著者は、イメージングの彼女の寛大な支援のため、ルースZelkha、MSに感謝します。この研究は、ARD、国立眼研究所、NIH、および研究から失明防止への無制限の助成金からコアグラントEY01792への助成金R01のEY024349-01A1、MEに臨床サイエンティスト育成プログラム賞K12EY021475によってサポートされていました。 ARDは失明を防止するための研究からキャリア開発賞を受賞です。

動物で行わすべての手順は、視覚研究における動物の使用のためのビジョンと眼科文での研究のための協会に準拠しています。 6ヶ月齢のオス/メスC57BL / 6J野生型マウスへフォーティーン四を使用した：10損傷モデルのためのマウスと対照動物として4（無傷角膜を）。 1.動物の準備<ol><li> 100mg / kgのケタミンおよび5mg / kgのキシラジン混合物の腹腔内注射でマウスを麻酔。麻酔が反映された後、麻酔の深さを確認するためにつま先をつまみます。動物が反応してはなりません。 </li><li>以前の角膜損傷がないことを確認するために実験を行う前に、スリットランプの下で目を点検します。 </li><li>眼に1％塩酸テトラカインの低下を植え付けます。 60後 - 90秒、感覚がないことを確認するために、角膜反射をテストします。プロパラカイン塩酸塩0.5％を代わりに使用することができます。 </li><li>角膜感覚の損失がある場合特定の、静かに目にし、目の周りの毛に5％ポビドンヨードのドロップを置きます。 1分後にドロップを拭き取るか、ツールチップに干渉から髪を防止するために、目の周りの毛の上に広げました。 </li></ol> 2.角膜上皮擦過<ol><li>手術用手袋とガウンを着用してください。無菌回転バリと滅菌ピンセット：必要なツールを準備します。より良い制御のために、曲がったピンセットを使用しています。手順中に滅菌シート上のツールを配置します。 </li><li>曲がったピンセットを使用して、鼻側から蓋をつかみ、そっと目をproptosingことで目を安定させます。あまりにも多くの圧力を使用しないでください。 </li><li>手術用顕微鏡下で、二回滅菌回転バリを使用して、輪部領域の周囲360°を剃ります。ラウンドごとに6秒 - 5の速度で角膜輪部の周りに移動します。 注：バリが1固定速度を持っています。しかし、それは確立された速度で回転するために、「先端ナットは「完全に締めてください。 </li><li>回転バリで角膜輪部に角膜輪部から全体の角膜上皮を削除します。より良い結果を得るために、循環方式でツールを移動し、それが角膜表面に多少の並列先端の側面で動作するように保持します。上皮はすでに削除されていない再ブラッシング領域によって間質を傷つけないように注意してください。眼の上の任意の圧力を加えないでください。必要に応じてブラシの先端を清掃してください。 </li><li>角膜上の滅菌リン酸緩衝生理食塩水のドロップを植え付けると柔らかいクリーニングティッシュで任意の切り離された上皮シートを乾いた布で拭き取ってください。 </li><li>もしあれば、残りの上皮を剃ります。 </li><li>手術中にマウス尾に注意してください。 注：任意の動きが発生した場合、麻酔の深さが薄れており、さらなる注入が必要です。一次注入量の三分の二の三分の一は十分なものでなければなりません。麻酔薬で動物を過剰摂取しないでください。 </li><li>別の目でそれらを使用する前に、すべてのツールを滅菌します。 </li></ol> 3.完全な上皮削除の確認<ol><li>角膜に1mg / mlのフルオレセインナトリウムの低下を適用します。 30秒後に角膜をきれいにし、上皮の完全な除去を確認するために、コバルトブルーフィルターを用いて、顕微鏡下でそれを調べます。 注：上皮欠損と角膜の領域が緑色に可視化されます。 </li></ol> 4.ポスト操作のケア<ol><li>加熱毛布の上に動物を入れて、回復の下ながら（そのケージに、例えば ）安全な場所に保管してください。意識的なものの会社に無意識の動物を保管しないでください。 </li><li> 1％のエリスロマイシン眼軟膏を適用します。これはまた、眼の乾燥を防ぐことができます。アプリケーションに一週間のための抗生物質の日常を続けます。 </li><li>キロブプレノルフィン皮下処置後にし、再び12時間後/ 0.1ミリグラムを注入します。 2日間一日二回の注射を続けます。 </li><li>麻酔から完全に回復するまで、45分 - 30のための動物を観察します。 注意：回復の下ながら、腹面に呼吸筋の軽度の運動は、動物の健康を示しています。 </li></ol>

<ol>
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E., Lorca, T., Castro, A., Burgess, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+inhibition+of+Cdk1+in+G+2+phase+overrides+the+SAC+and+decouples+mitotic+events.">Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events.</a> Cell Cycle. 13, 1400-1412 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have nothing to disclose.

この記事では、LSCDのマウスモデルを作成するための再現性と比較的単純な技術が記載されています。注目に値するこのモデルのいくつかの重要な側面があります。まず、化学物質11を使用する機種、12とは異なり、損傷は主に表面上皮（と基底膜）を含み、下層の角膜実質にまたは他の眼内構造への最小限のダメージで。従って、手順を複雑にし、それがより困難輪部幹細胞を目的とした任意の介入の結果を評価するために行うことができ、どちらも限られた炎症および瘢痕化があります。 Li らによって面白い最近の研究。外科的及び化学的処理の異なる組み合わせで、回転バリの使用を比較10は 、また、バリがウサギにおいてLSCDを作成するより安全でより効果的であることがわかりました。第二に、モデルは、少なくとも最大3ヶ月間1安定であると思われます。このモデルを作成するの使用を含みます回転バリ、角膜と連携臨床医に、だけでなく、マウスの創傷研究を行う者によく知られている楽器。鈍いスパチュラを使用して以上、その利点は、傷害がより均一で再現性の1であるということです。 より良い輪部幹細胞を破壊するために、輪部領域が2回処理しました。マウスの眼に取り組んでの経験に基づいて、以上の2回の治療は、多くの場合、輪部血管を磨耗や出血が発生します。ケースでは技術は他の動物において使用され、このステップは、角膜上皮の厚さに応じて変更されるかもしれません。本研究では、0.5 mmのバリの先端と、電動工具を使用しました。他の形状およびサイズのバリのヒントも利用可能であり、角膜の仕様上、目の大きさに応じて、代わりに使用することができます。 Li ら 。 10は一貫して 、ウサギの角膜や角膜縁上皮を除去するのに適していることが2.5 mmのバリを報告しました。 最適なを取得するにはその結果、角膜縁と角膜上皮は円形に剃られ、バリの側面を使用しました。ツールチップに干渉する動物の毛を防ぐために、ポビドンヨードドロップではなく拭き取るされるので、目の周りの毛に広げました。これは穿孔を引き起こす可能性があるようなツールは、一つの場所で静的に動作させることがないようにしてください。出血をもたらす可能性が非常に遅いペースで輪部を処理します。ラウンド当たり約6秒の速度は、C57BL / 6Jマウスの目に適しています。これはより多くの炎症や間質の不透明化を誘発するように、裸の間質を再ブラッシングを回避することが重要です。上皮を研磨しながら、圧力が眼に適用されるべきではありません。手順の後、角膜は、完全な上皮の除去を確認するために、フルオレセイン色素で染色しました。動物の回復中に目の乾燥を防止することが重要です。制限事項は、この技術は、幹細胞の100％を削除することはできませんということです。また、いくらかのオペレータに依存し、COを与える練習を必要としますnsistent結果。 角膜上皮表現型を研究すると、ホールマウント染色は、このモデルの結果を評価するための最良の方法です。断面は唯一の特定の各セクションについての情報を与えるのに対し、それは、全体の角膜上皮を一度に評価することを可能にするためです。 この制御技術は、同様にマウスにおいて、おそらく他の動物にLSCDを誘導することができます。これは、新規の治療法を研究するために、疾患の病態生理の広い側面を発見するLSCDの適切なモデルを提供します。いくつかの変更を加えて、それは同様に、角膜創傷治癒、血管新生、およびリンパ管新生を研究するのに有用であり得ます。

角膜上皮は角膜の透明性および完全性を維持するために必要とされます。それは、常に角膜や結膜の接合部に輪部の狭いゾーンに存在する上皮幹細胞によって生涯を通じて更新されます。これらの自己再生輪部幹細胞が両方正常および損傷後、角膜上皮の再生に重要な役割を果たしています。これらの幹細胞の部分的または完全な枯渇は、再発性角膜びらん、疼痛、角膜の瘢痕化および血管新生において杯細胞の出現をもたらし、未処理の、角膜失明を残した場合であろう。この条件は、輪部幹細胞欠損（LSCD）として知られており、特発性であり得ます。遺伝性;または起因する化学的または熱的傷害、長期的なコンタクトレンズは着用し、慢性炎症1-6に取得しました。 LSCDに関する研究は、適切な動物モデルを必要とするだけでなく、模倣、ヒトにおける疾患は、しかし、少なくともで、再現性と持続可能です他の角膜および眼の構造への損傷のマウント。このモデルは、治療を評価し、分子および細胞レベルでの疾患のメカニズムを解明することが必要です。 1前に説明したように、回転するバリを使用して、人は簡単上述の利点があり、少なくとも3ヶ月間持続するLSCDのマウスモデルを開発することができます。本研究の目的はLSCDの、簡単な再現性、持続可能なマウスモデルを提示することです。 回転バリが均等に根本的な間質1を傷つけることなく、上皮を除去する便利なツールです。創傷治癒研究において中心角膜びらん7,8を誘導するために使用されてきました。マウスでLSCDを作成するためにここに提示された技術は、以前に報告されていません。以前より回復Oで、不均一で傷害特に輪部と複数の変数の表現型1、9時鈍いスパチュラ結果と上皮を削る方法を導入F正常な角膜上皮1。鈍スクレーパと異なり、回転バリがよく7、8、10などの上皮基底膜を除去します。幹細胞を切断するための他の報告された方法は、下にある眼の構造への不要な損傷を引き起こすことができるだけでなく、有意な炎症およびその後の角膜の混濁またはにつながるだけでなく、水酸化ナトリウム、N-ヘプタノール、及び塩化ベンザルコニウムのような化学物質の使用を含みます上皮の扁平上皮化生11-15。回転バリは、これらの重篤な合併症に関連付けられていません。外科的に輪部上皮を除去し、単独で、または化学物質10、11、16を使用して、実行することがより困難であり、小さな目と（マウスなどの）薄い輪部上皮を有する動物における最良の選択肢ではありません。また、驚くべきことに、limbectomyはまだ10の背後にある輪部上皮の一部を残すことができます。 以下に記載された技術は、血管新生のANとLSCDになります患者における完全なLSCDの提示を模倣し、少なくとも3ヶ月1持続dはconjunctivalization。これは、マウスにおけるLSCDまたは創傷治癒の病態生理、免疫学、および潜在的な治療法を研究することを目指している人に適しています。おそらく、いくつかの修正を加えて、この手順は、ラットまたはウサギ10で行うことができます。回転バリが効率的に上皮を除去するように、角膜上皮摩耗/創傷および関連する治療または分子生物学的研究に関連する任意の研究に利用され得ます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1091">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Rumex International Co, Clearwater, FL</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 16-141</td>
			<td style="width:351px;">0.5 mm burr. Also available from other companies.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Surgical microscope</td>
			<td style="width:277px;">Wild Heerbrugg, Switzerland</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Wild M691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Digital camera</td>
			<td style="width:277px;">Nikon, Thailand</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Nikon FS-2 slit lamp</td>
			<td style="width:277px;">Nikon, Japan</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Polyclonal anti-CK12 antibody</td>
			<td style="width:277px;">Santa Cruz Blotechnology, CA,</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; SC-17101</td>
			<td>1:100 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Monoclonal anti-CK8 antibody</td>
			<td style="width:277px;">TROMA-I-s, Iowa City, IA</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; AB_531826</td>
			<td>1:50 concentration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple mechanical procedure to create limbal stem cell deficiency in mouse

輪部幹細胞欠損（LSCD）は、角膜上皮が結膜に置換された後輪部上皮幹細胞の機能不全または損失の状態です。患者は、再発性角膜欠陥、痛み、炎症、および視力の喪失に苦しみます。 以前は、LSCDのマウスモデルを説明し、2他のモデルと比較しました。目標は、両方の模倣、ヒトにおける表現型とは、疾患の病態生理を研究し、新しい治療法を評価することを可能にするのに十分長く続くLSCDの一貫性のマウスモデルを生成することでした。ここでは、技術は、より詳細に説明します。 回転バリでの電動工具は、角膜表面から錆リングを除去するために、または患者における翼状片のベッドを滑らかにするために設計されています。所望LSCDモデルを作成するのに適した装置です。それはのように、小さな目での作業のために、それが適切になる細かいチップで容易に入手できる、使いやすいツールですマウスインチそのアプリケーションは、眼への不必要な外傷を防止し、多くの場合、化学的損傷モデルの場合と同様に、それは、不要な怪我にはなりません。鈍スクレーパとは対照的に、基底膜と上皮を除去します。このプロトコルでは、輪部領域は2回擦過した後、全体の角膜上皮は、角膜縁から角膜縁に剃毛しました。間質損傷を避けるために、注意が上皮は既に削除された後に角膜表面を磨くしないように注意しました。

この技術を実行した後ヶ月以内に、角膜の100％が（ 図1A。写真は、明視野下でのスリットランプとコバルトブルーフィルターに接続されたカメラで撮影された）表面的な血管新生を開発しました。目の18/20（90％）において、血管新生は、全角膜表面（ 図1A）が関与します。 2/20（10％）で、血管新生が3 4の角膜の象限で観察されたが、それはまだ、角膜中央に達しました。 LSCDの発展を検証するために、ホールマウント免疫染色は、1を行いました。このステップは、プロトコルの一部ではなく、目標や興味に応じて変更することができます。 3つのバリエーションはLSCDの指標として考えられていたサイトケラチン（CK）の欠如12、正常な角膜上皮細胞17、18に特有の中間径フィラメント。 CK8の外観、単純な上皮マーカー<s通常の角膜上に存在しない&gt; 20アップ。そして、角膜表面上の杯細胞の存在。以前に1,9記載されているように角膜上皮表現型を評価するために、CK12およびCK8のための二重免疫染色は、3ヶ月の傷害後の全載試料について行きました。ゴブレット細胞の存在は、上皮除去後の19 45日、MUC5AC杯細胞特異的ムチン免疫染色1、15によって評価しました。杯細胞の出現は、時間に短縮されます。最良の結果を得るために、それ未満二ヶ月損傷後の染色を行うことが重要です。 角膜表面-throughout通常、無傷の角膜成熟した角膜上皮細胞17の急行CK12特異的マーカー、18を 、彼らは全体のマウント・サンプル（ 図1B）の角膜側でのCK8や杯細胞（MUC5AC）を欠いています。正常な眼と比較して、CK12の発現はinjurにほとんど存在しません<html> yのモデル角膜、彼らは大幅にCK8のための陽性染色を示し、細胞（ 図1B）を杯ながら。これらの観察は、LSCDの発展を示しています。 免疫染色の結果を定量化することに興味を持っている場合は、別々に同じ設定の下、顕微鏡で撮影したオリジナルの、変更されていない画像に20免疫染色密度を定量化するためにイメージ-Jを使用しています。簡単に言えば、ホールマウント標本の角膜の一部を選択し、その領域のための統合密度と面積を測定し、バックグラウンド20に対して補正密度を計算します。 CK8密度に対するCK12の比は、以前のサンプル1より多くの数の上で発表されました。対照と比較して減少率（正常な角膜）と角膜表面上の杯細胞の出現はLSCDの開発を実証します。 658 / 54658fig1.jpg &quot;/&gt; 図1： マウスにおけるLSCDを作成した後、角膜の表現型。細隙灯顕微鏡検査は、全ての角膜は、1ヶ月（：0.5ミリメートルA、スケールバー）によって血管新生のいくつかの程度を開発することを示しています。通常の角膜はすべて、角膜の上にCK12を発現するが、任意のCK8や杯細胞（MUC5AC）を欠いています。 CK8および杯細胞は、角膜（：200μmのB、スケールバー）に表示されている間CK12は、LSCDモデルには存在しません。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54658/54658fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

次の記事では効果的に輪部幹細胞欠損（LSCD）の持続可能なマウスモデルを作成する簡単な、再現可能な技術を提供します。この動物モデルで試験し、輪部幹細胞疾患の治療の有効性を比較するのに有用です。

マウスで輪部幹細胞欠損を作成するための単純な機械的手順

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

a-simple-mechanical-procedure-to-create-limbal-stem-cell-deficiency

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

8.3K ビュー.  University of Illinois at Chicago. 次の記事では効果的に輪部幹細胞欠損（LSCD）の持続可能なマウスモデルを作成する簡単な、再現可能な技術を提供します。この動物モデルで試験し、輪部幹細胞疾患の治療の有効性を比較するのに有用です。 

ビデオ: A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

のマウスモデル子宮内で移植

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

医学

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

単離骨格筋のミオ - 機械的分析

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

マウス肺挿管の簡単な方法

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of microvasculature at the site of inflammation. Parabiotic partners share their circulating antigens and thus are free of adverse immune reaction. First described by Paul Bert in 18641, the parabiosis surgery was refined by Bunster and Meyer in 1933 to improve animal survival2. In the current protocol, two mice are surgically joined following a modification of the Bunster and Meyer technique. Animals are connected through the elbow and knee joints followed by attachment of the skin allowing firm support that prevents strain on the sutured skin. Herein, we describe in detail the parabiotic joining of a ubiquitous GFP expressing mouse to a wild type (WT) mouse. Two weeks after the procedure, the pair is separated and GFP positive cells can be detected by flow cytometric analysis in the blood circulation of the WT mouse. The blood chimerism allows one to examine the contribution of the circulating cells from one animal in the other.

Parabiotic joining of two organisms leads to the development of a shared circulatory system. In this protocol, we describe the surgical steps to form a parabiotic connection between a wild-type mouse and a constitutive GFP-expressing mouse.

マウスの並体結合：詳細なプロトコル

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of ...

A Surgical Procedure for Resecting the Mouse Rib: A Model for Large-Scale Long Bone Repair

This protocol introduces researchers to a new model for large-scale bone repair utilizing the mouse rib. The procedure details the following: preparation of the animal for surgery, opening the thoracic body wall, exposing the desired rib from the surrounding intercostal muscles, excising the desired section of rib without inducing a pneumothorax, and closing the incisions. Compared to the bones of the appendicular skeleton, the ribs are highly accessible. In addition, no internal or external fixator is necessary since the adjacent ribs provide a natural fixation. The surgery uses commercially available supplies, is straightforward to learn, and well-tolerated by the animal. The procedure can be carried out with or without removing the surrounding periosteum, and therefore the contribution of the periosteum to repair can be assessed. Results indicate that if the periosteum is retained, robust repair occurs in 1 - 2 months. We expect that use of this protocol will stimulate research into rib repair and that the findings will facilitate the development of new ways to stimulate bone repair in other locations around the body.

The overall goal of this procedure is to successfully resect a portion of bone from the rib of a mouse. The procedure was developed as a model to study large-scale long bone repair.

マウスリブを切除するための外科的手順：大規模ロング骨修復のためのモデル

This protocol introduces researchers to a new model for large-scale bone repair utilizing the mouse rib. The procedure details the following: preparation ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

新しい治療戦略を開発するための膵臓癌幹細胞特性を研究

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe the use of a simple device to cut and &#8216;roll&#8217; mouse intestines to rapidly prepare whole mount preparations of superior and uniform quality to that which can be achieved by hand. The device comprises a base that holds 4 stainless steel rods and a top, which acts a cutting guide. The rods are inserted into the lumen of the small intestine [divided into thirds] and the colon. The rods and samples are then placed over a piece of filter paper or card into the holding slots in the base of the device. The top of the device is then positioned and serves as a cutting guide. The two angled sections in the center of the top piece are used to guide a knife or scalpel and cut the intestines longitudinally on the top of the rods. Once the intestinal sections have been cut, the top is removed and the card,&#160;tissue and rods gently removed from the device and placed on the bench. The rods are then gently rolled sideways to flatten and stick the intestinal segments onto the underlying piece of filter paper or card. The final preparation can then be examined or fixed and stored for later analysis. The preparations are invaluable for the study of intestinal changes in normal or genetically modified mouse models. The preparations have been used for the study and quantification of the effects of inflammation (colitis), damage, pre-cancerous lesions (aberrant crypt foci (ACFs) and mucin depleted foci (MDFs)) and polyps or tumors.

The use of a simple device to cut and &#8216;roll&#8217; mouse intestines to rapidly prepare whole mount preparations is described.

急速にマウス腸のホールマウントを準備するための簡単​​な装置

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

新生児マウス脊髄圧縮損傷モデル

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

静脈介在モデル：バイパスグラフト開存を研究するための適切なモデル

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of therapeutic stem cells via the intranasal route is a recently discovered alternative strategy, with strong potential for clinical translation, due to its non-invasive nature compared to intracranial implantation or delivery via systemic routes. The lack of blood brain barrier further strengthens the therapeutic potential of stem cells undergoing intranasal brain entry. This article summarizes the essential techniques utilized in our studies and outlines the basic principles of intranasal strategy for stem cell delivery using a mouse model of intracranial glioma xenografts. We demonstrate the optimized procedures that generate consistent and reproducible results with specific predetermined experimental parameters and offer guidelines for streamlined work flow that ensure efficient execution and reliable experimental outcome. The article is designed to serve as a baseline for further experimental customization based on hypothesis, stem cell types, or tumor specifics.

Stem cells are promising therapeutic carriers to treat brain tumors due to their intrinsic tumor tropism. Non-invasive intranasal stem cell delivery bypasses the blood brain barrier and demonstrates strong potential for clinical translation. This article summarizes the basic principles of intranasal stem cell delivery in a mouse model of glioma.

マウスモデルにおける膠芽細胞腫に対する治療用幹細胞の鼻腔内送達

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of ...