German Legal Casualty Insurance (DGUV), Research Commission of the Medical Faculty of the Heinrich-Heine-University

動物の安全性と快適性のための制度ガイドラインはに付着し、すべての外科的介入と前と手術後の動物のケアは、ドイツ動物保護法の遵守（ステートオフィス、環境・北Rhine-ヴェストファーレン州の消費者保護、LANUV NRWで提供されていました）。 （ - 250グラム220）女性のウィスターラットの胸部脊髄の1.完全離断<ol><li> 脊髄の調製 <ol><li>カルプロフェンのボーラス注射（皮下[SC] 5ミリグラム/キログラム）： - （2 1の比率でO 2 / NO 2でイソフルラン3％2）イソフルラン吸入麻酔を使用してください。カルプロフェンおよびオピオイドブプレノルフィン（0.02ミリグラム/ kg皮下）の組み合わせが推奨されます。綿棒と足引っ込め反射と軽いタッチの時眼瞼反射鉗子で刺激をつまんに手術を開始しますが、もはや観察されません。 </li><li>本体temperatuを維持するために37℃に加熱ブランケット上に動物を置きます手術中の再麻酔下ながら乾燥を避けるために、目に眼軟膏を置きます。 </li><li>動物の背中を剃ると皮膚の消毒剤で皮膚を準備します。 </li><li>手術用ブレード4 CMの胸椎に沿って正中線の皮膚を切り取って、それを開きます。上のこの段階から、すべての手順（オートクレーブ処理または浸漬滅菌）滅菌手術器具を使用しています。 </li><li>小さな筋肉のクランプを使用して胸椎上記の筋肉を撤回。 </li><li>椎骨が平らになるまで慎重に骨の小片をクリッピングすることにより、骨鉗子で胸部レベル8（TH8）で棘突起を外し、TH9。 </li><li>棘突起TH7で脊柱を持ち上げ、椎弓切除術がTH8とTH9で実行されるまで、吻側に尾側から椎骨の小片をクリップする骨鉗子を使用するために、解剖学的鉗子を使用してください。慎重に一度椎骨の数だけ、非常に小さな部分を除去することによって、それを損傷することなく硬膜を公開します。</li><li>棘突起TH7とTH10で2安定化クランプによってバックボーンをクランプ、椎骨から呼吸の動きを切り離すために動物を持ち上げます。 </li></ol></li><li> 胸部レベル8/9で脊髄離断を完了 <ol><li>細かい鉗子で硬膜を持ち上げ、横方向に微細な目のハサミで硬膜をカット。 </li><li>細かい鉗子で硬膜の横方向の切断端を持ち、硬膜とくも膜の間subarachnoidic空間に脊椎フックを挿入します。鉗子または脊髄フックのいずれかと軟膜または硬膜にチクチクしないことにより、髄膜の損傷を避けます。 </li><li>ゆっくりと（PIAが無傷のままである）硬膜に刺すないように注意しながら、脊髄組織に沿ってすべてを配置するフックを回転させます。 </li><li>ギャップが脊髄組織と硬膜の間の腹側で見られるまで、上向きに2ミリメートル - 約1用の脊髄を持ち上げます。 </li><li>スペースbetweeに細かい目のはさみを挿入nは硬膜と軟膜と脊椎フックが所定の位置に残されている間、脊髄を切りました。 </li><li> 2鉗子で脊髄の2切り株を持ち上げて、視覚的に完全な離断を確保。 </li><li>慢性傷害と対照-病変動物と動物のために、モノフィラメント非吸着性9.0スレッドと結節縫合によって硬膜を閉じます。 </li><li>慢性病変のために一部1.6に従ってください。 </li></ol></li><li> MMSの移植 <ol><li>椎骨の各横側にある2つのチューブとの損傷部位の上にMMSを置き、病変空洞内にそれを下げます。 </li><li> MMSの安定化を確保するための非吸収性4-0糸で椎骨の側の筋肉に縫合チューブ。このステップの間に鉗子を使用してMMSの固定を確認してください。 </li><li>細かいハサミで切断することにより、MMSのコネクタピンを外します。 </li><li> MMSの上に硬膜を閉じて、9.0のスレッドでそれを縫合。 </li><li>真空ポンプに1チューブを取り付け、シールクランプして他。 </li><li> MMSの内腔への脊髄の切り株を吸って、オープン管を介して真空ポンプでMMSに優しい負圧を適用します。 （10分間、最大で）数分間の負圧を適用し、センサによって監視（250から350ミリバール）。 </li><li> MMSに近いチューブをカットし、チューブを外します。ステップ1.6に進みます。 </li></ol></li><li> 最初の損傷後の5週目での慢性病斑傷跡を含む脊髄組織の切除 <ol><li> 1.1.5 - 手順を1.1.1に従ってください。 </li><li>脊髄の上に黄褐色の外観と硬い組織によって瘢痕組織を識別します。優しく細かい鉗子で保持し、細かいハサミで切断することにより、瘢痕組織の表面層を除去します。この方法では、脊髄損傷の領域を含む組織を露出させる椎弓切除部位を再度開きます。硬膜縫合糸が視覚的に識別されたときの準備を停止します。 </li><li>スピンで2安定化クランプによってバックボーンをクランプその後のOUプロセスTH7とTH10、および椎骨から呼吸の動きを切り離すために動物を高めます。 </li><li>小さな板紙定規で切除される脊髄領域（長さ：4ミリメートル）を測定し、組織のその後の除去を可能にするために横切開でこれそれぞれの組織領域のエッジをマーク。 </li><li>切断および吸引の組み合わせを介して、瘢痕組織を削除します。横切開で脊髄から分離された組織を取り出します。組織の除去を可能にするのに十分であるときはいつでも穏やかな吸引を使用してください。また、瘢痕組織のたびに硬い質感は、この組織を切断し、除去するために、細かいハサミを使用して、組織の吸引があまりにも困難になります。 </li><li>補助金を出血するまで、組織ギャップに止血ゼラチンスポンジの片（約5ミリメートル×5ミリメートル×5ミリメートルの立方体）を挿入します。ゼラチンスポンジはすぐにそれが液体で浸漬されるようにサイズに縮小します。 </li></ol></li><li> ImplaPEG 600のntation <ol><li> 37℃に加熱することによって、注射のために、純粋な未希釈のPEG 600の1ミリリットルを準備します。 </li><li>ゼラチンスポンジを取り外します。 </li><li> 10μlの注射器または10μlのピペットを用いて、ギャップにPEGの - （7μlの約5）十分な量を挿入します。 </li><li>慎重にシール剤/硬膜置換の片（約5ミリメートル×4ミリメートル）との領域をカバー。 </li><li>組織接着剤数滴の筋肉組織を周囲にシーラントを修正しました。 PEG-満たされた切除ギャップの上にシーラントを置きます。シーラントの滑りを防止するために、周囲の筋肉組織にシーラントの角を修正するために組織接着剤の小滴を使用します。注意：脊髄組織に組織接着剤の漏れを避けます！ </li></ol></li><li> 組織および術後ケアの閉会 <ol><li>編組吸着4-0スレッドと結節縫合を有する層のための縫合糸の筋肉と皮膚層</li><li>塩化ナトリウムの2×2.5ミリリットルを注入（塩化ナトリウム[0.9％]）手術後の再水和のために36℃のSCで。 5ミリリットルの塩化ナトリウムの単回注射は、動物の皮膚を伸ばすだろうし、動物に不必要な害をもたらす可能性があります。完全な意識が回復されるまで無人動物を放置しないでください。 </li><li>手術後少なくとも2日間、毎日カルプロフェン（皮下5ミリグラム/キログラム）を注入します。 3 - その後2のグループの最初の2日間シングルケージ内のハウス動物、。 </li><li>最初の手術後の週のための抗生物質治療（エンロフロキサシンの毎日の経口投与）を適用します。 </li><li>優しく吻側から尾側への動物の腹の上になでることにより、1日に2〜3回に排尿マニュアル膀胱を実行してください。動物の脊柱を移動しないと尾で動物を持ち上げていないように注意してください。手動で全生存期間の間、毎日完全spinalized動物の膀胱を無効にします。ケアをすることなく、動物によって達することができる高さに食物ペレットと水のボトルを置くように注意しなければなりません彼らの後足の上に立って。後肢四半期の機能が損なわれているが、動物は手術直後に積極的にケージを移動して探ります。社交的なグループでラットを維持することが推奨されています。 </li><li>慢性病変のために瘢痕切除術の前に5週間の動物の生存時間を残します。フォローは1.4を繰り返します。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

ここでは、2つの異なる外科的アプローチは、（1）急性完全離断およびMMS注入、（2）慢性脊髄損傷及び線維性瘢痕の除去に加えてPEGマトリックス注入後の脊髄の組織ギャップを埋めるために提示されます。どちらの戦略は組織保存および軸索再生に同様に処理された動物の重要な運動機能改善につながります。 MMSは、手術後の会社硬膜縫合により脊髄内のMMSの適切な固定を移植するための重要な技術的なステップです。 MMSは原因などを介して病変コアに治療的に活性な液体の局所注入を可能にし、その実装内部のマイクロチャネルシステムにさらなる治療可能性を秘めています。、添付の浸透圧ミニポンプ7。その意図された将来の臨床使用のために、MMS材料は、生体吸収性であるべきです。現在、ラクチドベースの材料からなるコネクタシステムの製造でありますテストされています。さらに、電子伝導体材料とMMSのコーティングは、損傷脊髄への治療電界を印加するために確立されます。 慢性脊髄損傷については、別の戦略は、数ミリの隙間が交差しなければならない場合、外科的瘢痕除去が高すぎる登場後に分離脊髄切り株の物理的な緊張以来、続いていました。驚くべきことに、低分子量のPEG 600は、得られたギャップを埋めるために非常に適したバイオポリマーであることが証明されました。これは、血管新生および有益な細胞型の細胞浸潤を促進する安定した組織ブリッジを形成することができます。より高いまたはより低い分子量及び/又は粘度を有する他のPEG-タイプのように有益ではなかったので、PEG600の物理的特性は、その粘性のような、観察有効性について重要な役割を果たしていると推定されます。 小説コネクタに急性切断後に小さいギャップを埋めます損傷後4週間早ければ明確な機能的改善にシステムリード。それぞれの動物は、その時点までに約7のBBBスコアに達し、MMS-動物とコントロールラットとの間に明確な違いが明らかでした。瘢痕切除およびPEG-移植を受けた慢性的に負傷した動物はまた、未処理対照よりも有意に良好で回復したが、改善は主に、後の時点（後に約16週間）で顕著でした。このような観察 ​​は、（慢性対急性、 すなわち 。、および1ミリメートル対4ミリメートルの組織欠損）傷害の性質によって説明することができました。より大きな病変の場合、病変部位を横切る軸索の回生成長は、より長い期間を必要とします。また、後肢の不使用の長い期間が目立た機能の改善に、したがって変性イベントと、より高い程度に生じる可能性が高いです。 慢性SPI後PEG処理の今後の最適化コンビナトリアルアプローチを経由して最終的脊髄損傷、in vivoでの 10は 、現在試験されている臍帯血細胞などの増殖促進（幹）細胞を用いたPEGの例えば 、追加の播種。

脊髄への外傷だけでなく、任意の回生応答を妨げる組織欠損における軸索が、それはさらに、結果の損失につながる（レビューのために1,2を参照してください）。脊髄組織は、多くの場合、病変領域とその周辺の嚢胞形成または穴に通じる二次変性によって失われます。ほとんどの実験的な治療的介入は、健康な組織の残りのリムとの部分的な離断、クラッシュまたは挫傷の傷害のような不完全な脊髄損傷に焦点を当てます。腫瘍切除などの外傷事故や外科的介入に起因する総離断、のような完全な傷害については、ごく限られた治療の選択肢は、今日3,4用意されています。完全に切断した後、脊髄断端後退における組織結果のメカニック張力は、脊髄の小さなギャップを残します。ほとんどの戦略は、組織、細胞または行列5,6と、このギャップを埋めるに焦点を当てます。 ここでは、異なる戦略新規マイクロコネクタ装置7を用いて分離切り株のすなわち再適応を提示されています。 2切り株を再適応させるために、機械的な力は、これを達成するためにわずかな負圧（ 図1）のように適用されなければなりません。機械的なマイクロコネクタ・システム（MMS）は、出口配管系を備えたハニカム形状の穴（ 図1A）とを有するポリメチルメタクリレート（PMMA）のマルチチャネルシステムです。これは、ラット（ 図1C）で完全な脊髄切断から生じる組織ギャップに注入されます。一つのチューブは、MMS（ 図1D）に負圧を適用する真空ポンプに接続することができます。圧力は、圧力が（ 図1B）がリリースされたときに所定の位置に組織を保持するために微細構造壁を持っているMMSのハニカム状の穴、中に切断された脊髄の切り株を引っ張ります。チューブは、手術後に無傷のまま、順番に浸透圧ミニポンプに付着させることができます病変のコア（ 図1E-F）に物質を注入します。 脊髄の急性横断脊髄腫瘍の外科的除去、またはこれまでにMMSによって克服することができない数ミリの大きな組織のギャップにつながる固体慢性病変の傷跡からの完全な病変の結果、別のタイプのほかに。脊髄損傷を有する患者の大多数は、慢性外傷に苦しみます。これらの患者では、十分に発達した傷跡は、病変のコアを占めています。病変の瘢痕の外科的除去は、現在実験SCI 8,9の後に検討されている治 ​​療のための概念です。切除手順自体はかなりの付加的な損傷を与えることなく行うことができるが、得られる組織ギャップが脊髄損傷の特定の場合に、可能にし、組織の再生を促進し、適切なマトリックス、神経線維の再生に架橋される必要があります運動機能を維持し、促進します。そうだった低分子量ポリエチレングリコール（PEG 600）がこの目的に非常に適した材料であることを見出しました。その免疫原性の欠如、非常に低粘度は、周囲の組織へのスムーズな統合を可能にします。非常に重要なこと- -降順でコンパクトミエリン8によって線維路並びにそれらensheathmentを昇順の軸索の再生と伸び生体高分子の挿入だけでは内皮細胞、末梢シュワン細胞、およびアストロサイトなど、有益な細胞の浸潤を促進します。これらの再生応答は、長持ち機能向上を伴うことが見出されました。瘢痕組織の切除およびPEG 600のその後の移植の組み合わせはかなりの脊髄組織欠損をブリッジの安全かつシンプルでありながら非常に効率的な手段を提供します。

<table><tbody><tr><td>PEG 600 Ph Eur&amp;nbsp;</td><td>Merck/VWR&amp;nbsp;</td><td>8,170,041,000</td><td></td></tr><tr><td>Gelastypt gelatine sponge&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>sanofi Aventis</td><td>PZN-8789582</td><td></td></tr><tr><td>Nescofilm Sealant&amp;nbsp;</td><td>Roth</td><td>2569.1</td><td></td></tr><tr><td>Baytril</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl (Carpofen)</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forene (Isoflurane)</td><td>Abbvie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kodan (skin disinfectant)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl (tissue glue)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeur, 1 mm cup, straight&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>16020-14</td><td></td></tr><tr><td>Two-in-one Micro Spatula - 12 cm&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10091-12</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Forceps - Inox Medical&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11273-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Forceps - Inox Medical&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-25</td><td></td></tr><tr><td>Spinal cord hook&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10162-12</td><td></td></tr><tr><td>Scissors&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14078-10</td><td></td></tr><tr><td>Clamp&amp;nbsp;</td><td>Aesculap</td><td>EA016R</td><td></td></tr><tr><td>Ethicon Vicryl 4-0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen Augen- und Nasensalbe</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anatomical forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-13</td><td></td></tr><tr><td>Self-retaining retractor&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>17008-07</td><td></td></tr><tr><td>Skin clamp&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>13008-12</td><td></td></tr><tr><td>Aluspray&amp;nbsp;</td><td>Selectavet</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

experimental strategies to bridge large tissue gaps in the injured spinal cord after acute and chronic lesion

軸索再生を阻害病変コアにおける脊髄損傷（SCI）瘢痕形ました。外傷性の事故に起因する脊髄腫瘍切除、または組織欠損への侮辱後に損傷部位を埋めることは、一般的な組織の修復だけでなく、患部を 超え に神経線維の回生成長を促進するのを助けることができます。後に切断された脊髄組織の切り株を再適応するための急性および完全に離断胸部ラットの脊髄への新たなマイクロコネクタ装置の（1）移植、および慢性病変ラットでのSCIサイトの（2）のポリエチレングリコール充填：二つの実験的治療戦略が提示されています瘢痕切除。このモデルにおける慢性脊髄損傷は、5週間の治療の前に負わ​​せた完全な脊髄離断です。どちらの方法は、最近、有益な細胞浸潤と機能改善を非常に有望な成果を達成し、軸索の再成長を推進してきました脊髄損傷の齧歯類モデルです。 機械的なマイクロコネクタ・システム（MMS）は、MMSに負圧を印加する出口配管系とポリメチルメタクリレート（PMMA）からなるマルチチャネルシステムである内腔こうしてハニカム構造穴に脊髄断端を引っ張ります。 、1mmの組織ギャップ内への移植後の組織は、デバイス内に吸引されます。また、MMSの内壁は、より良好な組織接着のためにミクロされています。 慢性脊髄損傷のアプローチの場合には、脊髄組織 - 瘢痕が充填された病変領域を含む - は、長さ4mmの領域にわたって切除されています。顕微瘢痕切除後、得られた空洞は、細胞浸潤、血管再生、軸索再生およびインビボでもコンパクトな再ミエリン化のための優れた基質を提供することが見出されたポリエチレングリコール（PEG 600）で満たされています。

組織保存、軸索再成長および脊髄の急性完全離断後のMMS移植の機能的ベネフィット MMSの急性注入が完全に離断脊髄切り株を安定化し、組織（B 対 図2A）の収縮を減少させたことが示されました。矢状切片でのトリクローム染色により可視化されるように、病変コアにおける線維性瘢痕の緑の結合組織染色は、MMS移植した動物（ 図2C）よりもコントロール病変動物（ 図2D）でずっと高密度でより顕著です。興味深いことに、対照病変動物対移植MMSでED-1に対する免疫組織染色により可視化病変部位におけるマクロファージ蓄積の長期生存時間で全く観察された差はなかった（図示せず）。 図3A）を検出することができました。また、内腔が血管新生されたMMS（ 図3B）および軸索構造は血管の近くに発見された（図示せず）。オープンフィールドバッソ-ビーティー-ブレスナハンの運動スコア（BBB）の評価は、2および4週間後に制御-病変動物（ 図3C中の灰色の線） 対 MMS-移植した動物の大幅な機能改善（ 図3Cの黒線）を明らかにしました手術後。 細胞浸潤、血行再建術、軸索再生および瘢痕切除およびPEG移植後の慢性脊髄損傷ラットにおける機能向上 慢性傷害モードで部分的および完全な両方の胸部脊髄離断のlsが最初の損傷後の週5での病変の瘢痕の外科的除去は、動物への任意の検出可能な追加の害や不快感を引き起こしませんでした。瘢痕切除およびPEG 600のその後の挿入は（ 図4）マトリックス内に検出可能であった組織の再生につながりました。また、細胞外コラーゲンシースの堆積-瘢痕組織の基底膜の網目構造のための典型的なものである-病変のみの対照（ 図4B）と比較して、PEG-処理（ 図4C）後は顕著ではなかったです。病変のみのコントロール（図示せず）の慢性の瘢痕とは対照的に、マトリックスを充填した切除部位は、切除後に軸索成長を促進する細胞に侵入しました。既に早く一週間後の切除及び治療などのマトリクス領域内のいくつかの有益な細胞型は、血液vを再生中に存在することが見出された内皮細胞（として同定することができessels【 図4D]）、アストロサイト（ 図4F）と周辺シュワン細胞（ 図4G）。 5週間切除後PEG処置した領域は、多数の軸索のプロファイル（ 図 4E）が充填されています。 PEGマトリックスは、多数の軸索（ 図4D、E、G）の実質的な回生成長を促進しました。研究および免疫組織化学染色、様々な上昇をトレースし、 にもPEG-塗りつぶされた領域8 を超えていないだけで再生された識別することができた軸索集団を降順と。 EMは長い生存期間（8ヶ月）で動物の治療領域の分析送信は、シュワン細胞の存在が確認されたが、さらなるPEG-マトリックス8内再生された軸索のコンパクトな髄鞘形成を明らかにしただけではなく。再生された軸索のプロファイルは、頻繁に、血管新生の領域と関連していました（ 図4D）。免疫組織化学染色は、処理された切除領域に発見された軸索のプロファイルは密接シュワン細胞に関連し、切除し、移植8後の早い時点で既にこれらの細胞によって髄されるように見えたことを実証しました。 長期（8カ月）行動の研究では、慢性瘢痕切除およびPEG-処理（ 図5）した後、実質的な長期的な運動機能の改善を明らかにしました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53331/53331fig1.jpg" /> 動作図1. MMSデザイン原則 （A）、MMSの写真画像、（B）のMMS側壁の接着面の微細構造、スケールバー：50μmで、（CF）の模式図：（C）implantatioハニカム構造体（赤矢印：負圧）に組織を吸引する脊髄損傷へのMMSのnは、真空の（D）アプリケーション、（E）接着力だけの距離で近接した脊髄の切り株を保持します4内部のマイクロチャネルを介して管腔内の薬理学的物質の数μm、（F）分布（黒い矢印は、マイクロチャネル1を指す- 4）。注入は入口ポートにある青色の矢印で示されています。 Dは- MMSのE半分のみが示されています。エルゼビアの許可を得てBrazda ら 、2013年7より転載。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53331/53331fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53331/53331fig2.jpg" /> MMSインプ後の図2.脊髄組織保存lantation。6での脊髄組織、RESP。 7ヶ月（A）との合計切断後およびMMSインプラント（B）なし。 （B）中の矢印（A）でMMS（矢印）の移植部位に対応する脊髄の領域を示しています。 （A）でよく保存された構造とは対照的に、未処理動物（B）中の脊髄組織の収縮を注意してください。インプラントない対照動物と比較MMS注入（C）（D）後のサジタル脊髄切片のトリクローム染色。グリーン：結合組織、赤：細胞質、黒：ごくわずか瘢痕化が治療にMMSの周りに明らかであるのに対し、nucleus.The病変の中心は、（D、黒い矢印は病変の震源地を描いている）コントロール病変動物に瘢痕組織（緑）が充填されています14日（C）の後に、動物。 MMSは、ハニカム構造体から構成されていることに注意してください20μmの切片に切断した場合に、組織処理の間に洗い流されています。 1 MM：（D）中の（C、D）は（A）における（A、B）のスケールバー。エルゼビアの許可を得てBrazda ら 、2013年7から変更された。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53331/53331fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53331/53331fig3.jpg" /> MMS移植後の図3.軸索再生、血行再建術とオープンフィールド歩行スコア。（A）は、完全な脊髄離断およびMMSの移植後5週目の矢状脊髄セクションの汎軸索マーカー（PAM）でリン酸化神経フィラメントの免疫組織染色。 MMSの内腔は、アスタリスクで示されています。 MMSの壁（W）は破線でマークされていますライン。以前に組織を欠いMMSルーメン内の多数の染色された軸索を注意してください。スケールバー：100μmです。 （B）のMMS内腔の血管の免疫組織学的染色（フォン・ヴィレブランド因子と同定【のvWF]染色、緑色）。移植MMSのためのBBB運動スコアの（C）アセスメント（黒線、N = 9） 対コントロール負傷した動物（灰色の線、N = 6）。左と右後肢の平均BBB（グループあたりの平均）は、標準偏差で示されています。統計的に有意な差はアスタリスク（マン・ホイットニー順位和検定、P &lt;0.05）でマークされています。エルゼビアの許可を得てBrazda ら、2013年7から変更された。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53331/53331fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53331/53331fig4.jpg" /> 図4。PEGマトリックスはスカー切除と治療以下の組織再生および受益細胞浸潤を促進する。（A）スダンブラック染色は（スーダンブラック染色を欠い）切除ギャップの大部分は、1週間後の切除で組織で満たされていることを示しています。 （B、C）1週間後の切除でのコラーゲンIV型を持つ繊維状の病変の瘢痕の染色。 PEG処置した動物は、非常に弱く、より明瞭な免疫染色​​を明らかにしながら、高密度の瘢痕は、対照動物中に存在します。血管新生の（D）エリア（WWF）1週間後の切除で再生された軸索（神経フィラメント[NF]で識別）のプロファイルが含まれています。 （E）多くの軸索は、切除後5週目に治療領域へと成長してきました。 （F、G）グリア線維性酸性タンパク質陽性（GFAP +）の両方アストロサイトおよびS100 +シュワン細胞は、PEGマトリックスに侵入し、後者はregeneratと密接に関連して発見されます1週間後の治療後、既に軸索をる。スケールバー：（A 1）mmの。 （CF）が100μm、（G）は50μm。 （BG）：。。エストラダらから適応、エルゼビアからの許可を得て2014年8 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53331/53331fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53331/53331fig5.jpg" /> 対コントロール図5.慢性脊髄損傷、傷跡切除およびPEG-治療後の運動機能の改善。PEG-処置のための修正BBB（mBBB）運動スコアの評価（PEG、黒菱形、N =時点あたり13-14）慢性脊髄損傷後の瘢痕切除術（TX、白三角、N =時点あたり13-14）せずに、全脊髄離断を受けた動物、。平均mBBBスコア平均値の±標準誤差マン・ホイットニーのU検定、* P≤0.05、** P≤0.01、*** pは≤0.001片側;エストラーダらから変更。2014年は8エルゼビア、WPL =週後の初期病変、WPR =週間後の切除から許可を得て。エラーバー= SEM（平均値の標準誤差）。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53331/53331fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Experimental Strategies to Bridge Large Tissue Gaps in the Injured Spinal Cord after Acute and Chronic Lesion

Severe spinal cord injuries often result in tissue defects. Two possibilities are described to successfully bridge such gaps to promote tissue adaptation, regenerative responses and functional improvement in rats via implantation of a mechanical microconnector system after acute injury and five weeks after complete spinal cord transection.

急性および慢性病変後に損傷した脊髄に大きな組織ギャップを埋めるための実験的戦略

After a spinal cord injury (SCI) a scar forms in the lesion core which hinders axonal regeneration. Bridging the site of injury after an insult to the ...

experimental-strategies-to-bridge-large-tissue-gaps-injured-spinal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.9K ビュー.  Heinrich-Heine-University Medical Center. Severe spinal cord injuries often result in tissue defects. Two possibilities are described to successfully bridge such gaps to promote tissue adaptation, regenerative responses and functional improvement in rats via implantation of a mechanical microconnector system after acute injury and five weeks after complete spinal cord transection.

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Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

Use of genetically modified mice enhances our understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders such as a spinal cord injury (SCI). Freehand manual control used to produce a laceration model of SCI creates inconsistent injuries often associated with a crush or contusion component and, therefore, a novel technique was developed. Our model of cervical laceration SCI has resolved inherent difficulties with the freehand method by incorporating 1) cervical vertebral stabilization by vertebral facet fixation, 2) enhanced spinal cord exposure, and 3) creation of a reproducible laceration of the spinal cord using an oscillating blade with an accuracy of &plusmn;0.01 mm in depth without associated contusion. Compared to the standard methods of creating a SCI laceration such as freehand use of a scalpel or scissors, our method has produced a consistent lesion. This method is useful for studies on axonal regeneration of corticospinal, rubrospinal, and dorsal ascending tracts.

A novel technique to create a reproducible in vivo model of cervical spinal cord laceration injury in the mouse is described. This technique is based on spine stabilization by fixation of the cervical facets and laceration of the spinal cord using an oscillating blade with an accuracy of &plusmn;0.01 mm.

マウスで制御子宮裂傷の傷害

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

医学

Combining Peripheral Nerve Grafting and Matrix Modulation to Repair the Injured Rat Spinal Cord

Traumatic injury to the spinal cord (SCI) causes death of neurons, disruption of motor and sensory nerve fiber (axon) pathways and disruption of communication with the brain. One of the goals of our research is to promote axon regeneration to restore connectivity across the lesion site. To accomplish this we developed a peripheral nerve (PN) grafting technique where segments of sciatic nerve are either placed directly between the damaged ends of the spinal cord or are used to form a bridge across the lesion. There are several advantages to this approach compared to transplantation of other neural tissues; regenerating axons can be directed towards a specific target area, the number and source of regenerating axons is easily determined by tracing techniques, the graft can be used for electrophysiological experiments to measure functional recovery associated with axons in the graft, and it is possible to use an autologous nerve to reduce the possibility of graft rejection. In our lab we have performed both autologous (donor and recipient are the same animal) and heterologous (donor and recipient are different animals) grafts with comparable results. This approach has been used successfully in both acute and chronic injury situations. Regenerated axons that reach the distal end of the PN graft often fail to extend back into the spinal cord, so we use microinjections of chondroitinase to degrade inhibitory molecules associated with the scar tissue surrounding the area of SCI. At the same time we have found that providing exogenous growth and trophic molecules encourages longer distance axonal regrowth into the spinal cord. Several months after transplantation we perform a variety of anatomical, behavioral and electrophysiological tests to evaluate the recovery of function in our spinal cord injured animals. This experimental approach has been used successfully in several spinal cord injury models, at different levels of injury and in different species (mouse, rat and cat). Importantly, the peripheral nerve grafting approach is effective in promoting regeneration by acute and chronically injured neurons.

Traumatic injury to the spinal cord disrupts communication with the brain. To restore lost connectivity we utilize a peripheral nerve graft to provide a substratum for regenerating fibers in combination with neurotrophic factors and matrix-modulating enzymes to remove inhibitory molecules to promote long distance growth.

負傷ラット脊髄を修復するために末梢神経移植とマトリックスモジュレーションを組み合わせ

Traumatic injury to the spinal cord (SCI) causes death of neurons, disruption of motor and sensory nerve fiber (axon) pathways and disruption of ...

生物学

Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord injury (SCI), and can form functional relays to re-connect spinal cord segments above and below a lesion. Previous studies grafting neural stem cells have been limited by incomplete graft survival within the spinal cord lesion cavity. Further, tracking of graft cell survival, differentiation, and process extension had not been optimized. Finally, in previous studies, cultured rat NSCs were typically reported to differentiate into glia when grafted to the injured spinal cord, rather than neurons, unless fate was driven to a specific cell type. To address these issues, we developed new methods to improve the survival, integration and differentiation of NSCs to sites of even severe SCI. NSCs were freshly isolated from embryonic day 14 spinal cord (E14) from a stable transgenic Fischer 344 rat line expressing green fluorescent protein (GFP) and were embedded into a fibrin matrix containing growth factors; this formulation aimed to retain grafted cells in the lesion cavity and support cell survival. NSCs in the fibrin/growth factor cocktail were implanted two weeks after thoracic level-3 (T3) complete spinal cord transections, thereby avoiding peak periods of inflammation. Resulting grafts completely filled the lesion cavity and differentiated into both neurons, which extended axons into the host spinal cord over remarkably long distances, and glia. Grafts of cultured human NSCs expressing GFP resulted in similar findings. Thus, methods are defined for improving neural stem cell grafting, survival and analysis of in vivo findings.

Fibrin matrices containing growth factors were used to retain grafted neural stem cells into sites of complete spinal cord transection. Grafted cells completely filled the lesion cavity and differentiated into multiple neural cell types, including neurons that extended axons into host spinal cord over long distances.

重度の脊髄損傷後のフィブリンおよび成長因子カクテル神経幹細胞の生存と分化の促進

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord ...

神経科学

Synergetic Use of Neural Precursor Cells and Self-assembling Peptides in Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. Clinically, more than 50% of SCI affect the cervical spine1. As a consequence of the primary injury, a cascade of secondary mechanisms including inflammation, apoptosis, and demyelination occur finally leading to tissue scarring and development of intramedullary cavities2,3. Both represent physical and chemical barriers to cell transplantation, integration, and regeneration. Therefore, shaping the inhibitory environment and bridging cavities to create a supportive milieu for cell transplantation and regeneration is a promising therapeutic target4. Here, a contusion/compression model of cervical SCI using an aneurysm clip is described. This model is more clinically relevant than other experimental models, since complete transection or ruptures of the cord are rare. Also in comparison to the weight drop model, which in particular damage the dorsum columns, circumferential compression of the spinal cord appears advantageous. Clip closing force and duration can be adjusted to achieve different injury severity. A ring spring facilitates precise calibration and constancy of clip force. Under physiological conditions, synthetic self-assembling peptides (SAP) self-assemble into nanofibers and thus, are appealing for application in SCI5. They can be injected directly into the lesion minimizing damage to the cord. SAPs are biocompatible structures erecting scaffolds to bridge intramedullary cavities and thus, equip the damaged cord for regenerative treatments. K2(QL)6K2 (QL6) is a novel SAP introduced by Dong et al.6 In comparison to other peptides, QL6 self-assembles into &#946;-sheets at neutral pH6.14 days after SCI, after the acute stage, SAPs are injected into the center of the lesion and neural precursor cells (NPC) are injected into adjacent dorsal columns. In order to support cell survival, transplantation is combined with continuous subdural administration of growth factors by osmotic micro pumps for 7 days.

Treating cervical spinal cord injury with both self-assembling peptides (SAP) and neural precursor cells (NPC), together with growth factors, is a promising approach to promote regeneration and recovery. A contusion/compression aneurysm clip rat model of cervical SCI and combined treatment involving SAP injection and NPC transplantation is established.

実験的子宮頸脊髄損傷における神経前駆細胞と自己組織化ペプチドの相乗使用

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can be used both to investigate the biological responses to injury and to test potential therapies. Contusion or compression injury delivered to the surgically exposed spinal cord are the most widely used models of the pathology. In this report the experimental contusion is performed by using the Infinite Horizon (IH) Impactor device, which allows the creation of a reproducible injury animal model through definition of specific injury parameters. Stem cell transplantation is commonly considered a potentially useful strategy for curing this debilitating condition. Numerous studies have evaluated the effects of transplanting a variety of stem cells. Here we demonstrate an adapted method for spinal cord injury followed by tail vein injection of cells in CD1 mice. In short, we provide procedures for: i) cell labeling with a vital tracer, ii) pre-operative care of mice, iii) execution of a contusive spinal cord injury, and iv) intravenous administration of post mortem neural precursors. This contusion model can be utilized to evaluate the efficacy and safety of stem cell transplantation in a regenerative medicine approach.

Spinal cord injury is a traumatic condition that causes severe morbidity and high mortality. In this work we describe in detail a contusion model of spinal cord injury in mice followed by a transplantation of neural stem cells.

脊髄損傷の実験的挫傷モデルにおける神経幹細胞移植

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings. 
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.

Here we present a protocol that is based on spinal cord slices cultured on multi-electrode arrays to study functional regeneration of propriospinal connections in vitro.

マルチ電極アレイ上に成長させた器官脊髄共培養における機能的再生の調査

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap

Among various models for spinal cord injury in rats, the contusion model is the most often used because it is the most common type of human spinal cord injury. The complete transection model, although not as clinically relevant as the contusion model, is the most rigorous method to evaluate axon regeneration. In the contusion model, it is difficult to distinguish regenerated from sprouted or spared axons due to the presence of remaining tissue post injury. In the complete transection model, a bridging method is necessary to fill the gap and create continuity from the rostral to the caudal stumps in order to evaluate the effectiveness of the treatments. A reliable bridging surgery is essential to test outcome measures by reducing the variability due to the surgical method. The protocols described here are used to prepare Schwann cells (SCs) and conduits prior to transplantation, complete transection of the spinal cord at thoracic level 8 (T8), insert the conduit, and transplant SCs into the conduit. This approach also uses in situ gelling of an injectable basement membrane matrix with SC transplantation that allows improved axon growth across the rostral and caudal interfaces with the host tissue.

This article describes a technique to insert a hollow conduit between the spinal cord stumps after complete transection and fill with Schwann cells (SCs) and injectable basement membrane matrix in order to bridge and promote axon regeneration across the gap.

シュワンの移植細胞のギャップを渡って軸索の再生を促進するために切断のラット脊髄切り株をブリッジする PVDF ・ セッション導管内

Among various models for spinal cord injury in rats, the contusion model is the most often used because it is the most common type of human spinal cord ...

Spinal Cord Lateral Hemisection and Asymmetric Behavioral Assessments in Adult Rats

Incomplete spinal cord injury (SCI) often leads to impairments of sensorimotor functions and is clinically the most frequent type of SCI. Human Brown-S&#233;quard syndrome&#160;is a common type of incomplete SCI caused by a lesion to one half of the spinal cord which results in paralysis and loss of&#160;proprioception&#160;on the same (or ipsilesional) side as the injury, and loss of pain and temperature sensation on the opposite (or contralesional) side. Adequate methodologies for producing a spinal cord lateral hemisection (HX) and assessing neurological impairments are essential to establish a reliable animal model of Brown-S&#233;quard syndrome. Although lateral hemisection model plays a pivotal role in basic and translational research, standardized protocols for creating such a hemisection and assessing unilateralized function are lacking. The goal of this study is to describe step-by-step procedures to produce a rat spinal lateral HX at the 9th thoracic (T9) vertebral level. We, then, describe a combined behavior scale for HX (CBS-HX) that provides a simple and sensitive assessment of asymmetric neurological performance for unilateral SCI. The CBS-HX, ranging from 0 to 18, is composed of 4 individual assessments which include unilateral hindlimb stepping (UHS), coupling, contact placing, and grid walking. For CBS-HX, the ipsilateral and contralateral hindlimbs are assessed separately. We found that, after a T9 HX, the ipsilateral hindlimb showed impaired behavior function whereas the contralateral hindlimb showed substantial recovery. The CBS-HX effectively discriminated behavioral functions between ipsilateral and contralateral hindlimbs and detected temporal progression of recovery of the ipsilateral hindlimb. The CBS-HX components can be analyzed separately or in combination with other measures when needed. Although we only provided visual descriptions of the surgical procedures and behavioral assessments of a thoracic HX, the principle may be applied to other incomplete SCIs and at other levels of the injury.

Here we describe surgical procedures to produce a reliable spinal cord lateral hemisection (HX) at the 9th thoracic level in adult rats and neurobehavioral assessments designed for detecting asymmetric deficits after such a unilateral injury.

成人ラットにおける脊髄横片切と非対称行動評価

Incomplete spinal cord injury (SCI) often leads to impairments of sensorimotor functions and is clinically the most frequent type of SCI. Human ...

Thoracic Spinal Cord Hemisection Surgery and Open-Field Locomotor Assessment in the Rat

Spinal cord injury (SCI) causes disturbances in motor, sensory, and autonomic function below the level of the lesion. Experimental animal models are valuable tools to understand the neural mechanisms involved in locomotor recovery after SCI and to design therapies for clinical populations. There are several experimental SCI models including contusion, compression, and transection injuries that are used in a wide variety of species. A hemisection involves the unilateral transection of the spinal cord and disrupts all ascending and descending tracts on one side only. Spinal hemisection produces a highly selective and reproducible injury in comparison to contusion or compression techniques that is useful for investigating neural plasticity in spared and damaged pathways associated with functional recovery. We present a detailed step-by-step protocol for performing a thoracic hemisection at the T8 vertebral level in the rat that results in an initial paralysis of the hindlimb on the side of the lesion with graded spontaneous recovery of locomotor function over several weeks. We also provide a locomotor scoring protocol to assess functional recovery in the open-field. The locomotor assessment provides a linear recovery profile and can be performed both early and repeatedly after injury in order to accurately screen animals for appropriate time points in which to conduct more specialized behavioral testing. The hemisection technique presented can be readily adapted to other transection models and species, and the locomotor assessment can be used in a variety of SCI and other injury models to score locomotor function.

The rat thoracic spinal hemisection is a valuable and reproducible model of unilateral spinal cord injury to investigate the neural mechanisms of locomotor recovery and treatment efficacy. This article includes a detailed step-by-step guide to perform the hemisection procedure and to assess locomotor performance in an open-field arena.

ラットにおける胸部脊髄半切除手術とオープンフィールドロコ運動評価

Spinal cord injury (SCI) causes disturbances in motor, sensory, and autonomic function below the level of the lesion. Experimental animal models are ...

A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique eliminates laminectomy by removing two spinous processes and lifting, then tilting the caudal vertebral arch. The surgical area opens up without the need for laminectomy. Lateral hemisection is then performed with direct visible control under a microscope. The trauma is minimized, requiring only a small bone wound. 
This technique has several advantages: it is faster and, therefore, less of a burden for the animal, and the bone wound is smaller. Because the laminectomy is eliminated, there is less chance for unwanted injury to the spinal cord, and there are no bone splinters that can cause problems (bone splinters embedded in the spinal cord can cause swelling and secondary damage). The vertebral canal remains intact. The main limitation is that the hemisection can only be performed in the intervertebral spaces. 
The results show that this technique can be performed much faster than the traditional surgical approach, using laminectomy (11 min vs. 35 min). This technique can be useful for researchers working with animal models of open spinal cord injury as it is widely adaptable and does not require any additional specialized instrumentation.

Here, we describe a new, fast technique modeling open spinal cord injury in rats that eliminates laminectomy. Lateral hemisection is performed while viewing through a microscope. The technique is versatile and can also be used in the cervical, thoracic, and lumbar regions of the spinal cord of other animals.

ラットの開腹脊髄損傷をモデル化するための低侵襲で高速な脊髄外側半断面技術

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique ...

急性および慢性病変後に損傷した脊髄に大きな組織ギャップを埋めるための実験的戦略

要約

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マウスで制御子宮裂傷の傷害

負傷ラット脊髄を修復するために末梢神経移植とマトリックスモジュレーションを組み合わせ

重度の脊髄損傷後のフィブリンおよび成長因子カクテル神経幹細胞の生存と分化の促進

実験的子宮頸脊髄損傷における神経前駆細胞と自己組織化ペプチドの相乗使用

脊髄損傷の実験的挫傷モデルにおける神経幹細胞移植

マルチ電極アレイ上に成長させた器官脊髄共培養における機能的再生の調査

シュワンの移植細胞のギャップを渡って軸索の再生を促進するために切断のラット脊髄切り株をブリッジする PVDF ・セッション導管内

成人ラットにおける脊髄横片切と非対称行動評価

ラットにおける胸部脊髄半切除手術とオープンフィールドロコ運動評価

ラットの開腹脊髄損傷をモデル化するための低侵襲で高速な脊髄外側半断面技術

急性および慢性病変後に損傷した脊髄に大きな組織ギャップを埋めるための実験的戦略

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マウスで制御子宮裂傷の傷害

負傷ラット脊髄を修復するために末梢神経移植とマトリックスモジュレーションを組み合わせ

重度の脊髄損傷後のフィブリンおよび成長因子カクテル神経幹細胞の生存と分化の促進

実験的子宮頸脊髄損傷における神経前駆細胞と自己組織化ペプチドの相乗使用

脊髄損傷の実験的挫傷モデルにおける神経幹細胞移植

マルチ電極アレイ上に成長させた器官脊髄共培養における機能的再生の調査

シュワンの移植細胞のギャップを渡って軸索の再生を促進するために切断のラット脊髄切り株をブリッジする PVDF ・ セッション導管内

成人ラットにおける脊髄横片切と非対称行動評価

ラットにおける胸部脊髄半切除手術とオープンフィールドロコ運動評価

ラットの開腹脊髄損傷をモデル化するための低侵襲で高速な脊髄外側半断面技術

シュワンの移植細胞のギャップを渡って軸索の再生を促進するために切断のラット脊髄切り株をブリッジする PVDF ・セッション導管内