我々は技術支援のためのロチェスター大学医療センターの電子顕微鏡研究の中核施設で、蠕動ポンプとビブラトームの使用だけでなく、カレンL. Bentleyとゲイルシュナイダーのために少明陸とハリスA. Gelbardに感謝。この作品は、NIH（EY019277）、ホワイトホール財団、バローズウェルカム基金、及びAKMのアルフレッドP.スローン財団からの補助金によって賄われていた。 M.-È.T.フォンデラ凝ったエンサンテケベック（FRSQ）ポスドクトレーニングの賞によって運営されている。

1。動物の血流<ol><li>灌流の前日に、準備します。 とナトリウムリン酸緩衝液（PBS、50mMのPBで0.9％のNaCl、pH7.4）を生理食塩水を1Lの蒸留水に、 - リン酸緩衝液（100mMの、pH7.4のPB）の2 L。 4でPBのPBSと1L℃にて保存してください。これらは血流との事前エンベディング免疫細胞化学のために使用されます。 - 6匹のマウスの灌流を可能とする4.0％のパラホルムアルデヒド（PFA、pH7.4）で固定液の1L。その目的のために、換気フードの下にPBの1 Lを加熱する。粒状パラホルムアルデヒド（PFA）の40gを秤量し、60℃に達すると、PB溶液中に注ぐこのソリューションは、完全に溶解PFAで、4℃、室温（RT）とストアへのクールなクリアされている場合℃の</li><li>血流の日に、換気フードの下にPBで3.5％アクロレイン溶液500mlを用意。その後、3.5％アクロレインとろ紙を用いて4.0％PFAのソリューションをフィルタリング。 </li><li>マウスの麻酔の場合は、27ゲージで腹膜にペントバルビタールナトリウム（80 mg / kg）を注入する½&quot;針を。 </li><li>灌流時には、PBSを50mLのは、アクロレインの75 mLを加え、PFAの150mLのは、順番にマウスの循環に渡されます。蠕動ポンプを設定するには、PBSでチューブを記入し、一方の端に23ゲージ¾&quot;蝶の針を固定する。灌流液（PBS、アクロレインまたはPFA）にチューブのもう一方の端を浸す。蠕動の速度を設定します。幼若および成熟マウス20〜25 mL / minのポンプ。灌流を通して、チューブ内に形成する空気の気泡を慎重に避ける。 </li><li>麻酔マウスは、もは​​や先に進む前に、そのような尾のピンチのような痛み刺激に応答するまで待って。解剖トレイに動物を置き、テープを使用して足を固定する。ピンセットやハサミで、肌と心を公開するために胸腔を開く。脳虚血を最小限に抑えるために、血流は急速に起動する必要があります。小さなハサミで右心房を開いてカットし、蠕動ポンプを起動します。ピンセットで心臓を押さえながら、左心室の頂部に蝶の針を挿入する。 </li><li>ソリューションを変更する場合は、蠕動ポンプを停止し、つのソリューションから別のチューブに移し、ポンプを直ちに再起動します。 </li><li> PFAの150mLのが経過すると、蠕動ポンプを停止する。小さなはさみを使って、肌を開く、頭を切り落とし、と目の間に頭蓋骨を破る。脳は簡単に削除できるようになるまで頭蓋骨の小さ​​い部分から慎重にチップ、小さなピンセットを、使用する。 4℃で2時間脳をポスト修正° PFAのC。 PBSで3回10分を洗浄する。 </li><li>すぐにビブラトームを用いて氷冷PBSで横の脳（50μm厚のセクション）をカット。細かいブラシで、PBSを含有するガラスバイアルに免疫細胞化学用に選択されたセクションを転送する。数年までのために凍結防止剤で、-20 ° C（30％エチレングリコール及びPBSで30％グリセロール）で残りのセクションを保管してください。 </li></ol> 2。プレ埋め込み免疫細胞化学<ol><li>免疫細胞の場合、セクションは、ガラスバイアルに浮かんで自由に処理されます。手順では、人は慎重にセクションが乾燥させることを回避する必要があります。 </li><li>最初に、転送ピペットを用いてPBSを除去し、すぐに室温で30分間、PBS中の0.1％の水素化ホウ素ナトリウムの新鮮な溶液を交換してください。 </li><li> 、PBSで3回10分でセクションをすすぎ、すべての気泡を除去し、0.5％ゼラチンおよび二次抗体が生成された動物の5％正常血清（正常ヤギ血清中の含有PBSブロッキング液に室温で2時間インキュベートIba1 -免疫染色の現在の例）。 </li><li>ブロッキング溶液に一次抗体で48時間インキュベートする。 Iba1 -免疫染色のために、ウサギ抗Iba1抗体（1:1000）を使用してください。 </li><li> PBSで3回の10分のセクションをすすぎ、室温で2時間ブロッキング溶液でビオチンへの結合二次抗体（1:1000）でインキュベートする。 Iba1 -免疫染色のために、ヤギ抗ウサギIgGを使用してください。 </li><li> PBSで3回の10分のセクションをすすぎ、室温で1時間ブロッキング溶液にストレプトアビジン - 西洋ワサビペルオキシダーゼ（1:1000）でインキュベートする。 </li><li> PBSの10分とトリス/塩酸緩衝生理食塩水でセクションをリンス（TBS、50 mMのは、pH 7.4）2回10分。ラベルを明らかにするために、0.05％DABとTBSの0.01％過酸化水素（新たに調製した溶液）を持つセクションをインキュベートする。染色は、暗褐色のとき（図1の例を参照）、TBSで洗浄して反応を停止する。いずれの場合でも、最大5分後に反応を終了させる。 TBSの10分とPB 2回10分でセクションをすすいでください。 </li></ol> 3。電子顕微鏡のための処理<ol><li>細かいブラシを使ってマルチウェル培養プレートにPBにセクションを移す。発煙ボンネットの下にPBの1％四酸化オスミウム溶液を調製。培養プレートのウェルからPBを外し、<html>細かいブラシでフラットなセクションを広げる。室温で30分間、1％オスミウムですぐに浸すセクション。 </li><li> 、ガラスバイアルにセクションを移しPB 3回10分ですすぎ、およびエタノールの濃度を昇順に2分のはめ込みを通して脱水：2回35％、1回50％、それぞれ、70％、80％、90％、および95 3倍の酸化プロピレン続い％、3回100％。 </li><li> Durcupan樹脂を準備するには、色が均一になるまでよく混ぜ、使い捨てビーカーにコンポーネントを20g、成分B、成分Cを0.6g、及び成分Dを0.4gの20gを組み合わせることで、アルミ重量に注ぐ皿。必要に応じて、樹脂ブロックは、金型を埋め込むと、48〜72時間、55℃のオーブンで硬化中に樹脂を注入することにより調製することができる。 </li><li>酸化プロピレンですすぎ細かいブラシを使用して、室温で一晩含浸用Durcupan樹脂に酸化プロピレンと浸すからセクションを削除。 </li><li>翌日、アルミ、樹脂を柔らかくするために10分間55℃のオーブンに皿の重量を量る置く。プロピレンオキサイド、コート樹脂の薄層とACLAR埋め込みフィルムでリンスブラシを使用して、別の埋め込みフィルムでカバーし、均等に（;例えばガラスバイアルのプラスチックキャップをgで約2）光の重みを分散、セクションを下に置く上に樹脂が拡散するのに役立ちます。樹脂の重合のため、48〜72時間のオーブン（55℃）でインキュベートする。 </li><li>重合後、セクションの上部に光の重みと埋め込み膜を除去。双眼顕微鏡下で、関心の正方形の領域を選択（2 × 2 mm程度）とカミソリの刃を使ってフィルムから、それらを注意深く物品。 </li><li>スーパー接着剤を使用して、樹脂ブロックの先端に接着剤の関心領域を、1時間、55℃のオーブンで硬化する。 </li><li>切片の準備のために、カミソリの刃と等脚台形の形状に樹脂ブロックをトリム。 </li><li>ウルトラミクロトーム、ガラスナイフを使用して、組織の表面に接着剤や樹脂を取り外します。再蒸留水とガラスのナイフのボートを記入し、いくつかの半薄切片を（0.5-1μmの厚さ）カット。 </li><li>完璧なループを持つSuperFrostスライドするセクションを転送する。 ℃で1分間80℃の加熱プレート上にスライドを配置することにより、セクションを乾かします。 1分間0.1％トルイジンブルー染色（2 gのホウ酸ナトリウム、200 mLの蒸留水に0.2グラムトルイジンブルー）を数滴でカバー。再蒸留水で汚れを過剰に洗い流してください。光学顕微鏡によるセクションの試験は、樹脂（図2）から染色した組織を区別できるようになります。 </li><li>組織と樹脂の間に境界線がセクションの真ん中に達するまで切削再開。次の手順では、トレーニングを必要とすることに注意してください。ダイヤモンドナイフでガラスナイフを交換し、再蒸留水で船を埋める。銀金の極薄のセクション（60〜80 nmの厚さ）に銀をカットし、慎重に細かい逆ピンセットを用いて銅メッシュグリッドにそれらを収集する。ろ紙上にグリッドを乾かします。 </li><li>コントラストを高めるために、超薄切片をクエン酸鉛（0.03 gのクエン酸鉛と10mLの蒸留水1の0.1mLの10N水酸化ナトリウム）で染色することができます。細かい逆ピンセットを使用して、2分間クエン酸鉛の低下にグリッドを転送する。グリッドを削除し、微妙に二重蒸留水の3回連続お風呂で洗う。最後に、ろ紙上にグリッドを乾燥し、電子顕微鏡検査（図3-6）までのグリッドボックスに格納します。 </li></ol> 4。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig1.jpg" alt="図1" /> 図1光学顕微鏡レベルでIba1染色セクション。 Iba1の細胞分布を免疫染色の特異性を示すミクログリア、に限定されている。スケールバー= 100μmの。 <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。光学顕微鏡レベルでのトルイジンブルー染色半薄片。免疫染色、電子顕微鏡で最も強烈に表示される組織と樹脂の間に境界線を注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig3.jpg" alt="図3" /> 電子顕微鏡レベルでIba1免疫陽性ミクログリアの周核体とプロセスを示す図3。極薄のセクション。 Iba1陽性構造要素は、それらの免疫ペルオキシダーゼ- DAB電子密度の高い沈殿物によって認識されています。バー= 2μmのスケール。 <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig4.jpg" alt="図4" /> 電子顕微鏡レベルで異なるサイズと形状のIba1免疫陽性ミクログリアのプロセスを表示する図4。極薄のセクション。バー= 2μmのスケール。 E 5&quot;/&gt; 図5。その細胞内小器官の同定を可能にする、より高い倍率で図4からIba1陽性ミクログリアのプロセスを示す薄部。スケールバー= 1μmの。 <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig6.jpg" alt="図6" /> より高い倍率でIba1陽性ミクログリアのプロセスとシナプスを含む神経網の近くには要素間の超微細構造の関係を明らかにする図6。極薄のセクション。スケールバー=1μmの。

<ol>
	<li>Venable, J. H., Coggeshall, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+lead+citrate+stain+for+use+in+electron+microscopy.">A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).</li><li>Riad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatodendritic+localization+of+5-HT1A+and+preterminal+axonal+localization+of+5-HT1B+serotonin+receptors+in+adult+rat+brain.">Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain.</a> J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+EphA4+in+axon+terminals+and+dendritic+spines+of+adult+rat+hippocampus.">Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+course+of+EphA4+cellular+and+subcellular+localization+in+the+postnatal+rat+hippocampus.">Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-synaptic+and+post-synaptic+localization+of+EphA4+and+EphB2+in+adult+mouse+forebrain.">Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain.</a> J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+is+localized+in+clathrin-coated+and+synaptic+vesicles+in+adult+mouse+brain.">EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain.</a> J Neurochem. , (2010).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここでは手続きが厳格に実行されるときに、最適な超微細構造の保全と免疫細胞化学的検出の間で優れた妥協点を提供する免疫電子顕微鏡のためのマウスの脳組織の準備のためのプロトコルを記述している。 TEMと組み合わせることで、この方法はいくつかの特徴と識別基準に携帯電話の要素を区別することができます。特に、Iba1の免疫ペルオキシダーゼ- DAB染色では神経網の中で、ミクログリアperikaryonの複数形およびプロセスを識別するだけでなく、その形態、細胞内小器官、および他の細胞要素（図3-6）との超微細構造の関係を分析することができます。さらに、このプロトコルは、超微細構造グリアや神経の要素で可溶性または膜結合タンパク質の位置だけでなく、細胞内小器官との関連を分析することができます。確かに、特異的な抗体で、このプロトコルを使用して、我々はこれまで5 - HT1Aと5 - HT1Bセロトニン作動性神経perikaryonの複数形で受容体、樹状突起、樹状突起、無髄軸索、および成体ラット縫線背核、ドーパミンの内皮細胞の電顕的局在を明らかにした黒質、淡蒼球、および海馬2。我々はまた、生後発達と成人3,4,5,6の間に、クラスリン被覆小胞とマウスとラットの海馬や大脳皮質の異なるアストロサイトとニューロンの要素でEphA4のとEphB2チロシンキナーゼ受容体の電顕的局在を示している。最後に、このプロトコルは、事前に埋め込 ​​むには、例えば、成体マウスの大脳皮質6の軸索末端にVglut1グルタミン酸トランスポーターとEphA4の受容体の共局在を次の2つの同時標識タンパク質との間の超微細構造の関係を分析するために免疫金と組み合わせることができます。したがって、この手法は成功し、健康や病気で、出生後の生活を通して、様々な地域や中枢神経系の細胞型内の様々なタンパク質の微細構造的解析のために、単独で、または免疫金標識との組み合わせで、適用することができます。

*一つは、常に換気フードの下で働くとアクロレイン、ホルムアルデヒド、及びオスミウムを処理しても適切に廃棄物を処分する時期ニトリル手袋を着用してください。

preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy

透過型電子顕微鏡（TEM）がで中枢神経系では、非常に、ミクログリア可視化に有用なオリゴデンドロサイト、アストロサイト、神経細胞内コンパートメント（樹状突起、樹状突起スパイン、軸索、軸索ターミナル、周核体）、ならびにそれらの細胞内小器官と細胞骨格です。高空間分解能。として提示さ、TEMと組み合わせることで、事前に埋め込み免疫細胞は、いくつかの特徴と識別基準（例えば、ミクログリアperikaryonの複数形やプロセス、ミクログリア特異的なマーカーIba1（イオン化カルシウム結合アダプター分子1に対して抗体を使用しているときに携帯電話の要素の識別を可能にここで））、神経伝達物質の細胞内要素の内容（例えば、セロトニン作動性）およびそれらの超微細構造の可溶性または膜結合タンパク質の局在化（例えば、5 HT1AおよびEphA4の受容体を）特定する。ここでは、アクロレイン固定液、脳の除去と切片だけでなく、免疫ペルオキシダーゼ - ジアミノベンジジン（DAB）染色、樹脂の埋め込み、および脳切片の切片極薄でマウスの経心臓的灌流のためのプロトコルについて説明します。これらの手順が完了すると、免疫染色の材料はTEMで試験の準備ができています。厳密に実行する場合は、この手法は、最適な微細構造の保全と免疫細胞化学的検出の間で優れた妥協点を提供します。

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Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

我々は経心臓的マウスの灌流、脳の除去と切片だけでなく、免疫ペルオキシダーゼ染色、樹脂の埋め込み、および脳切片の切片極薄のためのプロトコルについて説明します。これらの手順が完了すると、免疫染色の材料は、透過型電子顕微鏡による検査のための準備ができています。

免疫電子顕微鏡のためのマウスの脳組織の準備

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

preparation-of-mouse-brain-tissue-for-immunoelectron-microscopy

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

36.8K ビュー.  University of Rochester. 我々は経心臓的マウスの灌流、脳の除去と切片だけでなく、免疫ペルオキシダーゼ染色、樹脂の埋め込み、および脳切片の切片極薄のためのプロトコルについて説明します。これらの手順が完了すると、免疫染色の材料は、透過型電子顕微鏡による検査のための準備ができています。

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Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

集束イオンビームは、粉砕し、脳組織の走査型電子顕微鏡

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

神経科学

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

YFPを発現クリアマウス脳の多光子顕微鏡

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

共焦点光シート顕微鏡全体マウスの脳のミクロンスケールの分解能光トモ

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

モデルとしての嗅覚系は、軸索の成長パターンと形態を研究する<em&gt;インビボ</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

最適化されたNを使用して急性脳スライスの準備-メチル-D-glucamine 保護回復法

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

プレ埋め込み免疫組織化学および電子顕微鏡のための非ヒト霊長類脳組織の調製

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial organization of synaptic vesicles. In order to obtain high-quality electron micrographs that can yield the degree of morphological detail necessary for quantitative analysis of pre-synaptic vesicle distribution, optimal specimen preparation is critical. Chemical fixation is the first step in the process of specimen preparation, and of utmost importance to preserve fine ultrastructure. Vascular fixation with a glutaraldehyde-formaldehyde solution, followed by treatment of vibratome-sectioned specimens with osmium tetroxide, stabilizes the maximum number of molecules, especially proteins and lipids, and results in superior conservation of ultrastructure. Tissue is then processed with counterstaining, sequential dehydration and resin-embedding. En bloc staining with uranyl acetate (i.e., staining of vibratome-sectioned tissue before resin embedding) enhances endogenous contrast and stabilizes cell components against extraction during specimen processing. Contrast can be further increased by applying uranyl acetate as a post-stain on ultrathin sections. Double-staining of ultrathin sections with lead citrate after uranyl acetate treatment also improves image resolution, by intensifying electron-opacity of nucleic acid-containing structures through selective binding of lead to uranyl acetate. Transmission electron microscopy is a powerful tool for characterization of the morphological details of synaptic vesicles and quantification of their size and spatial organization in the terminal bouton. However, because it uses fixed tissue, transmission electron microscopy can only provide indirect information regarding living or evolving processes. Therefore, other techniques should be considered when the main objective is to study dynamic or functional aspects of synaptic vesicle trafficking and exocytosis.

We describe procedures for processing newborn rat brain tissue to obtain high-resolution electron micrographs for morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals. The micrographs obtained with these methods can also be used to study the morphology of a number of other cellular components and their dimensional structural relationships.

Ultrastructural のための新生ラット脳組織の調製 Morphometric 神経末端におけるシナプス小胞分布の解析

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered tissue samples. Traditional immunolabeling procedures require cutting the sample into thin sections, which restricts the ability to label and examine intact structures. However, if brain tissue can remain intact during processing, structures and circuits can remain intact for the analysis. Previously established clearing methods take significant time to completely clear the tissue, and the harsh chemicals can often damage sensitive antibodies. The iDISCO method quickly and completely clears tissue, is compatible with many antibodies, and requires no special lab equipment. This technique was initially validated for the use in mice tissue, but the current protocol adapts this method to image hemispheres of control and transgenic rat brains. In addition to this, the present protocol also makes several adjustments to preexisting protocol to provide clearer images with less background staining. Antibodies for Iba-1 and tyrosine hydroxylase were validated in the HIV-1 transgenic rat and in F344/N control rats using the present hydrophobic tissue clearing method. The brain is an interwoven network, where structures work together more often than separately of one another. Analyzing the brain as a whole system as opposed to a combination of individual pieces is the greatest benefit of this whole brain clearing method.

Here we present a hydrophobic tissue clearing method that allows for the viewing of target molecules as part of intact brain structures. This technique has now been validated for F344/N control and HIV-1 transgenic rats of both sexes.

ラット脳組織の疎水性組織除去法

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

樹状脊椎研究のためのシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBEM)

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...