Los autores desean agradecer al Dr. Brent Harris para proporcionar la revisión crítica del manuscrito. Estos estudios se realizaron en el Lombardi Comprehensive Cancer Center Histopatología y Tejidos recurso compartido que está apoyado en parte por el NIH / NCI subvención P30-CA051008. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional del Cáncer o los Institutos Nacionales de Salud.

1. Construcción de la mancha <ol><li> Añadir 50 mg de albúmina de suero bovino (BSA) a 1 ml de tejido tinte de marcado en un tubo cónico de 15 ml o 2 ml tubo de microcentrífuga y agitar durante 1 min o hasta que esté completamente disuelto. Nota: Para este protocolo, utilice bioquímica Grado BSA. Mientras que otros grados y purezas no han sido probados, se espera que el grado y la pureza no tendrían un impacto significativo en el éxito de la mancha. </li><li> Heat 9 ml hidroxietil gel de agarosa de procesamiento en un tubo cónico de 15 ml en un microondas a potencia 30% para incrementos de 10 seg hasta que el gel se funde completamente. </li><li> Combinar el gel de procesamiento fundido y solución de colorante-BSA en un solo tubo cónico de 15 ml y mezclar bien con una pipeta. Vortex la solución. </li><li> Colocar el tubo cónico en un refrigerador por algunos hrs o hasta que sólido. </li><li> Utilice un, espátula de metal larga y delgada o sonda para liberar suavemente el tapón de gel de color del tubo cónico. </li><li> Use una hoja de bisturí o una navaja a Cut el gel enchufe transversalmente en 5 mm de espesor secciones. Retire los extremos redondeados y desechar como residuos (Figura 2). </li><li> Coloque las secciones de conexión de gel planas en cassettes de histología y mantenga en etanol al 70% durante 1 hora. Cambie la solución de etanol al 70% cada 2-4 horas durante por lo menos 3 cambios durante un período de 24 hr. </li><li> Procesar manualmente las secciones gel a través de una serie de etanol (1 hr cada uno: etanol al 70%, etanol al 80%, etanol al 95%, etanol al 100% (cambios 3x), y luego despejado en la limpieza de solución de 3x durante 1 hr cada uno (por ejemplo, hidrocarburos alifáticos ( xilenos sustituto)) se utilizaron en este protocolo, xilenos también son aceptables), y se infiltran con parafina fundida (3x durante 1 hora cada uno), ya sea manualmente o en una procesadora de tejidos. Nota: Antes de la completa deshidratación en etanol 100%, el colorante puede gotear de la clavija de gel que podría afectar a otros tejidos y los reactivos líquidos en un procesador automatizado de tejido. Como es muy recomendable por ejemplo, la rehidratación manual, sin embargo procesamiento automatizado es equaliado eficaz. </li><li> Múltiples secciones de gel procesados ​​Integrar utilizando parafina estándar incrustar metodología (Figura 2B). Permitir que los bloques se enfríen y se endurecen y luego vienen a temperatura ambiente. </li><li> Utilice una aguja de perforación cutánea de tamaño deseado para eliminar núcleos punto desde las secciones de gel embebidos hasta que el bloque se agota (Figura 2C). Un solo bloque puede proporcionar hasta 20 x 2 mm 2 núcleos. Almacene los núcleos en un lugar fresco. Utilice punzón dérmico en este protocolo véanse las figuras, un 1,5 mm (figuras 1D, y 2D) o un 2 mm (figuras 1B, 1C y 2C). </li></ol> 2. Uso de lugares para Bloques Orient no dispuestas- <ol><li> Crear un diagrama de orientación del tejido para indicar los lugares deseados y las identidades de todas las piezas de tejido individuales para ser integrados juntos, y la ubicación de la mancha. NOTA: El diagrama de orientación del tejido es un mapa ilustrado que incluye la pubicaciones ÍSICA de todas las piezas de tejido marcados con identificadores y la ubicación de la mancha. Puede ser creado electrónicamente o puede ser dibujado a mano. El diagrama se debe crear utilizando cualquier método que mejor se adapte al técnico e investigador con el producto final. Este mapa servirá como guía para el investigador lo que las muestras pueden ser fácilmente identificados durante el análisis microscópico. El mapa utilizado en este protocolo fue elaborado a mano. Representa a un bloque de tejido y el vidrio portaobjetos de microscopio con cada pieza de tejido y el punto dibujado y etiquetados en la misma posición que el bloque de tejido real y tobogán. </li><li> Procesar los trozos de tejido normalmente, asegurando que queden debidamente identificados a través de los pasos de extrapolación y de procesamiento. Para este protocolo, procesar los tejidos durante 1 hr cada uno en: 70% de etanol, etanol al 80%, etanol al 95%, etanol al 100% (cambios x3), hidrocarburos alifáticos (xilenos) (sustitutos cambios x3), y la infiltración de parafina fundida tejido en 60 ° C (cambios x3). NOTA: Atejidos ll deben procesarse siguiendo procedimientos de laboratorio de histología normal. Esto puede ser variable debido al procedimiento de laboratorio individual, el tamaño y el tipo de tejido, pero esto no afectará a la capacidad de utilizar el lugar como una herramienta de orientación. </li><li> Organizar piezas de tejido en la estación de la incrustación en los lugares asignados correctos de acuerdo con el diagrama de la orientación del tejido. Utilice el diagrama de orientación del tejido como una referencia para guiar el técnico sobre la forma de organizar las piezas Spot y tejidos en cada cuadra. NOTA: En este protocolo el técnico incrustación de poner el mapa de orientación a mano junto a la estación de incrustación y arregló las piezas de tejido en la estación de incrustación exactamente de la misma disposición que dibujada en el diagrama. Esto asegura que todos los trozos de tejido permanecen correctamente identificable en el producto final. Esto es absolutamente fundamental para el uso exitoso de bloques de múltiples tejidos. </li><li> Asegúrese de que el núcleo de SPOT es más alto que todas las piezas de tejido para ser incorporados en el bloque. </li><li> Insertar las piezas de tejido y luego el punto en el extremo (transversal) en los lugares adecuados de acuerdo con el diagrama de orientación de tejido utilizando la metodología estándar de la incrustación. Según sea necesario, mantenga el punto (s) en posición vertical con las pinzas hasta que la parafina se ha solidificado lo suficiente que el punto (s) no se caiga (1-2 min). </li><li> Sección y parafina mancha secciones con el lugar utilizando metodología estándar. <ol><li> Permita que las secciones para flotar en un baño de agua a 40 ° C y se adhirieron a un portaobjetos de vidrio con carga positiva (diapositivas sin carga no se han probado). Secar los portaobjetos en un horno de secado a 60 ° C durante al menos 20 min. </li><li> Colocar los portaobjetos en una stainer automático y procesados ​​a través de los siguientes reactivos: xilenos (xilenos 1-5 min, xilenos 2 y 3-2 min, cada uno), etanol 100% (2 min), etanol 95% (1 min), 80 % de etanol (30 seg), etanol 70% (30 seg), el agua del grifo (2 min), hematoxilina (1,5 min), agua del grifo (3 min), alcohol ácido (1 min), agua del grifo (2 min ), blreactivo uing (1 min), agua corriente (2 min), etanol 80% (30 seg), eosina (1 min), agua corriente (10 seg), etanol 80% (1 min), etanol 100% (3 cambios, 2 min cada uno), xilenos (3 cambios, 30 seg cada uno). </li><li> Cubra los portaobjetos con cubreobjetos de vidrio, montadas con medio de montaje. NOTA: En este protocolo, el histólogo seccionó los bloques de parafina en un micrótomo de 5 micras secciones. Para este protocolo se utilizó un stainer automática, sin embargo igualdad de resultados pueden ser obtenidos a través de tinción manual. </li></ol></li></ol> 3. lugar en TMA (TMA Kit Manual) <ol><li> Crear un diagrama de orientación del tejido, como se describe en 2.1 y asignar la ubicación deseada (s) de la mancha. </li><li> Llenar el molde con parafina derretida TMA en una estación de incrustación. A medida que el molde se está enfriando, incrustar el punto (s) en el extremo en los márgenes del molde TMA en los lugares deseados indicados por el diagrama de orientación del tejido. Según sea necesario, mantenga el punto (s) en posición vertical con las pinzas hasta que la parafina has solidificó suficiente como para que el punto (s) no se caiga (1-2 min). </li><li> Montar los núcleos de TMA de acuerdo a las instrucciones del fabricante y con respecto a la ubicación de la mancha (s) en los márgenes de la matriz (Figura 2D), y seguir los protocolos de seccionamiento y tinción estándar. NOTA: Por favor, consulte el paso 2.6 para ver los métodos de seccionamiento y tinción utilizados en este protocolo. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Preparación exitosa y la utilización de los lugares requiere una cuidadosa adhesión a unos pasos técnicos. Fusión de la agarosa hidroxietil debe hacerse lentamente y al fuego lento. Melting rápidamente a fuego alto puede dar lugar a alguna ruptura de la agarosa por menos de unos resultados óptimos. Al cortar los tapones en colorantes cargados en trozos para el procesamiento, garantizar que el espesor de cada pieza es mayor que 4,5 mm y no excede de 7 mm. Los extremos redondeados se eliminan como residuos, ya que no son uniformemente 5 mm de espesor. Piezas de menos de 5 mm se traducirá en la creación de spots cortos que corren el riesgo de ser agotado por el corte antes del agotamiento de material tejido adyacente. Para asegurar el lugar está presente a través de la totalidad de la manzana, las piezas deben ser de al menos 4,5 a 5 mm. Para asegurar la infiltración adecuada de cera, sin embargo, las piezas no deben exceder de 7 mm. Cuando la deshidratación de las piezas de colorantes para la infiltración de cera, el colorante se filtrará ligeramente fuera de las piezas en el lower concentraciones de etanol. La lixiviación no afecta el producto final, los puntos seguirá siendo intensamente teñido y claramente visible. La lixiviación podría afectar otros tejidos, aunque, por lo que los cortes de tejido no debe ser procesado en los mismos baños como las piezas de tinte hasta que las piezas han llegado a 100% de etanol. Al colocar los puntos en los bloques dispuestos, asegúrese de que el resto de la colocación del tejido se ha completado antes de añadir el punto. Desde el lugar se infiltra con cera de parafina, la cera fundida del bloque receptor puede empezar a fundir el núcleo de lugar si se le permite sentarse durante demasiado tiempo. Organizar todos los trozos de tejido primero, agregue el núcleo SPOT e inmediatamente transferir el bloque a un plato frío para evitar la fusión de la mancha. El punto puede ser modificado para adaptarse a la mayoría de los flujos de trabajo de laboratorio de histología. El color del colorante puede ser cambiado para el contraste óptimo en cada aplicación. Tinte rojo o negro produce claras de alto contraste en las diapositivas IHC manchadas, wi bien el punto rojo no es tan llamativo en una diapositiva de H &amp; E manchadas de secciones de riñón dispuestas. Para H &amp; E diapositivas, manchas verdes o amarillos tienden a proporcionar un mayor contraste. Además, bajo fuego alto durante procesos como la inducida por el calor de recuperación de antígeno por inmunohistoquímica, la agarosa hidroxietil derrite. BSA se añade al medio de contraste durante la preparación del terreno para mantener un lugar de colores brillantes en la diapositiva, incluso después de métodos de recuperación de calor. Si las diapositivas no estarán expuestos a altas temperaturas, la BSA se puede omitir para la producción de spot más rápido. Los aspectos más críticos del uso de SPOT están en la creación y mantenimiento de un mapa de orientación clara y concisa, y la adhesión fiel al mapa al colocar el punto. Cuando se utiliza correctamente, el punto reduce la confusión sobre arreglo de tejido y simplifica la comunicación entre los técnicos y los investigadores, ya que el técnico de la incrustación puede simplemente indicar la ubicación de la mancha y la relación de la tissues a la misma en un mapa. Spot es claramente visible en todas las etapas de la preparación de diapositivas permitiendo sección altamente consistente de montaje en portaobjetos para el análisis de aguas abajo más fácil. En contraste con los marcadores fisiológicos, el lugar es claramente visible en todas las secciones y no modifica el tejido de cualquier manera, prevenir la introducción de artefactos o la obstrucción de la morfología. A diferencia del método de incorporación de los tejidos de forma asimétrica, El sitio permite a los técnicos e investigadores flexibilidad en la disposición de los tejidos para optimizar el análisis visual en el microscopio. En las TMA, el lugar puede ser colocado fuera de la matriz principal, eliminando la necesidad de espacios en blanco, conjuntos asimétricos, o núcleos de baliza, permitiendo toda la matriz que se compone de secciones de tejido valiosos. El lugar también se puede utilizar para indicar la dirección anatómica (por ejemplo, distal o proximal) de muestras de tejido. El lugar es una solución sencilla y de bajo costo para la orientación fácil y consistente de muestras de tejido durante la construcción y unnálisis de bloques de múltiples tejidos y TMA.

La capacidad de incrustar muestras de tejido de múltiples individuos en un solo bloque de parafina permite una fácil comparación lado a lado entre los tratamientos y los individuos, elimina la variabilidad entre las diapositivas, y reduce el costo y la carga de trabajo de seccionamiento y tinción de muestras. Estos bloques de múltiples tejidos se producen típicamente ya sea como microarrays de tejidos (TMA) o bloques de parafina que contienen tejido de varias personas en un diseño no-matriz. Mantenimiento de la identidad de la muestra es crítica para el éxito de cualquier análisis multi-tejido. Los investigadores han estado usando TMA desde su desarrollo para mejorar la eficiencia de análisis, reducir la variación entre las diapositivas, conservar los recursos valiosos del tejido, y reducir el tiempo y el costo de los experimentos 1. La orientación correcta de las TMA se puede lograr usando una variedad de métodos, incluyendo los espacios en blanco, filas o columnas entre núcleos de tejido 2-4, disposición asimétrica de los grupos principales 3, 5 (por ejemplo, control vs tratamiento), núcleos &quot;baliza&quot; 6, y núcleos de orientación designados situados fuera de la matriz TMA 3. Aunque estos métodos funcionan bien para TMA, la mayoría consumen valioso espacio central TMA y TMA con huecos y espacios como identificadores pueden llegar a ser confuso como núcleos de tejido se agotan con el tiempo. Además, estos métodos no son apropiados para su uso en bloques multi-tejido sin un formato de matriz porque se basan en anomalías en el patrón fuertemente ordenada de núcleos de microarrays uniformes como identificadores. La mayoría de los bloques no son de arrays de múltiples tejidos deben adaptarse a los tejidos no uniformes y, por definición, no mostrar la cuadrícula matriz estructurado que hace que estas aberraciones se destacan como puntos de referencia. Aunque hay muchas ventajas de utilizar una TMA, una de las desventajas más grandes es el pequeño tamaño de los núcleos que no siempre es representativa de tejido en gran medida heterogénea 1. Bloques multi-tejido no-dispuestas proporcionan muchos de tse beneficia de un TMA, pero contiene muestras de tejido más grandes u órganos enteros a partir de estudios con animales. Microarrays de tejidos utilizando núcleos individuales tienen diferentes concordancia con las secciones de tejidos enteros basados ​​en la proteína de interés y muchos requieren múltiples núcleos para una mayor concordancia 7-11. Debido a la complejidad y heterogeneidad de algunos fenotipos de biomarcadores, TMA utilizando incluso un gran número de núcleos (&gt; 10) todavía puede ser insuficiente y puede requerir métodos distintos de microarrays para el análisis de 8. Además, la construcción TMA es mucho tiempo, técnicamente exigente, y requiere que el costo inicial y la inversión en o acceso a una arrayer tejido. Bloques de múltiples tejidos no son de arrays se pueden hacer en cualquier laboratorio básico con mucho menos tiempo y esfuerzo y es una alternativa válida para los estudios que requieren más tejido que permiten matrices o como un medio para reducir los costos y simplificar el análisis. Bloques no son de arrays de múltiples tejidos de manera similar requieren un fiable oientation marcador para el seguimiento de identificación de la muestra, sin embargo, el desarrollo de estos marcadores ha sido limitado. Gran parte de la literatura que describe la orientación tejido se centra en la orientación fisiológica correcta para incrustar piezas de tejido individuales, tales como el tejido con el tatuaje de tinta 12, los tejidos en agar-gelatina pre-incrustación antes del procesamiento 13, y marcado ciertos tejidos con muescas 14 o suturas 15 . Aunque funcional, estos métodos no son ideales como marcadores en bloques multi-tejido debido a sus limitaciones. Una sutura se seccionó a través rápidamente y puede no ser visible en todas las secciones. Técnicas que utilizan agar-gelatina pueden mantener el tejido en la orientación correcta durante el procesamiento y la incrustación de Pre-incrustación, pero no proporciona una señal visual para diferenciar entre múltiples muestras en el bloque de parafina y se desliza. Las muescas o colorante en el tejido pueden complicar el análisis u ocluir importantes detalles morfológicos. Alternativamente, la identidad de tejidoen un bloque no vistió de múltiples tejidos se puede mantener a través de la incorporación de piezas de tejido en una disposición asimétrica, pero esto requiere de 3 o más piezas de tejido y puede no permitir la disposición óptima de los tejidos para su análisis. La Orientación Tag Espécimen (spot) se ha desarrollado como un método sencillo y de bajo costo para identificar claramente los tejidos en bloques de varios tejidos y ofrece muchas ventajas sobre los métodos de orientación existentes. El lugar es un pequeño colorido, núcleo, compuesto de hidroxietil gel de agarosa y procesamiento de tejidos de tinte marcado, y se infiltró con parafina (Figura 2C). El núcleo Punto está incrustado en el extremo próximo a un único tejido en un bloque de parafina de múltiples tejidos y aparece como un punto de colores brillantes en el bloque y en cada sección (Figura 1 A - D), lo que indica claramente la orientación correcta del bloque y secciones para la identificación de tejido fácil.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HistogelTM Specimen Processing Gel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td><a href="http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html">http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Marking Dye</td>
			<td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TMD-5</td>
			<td>Any tissue marking dye would most likely be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arraymold Kit A 2 mm (60 core)</td>
			<td>Arraymold</td>
			<td>20015A</td>
			<td>Any manual tissue arrayer would work similarly.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spot the correct tissue every time in multi-tissue blocks

Los bloques de parafina Multi-tejido proporcionan análisis de alto rendimiento con una mayor eficiencia, la uniformidad experimental, y reducción del tiempo y coste. Microarrays de tejidos constituyen la mayoría de los bloques de parafina de varios tejidos, pero cada vez más, los investigadores están utilizando bloques no son de arrays que contienen los tejidos más grandes de varios individuos que pueden proporcionar muchas de las ventajas de microarrays de tejidos sin una inversión sustancial en la planificación y el equipo. Un componente crítico de cualquier análisis de múltiples tejidos es el método de orientación utilizado para identificar cada tejido. Aunque existen métodos para mantener la orientación adecuada y la identificación de los tejidos en bloques de varios tejidos, la mayoría no son muy adecuados a los bloques no dispuestos, puede consumir el espacio valioso dentro de una matriz y / o son difíciles de producir en el laboratorio de histología normal. La Orientación Tag Espécimen (spot) es una herramienta simple, de bajo costo que la orientación es claramente visible en los bloques de parafina y todas las secciones de tejido FOr identificación de la muestra de confianza en diseños dispuestos y no dispuestos. El SPOT ofrece ventajas sobre los métodos de orientación existentes para bloques no dispuestos, ya que no requiere ninguna modificación directa al tejido y permite flexibilidad en la disposición de piezas de tejido.

El spot aparece como una ronda, punto de colores brillantes en el bloque de parafina (Figura 1A y 2D), en todas las secciones de parafina, y permanece en el portaobjetos de vidrio a través del procedimiento de tinción H &amp; E o IHC (Figuras 1B - 1D y 2D). Este obvias ayudas señal visual tanto la histotechnician e investigador en la identificación de cada pieza de tejido individuo y simplifica la comunicación como el histotechnician pueden utilizar esta señal visual para indicar la disposición de las piezas de tejido para el investigador recogida de datos de la diapositiva en el microscopio. El diagrama de orientación tejido debe ser incluido con las diapositivas proporcionada al investigador y se explica en detalle por lo que habrá ninguna confusión durante el análisis microscópico. La Figura 2A muestra los resultados de seccionar los tapones de gel de agarosa, de color solidificadas. La Figura 2B muestra el resultado de la incrustación el tapón de gel de agarosa seccionadas en un bloque de parafina. Figura 2C muestra los resultados del uso de un punzón dérmico para producir los núcleos SPOT. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52868/52868fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1: Punto núcleos se crean con facilidad y fácilmente visible en bloques de tejido y diapositivas manchas (A) son claramente visibles en el bloque integrado.. (B) Spots permiten una fácil orientación e identificación de tejidos para los bloques de múltiples tejidos que contienen tejidos que aparecen similares de diferentes grupos de individuos / tratamiento. (C) permiten manchas cada núcleo de un microarray de tejido a ser utilizado para muestras de tejido valiosas. (D) Vista de microscopio de SPOT adyacente a un núcleo TMA. Las flechas indican el lugar. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52868/52868fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> </p&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52868/52868fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2:. Preparación de núcleos SPOT bloques de agarosa (A) solidificado hidroxietilo se liberan de tubos Eppendorf y se cortan transversalmente en rodajas de 5 mm. (B) Múltiples rebanadas están integrados en un solo bloque de parafina y (C) un punzón dérmico se utiliza para eliminar las manchas de núcleos. (D) las manchas se incrustan en los márgenes de un microarray de tejido. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52868/52868fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

El propósito de la Orientación Tag Espécimen (spot) es funcionar como una herramienta de orientación para ayudar en la identificación de tejidos individuales en bloques de parafina de múltiples tejidos. Estos protocolos demuestran cómo se construye fácilmente de materiales histológicos comunes de bajo costo y sirve como marcador visual confiable en bloques de parafina y secciones.

Spot de Tejidos correcta cada vez que en los bloques de múltiples tejidos

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...

spot-the-correct-tissue-every-time-in-multi-tissue-blocks

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K vistas.  Frederick National Laboratory for Cancer Research.  El propósito de la Orientación Tag Espécimen (spot) es funcionar como una herramienta de orientación para ayudar en la identificación de tejidos individuales en bloques de parafina de múltiples tejidos. Estos protocolos demuestran cómo se construye fácilmente de materiales histológicos comunes de bajo costo y sirve como marcador visual confiable en bloques de parafina y secciones. 

Video: SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Co-sedimentación de ensayo, pues el análisis de proteína de unión a la F-actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Investigación

Biología

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

Implantación de la ingeniería tisular en el corazón de rata

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

La importancia de la concentración de la proteína correcta para la cinética y la determinación de afinidad en el análisis de la estructura-función

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

La cuantificación de γH2AX focos en muestras de tejido

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Un sistema para el cultivo de células epiteliales del pigmento del iris para el Estudio de Regeneración del objetivo de Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Time-lapse microscopía de embriogénesis temprana en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for vision. In the human a single LG resides in the orbit above the lateral end of each eye delivering tears to the ocular surface through 3 - 5 ducts. The mouse has three pairs of major ocular glands, the most studied of which is the exorbital lacrimal gland (LG) located anterior and ventral to the ear. Similar to other glandular organs, the LG develops through the process of epithelial branching morphogenesis in which a single epithelial bud within a condensed mesenchyme undergoes multiple rounds of bud and duct formation to form an intricate interconnected network of secretory acini and ducts. This elaborate process has been well documented in many other epithelial organs such as the pancreas and salivary gland. However, the LG has been much less explored and the mechanisms controlling morphogenesis are poorly understood. We suspect that this under-representation as a model system is a consequence of the difficulties associated with finding, dissecting and culturing the LG. Thus, here we describe dissection techniques for harvesting embryonic and post-natal LG and methods for ex vivo culture of the tissue.

The lacrimal gland (LG) is a branching organ that produces the aqueous components of tears necessary for maintaining vision and ocular health. Here we describe murine LG dissection and ex vivo culture techniques to decipher signaling pathways involved in LG development.

La manipulación de la murino Glándula Lagrimal

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays crucial roles in cell development and many diseases. Approximately 5,000 lysine methylation sites were identified on different proteins, which are set by few dozens of protein lysine methyltransferases. This suggests that each PKMT methylates multiple proteins, however till now only one or two substrates have been identified for several of these enzymes. To approach this problem, we have introduced peptide array based substrate specificity analyses of PKMTs. Peptide arrays are powerful tools to characterize the specificity of PKMTs because methylation of several substrates with different sequences can be tested on one array. We synthesized peptide arrays on cellulose membrane using an Intavis SPOT synthesizer and analyzed the specificity of various PKMTs. Based on the results, for several of these enzymes, novel substrates could be identified. For example, for NSD1 by employing peptide arrays, we showed that it methylates K44 of H4 instead of the reported H4K20 and in addition H1.5K168 is the highly preferred substrate over the previously known H3K36. Hence, peptide arrays are powerful tools to biochemically characterize the PKMTs.

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Análisis de la especificidad de la proteína lisina metiltransferasas Usando SPOT Péptido Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

-Alta resolución de imagen de lapso de tiempo y análisis automatizado de los microtúbulos en la dinámica de estar umbilical humana Las células endoteliales de vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

La disección de la Auditivo Bulla en ratones postnatales: Aislamiento de los huesos del oído medio y el análisis histológico

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...