We acknowledge support of this work by the National Multiple Sclerosis Society and Simons Center for the Social Brain. BQ acknowledges support from the U.S. National Defense Science &amp; Engineering Graduate Fellowship program.

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The authors have nothing to disclose.

Jede Technik, die in diesem Papier misst verschiedene Facetten der mechanischen Eigenschaften des Hirngewebes. Kriechnachgiebigkeit und Spannungsrelaxation Moduli sind ein Maß für zeitabhängige mechanische Eigenschaften. Die Speicher- und Verlustmodul repräsentieren geschwindigkeitsabhängigen mechanischen Eigenschaften. Schlag Einbuchtung misst auch geschwindigkeitsabhängigen mechanischen Eigenschaften, sondern im Rahmen der Energiedissipation. Wenn Gewebe mechanische Eigenschaften zu charakterisieren, sowohl AFM-fähige Vertiefung und Rheologie werden Methoden verwendet. AFM-fähigen Einbuchtung ist besonders nützlich , weil zusätzlich zu zeitabhängigen Materialeigenschaften Bereitstellung verschiedenen experimentellen Parameter verwendet werden können , Zell- und Gewebeelastizitätsmodul 4 und auch frequenzabhängige Eigenschaften 24, zu messen , wie zuvor beschrieben. Allerdings kann eine genaue Interpretation der Daten und das Design von Experimenten für konform, hydrierten Gewebe eine Herausforderung sein. Während rheometry Maßnahmen bulk ordnungsgemäßeBindungen des Gewebes, AFM-fähigen Vertiefung Sonden mikroskaligen Volumen relevant Mikro &#39;Zellen. Schlag Einbuchtung stellt ein Mittel spezifisch zu quantifizieren, wie ein Material verformt sich im Zusammenhang mit einer konzentrierten, dynamischen Stoßbelastung, die in Anwendungen wie dem Studium traumatische Hirnverletzung verursacht durch fokale Wirkung nützlich ist. Während die Ergebnisse von jeder Technik nicht direkt vergleichbar sind, folgen die Energieableitungseigenschaften über Auswirkungen Vertiefung gemessen, um die gleichen Trends wie der Scherverlustmodul über Rheologie gemessen, wie unten diskutiert. In der AFM-fähigen Vertiefung des Hirngewebes hierin dargestellt, gemessen wir viskoelastischen Eigenschaften Kriechcompliance verwenden und Entspannung erzwingen. Wegen der kleinen Maßstab der AFM - Sonde kann diese Technik die mechanischen Eigenschaften von anatomisch unterschiedlichen Bereichen des Gehirns, wie der weißen und grauen Substanz Regionen des Corpus callosum und cortex messen jeweils (Fig. 4 </strong&gt;). Zwar gibt es andere Techniken sind mikro- mechanischen Eigenschaften von biologischen Proben für die Messung - wie zum Beispiel magnetische Verdrillung Zytometrie, optische Pinzetten und Mikrorheologie - haben sich diese Techniken nicht erfolgreich auf Gewebeproben auf die relativ starke Streuung von Licht innerhalb halbopake teilweise aufgrund verwendet worden Gewebe. Wir fanden , dass das viskoelastische Verhalten des Gehirns auf diese Weise gemessen Gewebe qualitativ ähnlich ist bisher berichteten Ergebnisse von Elkin &amp; Morrison 26. Während die Größe der gemessenen Werte für Relaxationsmodul nicht übereinstimmen, ist dies in experimentellen Bedingungen der Differenz wahrscheinlich zurückzuführen. Elkin &amp; Morrison verwenden, um eine 250 &amp; mgr; m Durchmesser flach Stempel, im Vergleich zu unserem 20 &amp; mgr; m Durchmesser Kugel. Zusätzlich Elkin &amp; Morrison führen Messungen an Hirngewebe von Ratten, während wir Messungen an Hirngewebe von Mäusen erhalten wurden durchgeführt. Trotz dieser Unterschiede beide Techniken measheterogenen mechanischen Eigenschaften im Hirngewebe ured, oder genauer gesagt, dass die weiße Substanz des Corpus callosum einen niedrigeren Relaxationsmodul als die graue Substanz des Kortex in der koronalen Ebene zeigt. Es ist wichtig zu beachten, daß, während wir die Kriechnachgiebigkeit und Kraftrelaxation Moduli in Reaktion auf ein angefordertes Schritt Last oder Schritt Einbuchtung berechnet jeweils die experimentell aufgebrachten Last und Einbuchtung sind nicht ideal (unverzögert) Stufenfunktionen. Lasten und Vertiefungen sind über kurze Zeiträume angelegt (&lt;1 sec), und diese Belastungshistorien können die gemessenen Kriechen und Relaxation Antworten 7,25 beeinflussen. Genauer gesagt, ein angelegtes Schritt Vertiefung führt zu leichten Unterschätzung des Relaxationsmodul unter der Annahme, während ein angelegtes Schritt Belastung führt zu leichten Überschätzung des Compliance-Modul Kriechen unter der Annahme. Die Diskrepanzen zwischen den tatsächlichen und berechneten Elastizitätsmodul als die Rampenraten verringernder aufgebrachten Lasten und Einrückungen zu erhöhen. Ein Schlüsselschritt Last Entspannung bei der Durchführung ist die Wahl der richtigen Größe der Kraft aufrechterhalten (dh der Sollwert auf die Photodiode Spannung entspricht , die direkt auf die angelegte Kraft bezieht). Die Sollkraft für Kriechcompliance muss so gewählt werden: (1) die Antwort ist groß genug, um leicht meßbaren Veränderungen in der Eindringtiefe zu erzeugen; und (2) klein genug, dass die Eindringtiefe erforderlich, um die Sollkraft zu halten nicht so groß werden, als außerhalb des Bereichs des AFM piezoelektrischen Aktor zu treiben, die die vertikale Position des AFM Cantilever-Basis moduliert. In dem vorgestellten Protokoll haben wir eine Sollkraft von 5 nN vorgeschlagen, die für unsere experimentellen Aufbau gut funktioniert. Wenn jedoch die AFM Piezo nicht in der Lage ist , diese Kraft aufgrund seiner begrenzten Bewegungsbereich zu halten (siehe Abb. 4A, Einschub), kann dieser Wert gesenkt werden. Diese experimentelle Frage ist nicht encountEred mit Kraft Relaxationsexperimente, die eine konstante, berechnete Eindringtiefe durch eine Rückkopplungsschleife aufrechtzuerhalten. Im Gegensatz zur quasistatischen AFM-fähigen Einbuchtung am Nanonewton (nN) maßstäblich Kräfte und um angelegte Tiefen gilt Schlag Einbuchtung eine konzentrierte dynamische Belastung mN angelegten Kräfte und misst die Deformationsantwort Probe bis zu einer Tiefe nähert sich der Millimeterskala. Wir haben zuvor Auswirkungen Einrückung verwendet , um das Verhalten des Herzens und der Leber 9,11,12 und beobachteten eine ähnliche Abhängigkeit der Energiedissipation Reaktion auf Belastungsrate für Gewebe dieser Organe zu quantifizieren. Auswirkungen Einbuchtung Sonde Radien im Bereich von um bis mm aufzunehmen. Darüber hinaus können Versuche Auswirkungen Einbuchtung in vollständig eingetaucht Umgebungen durchgeführt werden, die für die mechanische Charakterisierung von hydratisiertem Gewebe 21 ermöglicht. Wenn hochnachgiebige Proben zu testen, wie Hirngewebe, important Überlegungen müssen berücksichtigt werden. Erstens ist die maximale meßbare Tiefe in das Material etwa 1 mm, eine Begrenzung der Längenskalen des Instruments eingestellt selbst; weiter Pendelauslenkungsdetektor physikalisch durch die Kollision zwischen der elektromagnetischen Spule angeordnet an der Spitze des Pendels und der stationären Magnetplatte angehalten wird. Für Hirngewebe begrenzt dies die höchste Schlaggeschwindigkeit, die erfolgreich auf ca. 5 mm / sec angewendet werden kann. Man beachte , dass , während die Aufprallgeschwindigkeiten in der Größenordnung mm / s sind, sind die entsprechenden Dehnungsenergiedichten in der Größenordnung von kJ / m 3, die 11 ballistische Bedingungen, aufgrund der geringen Abmessungen des Sondenradius annähert. Zweitens kann es möglicherweise schwierig werden, für die das Gerät den Kontakt zwischen der Sonde und der Gewebeoberfläche zu erfassen. Da der Probentisch in Richtung der Sonde bewegt, Kontakt erfasst wird, wenn das Pendel durch das sich bewegende Probe zurückgeschoben wird. Jedoch für sehr compliant Proben kann das Pendel nicht detektierbar abgelenkt werden, während die Sonde in die Probe eindringt. Um dieses Problem zu lösen, können wir die Geschwindigkeit erhöhen, mit der der Probentisch so bewegt, dass es eine größere Dynamik bei Kontakt sein, das Pendel zurück zu fahren. Die Probe sollte auch so flach wie möglich sein, um weitere Fehler zu minimieren in die richtige Anlaufstelle zu erkennen. Schließlich beachten, dass die Stoßbelastung nicht um eine echte Impulsbelastung ist, daß der elektromagnetische Strom am Pendel oben um eine Antriebskraft für die Penetration nach der ersten Aufprallereignis zu liefern fortgesetzt. Als Ergebnis kann bei den höheren Belastungsbedingungen auftreten, Kriechen vor allem, die Analyse der Energieableitungseigenschaften erschwert. Weitere Arbeiten zu diesem Verfahren kann die Zeitantwort von der Stoßantwort beinhalten entkoppeln, Temperaturregelung Einführung Studien bei Körpertemperatur zu ermöglichen, und auch die Visualisierung der Gewebeprobenfläche über eine microscope kompatibel mit der flüssigen Zelle. Rheometrie misst die frequenzabhängigen mechanischen Eigenschaften von viskoelastischen Feststoffe auf der makroskaligen Ebene. Die Schermodule Komponenten, Lagerung G &#39;und Verlust G &quot;kann in der Frequenz gemessen werden , typischerweise im Bereich Spanning 0,001-0,1 rad / sec bis 10-100 rad / sec, je nach Gerät, Sondengeometrie und Probe 13. Für eine genaue Messung eine Amplitudensweep, sollte vor einer Frequenz - Sweep durchgeführt werden , um den linearen elastischen Bereich des Materials zu bestimmen, das ist der Bereich des Stammes ist , für die G &#39;und G&#39; bleiben &#39;14,27 konstante , die die Scherbeanspruchung für die Frequenz gewählt. Sweep sollte so hoch wie möglich innerhalb des linearen viskoelastischen Grenze liegen (typischerweise 1-2% Scherbeanspruchung), so daß ein ausreichendes Drehmoment bei der Messung erreicht wird. Das Drehmoment während der Messungen immer in dem zulässigen Bereich vom Hersteller bereitgestellt werden sollte, um sicherzustellen, wieufficient Signal-Rausch-Verhältnis. Zusätzlich verwendet die Rheometrie Sonde sollte so groß wie möglich sein , um das Drehmoment zu maximieren, aber mit der Probe vollständig 13 überlagern muß. Bei der Herstellung der Probe sollte das Gewebe so flach wie möglich geschnitten werden, um Spannungsgradienten zu minimieren, wenn der Kontakt zwischen den Platten hergestellt wird. Bei Kontakt mit der Probe durchgeführt wird, haben die Gewebe sollten keine Wassertropfen auf sie an dieser Grenzfläche Schlupf zu minimieren. Aber auch das Gewebe darf nicht auf oder während der Messung ausgetrocknet werden , bevor , da dies die Gewebestruktur 13 abgebaut wird. Das Gewebe sollte vollständig mit den Medien nach dem Kontakt zwischen den beiden Platten mit Feuchtigkeit versorgt werden. Klebstoff kann wasserdicht Schmirgelpapier auch an den Platten angebracht werden Schlupf 28 zu minimieren. Zusätzlich axiale Kompression wurde 29 die Größe G &#39;des Hirngewebes zu verändern gezeigt. Da Rheologie Proben sind in der Regel dünn (~ 5 mm), kleine Änderungen in der Höhe (~ 500&amp; mgr; m) können große Druckspannungen (zB ~ 10%), und damit wesentliche Änderungen in der Schubmodul erzeugen. Außerdem ist , wie die Probe viskoelastischen ist, wird das Material Spannungsrelaxation durch axiale Kompression 28, unterzogen werden, die Messungen beeinflussen können. Somit sollte wiederholten Messungen bei ähnlichen Betriebs axialen Dehnungen durchgeführt werden, und die Probe erlaubt werden sollte , sich zu entspannen (beispielsweise 5-10 min) vor der Messung. Fehler bei diesen Phänomenen verbunden ist, ist eine Begrenzung der Technik. Andere Einschränkungen der Rheometrie umfassen die Annahme , dass das Material homogen und isotrop ist, die oft in Gewebeproben 13 nicht wahr ist. Zusätzlich sollten Temperatur unter physiologischen Bedingungen aufrechterhalten werden , wie es G beeinflussen &#39;und G &quot;22. Im Hirngewebe speziell erhöhte Temperatur wurde sowohl G verringern gezeigt&#39; und G &#39;&#39; bescheiden , ohne das Potenzgesetz beha WechselVior mit der Frequenz, folgt damit dem Zeit-Temperatur - Überlagerung Haupt 22,30. Unsere Daten sind in guter Übereinstimmung mit früheren Studien 22,27 in Schweinehirn, die ähnliche Größen von G &#39;und G&#39; &#39;beobachtet, sowie eine schwache Potenzgesetz Frequenzabhängigkeit sowohl G&#39; und G &quot;. Das berechnete Verhältnis tan &amp; dgr; = G &quot;/ G &#39;(Abb. 6) eine Basis eines Vergleichs zwischen rheometry und Auswirkungen Einzug bereitstellt. In Auswirkungen Einzug, fanden wir , dass die Energieverlustleistung bei erhöhter Belastung Raten erhöht das Hirngewebe. Mit rheometry fanden wir , dass wie Frequenz erhöht, tan &amp; dgr; auch. mit anderen Worten erhöht, wobei das Material bei höheren Frequenzen mehr ableitende war. Darüber hinaus, während Messungen Auswirkungen Einbuchtung nicht einen Elastizitätsmodul direkt zu quantifizieren, die Eindringtiefen x max Abnahme direkt mit increasing Elastizitätsmodul. Zusammen bilden die in diesem Dokument beschriebenen Verfahren auf der Mikro-, Meso- und Makrolängenskalen, und bei unterschiedlichen Belastungsgeschwindigkeiten die mechanische Charakterisierung von Hirngewebe ermöglichen. Die Verfahren hierin präsentierten können auf einer Anzahl von nachgiebigen Materialien verwendet werden, einschließlich sowohl biologischen Geweben und konstruiert Hydrogelen. Mit einer eingehenden Verständnis der Multiskalen-viskoelastischen Eigenschaften des Hirngewebes, können wir Design Materialien entwickelt, besser ist die mechanische Reaktion des Gehirns nachzuahmen. Diese Gewebe simulant Materialien können Vorhersage von mechanischen Beschädigungen und Engineering von Schutzstrategien erleichtern. Zusätzlich können die Materialeigenschaften des Gehirns verwendet werden bioinspirierter Materialien für in vitro zu konstruieren und in vivo Studien besseres Wachstum und Konnektivität von Zellen in das zentrale Nervensystem zu verstehen, insbesondere im Zusammenhang mit neurologischen Erkrankungen wie Autismus und Multiple Sklerose.

Die meisten Weichteile biologische Organe umfassen, sind mechanisch und strukturell komplexen, von geringer Steifigkeit im Vergleich zu mineralisiertem Knochen oder technischen Materialien und weisen eine nichtlineare und zeitabhängige Verformung. Im Vergleich zu anderen Geweben im Körper, ist bemerkenswert Hirngewebe kompatibel ist , mit Elastizitätsmoduln E in der Größenordnung von 100 s von 1 Pa. Das Hirngewebe zeigt strukturelle Heterogenität mit deutlichen und ineinandergreifenden grauen und weißen Substanz Regionen, die auch funktional unterscheiden. Verständnis Hirngewebe Mechanik wird in der Konstruktion von Materialien und Rechenmodelle unterstützen die Antwort des Gehirns während Verletzungen zu imitieren, Vorhersage mechanischer Beschädigung zu erleichtern, und das Engineering von Schutzstrategien ermöglichen. Zusätzlich können solche Informationen verwendet werden Entwurfsziele für die Geweberegeneration zu betrachten und zu einer besseren strukturellen Veränderungen im Hirngewebe zu verstehen, die mit Erkrankungen wie Multiple Sklerose und Autismus assoziiert sind. Here, wir beschreiben und verschiedene experimentelle Ansätze zeigen, dass die viskoelastischen Eigenschaften von mechanisch nachgiebigen Gewebe einschließlich Hirngewebe, auf der Mikro-, Meso- und Makroskalen zur Verfügung stehen zu charakterisieren. Am mikroskaligen führten wir Kriechen-Compliance und Relaxationsexperimente Kraft mit Rasterkraftmikroskop (AFM) -fähigen Einzug. Typischerweise wird AFM-fähige Vertiefung verwendet , um den Elastizitätsmodul (oder momentane Steifigkeit) zur Abschätzung einer Probe 2-4. Jedoch kann das gleiche Instrument auch zur Messung mikroskaligen viskoelastischen (zeit- oder geschwindigkeitsabhängig) Eigenschaften 5-10 verwendet werden. Das Prinzip dieser Experimente, die in 1 gezeigt, ist eine AFM - auskragenden Sonde in das Gehirngewebe einrücken, eine festgelegte Größe der Kraft oder Eindringtiefe, zu pflegen und die entsprechenden Änderungen in Eindringtiefe und Kraft messen, die jeweils über die Zeit. Mit Hilfe dieser Daten können wir die Kriechen comp berechnenliance J C und Entspannungsmodul G R. Am mesoskaliger führten wir Einfluss Einzug Experimente in Flüssigkeit getauchten Bedingungen, die die Gewebestruktur und Hydratationsniveaus, mit einem Pendel-basierten instrumentierten Nanoindentor halten. Der Versuchsaufbau ist in Figur 2 veranschaulicht. Da das Pendel mit dem Gewebe in Kontakt tritt, Sondenverdrängung als Funktion der Zeit aufgezeichnet wird , bis die oszillierende Pendel im Gewebe zur Ruhe kommt. Aus der resultierenden gedämpften harmonischen Schwingungsbewegung der Sonde kann man die maximale Eindringtiefe x max, Energiedissipation Kapazität K und Verlustqualitätsfaktor Q des Gewebes 11,12 (die der Rate der Energieabgabe bezieht) berechnen. Im makroskopischen verwendeten wir eine parallele Platte-Rheometer der frequenzabhängigen Scherelastizitätsmoduln zu quantifizieren,der Speichermodul G bezeichnet &#39;und Verlustmodul G &quot;des Gewebes. In dieser Art von Rheometrie wenden wir einen harmonischen Winkelspannung (und Scherbeanspruchung entspricht) mit bekannten Amplituden und Frequenzen und messen die Reaktions - Drehmoment (und eine entsprechende Scherspannung) , wie in Abbildung 3 dargestellt. aus der resultierenden Amplitude und Phasenverzögerung des gemessenen Drehmoments und geometrischen Variablen des Systems, können wir G &#39;und G &quot;bei angelegten Frequenzen von Interesse 13,14 berechnen.

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		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Xylaxine</td>
			<td style="width:161px;">Lloyd Laboratoried</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:401px;">perscription drug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine</td>
			<td>AnaSed Injections</td>
			<td></td>
			<td>perscription drug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome (Vibrating blade microtome)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hibernate-A Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1247501</td>
			<td>CO2-independent neural medium for adult tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Atomic Force Microscope, MFP-3D-BIO</td>
			<td>Asylum Research</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dish Heater</td>
			<td>Asylum Research</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AFM Probe, 0.03 N/m, 10 um radius borosilicate sphere</td>
			<td>Novascan</td>
			<td>PT.GS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>mussel-derived bioadhesive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>alternate suppliers can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide, 1N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59223C</td>
			<td>alternate suppliers can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Instrumented Indenter, NanoTest Vantage</td>
			<td>Micro Materials Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>probe tip needs to be machined (steel flat punch, 1mm diameter, 4-5 mm length)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoTest Liquid Cell</td>
			<td>Micro Materials Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parallel Plate Rheometer MCR501</td>
			<td>Anton-Parr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PP25&#160;</td>
			<td>Anton-Parr</td>
			<td>-</td>
			<td>25 mm diameter flat measurement plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adhesive Sandpaper</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4184A48</td>
			<td>alternate suppliers can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Loctite 4013 Instant Adhesive</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>20268</td>
			<td>alternate suppliers can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing multiscale mechanical properties of brain tissue using atomic force microscopy, impact indentation, and rheometry

Zu entwerfen und Ingenieur Materialien durch die Eigenschaften des Gehirns inspiriert, ob für mechanische simulants oder für die Geweberegeneration Studien sich das Hirngewebe gut sein müssen an verschiedenen Längen- und Zeitskalen charakterisiert. Wie viele biologische Gewebe weist Hirngewebe eine komplexe, hierarchische Struktur. Jedoch im Gegensatz zu den meisten anderen Geweben ist Gehirn sehr geringe mechanische Steifigkeit, mit Young&#39;schen Elastizitätsmoduln E in der Größenordnung von 100 s von Pa. Diese geringe Steifigkeit Herausforderungen experimentellen Charakterisierung von Schlüssel mechanischen Eigenschaften darstellen kann. Hier zeigen wir einige mechanische Charakterisierung Techniken, die angepasst wurden, um die elastischen und viskoelastischen Eigenschaften von hydriertem, konformen biologischen Materialien wie Hirngewebe zu messen, auf unterschiedlichen Längenskalen und Beladungsraten. Am mikroskaligen führen wir Kriechen-Compliance und Kraft Entspannung Experimente mit Rasterkraftmikroskop-fähigen Einzug. An den MesosCale, führen wir Experimente Auswirkungen Vertiefung ein Pendel-basierte instrumentierten Eindringkörper verwendet wird. Am makroskaligen führen wir Parallelplattenrheometrie die frequenzabhängigen Scherelastizitätsmodul zu quantifizieren. Wir diskutieren auch die Herausforderungen und Einschränkungen bei den einzelnen Methoden verbunden. Zusammen ermöglichen diese Techniken eine gründliche mechanische Charakterisierung von Hirngewebe, das besser genutzt werden kann, um die Struktur des Gehirns zu verstehen und bio-inspirierte Materialien zu konstruieren.

Abbildung 4 zeigt repräsentative Vertiefung und Kraft gegenüber der Zeit Antworten (4B, E) für Kriechcompliance und Relaxationsexperimente zwingen, da eine angelegte Kraft oder Eindringtiefe (4A, D) sind. Unter Verwendung dieser Daten und der Geometrie des Systems, die Kriechnachgiebigkeit J c (t) und Entspannungs Moduli Kraft G R (t) für unterschiedliche Regionen des Gehirns (4C, F) berechnet werden. Während frühere Studien haben einen Unterschied zwischen den Elastizitätsmoduln der verschiedenen Bereiche des Gehirns 23, die viskoelastischen Eigenschaften auf diese Weise für Maus - Gehirngewebe Scheiben zeigen inter Variation nicht innerhalb eines gegebenen Gewebeschnitt gemessen gezeigt. Schlag Einbuchtung misst die mechanischen Eigenschaften des Gewebes bei hohen Raten von räumlich und zeitlich concentrated Laden. Die Ergebnisse dieser Experimente liefern Informationen darüber, wie das Gewebe mit einer Operation verbunden sind Energie in Reaktion auf traumatische Verletzungen oder vorsätzliche Verformung abführt. Die gedämpfte Schwingbewegung der Auswirkungen Vertiefung Sonde (2B) liefert Informationen , um die maximale Eindringtiefe x max (5A), Energieableitungskapazität K (5B) und Energiedissipationsrate Q (5C) des Gewebes zu berechnen. Eindringtiefe misst die Verformungswiderstand, die stark mit dem Gewebe des Elastizitätsmodul korreliert: steifer Gewebe für eine bestimmte Aufprallgeschwindigkeit und Aufprallenergie kleinere Eindringtiefen aufweisen. Energiedissipation Kapazität ist ein einheitsloses Maß für das Ausmaß, in dem das Gewebe während der ersten Schlagzyklus, um die Aufprallenergie abführt. Dissipation Qualitätsfaktor misst, wie viele Zyklen auftreten, bevor die Schwingungen von impact erheblich bedämpft - dies bezieht sich direkt auf die Rate der Energieabgabe, obwohl dies nicht in Zeiteinheiten ausgedrückt wird. Diese drei Stoßantwortparameter können bei unterschiedlichen Aufprallgeschwindigkeiten quantifiziert werden, was ein Mittel bereitstellt, um die geschwindigkeitsabhängigen Eigenschaften des Gewebes zu untersuchen. 6 zeigt makroskopischen G &#39;und G &quot;für Frequenzen im Bereich von 0,1 rad / sec bis 50 rad / sec. Der Speichermodul ist fast eine Größenordnung größer als der Verlustmodul bei niedrigen Frequenzen. Um jedoch das Verhältnis zwischen den Speicher- und Verlustmoduln sinkt mit zunehmender Frequenz. Dies zeigt, dass elastische Eigenschaften, das Verhalten des Hirngewebes dominieren, da das Speichermodul beschreibt elastischen Eigenschaften und der Verlust beschreibt Modulus viskosen Verluste des Materials. bei einer ausreichend hohen Belastungsfrequenz, wird der Speicher- und Verlustmoduln gleichzusetzen, Angabe der Stelle, an derdas Material beginnt (dh viskosen Eigenschaften , das Verhalten der Probe dominieren) zu fließen. Für den Fall von Hirngewebe, wie dargestellt, gemessen hierin physikalischen Grenzen der Instrumente erlauben uns nicht, Materialeigenschaften bei höheren Frequenzen zu messen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54201/54201fig1.jpg" /> Abbildung 1. Abbildung der AFM-fähigen Kriechcompliance und zwingen Relaxationsexperimente. (A) AFM-fähigen Vertiefung wird unter Verwendung eines flexiblen Ausleger mit einem kugelförmigen Wulst von Nano- bis Mikroradius zum freien Ende angebracht werden. (B) Während der Einbuchtung Cantileverauslenkung gemessen wird unter Verwendung eines Lasers das Ende des Auslegers reflektiert und auf eine Photodiode. (C) Kraft Relaxationsexperimente werden durch Einrücken der Ausleger auf einen konstanten angelegten Tiefe durchgeführt, während die Kraft Zerfall mit respect zu Zeit gemessen. (D) Creep Compliance - Maßnahmen die sich verändernde Eindringtiefe des Auslegers mit einer konstanten angelegten Kraft. (C) und (D) wurden in fünf Regionen (grüner Text) unterteilt: (1) Anfahren der AFM-Sonde zur Probenoberfläche, (2) Kontakt mit der Probe und Rampe bis zu einer Soll-Einzug / Kraft, (3) Aufrechterhaltung der Soll Vertiefung / Kraft, (4) Rampe nach unten und (5) Zurückziehen der AFM - Sonde von der Probenoberfläche. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54201/54201fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54201/54201fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54201/54201fig2.jpg" /> Abbildung 2. Abbildung der Auswirkungen Vertiefung Experimenten. (A) Schematische Darstellung der Auswirkungen Vertiefung ist , welche die Fähigkeit Experimente in vollhydratisierte Bedingungen durchzuführen. (B) Repres<html> entative Sondenverschiebungsprofil als Funktion der Zeit von einer Mausgehirn-Scheibe und die entsprechende Geschwindigkeitsprofil gesammelt. Key gemessene Verschiebung und berechneten Geschwindigkeitsparameter zur Energieableitung zu quantifizieren sind angezeigt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54201/54201fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54201/54201fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54201/54201fig3.jpg" /> Abbildung 3. Abbildung der parallelen Platte Rheometer Experimenten. (A) Schematische Darstellung der parallelen Platte Rheometerexperiment und Definitionen der angelegten oszillierenden Scherdehnung bezogen. (B) Repräsentative ausgeübten Verformung und daraus resultierende Spannung als Funktion der Zeit. Scherspeichermodul G &#39;und Verlustmodul G &quot;werden über die Dehnungsamplitude berechnet54201 / 54201eq12.jpg &quot;/&gt;, Drehmoment Amplitude T &#39;0, Phasenverzögerung <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/54201/54201eq13.jpg" /> , Sonde und Probe Radius R und Probenhöhe h. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54201/54201fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54201/54201fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54201/54201fig4.jpg" /> Abbildung 4. Repräsentative Daten aus Kriechcompliance und zwingen Relaxationsexperimente. (A, B) Von den Rohdaten in Abbildung 1, eine Region von Interesse für Kriechcompliance definiert als die Zeit ist , wo Kraft ausgeübt konstant bleibt (A) während der Eindringtiefe gemessen wird (B). Der Einschub in (A) zeigt Daten aus einem erfolglosen Experiment , bei dem die AFM - Piezo war nicht in der Lagedie aufgebrachte Kraft und die Einfügung in (B) zeigt die entsprechende Einbuchtung Antwort zu erhalten, die zu den Daten eines erfolgreichen Versuchs qualitativ ähnlich ist , in (B) gezeigt. (C) mit Daten aus der aufgebrachten Kraft, gemessen Einbuchtung, und die Kenntnis der Geometrie der Sonde Kriechnachgiebigkeit J c (t) berechnet. (D, E) In Kraft Entspannung, Eindringtiefe konstant (D) gehalten, während Kraft gegen die Zeit gemessen wird (E). (F) Mit Hilfe dieser Daten Kraft Relaxationsmodul G R (t) berechnet werden. Kriechnachgiebigkeit und Kraftrelaxation Experimente können auf anatomisch unterschiedlichen Regionen des Gehirns, wie dem Corpus callosum (rot) und Kortex (blau) durchgeführt werden. Daten in (C, F) sind ein Durchschnitt der Messungen von n = 5 Mäuse. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54201/54201fig4large.jpg" target="_blank">Bitte clic</a>k hier eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54201/54201fig5.jpg" /> Abbildung 5. Repräsentative Daten aus schlagzäh Vertiefung Experimenten. Maximale Eindringtiefe x max, Energieableitungskapazität K und Verlustgütefaktor Q von Maus - Hirngewebe werden aus rohen Verschiebung Profile berechnet bei unterschiedlichen Aufprallgeschwindigkeiten erhalten. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt (n = 18 Wiederholungsmessungen pro Punkt). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54201/54201fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54201/54201fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54201/54201fig6.jpg" /> Abbildung 6. Repräsentative Daten aus rheometry Experimenten. Speicher G &#39;undVerlust G &#39;&#39; E - Module von koronalen Scheiben Schweine Gehirne. Die Menge tan &amp; delta; ist definiert als Verhältnis von Verlustmodul zu Speicher berechnet. Die Daten werden dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 4 Wiederholungsmessungen pro Punkt). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54201/54201fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54201/54201fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

Charakterisieren Multiskalige Mechanische Eigenschaften von Gehirngewebe mittels Rasterkraftmikroskopie, Schlag Einrückungen und Rheometrie

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

characterizing-multiscale-mechanical-properties-brain-tissue-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.2K Aufrufe.  Massachusetts Institute of Technology. We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

Serie: Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Vorbereitung von Gehirngewebe der Maus für Immunelektronenmikroskopie

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Forschung

Neurowissenschaften

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Fokussierten Ionenstrahl-Fräs-und Rasterelektronenmikroskopie des Hirngewebes

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Das olfaktorische System als Modell zur Axonal Wachstumsmuster und Morphologie Studieren<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation of a given stimulus might be dependent on context and history. If this is actually the case, bi-directional interactions between the brain (or if need be a reduced model of it) and sensory-motor system can shed a light on how encoding and decoding of information is performed. Here an experimental system is introduced and described in which the activity of a neuronal element (i.e., a network of neurons extracted from embryonic mammalian hippocampi) is given context and used to control the movement of an artificial agent, while environmental information is fed back to the culture as a sequence of electrical stimuli. This architecture allows a quick selection of diverse encoding, decoding, and learning algorithms to test different hypotheses on the computational properties of neuronal networks.

In this paper, an experimental framework to perform closed-loop experiments is presented, in which information processing (i.e., coding and decoding) and learning of neuronal assemblies are studied during the continuous interaction with a robotic body.

Closed-loop Neuro-Roboter-Experimente zur Computational Eigenschaften Neuronale Netze Testen

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, formed by ribosomes, mRNAs, several proteins and non-coding RNAs, represent integrated platforms where translational controls take place. However, while the ribosome has been widely studied, the organization of polysomes is still lacking comprehensive understanding. Thus much effort is required in order to elucidate polysome organization and any novel mechanism of translational control that may be embedded. Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that allows the acquisition of 3D images at nanoscale resolution. Compared to electron microscopy (EM) techniques, one of the main advantages of AFM is that it can acquire thousands of images both in air and in solution, enabling the sample to be maintained under near physiological conditions without any need for staining and fixing procedures. Here, a detailed protocol for the accurate purification of polysomes from mouse brain and their deposition on mica substrates is described. This protocol enables polysome imaging in air and liquid with AFM and their reconstruction as three-dimensional objects. Complementary to cryo-electron microscopy (cryo-EM), the proposed method can be conveniently used for systematically analyzing polysomes and studying their organization.

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

Peering am Gehirn Polysomen mit Rasterkraftmikroskopie

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, tri-carboxylic acid (TCA) cycle and oxidative phosphorylation (OXPHOS) pathways to produce cellular energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Impairment of mitochondrial ATP production causes mitochondrial disorders, which present clinically with prominent neurological and myopathic symptoms. Mitochondrial defects are also present in neurodevelopmental disorders (e.g. autism spectrum disorder) and neurodegenerative disorders (e.g. amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases). Thus, there is an increased interest in the field for performing 3D analysis of mitochondrial morphology, structure and distribution under both healthy and disease states. The brain mitochondrial morphology is extremely diverse, with some mitochondria especially those in the synaptic region being in the range of &#60;200 nm diameter, which is below the resolution limit of traditional light microscopy. Expressing a mitochondrially-targeted green fluorescent protein (GFP) in the brain significantly enhances the organellar detection by confocal microscopy. However, it does not overcome the constraints on the sensitivity of detection of relatively small sized mitochondria without oversaturating the images of large sized mitochondria. While serial transmission electron microscopy has been successfully used to characterize mitochondria at the neuronal synapse, this technique is extremely time-consuming especially when comparing multiple samples. The serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) technique involves an automated process of sectioning, imaging blocks of tissue and data acquisition. Here, we provide a protocol to perform SBFSEM of a defined region from rodent brain to rapidly reconstruct and visualize mitochondrial morphology. This technique could also be used to provide accurate information on mitochondrial number, volume, size and distribution in a defined brain region. Since the obtained image resolution is high (typically under 10 nm) any gross mitochondrial morphological defects may also be detected.

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

Analyse Mitochondrien von Hirnzellen Verwenden der seriellen Block Gesicht Rasterelektronenmikroskopie

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Herstellung von nichtmenschlichen Primaten Hirngewebe für die Pre-Einbettung Immunhistochemie und Elektronenmikroskopie

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...