test+battery+for+detecting+reproductive+toxicants.">Evaluation of an alternative in vitro test battery for detecting reproductive toxicants.</a> Reprod. Toxicol. 38, 53-64 (2013).</li><li>Escher, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+organic+micropollutants+in+wastewater,+recycled+water+and+drinking+water+with+in+vitro+bioassays.">Benchmarking organic micropollutants in wastewater, recycled water and drinking water with in vitro bioassays.</a> Environ. Sci. Technol. 48 (3), 1940-1956 (2014).</li><li>U.S. Environmental Protection Agency (USEPA) Endocrine Disruptor Screening Program. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Prioritization of the endocrine disruptor screening program universe of chemicals for an estrogen receptor adverse outcome pathway using computational toxicology tools. , (2012).</li><li>Leusch, F. D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+wastewater+and+recycled+water+quality:+a+comparison+of+lines+of+evidence+from+in+vitro,+in+vivo+and+chemical+analyses.">Assessment of wastewater and recycled water quality: a comparison of lines of evidence from in vitro, in vivo and chemical analyses.</a> Water Res. 50, 420-431 (2014).</li><li>Jia, A., Wu, S., Daniels, K. D., Snyder, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+budget:+accounting+for+glucocorticoid+bioactivity+and+fate+during+water+treatment.">Balancing the budget: accounting for glucocorticoid bioactivity and fate during water treatment.</a> Environ. Sci. Technol. 50 (6), 2870-2880 (2016).</li><li>Huang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genomics+profiling+of+environmental+chemical+modulation+of+human+nuclear+receptors.">Chemical genomics profiling of environmental chemical modulation of human nuclear receptors.</a> Environ. Health Perspect. 119 (8), 1142-1148 (2011).</li><li>Mehinto, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+comparison+of+in+vitro+bioassays+for+screening+of+endocrine+active+chemicals+in+recycled+water.">Interlaboratory comparison of in vitro bioassays for screening of endocrine active chemicals in recycled water.</a> Water Res. 83, 303-309 (2015).</li><li>Ternes, T. A., Joss, A., Siegrist, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrutinizing+pharmaceuticals+and+personal+care+products+in+wastewater+treatment.">Scrutinizing pharmaceuticals and personal care products in wastewater treatment.</a> Environ. Sci. Technol. 38 (20), 392A-399A (2004).</li><li>Tang, J. Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+characterization+of+urban+stormwater+with+bioanalytical+tools.">Toxicity characterization of urban stormwater with bioanalytical tools.</a> Water Res. 47, 5594-5606 (2013).</li><li>Scott, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+endocrine+activity+in+Australian+rivers+using+chemical+and+in+vitro+analyses.">An assessment of endocrine activity in Australian rivers using chemical and in vitro analyses.</a> Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (22), 12951-12967 (2014).</li><li>Vidal-Dorsch, D. E., Bay, S. M., Maruya, K., Snyder, S. A., Trenholm, R. A., Vanderford, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contaminants+of+emerging+concern+in+municipal+wastewater+effluents+and+marine+receiving+water.">Contaminants of emerging concern in municipal wastewater effluents and marine receiving water.</a> Environ. Toxicol. Chem. 31 (12), 2674-2682 (2012).</li><li>WateReuse Research Foundation (WRRF). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Direct potable reuse: a path forward. , (2011).</li><li>Leusch, F. D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+application+of+bioanalytical+tools+as+surrogate+measure+of+chemical+contaminants+in+recycled+water.">Assessment of the application of bioanalytical tools as surrogate measure of chemical contaminants in recycled water.</a> Water Res. 49, 300-315 (2014).</li><li>Schriks, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+glucocorticoid+activity+in+various+surface+waters+in+the+Netherlands.">Occurrence of glucocorticoid activity in various surface waters in the Netherlands.</a> Chemosphere. 93 (2), 450-454 (2013).</li><li>Suzuki, G., Sato, K., Isobe, T., Takigami, H., Brouwer, A., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+glucocorticoid+receptor+agonist+in+effluents+from+sewage+treatment+plants+in+Japan.">Detection of glucocorticoid receptor agonist in effluents from sewage treatment plants in Japan.</a> Sci. Tot. Environ. 527-528, 328-334 (2015).</li><li>Purdom, C. E., Hardiman, P. A., Byea, V. V. J., Enoa, N. C., Tyler, C. R., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenic+effects+of+effluents+from+sewage+treatment+works.">Estrogenic effects of effluents from sewage treatment works.</a> Chemistry and Ecology. 8 (4), 275-285 (1994).</li><li>Kidd, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collapse+of+a+fish+population+after+exposure+to+a+synthetic+estrogen.">Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (21), 8897-8901 (2007).</li><li>Kojima, H., Katsura, E., Takeuchi, S., Niiyama, K., Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+estrogen+and+androgen+receptor+activities+in+200+pesticides+by+in+vitro+reporter+gene+assays+using+Chinese+hamster+ovary+cells.">Screening of estrogen and androgen receptor activities in 200 pesticides by in vitro reporter gene assays using Chinese hamster ovary cells.</a> Environ. Health Perspect. 112 (5), 524-531 (2004).</li><li>Kugathas, S., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+glucocorticoids+in+the+environment:+First+results+on+their+potential+impacts+on+fish.">Synthetic glucocorticoids in the environment: First results on their potential impacts on fish.</a> Environ. Sci. Technol. 45, 2377-2383 (2011).</li><li>Van der Linden, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+panel+of+high-throughput+reporter-gene+assays+to+detect+genotoxicity+and+oxidative+stress.">Development of a panel of high-throughput reporter-gene assays to detect genotoxicity and oxidative stress.</a> Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 760, 23-32 (2014).</li><li>Cwiertny, D. M., Snyder, S. A., Schlenk, D., Kolodziej, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+designer+drugs:+when+transformation+may+not+eliminate+risk.">Environmental designer drugs: when transformation may not eliminate risk.</a> Environ. Sci. Technol. 48, 11737-11745 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

このようなNG / L濃度23,24でこれらの化学物質のための17βエストラジオール（E2）、ワラントのスクリーニングなどの環境エストロゲン、のよく文書効力。本研究では、汚水排水（BEQ範囲：2.3〜17 ngのE2 / L）のためのER応答は、オーストラリアのWWTPs 20から二次処理水のために報告されたものよりやや高かった、表面水のBEQs一方（&lt;0.5〜4 ngのE2 / L ）16（&lt;1〜11 ngのE2 / L）面と他の場所で雨水のために報告された範囲内でした。地表水の試料で測定ER活性の低レベルにもかかわらず、このアッセイは、水の品質評価に関連するスクリーニング・エンドポイントを表しています。ビスフェノールA及びアルキルフェノール界面活性剤などのエストロゲンは、多くの場合、水生環境中で検出され、それらは、従来の分析化学を使用して定量化することは困難です。小島らによって示されるようにER-細胞アッセイはまた、現在新たに登録された農薬のスクリーニングに有用であることを証明することができます25。 GR活性は、この研究（ 表2）で分析した全ての4流出物試料中の大きさの順序によってER活性を上回りました。この傾向は、流出廃水14上の以前の研究と一致している、とGR-BEQsの範囲はやや高いが、同じin vitroのバイオアッセイ12を使用して、他の二次排水のために報告されたものに匹敵する、ここで報告しました。異なる細胞バイオアッセイを使用して、日本の下水処理施設からの流出物のためのGR-BEQsの範囲は、本研究22で二次処理水について報告されたものよりも低い（&lt;3から78 ngのデックス/ L）でした。 30 ngのデックス/ Lの最大GR応答（ 表2、サンプルE）を登録し、単一の表面の水のサンプルを除いて、残りの表面の水試料中のGR活性が低活性と一致していたオランダの地表水21に対して報告。しかし、環境イムGRアクティブな化学物質のための協定はあまり高次の効果挑戦の可能性の評価を行う、26アクティブな化学物質ERの場合よりも特徴としています。 従来の化学分析と同様に、パフォーマンスベースのQA / QC手法を使って書かれたプロトコルおよび測定の検証の遵守は、データ品質と堅牢性を最大化します。水の品質評価のために適合細胞バイオアッセイの検証は最初Mehinto ら 14で概説し、本研究に適用されるQA / QCパラメータの測定は、我々の結果は、あらかじめ指定された指針値の範囲内であることを示した、進化し、改善していきますが（ 表1 ）。これらのバイオアッセイのための検量線のパラメータは、主な違いを示す細胞（ 例えば、細胞毒性）の生存度を評価する基準を追加した他の分析プロトコル（ 例えば、GC-MS）を較正するために使用されるものを反映します。別の動作ハイスループット形式で細胞を使用して可能となる違いは、生物活性を測定する際に予想される濃度依存性応答（ 図2）を示し、複数のサンプル希釈液を含むことです。サンプル測定値の見直しでは、低いERおよび3つの二次流出物サンプル（AC）と比較して、第三の流出のためのGR応答は（試料D）、表2における当社のバイオアッセイスクリーニング結果の相対精度のさらなる証拠を提供します。コントロールの取り込みまたは関心の行列を表す基準サンプルは、この場合、水に、さらに内、特にエンティティを測定にわたってバイオアッセイの結果を比較する能力を高めることになります。 この研究で使用さERとGRトランス細胞系の応答は、それぞれ、強いアゴニストE2およびデキサメタゾンの活動に対して表されました。生物活性の定量的な見積もりが発現のためにこれが可能にSAバイオアッセイ当量濃度（BEQ）。これにより、 すなわち 、従来の分析化学を介して決定個々の作動薬の濃度でBEQsの直接比較バイオアッセイ応答に貢献する化学物質の調査を可能にします。この概念はまた、効果指向分析として知られている原因物質の診断調査を、演出にbioscreeningの追加された有用性を強調しています。 SPEは、日常的に水から医薬品および他の「新興汚染物質」の広い範囲を単離するために使用されているので、我々は、水、親水性と疎水性の両方の化学物質を捕捉するように設計された吸着剤を特色以前に公開されたプロトコル9、20を用います。我々は、この技術を使用して、すべての生物活性の有機化合物の定量的な取り込みを想定しているが、追加の作業が完全に標準化し、そのような抽出法の性能を検証するために必要とされます。本研究で用いた細胞アッセイのタイプは、提示することができます別の制限。これらのアッセイは、汚染物質と核内受容体との間の相互作用を測定し、アカウントにこのような化学-膜受容体などの他の可能な相互作用を、取ることはありません。したがって、ここで測定されたスクリーニング応答が過小評価された可能性があります。サンプル抽出と同様に、標準化方法は、細胞アッセイデータを解析しないために、異なる手法が異なる結果を生成することがあります。検量線の下半分の応答をモデル化するために本研究で用いた線形回帰は、モデル化された応答は、本研究で指定された比較的狭い範囲を超えて拡張されている場合は特に、全細胞アッセイのために適切ではないかもしれません。上記の問題に追加の調査は、これらのツールは、堅牢な監視ツールとして適用可能な範囲を理解するために必要とされます。 土台の多くは内分泌アクティブな化学物質のためのスクリーンとしてERおよびGRのために敷設されているのに対し、研究者は、の範囲を拡大していますアクションの他の関連するモード、 例えば 、androgenicity、遺伝毒性、神経毒性や免疫毒性9,27が含まれるように生物学的分析ツール。より完全なツールボックスには、様々な水環境19で、28、現在および将来に起こり得る既知および/または未知の化学物質の変換生成物を含む生理活性化学物質をスクリーニングする能力を強化します。

現在の水質のモニタリングを正確かつ精密に野生動物とヒトへの暴露の代用としての化学汚染物質の発生を測定する能力を前提としています。しかし、この化学・バイ・化学的モニタリングと評価のパラダイムは、我々が直面して刻々と変化する化学の世界でペースを維持することはできません。私たちは、合成および天然の化学物質の運命と影響についての詳細を学ぶように、私たちは期待生物学的影響に対処測定ツールを探し続け、同時にそれは、化学物質の生産、使用状況や環境入力の変化に免疫があります。このようなツールは、未知または新規化学物質、および変換製品は、私たちの注目に値するかどうかを理解するために特に関連しています。また、水中に存在する化学物質の複雑な混合物はあまり個々の化学モニタリングによって対処されます。したがって、私たちはより良い表層水の股関節にこれらの問題に対処するために既存の監視ツールボックスの近代化の課題に直面しますトン下水処理水排水と都市/雨水流出の排出を受けます。 近年、生物分析技術は、水の品質評価のためのスクリーニングツールとして有望であることが示されています。知ら介して作用する化学物質への対応、特に、in&#39;vitroバイオアッセイでは、アクション1,2の特定のモードは、環境モニタリングのコミュニティ3に大きな関心が持たれています。多数の調査は飲酒、表面および廃水4 -6の内分泌活性を定量化するためにインビトロバイオアッセイで使用しています。また、バイオアッセイの数は、分子の開始イベントを（ 例えば、受容体活性化）、潜在的に有害な結果の経路を介して有害な影響にリンクさせることができる7,8を分析対象としています。 水質評価のためのbioscreeningの進化は、in vitroバイオアッセイのエンドポイントでの異なる数百人が彼らのために評価されたと、比較的急速にされていますユーティリティ9,10。水質5,6の間で分化する能力を発揮しながら、現在、バイオアッセイのほんの一握りは、（研究所内）、良好な測定精度を達成することが示されています。特に下水処理水排水のために、エストロゲンおよびグルココルチコイドステロイドの発生に成功ビトロトランスアッセイ11,12 に用いて会計処理されています。しかし、現在までのほとんどの研究は、その細胞株独自のもの（したがって、広く利用可能ではない）バイオアッセイを採用しており、継続的なケアと操作、またはその両方が必要です。その結果、プロトコルを標準化研究室間のキャリブレーション演習を行い、最終的に水資源のコミュニティに、このスクリーニング技術を転送する能力は、ヒンダードまま。 米国ToxCastプログラムを通じて吟味のin vitroバイオアッセイの少なくとも1つのサプライヤは、使いやすい「凍結融解で13市販されています。4;フォーマット。これらの分割阻止セル「キット」は、処置14の異なるレベルを表す水から抽出された化学物質の活性を測定することで堅牢であることが示されています。ベンダープロトコルは、個々の化学物質または混合物の生物活性をスクリーニングするために利用可能であるが、それらは、水サンプルに適用する前に、それらのいくつかは、修正を必要とします。下水処理水の流出物15、雨水流出16、受信水は17,18そして最近再生水の19,20水質コミュニティに関心のある水性媒体の主な例です。 本研究では、市販されている使用して、水試料中の内分泌活性を測定するための単一の、標準化されたプロトコルを提示し、分割逮捕ビトロトランスバイオアッセイで 。私たちは、TWの応答の背景、用量応答性と再現性を総合的に評価を通じてプロトコルの堅牢性を実証しました特に関心のエストロゲンとグルココルチコイド受容体トランスのOエンドポイント（ERおよびGR、それぞれ）。プロトコルは、カリフォルニアの淡水システムから下水処理水排水と表面水の画面サンプルに適用しました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="826">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:275px;">GeneBLAzer ER alpha DA assay kit</td>
			<td style="width:123px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:115px;">K1393</td>
			<td style="width:313px;">Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:275px;">GeneBLAzer GR DA assay kit</td>
			<td style="width:123px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:115px;">K1391</td>
			<td style="width:313px;">Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:275px;">PrestoBlue cell viability reagent&#160;</td>
			<td style="width:123px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:115px;">A-13261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:275px;">Trypan blue, 0.4% in PBS</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:115px;">T8154</td>
			<td>Also available at ThermoFisher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:275px;">Corning 96 well black wall, clear-bottom plate</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:115px;">3603</td>
			<td style="width:313px;">Individually wrapped, sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:275px;">Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 &#181;M</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:115px;">WHA1820025</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:275px;">Microplate aluminum sealing film</td>
			<td style="width:123px;">E&#38;K Scientific</td>
			<td style="width:115px;">T592100</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:275px;">Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent</td>
			<td style="width:123px;">Waters</td>
			<td style="width:115px;">WAT106202</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:275px;">17&#946; Estradiol</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:115px;">E2758</td>
			<td style="width:313px;">CAS #50-28-2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:275px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">A61-100</td>
			<td style="width:313px;">Also available at Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:275px;">Dexamethasone&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:115px;">D4902</td>
			<td style="width:313px;">CAS #50-02-2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:275px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:115px;">D8418</td>
			<td>Molecular grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:275px;">Solvents (acetone, hexane, methanol)</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:313px;">HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:275px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:115px;">S2002</td>
			<td style="width:313px;">Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fumehood. Also available at EMD Millipore.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:275px;">Automated cell counter or hemocytometer</td>
			<td style="width:123px;">Various*</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:313px;">Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:275px;">Class II biological safety cabinet</td>
			<td style="width:123px;">Various*</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:275px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:123px;">Various*</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:275px;">Cryogenic freezer&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Various*</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:313px;">Liquid nitrogen storage dewar is recommended.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:275px;">Fluorescence microplate reader</td>
			<td style="width:123px;">Various*</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:313px;">&#160;The reader must have bottom read capabilities.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;">* No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening for endocrine activity in water using commercially-available in vitro transactivation bioassays

試験管内トランスバイオアッセイではしかし、彼らの採用および広範囲のアプリケーションが原因で標準化された方法で堅牢な、ユーザーフレンドリーな技術の利用可能性の欠如に部分的に妨げられてきた、水質監視ツールとして有望であることが示されました。本研究では、市販されている、分割逮捕された細胞株を定量的環境の質の専門家への関心の水試料中に存在する化学物質の内分泌活性をスクリーニングするために使用しました。総合的な品質保証/品質管理（QA / QC）のチェックを含め、単一の、標準化されたプロトコルは、細胞ベースの蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）アッセイを用いて（それぞれERおよびGR）エストロゲンおよびグルココルチコイド受容体活性のために開発されました。カリフォルニア（米国）での淡水システムから処理された下水排水や地表水のサンプルは、固相抽出を用いて抽出し、標準化されたプロトを使用して、内分泌活性について分析しましたCOL。背景とエンドポイント固有の参照化学物質の用量反応は、信頼性の高い測定のために必要と認められるQA / QCのガイドラインを満たしました。地表水試料のバイオアッセイスクリーニング応答は、主に検出されませんでした。これとは対照的に、二次処理工場からの流出物サンプルは、ERのための392 ngのデキサメタゾンGR用/ Lおよび17 ngの17βエストラジオール/ Lまでの推定バイオアッセイ同等の濃度（BEQs）で、最高の測定可能な活性を有していました。三次流出物サンプルのためのバイオアッセイ応答は、高度処理後の内分泌アクティブな化学物質の低い残留を示し、二次排水のために測定されたものよりも低かったです。このプロトコルは、市販の利用ビトロトランスバイオアッセイで 、分割逮捕セル「キット」、水中の内分泌活性をスクリーニングするために適合させることができることを示しました。

本研究では、処理された都市下水排水の4倍24時間の複合サンプル、南カリフォルニアの淡水システムからの地表水の6グラブサンプルおよび超純水からなるフィールドブランクは、このプロトコルを説明するために選択しました。 4廃液試料の3は、従来の活性汚泥排水処理プラント（「二次流出液」）、および砂/炭素ろ過追加後の生物学的処理（「三次流出液」）との高度な排水処理プラントから4分の1からのものでした。地表水のサンプルは（オープン、農業や都市部）の異なる土地利用を表す流域から収集しました。 水抽出物の希釈は、DMSO対照（ 表1）と比較して観察された20％未満の細胞死で明らかな細胞毒性を示しませんでした。無細胞（メディアのみ）バックグラウンドが低く、CDMSOの応答を有する細胞のみ-と細胞との間omparison溶媒は、蛍光測定には測定可能な影響を与えなかったことを示しました。スロープおよびEC 50ログを含むアッセイ特異的な較正曲線のパラメータは、時間をかけて検量線の良好な再現性を実証的に許容される履歴値（ 表1）の範囲内でした。 ERアッセイのための許容可能な較正曲線の例を図2に示されている。17βエストラジオールおよびデキサメタゾンの選択基準の化学物質は、アッセイ応答、下水処理水と他の研究者による過去の使用で発生する可能性の強さに基づいていたとして20- 22。三重サンプル間の応答の変動は20％未満のRSDでした。したがって、すべてのデータが許容可能な品質であるとみなされ、その後排水表面水サンプル中濃度（ng / LでBEQとして表される）ERおよびGRの生物活性を推定するために使用しました。 <p claSS FO = &quot;jove_content&quot;：サンプルあたり5〜10と4の希釈のキープtogether.withinページ= &quot;1&quot;&gt;相対濃縮係数（REF）は、本研究で分析水サンプルのスクリーニングに適し登場しました。 WWTP流出物サンプルの大部分は、ERおよびGRバイオアッセイの両方についてLOD上記の用量反応を示しました。最低の希釈は、較正曲線内に応答を有し、最高の希釈は、典型的には、LOD（ 図3）未満でした。しかし、地表水抽出物は、強力なER又はGR活性を示しませんでした。 10のREFにもかかわらず、蛍光応答は、多くの場合、LODに以下近かったです。フィールドを空白のためのバイオアッセイ応答の欠如は、LOD上述の検出は、サンプリングや手続きラボアーチファクトの結果ではなかったことを確認しました。 ERおよびGR活性は17 ngのE2 / LのBEQs最高で、それぞれ10の代表的な水サンプル、（ 表2）の7及び4で検出されました<html>および392 ngのデックス/ Lは、二次排水中に見つかりました。三次流出物のサンプル中のGR活性は、バイオアッセイのLOD未満でした。同様に、ほとんどの表面の水のサンプルはLODと二次排水よりもER活性のはるかに低いレベルを超えないGRの活性を示しませんでした。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54725/54725fig2.jpg" /> 図2：ERアッセイ用量反応曲線のための検量線の例は 、平均蛍光比（±SEM）としてプロットし、シグモイド及びEC 10及びEC 50値を決定するために使用されます。曲線のこの部分は、線形回帰を用いて適合し、バイオアッセイ同等の濃度を導出するために使用されている。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54725/54725fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> レ/ ftp_upload / 54725 / 54725fig3.jpg &quot;/&gt; 図3：theRrelative濃縮係数バイオアッセイ等濃度に対してプロットした水試料の平均青/緑の蛍光比（±SEM）（BEQ）は、その希釈シリーズ限界上記2点の最小と濃度依存性反応を示したサンプルについて計算されています検出（LOD）の。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54725/54725fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td colspan="2"> エストロゲン受容体（ER）アッセイ </td><td colspan="2"> グルココルチコイド受容体（GR）アッセイ </td></tr><tr><td></td><td> 研究結果 </td><td> 合否基準 </td><td> 研究結果 </TD&gt; <td> 合否基準 </td></tr><tr><td> 較正パラメータ </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> EC50（M）を平均log </td><td> -9.6 </td><td> -9.1に-10.1 </td><td> -8.5 </td><td> -9.0に-8.0 </td></tr><tr><td>傾きを意味します</td><td> 1.1 </td><td> 0.9〜1.5 </td><td> 2.0 </td><td> 1.8から2.4 </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 150 </td><td> &gt; 0.95 </td><td> 150 </td><td> &gt; 0.95 </td></tr><tr><td> QA / QCコントロール </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>メディアの背景</td><td>はい</td><td>メディアのみ&lt;セル+メディア</td><td>はい</td><td>メディアのみ&lt;セル+メディア</td></tr><tr><td>細胞毒性（％の死亡率） </td><td> 0％ </td><td> &lt;20％の死亡率</td><td> 0〜5％ </td><td> &lt;20％の死亡率</td></tr><tr><td>サンプル精度（％のRSD）&lt;/ TD&gt; <td> 2〜18％ </td><td> &lt;20％ </td><td> 4〜13％ </td><td> &lt;20％ </td></tr></tbody></table> 表1：下水処理水排水の生物分析のスクリーニングおよび表面水試料から、QA / QCの結果のまとめ。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> サンプルIDと説明 </td><td> ER-BEQ（ngのE2 / L） </td><td> GR-BEQ（ngのデックス/ L） </td></tr><tr><td> - 完全な二次処理プラントからの放流水</td><td> 6.4 </td><td> 248 </td></tr><tr><td> B - フル二次処理プラントからの放流水</td><td> 13 </td><td> 392 </td></tr><tr><td> C - 完全な二次処理プラントからの放流水</td><td> 17 </td><td> 236 </td></tr><tr><td> D - 三次処理pから放流水LANT </td><td> 2.3 </td><td> &lt;22 </td></tr><tr><td> E - 農業地域からの表面水</td><td> &lt;0.5 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> F - 農業地域からの表面水</td><td> &lt;0.5 </td><td> &lt;22 </td></tr><tr><td> G - 都市部からの表面水</td><td> 4 </td><td> &lt;22 </td></tr><tr><td> H - 都市部からの表面水</td><td> 0.9 </td><td> &lt;22 </td></tr><tr><td> I - オープンフィールドから表面水</td><td> 0.8 </td><td> &lt;22 </td></tr><tr><td> J - オープンフィールドから表面水</td><td> &lt;0.5 </td><td> &lt;22 </td></tr><tr><td> K - フィールドブランク（超純水） </td><td> &lt;0.5 </td><td> &lt;22 </td></tr></tbody></table> 表2：エストロゲン受容体（ER-BEQ）およびグルココルチコイド受容体（GR-BEQ）交流のためのバイオアッセイ等濃度。tivityカリフォルニア（米国）で採取したサンプルの3つのタイプが分析されている：都市廃水流出物（AD）、地表水（EJ）、およびフィールドブランク（K）。

Watch this Scientific Journal Video about Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays at JoVE.com

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested ("freeze and thaw") in vitro transactivation bioassays.

水中の内分泌活性のスクリーニング市販の使い方<em&gt;インビトロ</em&gt;トランスバイオアッセイ

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

screening-for-endocrine-activity-water-using-commercially-available

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Environment

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

7.5K ビュー.  Southern California Coastal Water Research Project Authority. A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested ("freeze and thaw") in vitro transactivation bioassays.

ビデオ: Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

エンテロウイルスと文化およびRT-QPCRによる水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。ウイルスサンプルのI.コレクション

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

環境学

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

エンテロウイルスと文化およびRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。パートIII。 RT-qPCRによりウイルス検出

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated HF183 marker. The EntHF183 duplex dPCR (referred as EntHF183 dPCR hereon) assay uses the same primer and probe sequences as its published individual quantitative PCR (qPCR) counterparts. Likewise, the same water filtration and DNA extraction procedures as performed prior to qPCR are followed prior to running dPCR. However, the duplex dPCR assay has several advantages over the qPCR assays. Most important, the dPCR assay eliminates the need for running a standard curve and hence, the associated bias and variability, by direct quantification of its targets. In addition, while duplexing (i.e. simultaneous quantification) Enterococcus and HF183 in qPCR often leads to severe underestimation of the less abundant target in a sample, dPCR provides consistent quantification of both targets, whether quantified individually or simultaneously in the same reaction. The dPCR assay is also able to tolerate PCR inhibitor concentrations that are one to two orders of magnitude higher than those tolerated by qPCR. These advantages make the EntHF183 dPCR assay particularly attractive because it simultaneously provides accurate and repeatable information on both general and human-associated fecal contamination in environmental waters without the need to run two separate qPCR assays. Despite its advantages over qPCR, the upper quantification limit of the dPCR assay with currently available instrumentation is approximately four orders of magnitude lower than that achievable by qPCR. Consequently, dilution is needed for measurement of high concentrations of target organisms such as those typically observed following sewage spills.

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay that can be used to simultaneously quantify Enterococcus spp. and the HF183 genetic markers as indicators of general and human-associated fecal contamination in recreational waters.

の同時定量のための二重デジタルPCRアッセイ<em&gt;エンテロコッカス属。</em&gt;およびWatersにおけるヒトの糞便関連HF183マーカー

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study provides a protocol for the passive sampler preparation, calibration, extraction method and instrumental analysis. Sampling rates (RS) and passive sampler-water partition coefficients (KPW) were calculated for silicone rubber, polar organic chemical integrative sampler POCIS-A, POCIS-B, SDB-RPS and C18 disk. The uptake of the selected compounds depended on their physicochemical properties, i.e., silicone rubber showed a better uptake for more hydrophobic compounds (log octanol-water partition coefficient (KOW) &#62; 5.3), whereas POCIS-A, POCIS-B and SDB-RPS disk were more suitable for hydrophilic compounds (log KOW &#60; 0.70).

A protocol about the characterization and application of five different passive sampling devices is presented.

水中の農薬のモニタリングのための特性とパッシブサンプラーの応用

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

A Simple Planting Technique for Re-establishing Trees Where Frequent Inundation Occurs

Many of the Everglades tree islands have lost elevation over the past century and most of their trees have died such that they are now covered with herbaceous plants. This protocol describes a simple, cost-effective tree planting technique needed for restoring degraded Everglade tree islands. The design is patterned after a natural Everglades process that creates floating peat islands, which allows tree survival and growth in flooded conditions and often leads to the development of tree islands. Commercially available peat bags were used as the medium for the growth and establishment of potted native tree saplings. The pop-up configuration floated initially and provided additional elevation to minimize inundation, with a single native tree species sapling and a single tree fertilizer spike. During a 3 year study involving 105 pop-ups, most plants survived (80%) and many thrived. Determining whether this technique can establish trees on a degraded tree island will require longer studies and extensive field tests.

This protocol describes a simple, cost-effective tree planting technique for restoring degraded Everglades tree islands that experience inundation. The design creates an island (pop-up) which floats initially and adds elevation to promote tree survival and growth under flooded conditions.

単純な頻繁に浸水が発生した再構築ツリー手法を植栽

Many of the Everglades tree islands have lost elevation over the past century and most of their trees have died such that they are now covered with ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol for performing in situ juvenile exposure tests within oligotrophic river catchments over one-month and three-month periods. Two methods (in both modifications) are presented to evaluate the juvenile growth and survival rate. The methods and modifications differ in value for the locality bioindication and each has its benefits as well as limitations. The sandy cage method works with a large set of individuals, but only some of the individuals are measured and the results are evaluated in bulk. In the mesh cage method, the individuals are kept and measured separately, but a low individual number is evaluated. The open water exposure modification is relatively easy to apply; it shows the juvenile growth potential of sites and can also be effective for water toxicity testing. The within-bed exposure modification needs a high workload but is closer to the conditions of a natural juvenile environment and it is better for reporting the real suitability of localities. On the other hand, more replications are needed in this modification due to its high-hyporheic environment variability.

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

In situ bioindications enable determination of the suitability of an environment for endangered mussel species. We describe two methods based on the juvenile exposure of freshwater pearl mussels in cages to oligotrophic river habitats. Both methods are implemented in variants for open water and hyporheic water environments.

若い淡水パール ムール貝原露出メソッドを使用して Bioindication ストリーム環境適合性のテスト

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Optimized Procedure for Determining the Adsorption of Phosphonates onto Granular Ferric Hydroxide using a Miniaturized Phosphorus Determination Method

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric hydroxide (GFH), with little effort and high reliability. The phosphonate, e.g., nitrilotrimethylphosphonic acid (NTMP), is brought into contact with the GFH in a rotator in a solution buffered by an organic acid (e.g., acetic acid) or Good buffer (e.g., 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) [MES] and N-cyclohexyl-2-hydroxyl-3-aminopropanesulfonic acid [CAPSO]) in a concentration of 10 mM for a specific time in 50 mL centrifuge tubes. Subsequently, after membrane filtration (0.45 &#181;m pore size), the total phosphorus (total P) concentration is measured using a specifically developed determination method (ISOmini). This method is a modification and simplification of the ISO 6878 method: a 4 mL sample is mixed with H2SO4 and K2S2O8 in a screw cap vial, heated to 148-150 &#176;C for 1 h and then mixed with NaOH, ascorbic acid and acidified molybdate with antimony(III) (final volume of 10 mL) to produce a blue complex. The color intensity, which is linearly proportional to the phosphorus concentration, is measured spectrophotometrically (880 nm). It is demonstrated that the buffer concentration used has no significant effect on the adsorption of phosphonate between pH 4 and 12. The buffers, therefore, do not compete with the phosphonate for adsorption sites. Furthermore, the relatively high concentration of the buffer requires a higher dosage concentration of oxidizing agent (K2S2O8) for digestion than that specified in ISO 6878, which, together with the NaOH dosage, is matched to each buffer. Despite the simplification, the ISOmini method does not lose any of its accuracy compared to the standardized method.

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric hydroxide, with little effort and high reliability. In a buffered solution, the phosphonate is brought into contact with the adsorbent using a rotator and then analyzed via a miniaturized phosphorus determination method.

最適化された小型リン定量法を用いた粒状水酸化第二鉄に酸の吸着を確認する手順

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric ...

Colletotrichum fioriniae Development in Water and Chloroform-based Blueberry and Cranberry Floral Extracts

To accurately monitor the phenology of the bloom period and the temporal dynamics of floral chemical cues on fungal fruit rotting pathogens, floral extraction methods and coverslip bioassays were developed utilizing Colletotrichum fioriniae. In blueberry and cranberry, this pathogen is optimally controlled by applying fungicides during the bloom period because of the role flowers play in the initial stages of infection. The protocol detailed here describes how floral extracts (FE) were obtained using water-, chloroform-, and field rainwater-based methods for later use in corresponding glass coverslip bioassays. Each FE served to provide a different set of information: response of C. fioriniae to mobilized floral chemical cues in water (water-based), pathogen response to flower and fruit surface waxes (chloroform-based), and field-based monitoring of collected floral rainwater, moving in vitro observations to an agricultural setting. The FE is broadly described as either water- or chloroform-based, with an appropriate bioassay described to compensate for the inherent differences between these two materials. Rainwater that had run off flowers was collected in unique devices for each crop, alluding to the flexibility and application of this approach for other crop systems. The bioassays are quick, inexpensive, simple, and provide the ability to generate spatiotemporal and site-specific information about the presence of stimulatory floral compounds from various sources. This information will ultimately better inform disease management strategies, as FE decrease the time needed for infection to occur, thus providing insight into changing risks for pathogen infection over the growing season.

Colletotrichum fioriniae Development in Water and Chloroform-based Blueberry and Cranberry Floral Extracts

Here, bioassays designed to monitor the development of a fungal pathogen, Colletotrichum fioriniae, in the presence of blueberry or cranberry floral extracts on glass coverslips are described. Water-, chloroform-, and field rainwater- based floral extraction techniques are detailed as well as insight into how this information can be applied.

うり fioriniae水やクロロホルム ベースのブルーベリーとクランベリーの花エキスの開発

To accurately monitor the phenology of the bloom period and the temporal dynamics of floral chemical cues on fungal fruit rotting pathogens, floral ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for describing the vegetation structure in the fields of ecology, forestry, and agriculture. Therefore, procedures of three commercially used methods (litter traps, needle technique, and a plant canopy analyzer) for performing LAI estimation were presented step-by-step. Specific methodological approaches were compared, and their current advantages, controversies, challenges, and future perspectives were discussed in this protocol. Litter traps are usually deemed as the reference level. Both the needle technique and the plant canopy analyzer (e.g., LAI-2000) frequently underestimate LAI values in comparison with the reference. The needle technique is easy to use in deciduous stands where the litter completely decomposes each year (e.g., oak and beech stands). However, calibration based on litter traps or direct destructive methods is necessary. The plant canopy analyzer is a commonly used device for performing LAI estimation in ecology, forestry, and agriculture, but is subject to potential error due to foliage clumping and the contribution of woody elements in the field of view (FOV) of the sensor. Eliminating these potential error sources was discussed. The plant canopy analyzer is a very suitable device for performing LAI estimations at the high spatial level, observing a seasonal LAI dynamic, and for long-term monitoring of LAI.

An accurate estimation of leaf area index (LAI) is crucial for many models of material and energy fluxes within plant ecosystems and between an ecosystem and the atmospheric boundary layer. Therefore, three methods (litter traps, needle technique, and PCA) for taking precise LAI measurements were in the presented protocol.

純粋な落葉スタンドにおける3つの異なる方法を用いてリーフエリア指数推定

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...

Measuring Phosphorus Release in Laboratory Microcosms for Water Quality Assessment

Phosphorus (P) is a critical limiting nutrient in agroecosystems requiring careful management to reduce transport risk to aquatic environments. Routine laboratory measures of P bioavailability are based on chemical extractions performed on dried samples under oxidizing conditions. While useful, these tests are limited with respect to characterizing P release under prolonged water saturation. Labile orthophosphate bound to oxidized iron and other metals can rapidly desorb to solution in reducing environments, increasing P mobilization risk to surface runoff and groundwater. To better quantify P desorption potential and mobility during extended saturation, a laboratory microcosm method was developed based on repeated sampling of porewater and overlying floodwater over time. The method is useful for quantifying P release potential from soils and sediments varying in physicochemical properties and can improve site-specific P mitigation efforts by better characterizing P release risk in hydrologically active areas. Advantages of the method include its ability to simulate in situ dynamics, simplicity, low cost, and flexibility.

Accurate quantification of phosphorus (P) desorption potential in saturated soils and sediments is important for P modeling and transport mitigation efforts. To better account for in situ soil-water redox dynamics and P mobilization under prolonged saturation, a simple approach was developed based on repeated sampling of laboratory microcosms.

水質評価のための実験室用微小宇宙におけるリン放出の測定

Phosphorus (P) is a critical limiting nutrient in agroecosystems requiring careful management to reduce transport risk to aquatic environments. Routine ...