Gli autori ringraziano Ruth Zelkha, MS, per la sua generosa assistenza nella diagnostica per immagini. Questa ricerca è stata sostenuta dal programma clinico Scientist Development Award K12EY021475 a me, concedere R01 EY024349-01A1 a ARD, nucleo concessione EY01792 dal National Eye Institute, NIH, e una sovvenzione illimitata di ricerca per la prevenzione cecità. ARD è il destinatario di un Development Award carriera da Research per prevenire la cecità.

Tutte le procedure eseguite su animali siano conformi con l&#39;Associazione per la Ricerca in Oftalmologia dichiarazioni di visione e per l&#39;uso di animali nella ricerca visione. Quattordici quattro a sei mesi di età 6J maschio / femmina C57BL / selvatici tipo sono stati utilizzati: dieci topi per il modello infortunio e quattro come animali di controllo (cornee illesi). 1. Preparazione degli animali <ol><li> Anestetizzare un mouse con un&#39;iniezione intraperitoneale di 100 mg / kg di ketamina e xilazina miscela 5 mg / kg. Dopo l&#39;anestesia ha avuto effetto, pizzicare la punta di confermare la profondità dell&#39;anestesia; l&#39;animale non dovrebbe reagire. </li><li> Controllare l&#39;occhio sotto una lampada a fessura prima di condurre gli esperimenti per verificare l&#39;assenza di qualsiasi lesione corneale precedente. </li><li> Instillare una goccia di 1% tetracaina cloridrato sull&#39;occhio. Dopo 60-90 secondi, testare il riflesso corneale per confermare l&#39;assenza di sensazione. Proparacaina cloridrato 0,5% può essere usato al posto. </li><li> Quando la perdita di sensibilità corneale ècerto, inserire delicatamente un calo del 5% iodopovidone sull&#39;occhio e sui capelli intorno all&#39;occhio. Pulire la caduta dopo 1 min o diffonderlo sui capelli intorno all&#39;occhio per evitare che i capelli di interferire con la punta dello strumento. </li></ol> 2. abrasione l&#39;epitelio corneale <ol><li> Indossare guanti chirurgici e un abito. Preparare gli strumenti necessari: una fresa rotante sterile e un paio di pinzette sterili. Per un migliore controllo, utilizzare una pinzetta piegate. Posizionare gli strumenti su un foglio sterile durante la procedura. </li><li> Utilizzando le pinzette piegate, stabilizzare l&#39;occhio afferrando i coperchi dal lato nasale e proptosing delicatamente l&#39;occhio. Evitare l&#39;uso di troppa pressione. </li><li> Sotto un microscopio operatorio, la barba di 360 ° intorno alla zona limbare due volte utilizzando la fresa rotante sterile. Andare in giro per il limbo, con una velocità di 5 - 6 secondi per ogni turno. NOTA: La fresa ha una velocità fissa. Tuttavia, per farlo ruotare alla velocità stabilita, il &quot;dado estremità&quot; deve essere completamente serrato. </li><li> Rimuovere l&#39;intero epitelio corneale dal limbus al limbo con la bava rotante. Per ottenere risultati migliori, spostare l&#39;utensile in modo circolare e tenerlo po parallelo alla superficie corneale per lavorare con il lato laterale della sua punta. Fare attenzione a non danneggiare lo stroma, non ri-spazzolare le aree in cui è già stato rimosso l&#39;epitelio. Non applicare alcuna pressione sugli occhi. Pulire la punta del pennello, come richiesto. </li><li> Instillare una goccia di sterile PBS sulla cornea e rimuovere eventuali fogli epiteliali indipendente con un panno di pulizia morbido. </li><li> Radere l&#39;epitelio rimanente, se presente. </li><li> Prestare attenzione alla coda di topo durante l&#39;intervento chirurgico. NOTA: se si verifica un movimento, la profondità dell&#39;anestesia è sbiadito ed è necessaria un&#39;ulteriore iniezione. Un terzo a due terzi del volume iniettato primario dovrebbe essere sufficiente. Non overdose l&#39;animale con il farmaco anestetico. </li><li> Sterilizzare tutti gli strumenti prima di utilizzarli su un altro occhio. </li></ol> 3. Conferma completa rimozione epiteliale <ol><li> Applicare una goccia di 1 mg / ml di sodio fluoresceina sulla cornea. Pulire la cornea dopo 30 sec ed esaminare sotto un microscopio con un filtro blu cobalto, per verificare la completa rimozione dell&#39;epitelio. NOTA: le zone corneali con difetti epiteliali sono visualizzati in verde. </li></ol> 4. Post-operazione di cura <ol><li> Mettere l&#39;animale su una coperta di riscaldamento e di conservarlo in un luogo sicuro (ad esempio, nella sua gabbia), mentre sotto di recupero. Non tenere un animale privo di sensi in compagnia di quelli coscienti. </li><li> Applicare 1% eritromicina pomata oftalmica. Questo sarà anche prevenire la secchezza oculare. Continuare l&#39;applicazione del quotidiano antibiotico per una settimana. </li><li> Iniettare 0,1 mg / kg per via sottocutanea buprenorfina dopo la procedura e dopo 12 ore. Continuare l&#39;iniezione due volte al giorno per due giorni. </li><li> Osservare l&#39;animale per 30 - 45 minuti, fino al recupero completo dall&#39;anestesia. NOTA: Il movimento lieve dei muscoli respiratori sulla superficie ventrale indica benessere degli animali, mentre sotto di recupero. </li></ol>

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E., Lorca, T., Castro, A., Burgess, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+inhibition+of+Cdk1+in+G+2+phase+overrides+the+SAC+and+decouples+mitotic+events.">Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events.</a> Cell Cycle. 13, 1400-1412 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have nothing to disclose.

Questo articolo descrive una tecnica riproducibile e relativamente semplice per creare un modello murino di LSCD. Ci sono diversi aspetti importanti di questo modello, che sono degni di nota. Innanzitutto, a differenza modelli che utilizzano sostanze chimiche 11, 12, la lesione coinvolge principalmente l&#39;epitelio superficiale (e membrana basale), con il minimo danno al stroma corneale sottostante o ad altre strutture intraoculari. Quindi, vi è solo l&#39;infiammazione limitata e cicatrici, entrambi i quali possono complicare la procedura e rendere più difficile valutare l&#39;esito di eventuali interventi volti a le cellule staminali del limbus. Uno studio recente interessante da Li et al. 10, che confronta l&#39;utilizzo della fresa rotante con diverse combinazioni di trattamenti chirurgici e chimiche, anche trovato la fresa per essere più sicuri e più efficaci nella creazione LSCD nei conigli. In secondo luogo, il modello sembra essere stabile per almeno fino a tre mesi 1. La creazione di questo modello prevede l&#39;uso dila fresa rotante, uno strumento che è familiare a clinici che lavorano con la cornea, nonché a coloro che fanno studi topo ferimento. Il suo vantaggio rispetto all&#39;utilizzo di una spatola smussato è che la lesione è più uniforme e riproducibile 1. Per distruggere meglio le cellule staminali del limbus, la zona limbare è stato trattato due volte. Sulla base di esperienza di lavoro su occhi del mouse, il trattamento di più di due turni spesso abrades vasi sanguigni del limbus e provoca sanguinamento. Nel caso la tecnica è utilizzata in altri animali, questo passo può essere modificato a seconda dello spessore corneale epiteliale. In questo studio, un utensile motorizzato con una punta bava 0,5 mm è stato utilizzato; punte bava in altre forme e dimensioni sono disponibili e possono essere utilizzati al posto, a seconda delle specifiche della cornea e delle dimensioni degli occhi. Li et al. 10 ha riferito la bava da 2,5 mm per essere adatto per rimuovere costantemente corneale di coniglio e epiteli limbare. Per ottenere l&#39;ottimalerisultato, epiteli limbari corneali e sono state rasate in modo circolare ed è stato usato il lato laterale della bava. Per evitare che il pelo di interferire con la punta dell&#39;utensile, la caduta di povidone-iodio è stato diffuso sui capelli intorno all&#39;occhio, invece di essere cancellati. Lo strumento non deve essere utilizzato in modo statico in un punto, in quanto ciò potrebbe causare perforazione. Trattare il limbus a un ritmo molto lento può provocare sanguinamento; una velocità di quasi 6 secondi per ogni turno è adatto per un occhio topo C57BL / 6J. E &#39;fondamentale per evitare una nuova spazzolare lo stroma nuda, in modo da indurre più infiammazione e stroma opacizzazione. La pressione non deve essere applicata all&#39;occhio mentre abrasione dell&#39;epitelio. Dopo la procedura, la cornea era macchiato con fluoresceina per assicurarsi di rimozione epiteliale completa. E &#39;importante per prevenire la secchezza oculare durante il recupero degli animali. Le limitazioni sono che questa tecnica non può rimuovere il 100% delle cellule staminali. E &#39;anche un po&#39; operatore-dipendente e richiede pratica per dare corisultati nsistent. Quando si studia il fenotipo epiteliale corneale, tutto il monte colorazione è il modo migliore per valutare l&#39;esito di questo modello. Questo è perché permette l&#39;intera dell&#39;epitelio corneale da valutare contemporaneamente, mentre le sezioni trasversali sarebbe solo dare informazioni su ogni sezione particolare. Questa tecnica controllabile può indurre LSCD nei topi, e probabilmente in altri animali. Esso fornisce un modello adeguato di LSCD per studiare nuovi trattamenti e scoprire più ampi aspetti della fisiopatologia della malattia. Con alcune modifiche, può essere utile nello studio della cornea guarigione delle ferite, l&#39;angiogenesi, e linfoangiogenesi pure.

L&#39;epitelio corneale è necessaria per mantenere la chiarezza e l&#39;integrità della cornea. Si rinnova continuamente per tutta la vita dalle cellule staminali epiteliali che risiedono nel-un limbo zona ristretta a livello della giunzione della cornea e della congiuntiva. Queste cellule staminali del limbus auto-rinnovamento svolgono un ruolo cruciale nella rigenerazione dell&#39;epitelio corneale, sia normalmente e dopo l&#39;infortunio. esaurimento parziale o completa di queste cellule staminali si tradurrà in erosioni corneali ricorrenti, dolore, cicatrici corneali e la neovascolarizzazione, comparsa di cellule calice, e se non trattata, la cecità corneale. Questa condizione è nota come la carenza di cellule staminali limbari (LSCD) e può essere idiopatica; ereditaria; o acquisita a causa di infortuni chimici o termici, lenti a contatto a lungo termine indossare, e infiammazione cronica 1-6. La ricerca sulle LSCD richiede un modello animale adatto che non solo imita la malattia negli esseri umani, ma è riproducibile e sostenibile, con il minimo di unmonte di lesioni ad altre strutture corneali e oculari. Questo modello è necessario valutare i trattamenti e per chiarire i meccanismi della malattia a livello molecolare e cellulare. Come descritto in precedenza 1, con l&#39;uso di una fresa rotante, si può facilmente sviluppare un modello murino di LSCD che offre i vantaggi suddetti e persiste per almeno tre mesi. L&#39;obiettivo di questo studio è quello di presentare un modello semplice, riproducibile e sostenibile del mouse di LSCD. La bava di rotazione è un pratico strumento che rimuove in modo uniforme l&#39;epitelio senza ferire lo stroma sottostante 1. È stato usato per indurre erosione corneale centrale 7, 8 in studi guarigione di ferite. La tecnica presente-presentato per creare LSCD in un topo non è stato riportato in precedenza. Precedentemente introdotto metodi di raschiare l&#39;epitelio con un risultato spatola smussato in meno uniforme infortuni particolarmente al limbus e un fenotipo più variabile 1, 9, con più o ristorazionef normale epitelio corneale 1. Diversamente il raschietto smussato, la fresa rotante rimuove la membrana basale dell&#39;epitelio e 7, 8, 10. Altri metodi riportati di sever cellule staminali comportano l&#39;uso di sostanze chimiche, quali idrossido di sodio, n-eptanolo, e cloruro di benzalconio, che non solo può indurre lesioni indesiderato strutture oculari sottostanti, ma può anche portare a infiammazione significativa e successiva opacizzazione corneale o epiteliali metaplasia squamosa 11-15. La bava di rotazione non è associata a queste gravi complicazioni. Rimuovere chirurgicamente l&#39;epitelio limbare, da solo o con l&#39;uso di prodotti chimici 10, 11, 16, è più difficile da eseguire e non è l&#39;opzione migliore in animali con occhi piccoli e un sottile epiteli limbare (come topi). Inoltre, a sorpresa, limbectomy può ancora lasciare un po &#39;dell&#39;epitelio limbare dietro 10. La tecnica di seguito descritta comporta LSCD con neovascolarizzazione und conjunctivalization che imita la presentazione di completa LSCD in pazienti e dura per almeno tre mesi 1. E &#39;adatto per coloro che mirano a studiare LSCD o ferite fisiopatologia guarigione, immunologia, e potenziali trattamenti nei topi. Possibilmente, con alcune modifiche, questa procedura può essere eseguita in ratti o conigli 10. Come la fresa rotante rimuove efficacemente l&#39;epitelio, può essere utilizzato in ogni ricerca di pertinenza corneale epiteliale all&#39;abrasione / ferimento e in qualsiasi trattamento correlata o studi di biologia molecolare.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1091">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Rumex International Co, Clearwater, FL</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 16-141</td>
			<td style="width:351px;">0.5 mm burr. Also available from other companies.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Surgical microscope</td>
			<td style="width:277px;">Wild Heerbrugg, Switzerland</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Wild M691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Digital camera</td>
			<td style="width:277px;">Nikon, Thailand</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Nikon FS-2 slit lamp</td>
			<td style="width:277px;">Nikon, Japan</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Polyclonal anti-CK12 antibody</td>
			<td style="width:277px;">Santa Cruz Blotechnology, CA,</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; SC-17101</td>
			<td>1:100 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Monoclonal anti-CK8 antibody</td>
			<td style="width:277px;">TROMA-I-s, Iowa City, IA</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; AB_531826</td>
			<td>1:50 concentration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple mechanical procedure to create limbal stem cell deficiency in mouse

carenza di cellule staminali limbari (LSCD) è uno stato di malfunzionamento o la perdita delle cellule staminali epiteliali limbari, dopo di che l&#39;epitelio corneale viene sostituito con congiuntiva. I pazienti che soffrono di difetti ricorrenti corneali, dolore, infiammazione, e la perdita della vista. In precedenza, un modello murino di LSCD stato descritto e confrontato con altri due modelli. L&#39;obiettivo era quello di produrre un modello di topo consistente di LSCD che entrambi imita il fenotipo negli esseri umani e dura abbastanza a lungo da permettere di studiare la fisiopatologia della malattia e per valutare nuovi trattamenti. Qui, la tecnica è descritta in dettaglio. Uno strumento motorizzato con una fresa rotante è stato progettato per rimuovere gli anelli di ruggine dalla superficie corneale o per lisciare il letto pterigio nei pazienti. Si tratta di un dispositivo atto a creare il modello LSCD desiderato. È facilmente disponibile, facile da usare con una punta fine che lo rende adatto per la lavorazione di piccoli occhi, comenei topi. La sua applicazione evita inutili traumi all&#39;occhio e non comporti lesioni indesiderati, come spesso accade con i modelli danno chimico. Al contrario di un raschietto smussato, rimuove l&#39;epitelio con la membrana basale. In questo protocollo, la zona limbare è stata abrasa due volte, e quindi l&#39;intero epitelio corneale è stato rasato dal limbus al limbus. Per evitare lesioni stroma, si è avuto cura di non spazzolare la superficie della cornea una volta che l&#39;epitelio è già stato rimosso.

Nel giro di un mese dopo l&#39;esecuzione di questa tecnica, il 100% delle cornee sviluppato neovascolarizzazione superficiale (Figura 1A. Le foto sono state scattate con una macchina fotografica collegata ad una lampada a fessura sotto un campo chiaro e blu cobalto filtro). In 18/20 (90%) degli occhi, neovascolarizzazione coinvolto l&#39;intera superficie della cornea (Figura 1A). In 2/20 (10%), neovascolarizzazione è stata osservata in tre dei quattro quadranti corneali, ma ancora raggiunto il centro della cornea. Per convalidare lo sviluppo di LSCD, tutto il monte immunocolorazione è stata effettuata 1. Questa fase non è una parte del protocollo e può essere modificato a seconda degli obiettivi e interessi. Tre varianti sono stati considerati come indicatori di LSCD: assenza di citocheratina (CK) 12, un filamento intermedio specifico normali cellule epiteliali corneali 17, 18; aspetto di CK8, un semplice marcatore epiteli <sup&gt; 20 che non è presente sulla cornea normale; e la presenza di cellule caliciformi sulla superficie corneale. Per valutare il fenotipo epiteliale corneale, doppio immunostaining per CK12 e CK8 è stato eseguito su campioni interi montare tre mesi dopo l&#39;infortunio, come descritto in precedenza 1, 9. Esistenza delle cellule Goblet è stata valutata mediante MUC5AC-calice specifiche cellule mucina-immunocolorazione 1, 15, 19 45 giorni dopo la rimozione dell&#39;epitelio. La comparsa di cellule caliciformi riduce nel tempo. Per i migliori risultati, è importante effettuare la colorazione meno di due mesi dopo la ferita. Normale, cornee illesi espresso CK12-un marker specifico di mature cellule epiteliali corneali 17, 18 -throughout la superficie corneale, ma privi di CK8 o calice cellule (MUC5AC) da parte della cornea di tutto campioni di montaggio (Figura 1B) . In confronto ad occhi normali, espressione CK12 è quasi assente in injur<html> y cornee modello, mentre mostrano in modo significativo colorazione positiva per CK8 e calice cellule (Figura 1B). Queste osservazioni indicano lo sviluppo di LSCD. Se siete interessati a quantificare i risultati di immunoistochimica, Usa immagine-J per quantificare separatamente 20 densità immunoistochimica sulle immagini originali, inalterati prese dal microscopio sotto le stesse impostazioni. In breve, selezionare la parte della cornea dell&#39;intero campione monte, misurare la densità integrata e un&#39;area per quella regione, e calcolare la densità corretta per lo sfondo 20. Il rapporto di CK12 a densità CK8 stati precedentemente presentato su un numero maggiore di campioni 1. Il rapporto ridotto rispetto ai controlli (cornee normali) e la comparsa di cellule caliciformi sulla superficie corneale dimostrano lo sviluppo di LSCD. 658 / 54658fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Fenotipo corneale dopo la creazione LSCD nei topi. L&#39;esame con lampada a fessura mostra che tutte le cornee di sviluppare un certo grado di neovascolarizzazione di un mese (A, Barra di scala: 0.5 mm). Una cornea normale esprime CK12 tutta la cornea, ma è priva di qualsiasi CK8 o cellule caliciformi (MUC5AC). CK12 è assente nel modello LSCD, mentre CK8 e calice cellule appaiono sulla cornea (B, Barra di scala: 200 micron). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54658/54658fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

Il seguente articolo fornisce un facile, tecnica riproducibile per creare efficacemente un modello sostenibile del mouse di carenza di cellule staminali limbari (LSCD). Questo modello animale è utile in fase di test e confrontando l&#39;efficacia dei trattamenti per le malattie di cellule staminali del limbus.

Una semplice procedura meccanica per creare Limbal carenza Stem Cell in mouse

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

8.3K Views.  University of Illinois at Chicago.  Il seguente articolo fornisce un facile, tecnica riproducibile per creare efficacemente un modello sostenibile del mouse di carenza di cellule staminali limbari (LSCD). Questo modello animale è utile in fase di test e confrontando l'efficacia dei trattamenti per le malattie di cellule staminali del limbus. 

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A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Un modello murino di Nell&#39;utero Trapianto

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

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Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

Myo-meccanico Analisi dei isolata del muscolo scheletrico

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

Un metodo semplice di intubazione mouse polmone

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of microvasculature at the site of inflammation. Parabiotic partners share their circulating antigens and thus are free of adverse immune reaction. First described by Paul Bert in 18641, the parabiosis surgery was refined by Bunster and Meyer in 1933 to improve animal survival2. In the current protocol, two mice are surgically joined following a modification of the Bunster and Meyer technique. Animals are connected through the elbow and knee joints followed by attachment of the skin allowing firm support that prevents strain on the sutured skin. Herein, we describe in detail the parabiotic joining of a ubiquitous GFP expressing mouse to a wild type (WT) mouse. Two weeks after the procedure, the pair is separated and GFP positive cells can be detected by flow cytometric analysis in the blood circulation of the WT mouse. The blood chimerism allows one to examine the contribution of the circulating cells from one animal in the other.

Parabiotic joining of two organisms leads to the development of a shared circulatory system. In this protocol, we describe the surgical steps to form a parabiotic connection between a wild-type mouse and a constitutive GFP-expressing mouse.

Parabiosis in topi: un protocollo dettagliato

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of ...

A Surgical Procedure for Resecting the Mouse Rib: A Model for Large-Scale Long Bone Repair

This protocol introduces researchers to a new model for large-scale bone repair utilizing the mouse rib. The procedure details the following: preparation of the animal for surgery, opening the thoracic body wall, exposing the desired rib from the surrounding intercostal muscles, excising the desired section of rib without inducing a pneumothorax, and closing the incisions. Compared to the bones of the appendicular skeleton, the ribs are highly accessible. In addition, no internal or external fixator is necessary since the adjacent ribs provide a natural fixation. The surgery uses commercially available supplies, is straightforward to learn, and well-tolerated by the animal. The procedure can be carried out with or without removing the surrounding periosteum, and therefore the contribution of the periosteum to repair can be assessed. Results indicate that if the periosteum is retained, robust repair occurs in 1 - 2 months. We expect that use of this protocol will stimulate research into rib repair and that the findings will facilitate the development of new ways to stimulate bone repair in other locations around the body.

The overall goal of this procedure is to successfully resect a portion of bone from the rib of a mouse. The procedure was developed as a model to study large-scale long bone repair.

Una procedura chirurgica per la resezione Rib Mouse: Un modello per le grandi ossa lunghe Repair

This protocol introduces researchers to a new model for large-scale bone repair utilizing the mouse rib. The procedure details the following: preparation ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studiare cancro del pancreas staminali caratteristiche cellulari per lo sviluppo di nuove strategie di trattamento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe the use of a simple device to cut and &#8216;roll&#8217; mouse intestines to rapidly prepare whole mount preparations of superior and uniform quality to that which can be achieved by hand. The device comprises a base that holds 4 stainless steel rods and a top, which acts a cutting guide. The rods are inserted into the lumen of the small intestine [divided into thirds] and the colon. The rods and samples are then placed over a piece of filter paper or card into the holding slots in the base of the device. The top of the device is then positioned and serves as a cutting guide. The two angled sections in the center of the top piece are used to guide a knife or scalpel and cut the intestines longitudinally on the top of the rods. Once the intestinal sections have been cut, the top is removed and the card,&#160;tissue and rods gently removed from the device and placed on the bench. The rods are then gently rolled sideways to flatten and stick the intestinal segments onto the underlying piece of filter paper or card. The final preparation can then be examined or fixed and stored for later analysis. The preparations are invaluable for the study of intestinal changes in normal or genetically modified mouse models. The preparations have been used for the study and quantification of the effects of inflammation (colitis), damage, pre-cancerous lesions (aberrant crypt foci (ACFs) and mucin depleted foci (MDFs)) and polyps or tumors.

The use of a simple device to cut and &#8216;roll&#8217; mouse intestines to rapidly prepare whole mount preparations is described.

Un dispositivo semplice da preparare rapidamente intere Monti della Intestino mouse

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

Un neonatale mouse Spinal Cord Injury compressione Modello

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

Vena interposizione Modello: un modello adatto per studiare Bypass Graft pervietà

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of therapeutic stem cells via the intranasal route is a recently discovered alternative strategy, with strong potential for clinical translation, due to its non-invasive nature compared to intracranial implantation or delivery via systemic routes. The lack of blood brain barrier further strengthens the therapeutic potential of stem cells undergoing intranasal brain entry. This article summarizes the essential techniques utilized in our studies and outlines the basic principles of intranasal strategy for stem cell delivery using a mouse model of intracranial glioma xenografts. We demonstrate the optimized procedures that generate consistent and reproducible results with specific predetermined experimental parameters and offer guidelines for streamlined work flow that ensure efficient execution and reliable experimental outcome. The article is designed to serve as a baseline for further experimental customization based on hypothesis, stem cell types, or tumor specifics.

Stem cells are promising therapeutic carriers to treat brain tumors due to their intrinsic tumor tropism. Non-invasive intranasal stem cell delivery bypasses the blood brain barrier and demonstrates strong potential for clinical translation. This article summarizes the basic principles of intranasal stem cell delivery in a mouse model of glioma.

Intranasale consegna delle cellule staminali terapeutiche a Glioblastoma in un modello di mouse

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of ...