著者は、原稿の重要なレビューを提供するための博士ブレントハリスに感謝したいと思います。これらの研究は、NIH / NCI助成金P30-CA051008によって部分的にサポートされているロンバルディ総合がんセンター病理組織学および組織の共有リソースで行われました。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立がん研究所や国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。

スポットの1建設<ol><li> 1分間または完全に溶解するまで15ミリリットルコニカルチューブまたは2ミリリットルマイクロチューブ、ボルテックスで1ミリリットルの組織マーキング色素にウシ血清アルブミン（BSA）50mgを追加します。 注：このプロトコルでは、生化学グレードBSAを使用しています。他のグレードと純度がテストされていないが、それはグレードと純度がスポットの成功に大きな影響を与えないことが予想されます。 </li><li>ゲルが完全に融解するまで10秒刻みで30％の電力で電子レンジで15ミリリットルコニカルチューブ内の熱9ミリリットルヒドロキシエチルアガロース処理ゲル。 </li><li>シングル15ミリリットルコニカルチューブで溶融処理ゲルと色素BSA溶液を組み合わせて、ピペットで十分に混合します。溶液をボルテックス。 </li><li>数時間または固体まで冷蔵庫にコニカルチューブを置きます。 </li><li>静かに円錐管から着色されたゲルプラグを解放するために長く、薄い、金属へらまたはプローブを使用してください。 </li><li>銅にメスやカミソリの刃を使用してくださいゲルトン厚さ5mmの部分に横方向に差し込みます。丸みを帯びた端部を削除し、（ 図2A）廃棄物として処分します。 </li><li>組織学カセットに平らなゲルプラグ部を配置し、1時間70％エタノールで開催しています。 70％エタノール溶液に24時間の期間にわたって少なくとも3変更ごとに2〜4時間を変更します。 </li><li> （1時間毎（ 例えば、脂肪族炭化水素を溶液3回クリアで、クリア、70％エタノール、80％エタノール、95％エタノール、100％エタノール（3回の変更）：手動エタノール系列（1時間各貫通ゲル切片を処理しますキシレン代替））は、このプロトコルで使用された、キシレン）も許容され、手動または組織プロセサに、溶融パラフィン（1時間ごとに、3回）で潜入。 注：100％エタノールで完全な脱水の前に、染料が自動化組織プロセッサで他の組織および液体試薬に影響を与える可能性ゲルプラグから漏れることがあります。このような、手動の再水和が強く推奨されているように、しかし、自動処理はEQUです味方に有効。 </li><li>標準のパラフィン包埋の方法論（ 図2B）を使用して埋め込 ​​み、複数の処理されたゲル切片。ブロックを冷却し、硬化した後、室温に戻します。 </li><li>ブロックは（ 図2C）に排出されるまで埋め込 ​​みゲル切片からのスポットコアを除去するために、所望の大きさの皮膚パンチ針を使用してください。単一のブロックは、20×2 mm 2のコアまで提供することができます。涼しい場所にコアを保管してください。このプロトコルで皮膚パンチを使用している図1.5ミリメートル（ 図1Dおよび2D）または2ミリメートル（ 図1B、1C、および2C）を参照してください。 </li></ol> 2.オリエント非アレイブロックにスポットを使用して<ol><li>所望の位置と一緒に埋め込まれる個々の組織片の全ての識別、およびスポットの位置を示すために、組織の方向図を作成します。 注：組織配向ダイアグラムは、pを含む図示したマップであります識別子とスポットの位置で標識されたすべての組織片のhysical場所。これは、電子的に作成することができるか、手で引くことができます。図は、最高の最終製品を使用して、技術者や研究者に適した任意の方法を使用して作成する必要があります。サンプルは簡単に​​顕微鏡分析中に識別できるように、このマップは、研究者のためのガイドとして機能します。このプロトコルで使用されるマップは、手描きしました。それは、組織の各部分と実際の組織ブロックとスライドと同じ位置に描画され、標識されたスポットで組織ブロックとガラス顕微鏡スライドを示しています。 </li><li>それらが適切にグロスや処理工程を通じて同定されたままことを確認して、正常組織片を処理します。 70％エタノール、80％エタノール、95％エタノール、100％エタノール（×3の変化）、脂肪族炭化水素（キシレン代替物）（X3の変化）、溶融組織浸潤パラフィンでこのプロトコルでは、1時間毎でのために組織を処理します60°C（X3の変更）。 注意：LL組織は、標準的な組織学の研究室の手順に従って処理されるべきです。これは、個々の研究室の手順、組織のサイズと種類に可変であってもよいが、これはオリエンテーションツールとしてスポットを使用する能力には影響しません。 </li><li>組織の向き図に従って正しい割り当てられた場所に埋め込みステーション上の組織片を配置します。ブロックごとにスポットし、組織片を配置する方法についての技術者を案内するための基準として、組織の方向図を使用してください。 注：このプロトコルでは、埋め込み技術者は埋め込み駅に隣接手描きの方位マップを入れて、図に描かれたとまったく同じ配置で埋め込みステーション上の組織片を配置しました。これは、すべての組織片は、最終製品に正確に識別しておくことができます。これは、マルチ組織ブロックの使用の成功に絶対的に重要です。 </li><li>スポットコアがブロックに埋め込まれるすべての組織片よりも背が高いであることを確認してください。 </li><li>標準的な埋め込み方法論を用いて組織の向き図に従って適切な位置で、次に組織片と終了（横）にスポットを埋め込みます。必要に応じて、パラフィン、スポット（s）は（1〜2分）を転倒しないことを十分に凝固するまで、ピンセットで直立スポット（複数可）を開催しています。 </li><li>標準的な方法論を用いて、スポットのセクションと染色パラフィン切片。 <ol><li>セクションでは、正に帯電したスライドガラスに40℃の水浴上に浮遊して付着することを可能にする（非荷電スライドがテストされていません）。少なくとも20分間、60℃の乾燥オーブン中でスライドを乾燥させます。 </li><li>自動染色でスライドを配置し、以下の試薬を介して処理：キシレン（キシレン1-5分、キシレン2、3-2分、それぞれ）、100％エタノール（2分）、95％エタノール（1分）、80 ％エタノール（30秒）、70％エタノール（30秒）、水道水（2分）、ヘマトキシリン​​（1.5分）、水道水（3分）、酸アルコール（1分）、水道水（2分）、BLuing試薬（1分間）、流水（2分）、80％エタノール（30秒）、エオシン（1分間）、流水（10秒）、80％エタノール（1分）、100％エタノール（3回交換、 2分ごと）、キシレン（3変更、30秒ごと）。 </li><li>マウンティング培地でマウントカバーガラスとスライドをカバーしています。 注：このプロトコルでは、組織学技師は、5μmの切片でミクロトームでパラフィンブロックを切断しました。我々は、自動染色を使用し、このプロトコルのために、しかし同等の結果が手動染色を介して得ることができます。 </li></ol></li></ol>のTMA 3.スポット（手動TMAキット） <ol><li> 2.1で説明したように、組織の方向図を作成し、スポットの所望の位置（複数可）を割り当てます。 </li><li>埋め込み駅で溶融パラフィンでTMAの金型を入力します。金型が冷却されると、組織の配向図で示される所望の位置でのTMAの鋳型の縁端上のスポット（複数可）を埋め込みます。必要に応じて、パラフィンヘクタールまで鉗子で直立スポット（複数可）を保持Sは、スポット（複数可）（1-2分）倒れないことを十分に固化しました。 </li><li>メーカーの指示およびアレイマージン（ 図2D）のスポット（複数可）の位置に関して記載のTMAコアを組み立てて、標準切片と染色プロトコルに従ってください。 注：このプロトコルで使用される切片および染色方法を参照するために、ステップ2.6を参照してください。 </li></ol>

<ol>
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Morphol. 20 (4), 410-412 (2012).</li><li>Jones, M., Calabresdi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar-gelatin+for+embedding+tissues+prior+to+paraffin+processing.">Agar-gelatin for embedding tissues prior to paraffin processing.</a> BioTechniques. 42, 569-570 (2007).</li><li>Carson, F., Hladik, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histotechnology: A Self-Instructional Text. , (2009).</li><li>Suvarna, S., Layton, C., Bancroft, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bancroft&#8217;s Theory and Practice of Histological Techniques. 7th ed. , (2013).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

スポットの調製に成功したと活用は、いくつかの技術的な手順に慎重に遵守する必要があります。ヒドロキシエチルアガロースの溶融がゆっくりと弱火で行われるべきです。高熱で迅速に溶融して最適な結果よりも少ないため、アガロースのいくつかの破壊をもたらすことができます。処理のための片に色素を含んだプラグを切断すると、それぞれの作品の厚さが4.5ミリメートルより大きく、7ミリメートルを超えないようにしてください。丸みを帯びた端部は、それらが厚さ5mm均一でないとして廃棄物として除去されます。 5ミリメートル未満の作品は、隣接する組織材料の枯渇する前に切片によって排出される危険が短いスポットの作成になります。スポットは、ブロック全体を通して存在していることを確認するために、ピースは、少なくとも4.5〜5ミリメ​​ートルにする必要があります。ワックスの適切な浸透を確実にするために、しかし、作品は7ミリメートルを超えてはなりません。ワックス浸透のための色素片を脱水すると、染料はロウに作品のうち、わずかに浸出しますエタノールの濃度R。浸出は、最終製品に影響を与えない、スポットは依然として激しく染め、はっきりと見えるようになります。作品は100％エタノールに達するまで組織切片を染料片と同じ浴で処理されるべきではないので、浸出は、しかし、他の組織に影響を与える可能性があります。 配列されたブロックにスポットを配置する場合、他のすべての組織の配置は前のスポットを追加することに完全であることを確認してください。スポットはパラフィンワックスを浸透させているので、それがあまりにも長い間放置されている場合、レシピエントブロックの溶融ワックスは、スポットコアを溶融し始めることができます。 、最初にすべての組織片を配置し、スポットコアを追加し、直ちにスポットの任意の溶融を防止するために、コールドプレートにブロックを転送します。 スポットは、ほとんどの組織学ラボのワークフローに適合するように修正することができます。染料の色は、各アプリケーションにおける最適なコントラストのために変更することができます。赤や黒の染料はwが、IHC染色したスライド上の明確な高いコントラストを生み出しますhile赤斑は目が配列された腎臓切片のH＆E染色スライドで引くようではありません。 H＆Eスライドには、緑や黄色の斑点は、より高いコントラストを提供する傾向があります。また、このような免疫組織化学のための熱誘導された抗原回復のようなプロセスの間に高熱下で、ヒドロキシエチルアガロースが溶け。 BSAも高熱検索方法の後にスライド上の明るい色のスポットを維持するために、スポット準備中に染料に追加されます。スライドは、高熱にさらされない場合、BSAは速いスポット生産のために省略することができます。 スポットを配置するとき、スポットの使用の最も重要な側面は、明確かつ簡潔な方位マップとマップに忠実な遵守の作成と維持にあります。適切に使用すると、埋め込み技術者は、単にスポットの位置とTISSUの関係を示すことができるように、スポットは、組織構成の混乱を軽減し、技術者や研究者との間の通信を簡素化地図上のそれへのES。スポットは簡単に、下流の分析のためにスライドに取り付け、高一貫のセクションを可能にするスライドの準備のすべての段階ではっきりと見えます。生理的マーカーとは対照的に、スポットはすべてのセクションにはっきりと表示され、成果物または形態の閉塞の導入を防止する、どのような方法で組織を変更しません。非対称組織を埋め込む方法とは異なり、スポットを顕微鏡下で視覚分析を最適化するために、組織の配置の技術者や研究者の柔軟性を可能にします。のTMAでは、スポットは、アレイ全体が貴重な組織切片で構成することができるように、空白、非対称アセンブリ、またはビーコンコアの必要性を排除し、メインアレイの外部に配置することができます。スポットはまた、組織サンプル（ 例えば、遠位または近位の）解剖学的方向を示すために使用することができます。スポットは、建設とAの間に組織サンプルを簡単かつ一貫した姿勢ためのシンプルで低コストのソリューションです。マルチ組織ブロックとのTMAのnalysis。

単一のパラフィンブロックに複数の個人から組織サンプルを埋め込む機能は、トリートメントや個人間で簡単に並べて比較を可能にするスライド間のばらつきを排除し、標本を切​​片と染色のコストと作業負荷を軽減します。これらの多組織ブロックは、典型的には、組織マイクロアレイ（TMA）または非アレイレイアウトにおける複数の個体からの組織を含むパラフィンブロックのいずれかとして製造されます。サンプルのアイデンティティの維持は任意の多組織解析の成功に不可欠です。研究者は、分析の効率を向上させるスライド間のばらつきを低減し、貴重な組織のリソースを節約し、実験1の時間とコストを削減するために、それらの開発以来のTMAを使用しています。のTMAの正しい姿勢は、組織コア2-4との間の空白、行や列、コアグループ3,5の非対称の配置（ 例えば、制御を含め、様々な方法を用いて達成することができます治療対 L）、「ビーコン」コア6、およびTMAマトリックス3の外側に配置された指定の向きコア。これらの方法はのTMAのためにうまく機能しているが、ほとんどは組織コアが時間をかけて排出されるように識別子が混乱になるかもしれとして隙間やスペースで貴重なTMAコア空間とのTMAを消費します。彼らは識別子として均一なマイクロアレイコアの緊密注文パターンの異常に依存しているためさらに、これらの方法は、アレイ形式なく、マルチ組織ブロックでの使用には適していません。ほとんどの非アレイマルチ組織ブロック不均一な組織に対応しなければならないと、定義により、これらの収差は、ランドマークとして目立つ構造のアレイグリッドを表示しません。 TMA、最大の欠点のいずれかを使用することには多くの利点があるが、常に大部分は不均一な組織1の代表ではないコアのサイズが小さいです。非アレイマルチ組織ブロックは、tの多くを提供します彼はTMAの利点が、より大きな組織サンプル、または動物試験から全体の臓器が含まれています。単一コアを使用して、組織マイクロアレイは、目的のタンパク質に基づいて全組織切片と一致しており、多くの変化が大きく一致7-11ための複数のコアを必要とします。による複雑さといくつかのバイオマーカー表現型の不均一性のために、コアのさえ大量に使用してのTMA（&gt; 10）はまだ不十分であることができ、分析の8のためのマイクロアレイ以外の方法が必要な場合があります。さらに、TMAの構築は、技術的に厳しい時間がかかり、初期コストと投資にまたは組織アレイヤーにアクセスする必要があります。非アレイマルチ組織ブロックが大幅に少ない時間と労力で任意の基本的な実験室で行われ、アレイが許可またはコストを削減し、分析を単純化する手段として、より多くの組織を必要とする研究のための有効な代替手段であることができます。 非アレイマルチ組織ブロックは、同様に信頼性を必要としますか、ientationマーカーがサンプル識別を追跡するために、しかし、これらのマーカーの開発が制限されています。組織の向きを説明する文献の多くは、このようなインク12で組織を刺青のような個々の組織片を、埋め込 ​​むための正しい生理向きに焦点を当てて、前処理13に寒天ゼラチンで組織を事前に埋め込 ​​み、およびノッチ14または縫合糸15で特定の組織をマーキング。機能が、これらの方法は、それらの制限によるマルチ組織ブロック内のマーカーとして理想的ではありません。縫合糸はすぐに通って区分され、各セクションに表示されない場合があります。寒天、ゼラチンを使用して事前に埋め込む技術は、加工及び埋め込み中に適切な方向に組織を維持することができるが、パラフィンブロック、スライドに複数のサンプルを区別するための視覚的な手掛かりを提供していません。組織のノッチまたは色素が分析を複雑にしたり、重要な形態学的な詳細を閉塞することができます。あるいは、組織アイデンティティ非アレイマルチ組織ブロックに非対称な配置で組織片の埋め込みによって維持が、これは3つ以上の組織片を必要とし、分析のための組織の最適な配置を可能にしない場合がありますすることができます。 試料オリエンテーションタグ（スポット）は、明らかに、マルチ組織ブロック内の組織を同定するための簡単​​で安価な方法として開発され、既存の配向方法に比べて多くの利点を提供していますされています。スポットは、ヒドロキシエチルアガロース処理ゲルおよび組織マーキング染料、から構成され、パラフィン（ 図2C）を浸透させ、小さな、カラフル、コアです。スポットコアは、マルチ組織のパラフィンブロック内の単一の組織の横端部に埋め込 ​​まれ、ブロック内の、すべてのセクション（ 図1A - D）で鮮やかな色のドットとして表示され、明らかにブロックとセクションの正しい方向を示します簡単に組織識別のため。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HistogelTM Specimen Processing Gel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td><a href="http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html">http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Marking Dye</td>
			<td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TMD-5</td>
			<td>Any tissue marking dye would most likely be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arraymold Kit A 2 mm (60 core)</td>
			<td>Arraymold</td>
			<td>20015A</td>
			<td>Any manual tissue arrayer would work similarly.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spot the correct tissue every time in multi-tissue blocks

マルチ組織のパラフィンブロックは、効率の向上、実験的均一性、および減少した時間とコストで高スループット分析を提供しています。組織マイクロアレイは、マルチ組織のパラフィンブロックの大部分を占めるが、ますます、研究者は、計画や設備の大幅な投資なし組織マイクロアレイの多くの利点を提供することができる複数の個人から大きな組織を含む非アレイブロックを使用しています。任意の多組織分析の重要な要素は、個々の組織を識別するために使用される配向法です。方法が適切な方向およびマルチ組織ブロック内の組織の識別を維持するために存在するが、大部分は、アレイ内の貴重なスペースを消費する可能性があり、非アレイブロックに適していない、および/または標準的な組織学の研究室で製造することが困難です。試料オリエンテーションタグ（スポット）は、パラフィンブロックとfoのすべての組織切片ではっきりと見ることが簡単で低コスト指向のツールです。配列と非アレイレイアウトでR信頼性の高い検体識別。スポットは、組織への直接の変更を必要としないように非アレイブロックのための既存の配向方法を上回る利点を提供し、組織片の配置の自由度を可能にします。

スポットは、すべてのパラフィン切片でパラフィンブロック（ 図1Aおよび2D）でのラウンド、鮮やかな色のドットとして表示され、H＆EまたはIHC染色手順を介してスライドガラス（ 図1B - 1Dおよび2D）に残ります。この明らかな視覚的な手がかり助剤は、それぞれの個々の組織片を識別し、組織学技師が顕微鏡でスライドからデータを収集する研究者に組織片の配置を示すために、この視覚的なキューを使用できるように通信を簡素化で組織学技師や研究者の両方。組織の方向図は研究者に提供し、スライドに含まれており、顕微鏡分析の間に混乱は存在しませんので、詳細に説明されるべきである。 図2（a）は固化し、着色されたアガロースゲルプラグを区画した結果を示す。 図2Bは、埋め込 ​​みの結果を示しています区分アガロースゲルプラグパラフィンブロック中のS。 図2Cは、スポットコアを製造するために皮膚パンチを使用した結果を示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52868/52868fig1highres.jpg" width="700" /> 図1：スポットコアは、組織ブロックとスライドで簡単に作成し、容易に視認されている（A）のスポットが埋め込 ​​まれたブロック内にはっきりと見えます。 （B）スポットは簡単に向きと異なる個体/治療群から類似登場する組織を含む多組織ブロックのための組織の識別を可能にします。 （C）スポットが組織マイクロアレイのすべてのコアは、貴重な組織試料のために利用されることを可能にします。 （D）TMAコアに隣接するスポットの顕微鏡図です。矢印はスポットを示す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52868/52868fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> </P&gt; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52868/52868fig2highres.jpg" width="700" /> 図2：スポットコアの調製（A）凝固ヒドロキシアガロースプラグをエッペンドルフ管から放出され、5mmのスライスに横方向に切断されます。 （B）複数のスライスは、単一のパラフィンブロック中に埋め込 ​​まれており、（C）皮膚パンチスポットコアを除去するために使用されます。 （D）のスポットが組織マイクロアレイの余白に埋め込 ​​まれている。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52868/52868fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

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SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

試料オリエンテーションタグ（スポット）の目的は、マルチ組織のパラフィンブロック内の個々の組織の識別を支援するためのオリエンテーションツールとして機能することです。これらのプロトコルは、それが一般的な、低コストの組織学物質から容易に構築し、パラフィンブロックとセクションの信頼性の高い視覚的なマーカーとして機能する方法を示しています。

マルチ組織ブロック内のスポットの正しい組織毎回

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...

spot-the-correct-tissue-every-time-in-multi-tissue-blocks

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K ビュー.  Frederick National Laboratory for Cancer Research. 試料オリエンテーションタグ（スポット）の目的は、マルチ組織のパラフィンブロック内の個々の組織の識別を支援するためのオリエンテーションツールとして機能することです。これらのプロトコルは、それが一般的な、低コストの組織学物質から容易に構築し、パラフィンブロックとセクションの信頼性の高い視覚的なマーカーとして機能する方法?...

ビデオ: SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

アクチン共沈降アッセイ、F -アクチンへの結合タンパク質の解析のための

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

生物学

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

ラット心臓における培養組織の移植

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

速度論と構造機能解析のアフィニティ定量のための適切なタンパク質濃度の重要性

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

組織サンプルのγH2AX病巣の定量

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

イモリのレンズ再生を研究するために培養虹彩色素上皮細胞のためのシステム

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

の初期発生のタイムラプス顕微鏡線虫（Caenorhabditis elegans）

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for vision. In the human a single LG resides in the orbit above the lateral end of each eye delivering tears to the ocular surface through 3 - 5 ducts. The mouse has three pairs of major ocular glands, the most studied of which is the exorbital lacrimal gland (LG) located anterior and ventral to the ear. Similar to other glandular organs, the LG develops through the process of epithelial branching morphogenesis in which a single epithelial bud within a condensed mesenchyme undergoes multiple rounds of bud and duct formation to form an intricate interconnected network of secretory acini and ducts. This elaborate process has been well documented in many other epithelial organs such as the pancreas and salivary gland. However, the LG has been much less explored and the mechanisms controlling morphogenesis are poorly understood. We suspect that this under-representation as a model system is a consequence of the difficulties associated with finding, dissecting and culturing the LG. Thus, here we describe dissection techniques for harvesting embryonic and post-natal LG and methods for ex vivo culture of the tissue.

The lacrimal gland (LG) is a branching organ that produces the aqueous components of tears necessary for maintaining vision and ocular health. Here we describe murine LG dissection and ex vivo culture techniques to decipher signaling pathways involved in LG development.

マウス涙腺を操作する

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays crucial roles in cell development and many diseases. Approximately 5,000 lysine methylation sites were identified on different proteins, which are set by few dozens of protein lysine methyltransferases. This suggests that each PKMT methylates multiple proteins, however till now only one or two substrates have been identified for several of these enzymes. To approach this problem, we have introduced peptide array based substrate specificity analyses of PKMTs. Peptide arrays are powerful tools to characterize the specificity of PKMTs because methylation of several substrates with different sequences can be tested on one array. We synthesized peptide arrays on cellulose membrane using an Intavis SPOT synthesizer and analyzed the specificity of various PKMTs. Based on the results, for several of these enzymes, novel substrates could be identified. For example, for NSD1 by employing peptide arrays, we showed that it methylates K44 of H4 instead of the reported H4K20 and in addition H1.5K168 is the highly preferred substrate over the previously known H3K36. Hence, peptide arrays are powerful tools to biochemically characterize the PKMTs.

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

SPOTペプチド配列を用いてタンパク質リジンメチルトランスフェラーゼの特異性の解析

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

生後マウスにおける聴覚ブラの解剖：中耳の骨の単離および組織学的解析

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...