We acknowledge support of this work by the National Multiple Sclerosis Society and Simons Center for the Social Brain. BQ acknowledges support from the U.S. National Defense Science &amp; Engineering Graduate Fellowship program.

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

本論文で各技術は、脳組織の機械的性質の異なる側面を測定します。クリープコンプライアンスと応力緩和弾性率は時間に依存する機械的特性の尺度です。貯蔵弾性率および損失弾性率は、速度に依存する機械的特性を表します。インパクトインデントも速度に依存する機械的特性を測定したが、エネルギー散逸のコンテキストインチ組織の機械的特性を特徴づけるとき、両方のAFM対応インデントおよびレオロジーは、通常の方法を使用しています。前述のように時間に依存する材料特性を提供することに加えて、種々の実験パラメータは、細胞および組織の弾性率4、さらに周波数依存特性24を測定するために使用することができるので、AFM対応インデントは特に有用です。しかし、実験のデータと設計の正確な解釈は準拠して、水和した組織のために挑戦することができます。レオメトリー対策が適切一括ながら組織、AFM-有効インデントの絆は、細胞の微小環境に関連するマイクロスケールのボリュームを検査します。インパクトのインデントは、材料が焦点衝撃による外傷性脳損傷を研究するような用途において有用である濃厚、動的衝撃荷重の文脈に変形する方法を具体的に定量化する手段を提供します。各手法の結果を直接比較することはできませんしながら、以下に説明するように、インパクトのインデントを介して測定エネルギー散逸特性は、レオロジーを介して測定せん断損失弾性率と同じ傾向をたどります。 本明細書に示さ脳組織のAFM対応のインデントでは、クリープコンプライアンスと力の緩和を使用して粘弾性特性を測定しました。そのため、AFMプローブの小規模のため、この技術は、それぞれ、脳梁および皮質（ 図の白と灰白質領域としての脳の解剖学的に異なる領域の機械的特性を測定することができます。4 </stronグラム&gt;）。磁気ねじれサイトメトリー、光ピンセット、およびマイクロレオロジーのような - - 生体試料のマイクロ機械的特性を測定するための他の技術が存在するが、これらの技術はうまく半透明内の光の比較的強い散乱に一部起因した組織サンプルに使用されていません組織。 我々は、このように測定された脳組織の粘弾性挙動が以前エルキン・モリソン26で結果を報告と定性的に類似していることを見出しました。緩和弾性率の測定値の大きさが一致していないが、これは、実験条件の違いによる可能性があります。エルキン＆モリソンは、当社の直径20μmの球に比べて、直径250μmのフラットパンチを使用しています。我々はマウスから得られた脳組織の測定を実施しながら、さらに、エルキン＆モリソンは、ラットの脳組織上で測定を行います。これらの違い、両方の技術のMEASにもかかわらず、脳梁の白質が前頭面における皮質の灰白質よりも低い緩和弾性率を示すことが、より具体的に脳組織内の異種の機械的特性をured、または。 我々がクリープコンプライアンスを計算し、要求されたステップ負荷またはステップのくぼみに応じて緩和弾性率を強制しながら、それぞれ、実験的に作用する荷重とインデントが理想的（瞬時）ステップ関数ではないことに注意することが重要です。ロードおよびくぼみは、短い時間スケール（&lt;1秒）の上に適用され、これらの荷重履歴を測定し、クリープと弛緩反応7,25に影響を与えることができます。クリープコンプライアンス弾性率のわずかな過大評価で適用されるステップ負荷結果を想定しながら具体的に、過小評価緩和弾性率のわずかに適用されるステップインデント結果を仮定。実際と計算された弾性率との間に不一致がランプ速度として減少しますかかる荷重とインデントの増加。 負荷の緩和を行う上で重要なステップは、（ すなわち 、設定値は、加えられた力に直接関係のフォトダイオード電圧に相当）が維持力の適切な大きさを選択します。クリープコンプライアンスのセットポイント力が選択されな​​ければならないように：（1）応答が押し込み深さで容易に測定可能な変化を生じさせるのに十分な大きさです。 （2）設定値の力を維持するのに必要な押し込み深さをAFMカンチレバーのベースの垂直位置を調節するAFMの圧電アクチュエータの範囲の外にドリフトするほど大きくならないように十分に小さいです。提示されたプロトコルでは、我々は我々の実験のためによく働いた5 nNの、の設定値の力を示唆しています。 AFMピエゾが原因で動き、その制限された範囲（ 図4A、挿入図を参照）、その力を維持することができない場合には、その値を下げることができます。この実験的な問題はencountではありませんフィードバックループを介して、安定した計算された押し込み深さを維持する力緩和実験でered。 nanoNewton（NN）規模の部隊とミクロンスケールの深さでの準静的AFM対応インデントとは対照的に、インパクトのインデントは、MN-規模部隊の濃縮動的負荷を適用し、ミリスケールに近づい深さまで試料の変形応答を測定します。我々は以前、心臓や肝臓9,11,12の挙動を定量化するために、衝撃のインデントを使用し、それらの器官からの組織のための負荷速度でのエネルギー散逸応答の同様の依存性を観察しています。 インパクトのインデントはミクロンからミリメートルまでのプローブ半径を収容することができます。さらに、衝撃押込み実験は、水和した組織21の機械的な特徴付けを可能にする完全に浸漬した環境で行うことができます。このような脳組織として非常に準拠したサンプルをテストする場合、インプortant考慮事項が考慮されなければなりません。まず、材料への最大測定深度は約1mm、器具自体の長さスケールで設定された制限です。任意の更なる振り子の変位が物理的に振り子と固定磁性板の上部に位置する電磁コイルとの間の衝突によって停止されます。脳組織の場合、これは正常に約5mm /秒にも適用することができる最高の衝撃速度を制限します。衝突速度 ​​が注文ミリメートル/秒であるが、対応するひずみエネルギー密度が原因でプローブ半径11の小さな寸法に、弾道条件に近づくkJの/ m 3で、程度であることに注意してください。器具は、プローブと組織表面との接触を検出するための第二に、潜在的に困難になることができます。試料ステージは、プローブに向かうように振り子が移動する試料によって押し戻されると、接触が検出されます。しかし、のために非常にcomplianプローブがサンプルに浸透しつつトンのサンプルは、振り子が検出可能に偏向されない場合があります。 この問題に対処するために、我々は、試料ステージバック振り子を駆動するための接触時に大きな勢いが存在することになるように移動する速度を増加させることができます。サンプルはまた、適切な接触点を検出するエラーを最小限に抑えるために、できるだけ平坦であるべきです。最後に、振り子の上部に電磁電流が第1の衝突事故後の浸透のための駆動力を供給し続けることに衝撃荷重が、真のインパルス負荷ではないことに注意してください。その結果、クリープは、エネルギー散逸特性の解析を複雑にする、より高い負荷条件下で特に起こり得ます。この技術のさらなる研究は、顕微鏡を介して組織サンプル表面の視覚化を体温での研究を可能にするように温度制御を導入すること、を含む、衝撃応答からクリープ応答を切り離す含むことができます液晶セルとの互換性電子。 レオメトリーは、マクロスケールレベルでの粘弾性固体の周波数依存の機械的特性を測定します。せん断弾性率成分、貯蔵G &#39;及び損失G」は 、典型的には、機器、プローブジオメトリ、及び試料13に応じて、10〜100ラジアン/秒に0.001ラジアン/秒にわたる範囲の周波数で測定することができる。正確な測定のために、振幅スイープは、材料の線形弾性範囲を決定する前に、周波数掃引に行われるべきである。これは、G &#39;およびG&#39; &#39; は 14,27一定に保たれるひずみの範囲で周波数のために選択されたせん断ひずみ。掃引は、十分なトルクが測定中に達成されるような線形粘弾性限界（典型的には1~2％のせん断ひずみ）内で可能な限り高くあるべきである。測定時のトルクが常に確実にするために、製造業者によって提供される許容範囲内にあるべきです対雑音比ufficient信号。 さらに、使用レオメトリープローブは、トルクを最大にするために、できるだけ大きくなければならないが、完全に13サンプルとオーバーレイしなければなりません。試料を調製する際に、組織接触は、プレート間で行われたときの応力勾配を最小限に抑えるために、できるだけ平らにスライスされるべきです。接触がサンプルで作られた場合、組織は、そのインターフェイスでのスリップを最小限に抑えるために、その上に任意の水滴を持つべきではありません。これは組織構造13を劣化させるようしかし、組織はまた、前または測定中に乾燥させてはいけません。組織が完全に両プレート間の接触後にメディアで水和する必要があります。接着剤、防水紙やすりもスリップ28を最小化するためにプレートに取り付けられてもよいです。さらに、軸方向の圧縮は、脳組織29のG &#39;の大きさを変化させることが示されています。レオロジーサンプルは典型的に（約5 mm）の薄膜であるため、高さの小さな変化は、（500〜μm）は大きな圧縮株（ 例えば 、〜10％）、および剪断弾性率で、したがって重要な変化を生成することができます。サンプルは粘弾性であるとしてさらに、物質が原因の測定値に影響を与える可能性が軸方向圧縮28に応力緩和を受けます。このように、繰り返し測定は、同様に動作し、軸方向ひずみで行われるべきであり、サンプルは、測定前に（ 例えば、5〜10分）をリラックスさせるべきです。これらの現象に関連したエラーは、技術の限界です。レオのその他の制限は、多くの場合、組織サンプル13で真実ではない材料が均質で等方性であるという仮定が含まれます。さらに、温度は、それがGに影響するように、生理学的条件下で維持されるべきでべき乗則behaを変更することなく、適度とG &#39;&#39;とG &quot;22。脳組織において特異的に、温度上昇は、両方のGを減少させることが示されています[このように時間-温度重ね合わせプリンシパル22,30を以下の周波数でvior、。我々のデータは、G &#39;およびG&#39; &#39;の同様の大きさだけでなく、両方のG&#39;とG &quot;に弱いパワー則周波数依存性を観察したブタの脳内の以前の研究22,27、とよく一致しています。 算出された比率のtanδ= G &quot;/ G &#39;（ 図6）は、レオメトリー衝撃くぼみの間の比較の基礎を提供する。衝撃インデントでは、脳組織のエネルギー消費容量を大きく負荷率とともに増加することを見出した。レオメトリーを使用して、我々はことを発見しました周波数が増加すると、tanδはまた、換言すれば、材料は、より高い周波数でより多く電力を消費した。増加した。また、衝撃押込測定は直接弾性率を定量化していないが、直接侵入深さXの最大減少increasinとグラム弾性率。 一緒に、この論文に記載された方法は、マイクロ、メソ、およびマクロの長さスケールでの脳組織の機械的特性評価を可能にし、異なる負荷率で。本明細書に提示される方法は、生物学的組織および操作ヒドロゲルの両方を含むコンプライアント材料の数を使用することができます。脳組織のマルチスケール粘弾性特性の深い理解では、我々は脳の機械的応答を模倣するように設計設計資料をより良くすることができます。これらの組織模擬材料は、機械的損傷、保護戦略のエンジニアリングの予測を容易にすることができます。さらに、脳の材料特性が良く、特にそのような自閉症および多発性硬化症などの神経疾患の文脈において、中枢神経系における細胞の増殖および接続性を理解するために、インビトロおよびインビボ研究におけるバイオインスパイアード材料を設計することができます。

生物学的器官を含むほとんどの軟組織石灰化した骨または工学材料と比較して機械的及び構造的に複雑な、低剛性であり、非線形および時間依存の変形を示します。体内の他の組織と比較して、脳組織は1Paで数百程度の弾性率をEと、格段に準拠しています。脳組織は、異なるとの構造的不均一性を示し、また、機能的に異なるグレーと白質領域を互いにかみ合っ。脳組織の力学を理解することは、傷害の間に脳の応答を模倣する材料と計算モデルの設計に役立つ機械的損傷の予測を容易にし、保護戦略の設計を可能にします。さらに、このような情報は、組織再生のための設計目標を考慮するために使用することができ、より良好な多発性硬化症や自閉症などの疾患と関連している脳組織の構造的変化を理解します。 HERE、我々はメソ、ミクロで、脳組織を含む機械的に準拠した組織の粘弾性特性を特徴づけるために利用可能ないくつかの実験的アプローチ、およびマクロスケールを説明し、実証します。 マイクロスケールで、我々はクリープコンプライアンスを行い、原子間力顕微鏡（AFM）対応のインデントを使用して緩和実験を強制します。典型的に、AFM対応くぼみは、試料2-4の弾性率（または瞬間剛性）を推定するために使用されます。しかし、同一の器具はまた特性5-10（タイムまたはレートに依存）マイクロ粘弾性を測定することができます。 図1に示すこれらの実験の原理は、時間の経過とともに、脳組織内にプローブを片持ちAFMをインデント力や押し込み深さの特定の大きさを維持し、それぞれ押し込み深さと力の対応する変化を測定することです。これらのデータを用いて、クリープCOMPを算出することができますそれぞれliance J Cと緩和弾性率G R、。 メソスケールで、我々は振り子ベースのインストルメントナノインデンターを使用して、組織構造と水和レベルを維持する流体に浸漬条件における衝撃インデントの実験を行いました。実験は、 図2に示されている。振り子が組織と接触するように揺動するように、振動振り子が組織内に静止するまでの変位を時間の関数として記録されているプローブ。プローブの結果として生じる減衰高調波振動運動から、我々は、組織11,12の（エネルギー散逸率に関する）の最大侵入深さx MAX、エネルギー散逸能力K、及び散逸品質係数Qを算出することができます。 マクロスケールで、我々は、周波数依存のせん断弾性率を定量化するために、平行平板レオメーターを使用しました。組織の貯蔵弾性率G &#39;及び損失弾性率G &quot;を 、と呼ばれるレオメトリーのこのタイプでは、高調波角度歪みを適用する（剪断歪みに対応する）既知の振幅と周波数で及びreactionalトルクを測定（及びせん断応力に対応します） 図3に示すように、測定されたトルクの結果として得られる振幅と位相遅れおよびシステムの幾何学的な変数から、我々は興味13,14の印加周波数で&quot;G &#39;及びGを計算することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1078">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Xylaxine</td>
			<td style="width:161px;">Lloyd Laboratoried</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:401px;">perscription drug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine</td>
			<td>AnaSed Injections</td>
			<td></td>
			<td>perscription drug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome (Vibrating blade microtome)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hibernate-A Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1247501</td>
			<td>CO2-independent neural medium for adult tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Atomic Force Microscope, MFP-3D-BIO</td>
			<td>Asylum Research</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dish Heater</td>
			<td>Asylum Research</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AFM Probe, 0.03 N/m, 10 um radius borosilicate sphere</td>
			<td>Novascan</td>
			<td>PT.GS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>mussel-derived bioadhesive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>alternate suppliers can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide, 1N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59223C</td>
			<td>alternate suppliers can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Instrumented Indenter, NanoTest Vantage</td>
			<td>Micro Materials Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>probe tip needs to be machined (steel flat punch, 1mm diameter, 4-5 mm length)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoTest Liquid Cell</td>
			<td>Micro Materials Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parallel Plate Rheometer MCR501</td>
			<td>Anton-Parr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PP25&#160;</td>
			<td>Anton-Parr</td>
			<td>-</td>
			<td>25 mm diameter flat measurement plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adhesive Sandpaper</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4184A48</td>
			<td>alternate suppliers can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Loctite 4013 Instant Adhesive</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>20268</td>
			<td>alternate suppliers can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing multiscale mechanical properties of brain tissue using atomic force microscopy, impact indentation, and rheometry

機械的な模擬または組織再生研究のためかどうか、脳の性質に触発された材料を設計エンジニアには、脳組織自体がよく、様々な長さと時間スケールで特徴づけされなければなりません。多くの生物学的組織のように、脳組織は、複雑な階層構造を示します。しかし、大部分の他の組織とは対照的に、脳はPaで数百のオーダーのヤング弾性率をEと、非常に低い機械的剛性のものである。この低剛性は、キーの機械的特性の実験的特性評価に課題を提示することができます。ここでは、異なる長さスケールおよび負荷速度で、例えば、脳組織などの水和、コンプライアントの生物学的材料の弾性および粘弾性特性を測定するように適応されているいくつかの機械的特性評価技術を実証します。マイクロスケールで、我々は原子間力顕微鏡対応のインデントを使用して、クリープコンプライアンスと力緩和実験を行います。 mesosでCALEは、我々は振り子ベースのインストルメント圧子を使用して、衝撃インデント実験を行います。マクロスケールで、我々は周波数に依存するせん断弾性率を定量化するために平行プレートレオメトリーを行っています。また、それぞれの方法に伴う課題や制限について説明します。一緒にこれらの技術は、より良い脳の構造を理解するために、バイオ風の材料を操作するために使用することができます脳組織の徹底的な機械的特性評価を可能にします。

図4は 、それぞれ適用された力あるいは押し込み深さ（ 図4A、D）、与えられた、クリープコンプライアンスのための時間応答（ 図4B、E）対代表インデントと力を示し、リラクゼーション実験を強制します。これらのデータおよびシステムの幾何学的形状を使用して、クリープコンプライアンスJの C（t）と緩和弾性率G R（t）を強制することは、脳の異なる領域（ 図4C、F）について計算することができます。以前の研究は、脳23の異なる領域の弾性率の差を示しているが、粘弾性特性は、所与の組織切片内の地域間変動を示していないマウスの脳組織切片のためにこのようにして測定しました。 インパクトのインデントは、空間的および時間的にconcentraの高速で組織の機械的特性を測定しますテッド・ロード。これらの実験の結果は、組織が外傷や手術に伴う意図的な変形に応じてエネルギーを消費する方法についての情報を提供します。衝撃押込みプローブの減衰振動運動（ 図2B）は、最大浸透深さx MAX（ 図5A）、エネルギー散逸能力K（ 図5B）と組織のエネルギー散逸率Q（ 図5C）を計算するための情報を提供します。侵入深さが強く、組織の弾性率と相関変形抵抗を測定する：硬い組織が与えられた衝突速度や衝突エネルギーより小さい侵入深さを示します。エネルギー散逸能力組織は、最初の衝撃サイクルの間に衝撃エネルギーを散逸する程度の単位のない尺度です。散逸品質係数の測定サイクル数Iからの振動の前に発生しますMPACTは著しく減衰される - これは、時間の単位で表されていないが、これは、エネルギー散逸の速度に直接関係します。これら三つの衝撃応答パラメータは、組織の速度に依存する特性を研究するための手段を提供する、別の衝撃速度で定量することができます。 図6は、0.1ラジアン/秒から50ラジアン/秒までの範囲の周波数に対してマクロスケールのG &#39;とG &quot;を示している。貯蔵弾性率がほぼ低周波数での損失弾性率よりも大きい大きさのオーダーである。しかし、貯蔵弾性率および損失弾性率との比を周波数が増加するにつれて減少する。これは、貯蔵弾性率は、弾性特性を説明し、損失弾性率は材料の粘性損失を説明するので、弾性特性は、脳組織の挙動を支配することを示している。十分に高い負荷周波数で、貯蔵弾性率および損失弾性率を同一視し、点を示すれます材料は、（ すなわち 、粘性特性はサンプルの挙動を支配する）流れ始めます。本明細書に示されるように測定された脳組織の場合には、計測器の物理的な限界は、私たちは、より高い周波数での材料特性を測定することはできません。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54201/54201fig1.jpg" /> AFM対応のクリープコンプライアンスの 図1. イラストや緩和実験を強制します。（A）AFM-有効インデントは自由端に取り付けられたマイクロスケール半径にナノの球状ビーズで柔軟なカンチレバーを用いて行われます。 （B）インデントの間、カンチレバーのたわみは、レーザを用いて測定されるカンチレバーの端からフォトダイオードへ反射されます。 （C）フォース緩和実験は、一定の印加深さにカンチレバーをインデントによって行われ、一方のresと力崩壊時間にPECTが測定されます。 （D）クリープコンプライアンスは一定の印加力でカンチレバーの変更押し込み深さを測定します。 （C）及び（D）は、5つの領域（緑のテキスト）に分割されている：試料表面のAFMプローブ（1）アプローチ、（2）試料と接触し、設定値のインデント/力まで上昇、（3）設定値のインデント/力の維持、（4）ランプダウンと試料表面からのAFMプローブの（5）後退。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54201/54201fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54201/54201fig2.jpg" /> インパクトのインデント実験の 図2. イラスト。インパクトのインデントの（A）の回路図、完全に水和条件で実験を行う能力を示します。 （B）Repres<html>マウス脳切片および対応する速度プロファイルから収集し、時間の関数としてentativeプローブ変位プロファイル。主な測定変位と示されているエネルギー散逸を定量化するために使用され算出された速度パラメータを設定します。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54201/54201fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54201/54201fig3.jpg" /> 平行板レオメーター実験の図3.イラスト。平行板レオメーター実験と適用された振動剪断ひずみに関連した定義の（A）の回路図。 （B）代表は、時間の関数としてのひずみと結果のストレスを適用しました。せん断貯蔵弾性率G &#39;及びせん断損失弾性率G &quot;は歪み振幅を介して計算されます54201 / 54201eq12.jpg &quot;/&gt;、トルク振幅T &#39;0、位相遅れ<img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/54201/54201eq13.jpg" /> 、探針と試料の半径R、およびサンプルの高さh。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54201/54201fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54201/54201fig4.jpg" /> 図クリープコンプライアンスから4.代表的なデータとリラクゼーション実験を強制します。（A、B）は、 図1中の生データからは、関心領域は、加えられた力は押し込み深さながら、（A）一定のまま時間としてクリープコンプライアンスのために定義されています（B）測定されます。 （A）の挿入図は、AFMピエゾができませんでした失敗した実験からのデータを示しています加えられた力と、（B）の挿入図を維持するためには、（B）に示す成功実験のデータと定性的に類似している対応する凹み応答を示しています。加えられた力からのデータを、測定インデント、およびプローブの幾何学の知識と（C）は 、クリープコンプライアンスJ cの （t）が計算されます。時間に対する力を測定しながら（D、E）は 、力緩和は、押し込み深さ（E）、（D）が一定に保持されます。これらのデータを使用して（F）は 、力の緩和弾性率G R（t）を計算することができます。クリープコンプライアンスと強制緩和実験は、このような脳梁（赤）および皮質（青）などの脳の解剖学的に別個の領域、に行うことができます。 （C、F）のデータは、n = 5匹のマウスからの測定値の平均である。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54201/54201fig4large.jpg" target="_blank">CLICください</a>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをk個。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54201/54201fig5.jpg" /> 図衝撃押込み実験から5の代表的なデータ、最大浸透深さx MAX、エネルギー散逸能力K、およびマウス脳組織の損失品質係数Qは、異なる衝撃速度で得られた生変位プロファイルから計算されます。データは。平均値±標準偏差として表された（n =ポイント当たり18反復測定）されている<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54201/54201fig5large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54201/54201fig6.jpg" /> レオメトリー実験から図6の代表的なデータ。ストレージG &#39;と損失G &#39;&#39;豚の脳の冠状切片からの弾性率。量のtanδは、貯蔵弾性率に対する損失の比として計算されます。データは。平均値±標準偏差として表された（n =ポイント当たり4反復測定）されている<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54201/54201fig6large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

原子間力顕微鏡、インパクトインデント、およびレオを使用した脳組織のマルチスケール力学的性質を特徴づけます

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

characterizing-multiscale-mechanical-properties-brain-tissue-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.2K ビュー.  Massachusetts Institute of Technology. We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

ビデオ: Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

免疫電子顕微鏡のためのマウスの脳組織の準備

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

神経科学

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

集束イオンビームは、粉砕し、脳組織の走査型電子顕微鏡

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

超音波血液脳関門の破壊とマンガン増強MRIを用いた脳機能イメージングの試み

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

モデルとしての嗅覚系は、軸索の成長パターンと形態を研究する<em&gt;インビボ</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation of a given stimulus might be dependent on context and history. If this is actually the case, bi-directional interactions between the brain (or if need be a reduced model of it) and sensory-motor system can shed a light on how encoding and decoding of information is performed. Here an experimental system is introduced and described in which the activity of a neuronal element (i.e., a network of neurons extracted from embryonic mammalian hippocampi) is given context and used to control the movement of an artificial agent, while environmental information is fed back to the culture as a sequence of electrical stimuli. This architecture allows a quick selection of diverse encoding, decoding, and learning algorithms to test different hypotheses on the computational properties of neuronal networks.

In this paper, an experimental framework to perform closed-loop experiments is presented, in which information processing (i.e., coding and decoding) and learning of neuronal assemblies are studied during the continuous interaction with a robotic body.

閉ループ神経のロボット実験は、神経回路網の計算特性を試験すること

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, formed by ribosomes, mRNAs, several proteins and non-coding RNAs, represent integrated platforms where translational controls take place. However, while the ribosome has been widely studied, the organization of polysomes is still lacking comprehensive understanding. Thus much effort is required in order to elucidate polysome organization and any novel mechanism of translational control that may be embedded. Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that allows the acquisition of 3D images at nanoscale resolution. Compared to electron microscopy (EM) techniques, one of the main advantages of AFM is that it can acquire thousands of images both in air and in solution, enabling the sample to be maintained under near physiological conditions without any need for staining and fixing procedures. Here, a detailed protocol for the accurate purification of polysomes from mouse brain and their deposition on mica substrates is described. This protocol enables polysome imaging in air and liquid with AFM and their reconstruction as three-dimensional objects. Complementary to cryo-electron microscopy (cryo-EM), the proposed method can be conveniently used for systematically analyzing polysomes and studying their organization.

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

原子間力顕微鏡で脳ポリソームでピアリング

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, tri-carboxylic acid (TCA) cycle and oxidative phosphorylation (OXPHOS) pathways to produce cellular energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Impairment of mitochondrial ATP production causes mitochondrial disorders, which present clinically with prominent neurological and myopathic symptoms. Mitochondrial defects are also present in neurodevelopmental disorders (e.g. autism spectrum disorder) and neurodegenerative disorders (e.g. amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases). Thus, there is an increased interest in the field for performing 3D analysis of mitochondrial morphology, structure and distribution under both healthy and disease states. The brain mitochondrial morphology is extremely diverse, with some mitochondria especially those in the synaptic region being in the range of &#60;200 nm diameter, which is below the resolution limit of traditional light microscopy. Expressing a mitochondrially-targeted green fluorescent protein (GFP) in the brain significantly enhances the organellar detection by confocal microscopy. However, it does not overcome the constraints on the sensitivity of detection of relatively small sized mitochondria without oversaturating the images of large sized mitochondria. While serial transmission electron microscopy has been successfully used to characterize mitochondria at the neuronal synapse, this technique is extremely time-consuming especially when comparing multiple samples. The serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) technique involves an automated process of sectioning, imaging blocks of tissue and data acquisition. Here, we provide a protocol to perform SBFSEM of a defined region from rodent brain to rapidly reconstruct and visualize mitochondrial morphology. This technique could also be used to provide accurate information on mitochondrial number, volume, size and distribution in a defined brain region. Since the obtained image resolution is high (typically under 10 nm) any gross mitochondrial morphological defects may also be detected.

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

シリアルブロック・フェイス走査型電子顕微鏡を用いて脳ミトコンドリアの解析

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

プレ埋め込み免疫組織化学および電子顕微鏡のための非ヒト霊長類脳組織の調製

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...