We thank Dr. C. Geoffrey Burns for fish stock. The authors are grateful to UNC Flow Cytometry Core Facility, UNC-CGIBD AAC core for resources enabling this project, and the ZAC facility for animal care. L.S. is supported by NIH T32 grant HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. is supported by NSF Graduate Research Fellowship NSF-DGE-1144081. This study was supported by NIH P30DK034987 grant (to UNC Advanced Analytics Core), American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG17060010 and Ellison Medical Foundation New Scholar Grant AG-NS-1064-13 (to Dr. Qian), and NIH R00 HL109079 grant (to Dr. Liu).

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The authors have nothing to disclose.

本明細書に記載される方法は、単一の心臓遺伝子のサブセットの発現を評価するために、マイクロ流体アシスト単一細胞捕捉システムで使用するためのゼブラフィッシュ胚からの心臓前駆細胞の集団を濃縮するために細胞型特異的プロモーターの制御下で蛍光タンパク質の発現を使用して細胞。 FACSレーザ励起と発光の機能が選択されたフルオロフォア（複数可）と適合することを、この方法は、任意の蛍光レポーターラインのために使用することができます。多くのゼブラフィッシュのレポーターラインがすでに存在しており、新たなレポーターを保有するトランスジェニック魚はわずか3ヶ月で生成することができます。また、このワークフローは、単一細胞RNA配列決定のための全トランスクリプトームからcDNAを生成するように適合されてもよいです。これを行うには、ステップ5-7 RNA配列決定に適したライブラリーを作製するためのcDNAを調製するために最適化された化学反応で使用するためにわずかに修正する必要があります。しかし、人口の異質性を検証することをお勧めしますハイスループットシークエンシングアプリケーションを追求する前に、ここで説明した方法を使用して。 記載された方法にはいくつかの制限があることに留意することが重要です。まず、統合されたマイクロ流体回路（IFC）プレートの使用は、特殊な、高価な装置を必要とします。しかし、マイクロ流体チップは、単一細胞をアッセイするための伝統的な96ウェルおよび384ウェルプレートフォーマットを超える実質的な利点を提供します。マイクロメートルスケールのレーンを介して細胞および試薬を流すことにより、単一細胞は、それらが直接、彼らが健康で単一細胞であることを確認するために観察することができる単一の捕捉部位に配置されています。 RNA抽出およびcDNA合成は、各セルのための非常に少量を使用したIFCチップ上にその場で起こります。統合された流体チップは、この記事の執筆時点では、唯一のソースを介して市販されています。非商業的な製造は、いくつかのグループによって行われていたが、それはほとんどの研究室の容量の外にあります。 5-7できるステップ他の企業や社内の捏造によって生成プラットフォーム用に変更する必要があります。市販のIFCプレートは96遺伝子まで収容できるものの第二に、選択された遺伝子は、ゼブラフィッシュでの使用のために検証発蛍光標識遺伝子プローブの利用可能性によって制限されています。第三に、ゼブラフィッシュ細胞は、典型的には、哺乳動物細胞よりも小さく、この小さなサイズは、サンプル処理の課題を提示します。セル径の小さな変化は、利用可能な材料を低減し、低検出遺伝子を発現する可能性を減少させる、細胞体積の大きな変化に変換されます。 このプロトコルのためのいくつかの追加の考慮事項があります。ステップ1では、それは短い時間窓内受精のみ使用胚にとって重要です。一定の酸素条件を限定することなく、温度を維持し、ゼブラフィッシュ胚は同期開発します。このプロトコル（単一細胞からの相対的な遺伝子発現）の最終的な読み出しがheterogeのソースを判別することはできません個々のセル間のneity。このため、細胞間不均一性の解釈は慎重に段階的な胚および同期の開発に依存してい。ステップ2-3で、解離および生存率との間にトレードオフが存在します。ステップ4は、生細胞のために選択し、ステップ3は、多量体を除外するに役立ついくつかのフィルタリングステップが含まれていますが、過剰消化FACSで使用可能な実行可能な材料を削減し、潜在的にソートされた細胞収量が減少します。手順は、低い生存率は、消化時間を短縮する粉砕強度を低減し、出発物質中の胚の数を最​​適化することが挙げられるトラブルシューティングします。関心（ステップ4）の細胞集団のFACS濃縮は、間違いなく、このプロトコルの中で最も重要なステップです。厳格なソート基準は、目的の蛍光タンパク質を発現する唯一の生きた細胞を含む単一細胞調製物を生成するために必須です。他の集団から細胞を汚染することは細胞間の異質の誤った表現につながる可能性があります。注目すべきは、関心の人口のFACS濃縮は、このプロトコルに示した2色の戦略に限定されるものではありません。より複雑な戦略は、より洗練された細胞集団を生成し、原則として研究の証拠で報告された方法論を拡張するための迅速な方法であることができます。ステップ5において、細胞は、直接捕捉された細胞の数、細胞の健康、および蛍光タンパク質の発現を確認するために観察することができます。しかし、細胞の大きさや明るさに応じて、関心のフルオロフォアは、視覚的に検出できないと信頼性の高い読み出していない場合があります。ステップ6-8の正常終了は、製造業者のプロトコルに慎重に遵守する必要があります。 原理の証明としては、既知の心臓マーカーのサブセットの発現レベルは、以前に記載さBACトランスジェニックゼブラフィッシュラインnkx2.5に由 ​​来する単一に評価された：ZsYは 、個々のnkx2.5における心臓分化マーカーを調べた：ZsY陽性細胞18時間後に受精（HPF）。 heterogeneiを探求するために、捕獲さnkx2.5で表現分化マーカーのTY：、遺伝子のスイートはハウスキーピング遺伝子（EF1A、GAPDH）、早期の心臓仕様（GATA4、nkx2.5）でオンにすることが知られている転写因子を含むアッセイした ZsY 発現している細胞 、心臓分化（myl7、vmhc）中に、後にオンされることが知られている第二の心臓フィールド前駆マーカー（ISL1）、および遺伝子。各遺伝子の相対的存在量は、サイクル閾値（CT）を計算することにより定​​量RT-PCRにより測定しました。計算された最も低いCT値は17.9だった、最高には、増幅（表1）を表すない、40でした。 &gt; 35.0のCT値が検出について考察しました。 データセット内の46細胞のうち、6は何らかの遺伝子の障害が発生した増幅を除外しました。残りの細胞はGATA4、nkx2.5、myl7、およびvmhc、およびWERの発現に基づいて5種類に細胞をサブ分類しましたeはグループ内のEF1A値によってソート。 GAPDHは、もともと可能なハウスキーピング遺伝子として含まれていたが、表情はハウスキーピング遺伝子として、それが不適当、細胞全体で非常に変動した。GAPDH発現の可能性が高い、より良い、この細胞型で心臓分化に関連したエネルギー代謝の変化を表しています。興味深いことに、未検出可能であったが、他の遺伝子は、（セル26におけるGATA1）検出可能であったEF1Aで一つのセルがありました。これはEF1Aは一般的に成功と失敗単細胞逆転写反応を区別するための十分なハウスキーピング遺伝子であるが、それはすべてのアプリケーションに理想的ではないかもしれないことを示唆しています。セル26におけるEF1A発現の欠如は、単一細胞の転写ダイナミクスが原因である可能性があります。最近の単一細胞研究は、迅速かつごくわずかな転写活性26の位相との間に交互に、遺伝子転写は、基本的に確率論的であることを示しています。 T彼の転写破裂モデルは、単一の細胞間の定量的比較のためのハウスキーピング遺伝子の使用は全く不適切であることを示唆しています。 タイプ1のグループでは、EF1Aは、検出可能な唯一の遺伝子です。関心のある他の遺伝子の非常に低い発現とZsY陰性細胞または細胞：これらの細胞は、nkx2.5のいずれかを含むことができます。 2細胞を入力し、セル-26を除いて、これらの遺伝子の相対的発現レベルの相関がないとEF1AとGATA4の両方を表明しました。なお、タイプ1とタイプ2細胞におけるnkx2.5式が原因で、次善のFACSジェンシー、転写破裂、導入遺伝子の漏出、またはサブスレッショルド発現レベルである可能性があります。タイプ3細胞はEF1A、GATA4、及びNKX-2.5の検出可能なレベルで発現した。これらの細胞は、おそらく心臓前駆細胞であり、心房心筋細胞を分化含んでいてもよいです。タイプ4細胞はEF1A、GATA4、nkx2.5、myl7の検出可能なレベルで発現し&lt;/ em&gt;のとvmhcおよび心室心筋細胞に分化する可能性が高い細胞です。タイプ5細胞はEF1A、GATA4、nkx2.5、myl7、vmhc、およびGAPDHを表明しました 。 GAPDHの検出可能なレベルの添加は、これらの細胞が分化した心筋細胞において見出さ増強解糖代謝能力を有することを示唆しています。 、胚、40分の21細胞は私たちの定量RT-PCR解析でnkx2.5のサブスレッショルドレベルを有していた。これは、転写破裂が原因である可能性があります：それはTgは（ZsYellow nkx2.5）からZsYellow陽性細胞のソートにもかかわらず、ことは興味深いでした。または内因性nkx2.5とZsYellow間の転写物処理の違いを反映している可能性が。重要なのは、第二の心臓フィールドマーカーISL1は、当社の捕捉部位の全てからプールの任意の細胞またはcDNAで検出されませんでした。要するに、サンプル全体で比較すると、かなりの異質性が示唆され、単一細胞レベルで明らかになったその18 HPFで、nkx2.5：ZsY + CELlsコマンドは、分化の異なる段階で心臓前駆体だけでなく、子孫を含みます。

細胞及び分子生物学の最新の研究は、母集団平均に基づいています。マイナー集団は生物学的プロセスおよび疾患の結果で主要な役割を再生することができますので、重要な生物学的事象は、これらの伝統的な集団ベースの分析によってマスクすることができます。関連する生物学的および臨床的洞察1,2につながる（たと）単一細胞レベルでの不均一な集団における遺伝子発現をすることができます理解します。胚発生の研究に懸念されるのは、細胞の大きな集団において、前駆細胞は、それが困難な、最終的に細胞の運命の決定3を開始し 、遺伝子発現の微妙な変化を検出すること、しばしば過小評価されています。同様に、単一の細胞型は、微小環境4に対応して異なる発現プロファイルを有することができます。たとえば、同じ器官または異なる器官内に常駐内皮細胞（ 例えば 、大動脈または腎臓）は、共通のmorpを共有するにもかかわらず、有意な異質性を示しますhologicalおよび機能的特徴5。また、同じ腫瘍を移植癌細胞は、単一細胞レベルでの6分子プロフィールまたは突然変異を変化させることができます。 モデル系では、単一細胞におけるトランスクリプトが正常に、新しい細胞集団を同定し、細胞分化の間に生じる中間状態を特徴づけ、そして7,8,9を刺激するために、差動細胞応答を明らかにしました。このような洞察は、従来の集団ベースの研究でマスクされていたであろう。ゼブラフィッシュの胚は、単一の細胞の不均一や開発中の細胞のアイデンティティの分子調節の質問を探索するための幹細胞、前駆細胞、および分化する細胞の途方もなく過小利用源です。彼らの非常にステレオタイプ、ex vivoでの開発や遺伝子操作の容易さは、それらのこのアプローチ10,11のための優れたモデル系にします。具体的には、単一のセル世代の解釈に大きな制限Eの発現データは、開発中の新規な中間体セル状態の信頼性の識別は、組織収集9の非常に慎重にタイミングを必要とすることです。これは、捕捉された細胞との間の不均一性は、年齢依存性細胞分化によって提示される遺伝子発現における単一の時点で組織内の不均一ではなく、不均一性を表していることを保証する必要があります。マウスと比較して、ゼブラフィッシュ胚発生を正確に胚12の多数にわたって同期させることができます。さらに、大規模なクラッチサイズで、ゼブラフィッシュの胚は、幹細胞および前駆細胞の豊富な供給源として使用することができます。 このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚からの細胞を単離し、市販の集積マイクロ流体回路のqRT-PCR遺伝子発現解析のために（IFC）チップとオートプレップシステムを用いて単一細胞を捕捉する方法を記載します。このプロトコルは、全体を含む任意の高スループット多重アッセイに急速に譲渡することができます細胞異質13のより包括的な分析を可能にするトランスクリプトーム配列決定。また、伝統的な遺伝子発現アッセイにいくつかの利点を提供しています。単一細胞単離プロトコールは、下流アプリケーションに含まれている妥協細胞の割合を減少さFACS、後に高い生存率をもたらします。 IFCを使用することにより、捕捉された細胞を直接捕捉率を評価し、形態学的細胞の健康を評価するために観察することができます。また、このプロトコルは、マイクロ流体細胞捕捉技術にのみラベルされたトランスジェニック魚のラインとのアクセスを必要とする、ゼブラフィッシュ研究コミュニティに広く適用可能です。 原理の証明として、心臓前駆細胞に由来する単一の細胞を単離し、IFCチップ上に捕捉し、次いで心臓分化マーカーの相対的存在量は、定量RT-PCRにより測定しました。単一細胞レベルでの遺伝子発現解析は、心臓前駆体が自分のdiffereと共存することを実証しますntiating子孫。心臓前駆体の単一細胞プロファイリングから得られた知見は、伝統的な集団ベースの解析でマスクされている可能性があり、脊椎動物の発生時に心臓前駆細胞間の遺伝子発現パターンの不均一性、に光を当てることがあります。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>For removing the chorion from embryos</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube 2 ml</td><td>GeneMate</td><td>C-3261-1</td><td></td></tr><tr><td>40 um cell strainer</td><td>Biobasic</td><td>SP104151</td><td></td></tr><tr><td>35 mm culture dish</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes topped with 35 um cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>P1000 and tips</td><td>Rainin</td><td>17005089</td><td></td></tr><tr><td>P20 and tips</td><td>Rainin</td><td>17005091</td><td></td></tr><tr><td>IFC chip manufacturer&#039;s protocol</td><td>Fluidigm</td><td>100-6117</td><td>Version 100-6117 E1 was used in representative experiment</td></tr><tr><td>Wide bore pastuer glass pippette</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>For transferring embryos</td></tr><tr><td>Adult wild type zebrafish</td><td>N/A</td><td></td><td>We used AB line</td></tr><tr><td>Adult transgenic zebrafish</td><td>N/A</td><td></td><td>We used Tg(nkx2.5:ZsYellow)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents for cell dissociation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Double distilled water</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>FisherScientific</td><td>S271-3</td><td>make stock in water and use for de-yolking buffer</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td>make stock in water and use for de-yolking buffer</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td>make stock in water and use for de-yolking buffer</td></tr><tr><td>Leibovitz&#039;s L-15</td><td>Gibco</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>FisherScientific</td><td>03-600-511</td><td>Heat inactivate; any brand of FBS should be fine</td></tr><tr><td>Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Cell Dissociation Reagent 2 - FACSmax</td><td>Genlantis</td><td>T200100</td><td>Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use</td></tr><tr><td>pronase (optional)</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>L/D Dye - Sytox Blue</td><td>Life Technologies</td><td>S34857</td><td>Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents for IFC plate use and qRT-PCR&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene-specific probes</td><td></td><td></td><td>Probes will vary by experiment</td></tr><tr><td>TaqMan Probe ef1a</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03432748_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe gata4</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03443262_g1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe nk2-5</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03074126_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe myl7</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03105700_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe vmhc</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03431136_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe isl1</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03425734_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>Reagents listed in IFC manufacturer&#039;s protocol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 Reagent Kit</td><td>Fluidigm</td><td>100-5319</td><td>Reagents for loading cells onto IFC plate</td></tr><tr><td>Ambion Single Cell-to-CT&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td><td>Life Technologies</td><td>4458237</td><td>Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps</td></tr><tr><td>Molecular Biology Quality Water</td><td>Corning</td><td>46-000CM</td><td></td></tr><tr><td>C1 IFC for PreAmp (5-10 um)</td><td>Fluidigm</td><td>100-5757</td><td>IFC plate for small cells</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 AutoPrep machine</td><td>Fluidigm</td><td>100-5477</td><td>For IFC plate use</td></tr><tr><td>Hemocytometer&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359629</td><td>For counting cells and assessing cell size</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td></td><td></td><td>For removing embryos from chorion</td></tr><tr><td>Tissue culture microscope</td><td></td><td></td><td>For assessing single cell digestion</td></tr><tr><td>FACS machine</td><td></td><td></td><td>For isolating cells of interest</td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of single cells from zebrafish embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

原理の証明として、遺伝子発現は、心臓の開発中分化の動態を調査するために評価しました。ゼブラフィッシュでは、心臓前駆体は、彼らが線形心管を形成するために融合し、前方側板中胚葉に移動する細胞の中胚葉集団から生じます。融合の前に、心臓前駆体は、心臓前駆体16,17の最も初期の特異的なマーカーであると考えられる転写因子nkx2.5（NK2ホメオボックス5）、発現し始めます。ここでは、先に述べたBACトランスジェニック魚のTg（nkx2.5：ZsYellow）18、nkx2.5 を略記：ZsYは 18体節期、18時間後に受精（HPF）12で単一細胞における心臓分化マーカーを調べました。これはZsYellow信号が視覚的に検出した最も早い時点でした。以前にこのトランスジェニック系統のために説明したように、ZsYellowは、私たちのように、心臓前駆体を標識28 HPF 19における咽頭弓の内皮細胞を生じ得、いくつかの余分な心臓細胞のようなLL（ 図1A-Bを 、データは示していません）。 18 HPFでは、nkx2.5：ZsY胚その後、死細胞を排除するためのSytoxブルーで染色した単一細胞懸濁液に解離しました。正、のSytoxブルー陰性細胞は、FACSが100μmのノズル（ 図1C-F）を装備したMoFloXDPまたはソニーSH800Zソーターのいずれかを使用して選別したZsYellow、住んでいます。ソートされた集団とポストソート生存率の純度を評価するために、選別した細胞のアリコートのSytoxブルーで染色し、元の選別ゲート（ 図1G-J）内に入る事象の割合を評価しました。 選別後、細胞を、製造者の指示に従って、集積マイクロ流体回路（IFC）チップワークフロー（ 図2A）に入力しました。トリパンブルーexclusioと組み合わせる血球計数器、nが（ 図2B、データは示していない）セル径、濃度、及び生存率を測定しました。製造者の指示に従って、細胞は5-10ミクロンの直径の細胞を捕捉するためにIFCにロードした（緩衝液：3.5細胞6.5）細胞浮力を最適化しました。捕捉効率、蛍光および/またはすべてのキャプチャサイトで撮像した明視野信号を評価するために、フィジーでのタイリング機能は、マイクロフルイディクスプレートの単一画像をステッチするために使用されました。各捕捉部位は0、1、又は&gt; 1、個々の細胞（ 図2C-F）を含有しました 。 FACS濃縮から予想されるように、捕獲された細胞はZsYellow（ 図2G）を表明しました。捕捉効率は、nkx2.5を用いて、5個体の実験において、90％を超えて：ZsY細胞をソートし、捕捉部位の少なくとも70％が単一のセルによって占有された（データは示さず）。細胞を溶解し、RNA単離され、cDNAを合成し、特定の標的遺伝子は、すべての製造業者の指示に従って、増幅しました。 上記のプロトコールに記載のように細胞捕捉部位のサブセットは、定量RT-PCR分析のために選択しました。具体的には、伸長因子1A（efl1a）は 20とグリセルアルデヒド-3-リン酸（GAPDH）21は、全ての細胞において発現されることが予想されるハウスキーピング遺伝子としてアッセイしました。 GATA結合タンパク質4（GATA4）22及びNK2ホメオボックス5（nkx2.5）早けれ心臓前駆マーカー;第二の心臓フィールドマーカー23,24としてISL LIMホメオボックス1ボックス1（ISL1）。そして、ミオシン軽鎖（myl7）と心室ミオシン重鎖（vmhc）25は、心室心筋細胞をマークします。遺伝子特異的プローブは、48 HPFの胚（ 図3）からのcDNAを用いて検証しました。定量RT-PCRは、18 HPF胚、無テンプレート陰性対照からの45の単一細胞におけるこれらの遺伝子の相対的な遺伝子発現を評価するために使用され、プールされた集団の陽性対照containiました全96捕捉部位からcDNAをngの。 40代表的な細胞およびコントロールの生のCT値は、すべての遺伝子発現CT値をCT = 35.0を超えたために調べ46細胞のプールから、6個の細胞を分析から除外した、特に表1に示され、それは未知であるこれらの高CTか値がtrueの場合、非常に低い発現レベルまたはサンプルの分解に起因するものです。ハウスキーピング遺伝子、EF1AためのCT値の範囲ので、試料間の遺伝子発現を比較することが広すぎであり、多くのCT値が30を超えて、CT値は、ヒートマップ（ 図3）のように可視化しました。サンプルにわたって比較し、遺伝子発現の実質的な不均一性が観察され、細胞は、発現パターンに基づいて、タイプ1-5（ 図3）のような細胞を分類しました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53877/53877fig1.jpg" /> ゼブラフィッシュの1.単一細胞の単離を図 <strong&gt; nkx2.5：18 HPFで ZsY 陽性細胞全体が代表のTg（nkx2.5：ZsYellow）の画像をマウントします。（A）ZsYellow単独の蛍光または（B）で18 HPFで胚は、明視野像と合併しました。 （CF）代表FACSゲーティング戦略はZsYellow陽性細胞とを富化する（GJ）（C、G）FSC / SSCサイズ・ゲーティング、（D、H）ダブレット差別、（E、I）ライブ/デッド・ゲーティングとポストソート解析、及び（F、J）は、人口ソート。スケールバーは100μmである。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53877/53877fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53877/53877fig2.jpg" /> 図2ゼブラフィッシュ nkx2.5 の単一細胞捕捉 ：ZsY <str<html>オング&gt;陽性細胞。（A）作業の流れ。 （B） のTg（nkx2.5：ZsYellow）からソートされた細胞の細胞サイズ分布18 HPFで分離胚。 （CF）、（C）は空のウェルであるIFCプレート上の代表的な細胞捕捉イベント、（D）は、2つのセルを含む、（E）は、「チャネル捕捉」として流体チャネルに留まる1つのセルを有し、及び（F）であります単一捕捉された細胞。パープルボックスは、捕捉部位の拡大図のためのインセットマーク。明視野、ZsYellowとマージされた画像と（G）単一細胞の捕捉。 （CF）ホワイトスケールバーは50μmです。黄色のスケールバーは10μmです。 （G）スケールバーは10μmである。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53877/53877fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> igure 3 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 53877 / 53877fig3.jpg &quot;/&gt; 図キャプチャ単一ゼブラフィッシュ nkx2.5 の3遺伝子発現解析 ：ZsY 陽性細胞の遺伝子陽性対照における定量RT-PCRによる発現（2日-受精後に胚、単一細胞からのcDNAをプールされた）、ネガティブコントロール（無テンプレート。 ）と40単セル（セル01から40）。キーに記載されているように、生のCT値を色分け基づいていた。EF1A = 伸長因子1aと 、GATA4 = GATA結合タンパク質4、nkx2.5 = NK2ホメオボックス5、myl7 = ミオシン軽鎖7、vmhc = 心室ミオシン重鎖 、GAPDH = グリセルアルデヒド-3-リン酸 、およびISL1 = ISL LIMホメオボックス1。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53877/53877fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-ページ= &quot;1&quot;のfo：キープで-next.within-ページ= &quot;常に&quot;&gt; <tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="7"> サイクル閾値（CT） </td></tr><tr><td></td><td></td><td> EF1A </td><td> GATA4 </td><td> nkx25 </td><td> myl7 </td><td> vmhc </td><td> GAPDH </td><td> ISL1 </td></tr><tr><td></td><td>胚</td><td> 20.69 </td><td> 20.92 </td><td> 28.59 </td><td> 32.87 </td><td> 26.30 </td><td> 27.00 </td><td> 33.57 </td></tr><tr><td></td><td>プール</td><td> 26.4 </td><td> 22.4 </td><td> 27.7 </td><td> 27.4 </td><td> 24.5 </td><td> 29.2 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td></td><td> NTC </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td rowspan="9">タイプ1 </td><td>セル-01 </td><td> 25.1 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-02 </td><td> 25.4 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-03 </td><td> 26.3 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-04 </td><td> 27.4 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-05 </td><td> 28.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-06 </td><td> 28.2 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-07 </td><td> 29.3 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 400.0 </td></tr><tr><td>セル-08 </td><td> 30.7 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-09 </td><td> 34.3 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td rowspan="17">タイプ2 </td><td>セル-10 </td><td> 23.5 </td><td> 28.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 26.3 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-11 </td><td> 23.5 </td><td> 27.2 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-12 </td><td> 23.7 </td><td> 17.9 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-13 </td><td> 24.1 </td><td> 32.4 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-14 </td><td> 24.9 </td><td> 27.5 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-15 </td><td> 25.9 </td><td> 28.6 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-16 </td><td> 26.0 </td><td> 28.1 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-17 </td><td> 27.0 </td><td> 27.7 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 38.5 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-18 </td><td> 27.0 </td><td> 27.4 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-19 </td><td> 27.0 </td><td> 30.2 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 38.2 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-20 </td><td> 27.0 </td><td> 28.2 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 400.0 </td><td> 39.2 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-21 </td><td> 27.7 </td><td> 30.3 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 38.6 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-22 </td><td> 30.4 </td><td> 26.2 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 38.3 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-23 </td><td> 31.3 </td><td> 22.4 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 39.7 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-24 </td><td> 31.5 </td><td> 28.8 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 39.5 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-25 </td><td> 33.8 </td><td> 27.4 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 37.3 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-26 </td><td> 40.0 </td><td> 27.4 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 36.6 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td rowspan="9">タイプ3 </td><td>セル-27 </td><td> 24.7 </td><td> 19.9 </td><td> 28.8 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-28 </td><td> 24.8 </td><td> 28.4 </td><td> 26.3 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-29 </td><td> 25.1 </td><td> 23.5 </td><td> 27.6 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 32.5 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-30 </td><td> 26.3 </td><td> 21.4 </td><td> 27.5 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 39.9 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-31 </td><td> 26.9 </td><td> 24.8 </td><td> 28.2 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-32 </td><td> 27.0 </td><td> 22.5 </td><td> 23.8 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-33 </td><td> 27.8 </td><td> 27.6 </td><td> 27。7 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-34 </td><td> 28.1 </td><td> 21.9 </td><td> 26.6 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 37.7 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-35 </td><td> 29.3 </td><td> 26.5 </td><td> 28.1 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 38.3 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td rowspan="2">タイプ4 </td><td>セル-36 </td><td> 24.8 </td><td> 20.3 </td><td> 26.0 </td><td> 27.4 </td><td> 26.6 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-37 </td><td> 28.7 </td><td> 22.3 </td><td> 25.9 </td><td> 28.9 </td><td> 22.9 </td><td> 38.5 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td rowspan="3">タイプ5 </td><td>セル-38 </td><td> 25.5 </td><td> 20.0 </td><td> 29.3 </td><td> 23.0 </td><td> 19.9 </td><td> 25.9 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-39 </td><td> 25.9 </td><td> 21.8 </td><td> 28.6 </td><td>25.1 </td><td> 21.7 </td><td> 25.7 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td>セル-40 </td><td> 28.9 </td><td> 22.0 </td><td> 27.0 </td><td> 23.0 </td><td> 21.3 </td><td> 27.6 </td><td> 40.0 </td></tr></tbody></table> 表1. 生のCT値。

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Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

isolation-and-characterization-of-single-cells-from-zebrafish-embryos

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.4K ビュー.  University of North Carolina at Chapel Hill. This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells. 

ビデオ: Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

ゼブラフィッシュ後脳における標識およびイメージング細胞

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

神経科学

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

サンプル準備およびゼブラフィッシュから RNASeq による遺伝子発現データの解析

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

遺伝学

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

In Vivoモデル システムとしてゼブラフィッシュを用いた DNA 複製タイミングのプロファイリング

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

生物学

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

文化、ゼブラフィッシュ初代培養細胞のトランスフェクション

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

発生生物学

Preparation of Single-Somite Explants from Zebrafish Embryos

The body axis of vertebrate embryos is periodically subdivided into 3D multicellular units called somites. While genetic oscillations and molecular prepatterns determine the initial length-scale of somites, mechanical processes have been implicated in setting their final size and shape. To better understand the intrinsic material properties of somites, a method is developed to culture single-somite explant from zebrafish embryos. Single somites are isolated by first removing the skin of embryos, followed by yolk removal and sequential excision of neighboring tissues. Using transgenic embryos, the distribution of various sub-cellular structures can be observed by fluorescent time-lapse microscopy. Dynamics of explanted somites can be followed for several hours, thus providing an experimental framework for studying tissue-scale shape changes at single-cell resolution. This approach enables direct mechanical manipulation of somites, allowing for dissection of the material properties of the tissue. Finally, the technique outlined here can be readily extended for explanting other tissues such as the notochord, neural plate, and lateral plate mesoderm.

We present a protocol for isolating single somites from zebrafish embryos, the dynamics of which can be followed in culture for several hours by fluorescence time-lapse microscopy, thus providing a methodology to quantify tissue-scale shape changes at single-cell resolution.

The body axis of vertebrate embryos is periodically subdivided into 3D multicellular units called somites. While genetic oscillations and molecular ...

ゼブラフィッシュ幼生の腸細胞をプロセッシングし、シングルセル RNA シーケンシングを行う(英語)

Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric neuromuscular disorders, highlighting the importance to understand the molecular mechanisms underlying GI development and dysfunction. In this study, we present a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization to obtain live,&#160;viable cells which can be used for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis. This protocol is based on the manual dissection of the zebrafish intestine, followed by enzymatic dissociation with papain. Subsequently, cells are submitted to fluorescence-activated cell sorting, and viable cells are collected for scRNA-seq. With this method, we were able to successfully identify different intestinal cell types, including epithelial, stromal, blood, muscle, and immune cells, as well as enteric neurons and glia. Therefore, we consider it to be a valuable resource for studying the composition of the GI tract in health and disease, using the zebrafish.

著者スポットライト:ゼブラフィッシュ幼生の腸内細胞の単離と分析による胃腸発生のトランスクリプトーム的側面の調査 

Here, we describe a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization, for single-cell RNA sequencing analysis.

シングルセルRNAシーケンシングのためのゼブラフィッシュ幼生からの腸管分離

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

高解像度全マウント<em&gt;その場で</em遺伝子発現と機能を研究するためにゼブラフィッシュ胚内&gt;ハイブリダイゼーション

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション

要約

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ゼブラフィッシュ後脳における標識およびイメージング細胞

サンプル準備およびゼブラフィッシュから RNASeq による遺伝子発現データの解析

In Vivoモデルシステムとしてゼブラフィッシュを用いた DNA 複製タイミングのプロファイリング

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

文化、ゼブラフィッシュ初代培養細胞のトランスフェクション

Preparation of Single-Somite Explants from Zebrafish Embryos

シングルセルRNAシーケンシングのためのゼブラフィッシュ幼生からの腸管分離

シングルセルRNAシーケンシングのためのゼブラフィッシュ幼生からの腸管分離

シングルセルRNAシーケンシングのためのゼブラフィッシュ幼生からの腸管分離

高解像度全マウント

ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション

要約

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ゼブラフィッシュ後脳における標識およびイメージング細胞

サンプル準備およびゼブラフィッシュから RNASeq による遺伝子発現データの解析

In Vivoモデル システムとしてゼブラフィッシュを用いた DNA 複製タイミングのプロファイリング

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

文化、ゼブラフィッシュ初代培養細胞のトランスフェクション

Preparation of Single-Somite Explants from Zebrafish Embryos

シングルセルRNAシーケンシングのためのゼブラフィッシュ幼生からの腸管分離

シングルセルRNAシーケンシングのためのゼブラフィッシュ幼生からの腸管分離

シングルセルRNAシーケンシングのためのゼブラフィッシュ幼生からの腸管分離

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In Vivoモデルシステムとしてゼブラフィッシュを用いた DNA 複製タイミングのプロファイリング