この作品は、NIHの助成金1R21NS064412、NSFの助成金1052048とJeffressメモリアル·トラスト助成金、J-908でサポートされていました。

1。サンプルの調製注：多くの場合、灌流実験はイライラ問題になることができ、細胞の大部分を、洗い流す。ポリ-L-リジンを有する全ての細胞株、被覆カバーガラス表面のために（表面への0.01％溶液の1.0 ml/25 cm 2の投稿必要はないが、細胞培養グレードの水で2回洗浄し、&gt; 5分間インキュベートし、乾燥生物学的安全キャビネット）は、細胞接着を増強する。また、使用される細胞株のバイオセーフティレベル（BSL）を認識して、地域の環境、安全衛生事務所によって承認標準作業手順に従ってください。この実験では、COS7細胞（ 図4参照）が低いため、内因性グルタミン輸送活性を用いた。 <ol><li>ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中で70〜80％コンフルエント+ 10％宇宙胎児血清および100 U / mlペニシリン/ストレプトマイシン、いずれか6ウェル培養中に入れ、無菌25mmのガラスカバースリップ上に〜をシードCOS7細胞皿または8ウェルガラス底スライドする。 37°C、5％CO 2、24時間、100％湿度でインキュベートする。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って、DMEM +10％宇宙胎児血清（抗生物質なし）に成長培地を交換する。湿度100％で37℃、5％CO 2でO / Nを成長させる。 </li><li> （CMVプロモーター10の下FLIPQTV3.0センサーを運ぶのpcDNA3.1）グルタミンセンサーと10〜50ミリリットルの無血清培地（OPTI-MEM）mCherryタグ付きASCT2をコードする0.4 mgのプラスミドDNAのそれぞれを追加し、穏やかに混合する。 </li><li> 50ミリリットルの無血清培地へのトランスフェクション試薬の1ミリリットルを追加します。室温で5分間インキュベートする。 </li><li> DNA（ステップ1.3）およびトランスフェクション試薬（工程1.4）を含む二つの溶液を混合し、20分間インキュベートする。 </li><li>静かに、細胞の上にトランスフェクション試薬を追加し、チャンバーロッキングにより穏やかに混合します。 37°C、5％CO 2、湿度100％で24時間インキュベートする。 </li><li> 24時間後、DMEM +10 10パーセントコズミック胎児血清にメディアを交換する（CCS）ペニシリン/ストレプトマイシン+ 100単位。 </li><li>細胞は、48〜72時間後にトランスフェクションをイメージしている。 </li></ol> 2。灌流実験注：この実験で使用したCOS7細胞は、灌流媒体およびRTチャンバは、周囲CO 2濃度に維持した。使用される細胞は生存のために、より高い温度およびCO 2濃度の制御を必要とする場合は、加熱した顕微鏡ステージおよび/ ​​または環境チャンバを使用すべきである。 <ol><li>灌流液のAF（材料のリストを参照してください）​​を準備します。灌流液でそれらを埋めるし、ストップコックを閉じ、50ミリリットルの注射器にコックを取り付けます。バッファーでストップコック内のヘッドスペースを埋めるために短時間のストップコックを開きます。 </li><li>灌流鉛筆で8チャンネル、重力送り灌流システムの電源を入れ、[選択]機能オプションの下に「マニュアルモード」を選択します。灌流鉛筆の下に廃棄用容器を置きます。 </li><li>手動で対応する番号を押して、ポートをアクティブにして、水を入れた10ミリリットルの注射器を使用してチューブを埋め、その後、ポートを閉じる。ポートが水で満たされると、灌流システムのポート1-6にバッファAFを含有する注射器を設定し、コックを開きます。バッファを備えたチューブ内の水を交換し、再びポートを開く。流量は約0.8ミリリットル/分である必要があります。 </li><li>を押して戻って「選択機能」メニューに移動し、灌流コントローラを一度解除してください。 表1に示した灌流プロトコルで入力し、 &quot;編集プログラム」のオプションに切り替えます。灌流プログラムを保存します。 </li><li>インキュベーターから細胞を取る。灌流緩衝液で2回洗い、その後、ステージ上のセルを設定します。チャンバーに灌​​流システムを接続します。開放室を使用する場合は、チャンバーからの灌流液を除去し、別のポンプを設置した。 </li><li> Slidebookソフトウェアを起動します。新しいスライドを開始します。 注意：次の手順は、Slidebookソフトウェアに固有であるが、MetaFluor及びニシュ-要素のような他のソフトウェアはまた、ここに記載の撮像のタイプのために使用することができる。理論的実験は、時間経過イメージングを可能にする任意のソフトウェアを用いて行うことができ、画像シーケンスは、ImageJの（http://rsbweb.nih.gov/ij/）又はフィジーなどのソフトウェアを使用してポスト実験的に分析することができる（http:/ / fiji.sc /フィジー）。しかしながら、アクセプター/ドナー比率のリアルタイムモニタリングを可能にするソフトウェアは非常に有用である。 </li><li>蛍光顕微鏡のステージ上にスライドをマウントします。適切なフィルターセットを用いたセンサとASCT-mCherryを共発現する細胞を見つける「フォーカス」機能の下で（材料のリストを参照してください）​​。 「カメラ」タブをクリックし、「利得」の下のスライドバーをスライドさせてゲインを調整します。また、減光フィルタのドロップダウンメニューから減光フィルタの設定を調整します。注：フィルターキューブが目のフィルタが含まれていない場合は、ショアから接眼レンズを使用しないでくださいT-波長の励起光は、目に有害である。代わりに、細胞を見つけるために、コンピュータの画面を使用します。 </li><li>細胞の画像を取得with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels （フィルタは材料のリストで指定されています）。 「イメージキャプチャ」をクリックし、[取得]ウィンドウで、使用する予定のフィルタを指定。次のフィルタ設定にあるボックスに所望の露光時間を入力することで、露光時間を調整するために「TEST」ボタンをクリックしてください。注：すべての3つのチャネルが同じ長さのために露出される必要がある。撮像パラメータを調整するとき、予想されるFRET効率の変化を取ると考慮倍増加：FRET効率は、実験中に2倍に上がることが予想される場合など、撮影パラメータを調整すべきであるように、休止状態でのドナー· アクセプターエクスビボ実施の強度は、&lt;チャネルが実験中に飽和しないように、機器によって記録することができる最大値の50％であるべきである。標識された細胞からのシグナルは、バックグラウンド領域におけるよりも少なくとも3倍高くなければならない。 </li><li>ソフトウェアにおける領域ツールを使用して関心領域を描画します。あるいは、特定の強度の上方に画素を選択するためのソフトウェア機能を使用して、[領域に変換することができる。これを行うには、マスクをクリックします - セグメントは、所望の領域を強調表示するスライドバーを移動します。 </li><li>キャプチャの種類]ボックスで「時間の経過」を選択して、実験のための間隔（本実験では10秒）の時点を指定します。 </li><li>任意の蛍光細胞なしエリア内の領域を描画します。この領域は、バックグラウンド減算のために使用される。右描かれた領域をクリックして、背景として設定します。注：ある理想的には、細胞をセンサーを発現tは自家蛍光かつカメラによって検出された背景蛍光の両方を考慮して、背景領域として使用されるべきである。そのような細胞は、視野内に使用できない場合、細胞を含まない領域は、少なくともバックグラウンド蛍光を説明するために使用されるべきである。 </li><li>オプション - &quot;を実行したプログラム機能を選択」の下で目的のプログラムを選択します。保存されたプログラム（ステップ2.3を参照）に切り替え、その後、灌流コントローラ上でエンターキーを押します。今すぐプログラムがロードされ、いずれかのキーを打つと、灌流を開始します。 </li><li>灌流コントローラのキーを押すと同時にキャプチャウィンドウで「スタート」ボタンをクリックすることで、同時に灌流およびイメージング実験開始を確認してください。 注意：これは、溶液が（これは買収タブ内にある「注意」機能を使用して行うことができます）交換された時点を記録することをお勧めします。 </li><li>同じ灌流プロトコルUSIを行う実験条件の下で、飽和または非連結のどちらかであることが期待されているセンサーを発現する細胞をngの。 注：ここでは、実験条件の下で飽和するFLIPQTV3.0_1.5μは、制御は図6のように使用されるような制御実験は、FRET効率の変化ではなく、基板の実際の変化によるものであるとことを確認する必要がある。セルラpHなどの他のパラメータの変化による。 </li></ol> 3。ポスト実験解析<ol><li>サンプルドリフトが実験中に発生したかどうか調べます。画像ウィンドウの上部にあるスライドバーを移動し、細胞は、実験の後半で撮影した画像にROIの外に落ちるかどうかを確認して、関心領域（ROI）は時点0で撮影された画像のS描画します。 </li><li>はい、マスクを選択することで、セルの周囲にマスクを作成、最初でドリフトを補正するためにトラッキング機能を使用する場合 - セグメントを、その後HIGにカットオフを指定する行をスライド細胞を含有する領域をhlight。粒子追跡 - - 基本粒子追跡マスクをクリックして領域を追跡します。 </li><li>必要なときにROIを再描画し、背景領域。 </li><li>実験の過程でのROIの平均強度をエクスポートします。エクスポート - - レシオ/タイムラプスデータ統計をクリックします。 </li><li>基質濃度のFRET効率および定量化を必要としない場合は、基板のダイナミクスのプロキシとして強度比（ ドナー· アクセプター元全角 /ドナー生体ドナー全角 ）の経時変化をプロットする。 、細胞質ゾル濃度を測定最大（それぞれの基板の飽和および不存在下で、すなわち 、）最小比率変更、Δrの最大を計算するには-をΔr 分 、次式Δratio（ΔR）の非線形回帰によって： ΔR= [S] /（ のK D + [S]）×（ΔR <suB&gt;マックス- Δrの分 ）+ΔR 分 ここで、[S]細胞質ゾル中の基質濃度である。 Δrはマックスを使用した-得Δrの最小値が、与えられた量Δrにおけるセンサの彩度（S）は次のように計算されます S =（ΔR - Δrの分 ）/（ΔR マックス - Δrの分 ） Sは、さらに、以下の式を用いて基質濃度[S]に変換することができる。 S = [S] /（ のK D + [S]） 注意： アクセプタEXアクセプターEMチャネルの強度も、実験条件は、直接アクセプターの蛍光に影響を与えたかどうかを調べるためにプロットされるべきである。 </li><li>時による光退色ベースラインドリフトは、ベースライン補正を行い、観察される。これを行うには、時間をかけて（ 図5A）をドナーとアクセプターの強度をプロットします。そして、目に使用する時点を特定するEベースライン、灌流システムでの遅延と、特定のセル（ 図5B）の輸送活性に応じた。 </li><li>最高のベースラインを記述する多項式フィッティングを計算します。その後、ベースライン（ 図5C）に各時点からの生強度を正規化する。正規化されたドナーとアクセプターの強度から強度比（ ドナーEX·アクセプター·EM、/ドナーEXドナーEM）を計算します。 </li></ol>

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開示することは何もありません。

イメージング実験の成功は、いくつかの重要な要因に依存します。これらの要因の一つは、上述したように、使用されるセンサの親和性である。関心対象の細胞内区画中の基質の絶対濃度は、しかしながら、多くの場合不明である。そこで我々は、目的の実験条件の下で最適なものを見つけるために千鳥親和性を有する複数のセンサを試してみることをお勧め。例えば、我々の場合、我々は1.5μとグルタミンセンサーをCOS7細胞をトランスフェクションし、100μ、2メートル、8メートルとします（ 図3、データは示していない）。 別の重要な要因は、センサータンパク質の発現レベルである。短命のイベント（ 例えば、単一活動電位）より高い発現レベルが必要になる可能性が19観察する必要がある場合、検出に必要な発現レベルは、例えば、実験の間で変化する。したがって、ほとんどの場合、必要​​とされるレベルはempiricallする必要があるYが決定。標的が細胞内で非常に低濃度で存在する場合は、空乏を標的とする内因性のプロセスの摂動が問題になることができる20。そのような可能性を評価するための独立したアッセイが、利用可能な場合、が望ましい。この資料に示された実験において、CMVプロモーターによって駆動されるタンパク質発現は十分であることが見出された。非常に弱い活性を有するプロモーターを使用する必要がある状況では、シグナル強度を増加させるための調整が必要になるかもしれない。例えば、露光時の信号強度および光退色の間の妥協点に到達する必要がある。長い露光時間に加えて、このようなフルオロフォアの明るさなどの要因には、センサ、ビニング、及びCCDカメラの感度の最大強度変化は、信号強度を増強するために変更することができる。 上記の2つの基準がしそうであっても、まだ比の変化は、実験条件下で観察されない場合に満たされ、それは所与の代謝産物又はイオンに対する細胞ホメオスタシスは（結果の項を参照）輸送活性をマスクするのに十分な強度であることが可能である。このような場合には、異なる生化学的活性を有する細胞株は、トランスポーター活性10,21を検出するためのバックグラウンドとして必要になる場合があります。 これらのセンサは、1抽出に基づく方法よりもはるかに高い時空間分解能での基質濃度の動態を監視することができますが、絶対濃度の​​測定は、さらなる実験工程および考慮事項が必要です。通常、基質濃度は、細胞内で発現するとき、通常、精製されたセンサータンパク質を滴定することにより算出センサーの親和性は、変化しないと仮定して計算される。濃度は、次の単一の結合等温線を使用して計算され、 [S] = K d は X（R - R 分 ）/（R &lt;/ em&gt;のマックス - R） [S]は、K d は 、インビトロで決定された解離定数であり、基質濃度であり、rは所与の時点で観察されたアクセプター/ドナー比であり、センサはアポ形態である場合minはアクセプター/ドナー比であるrは、rは最大すべてのセンサが基板に結合されるアクセプター/ドナー比である。R 最小およびr maxは 、そのようなセンサの濃度などのパラメータによって影響撮像設定が使用および細胞milleuの組成、従ってその場で測定される必要がある細胞内基質濃度の変更が必要となる可能にするr個の 最小及びr max 値は、実験条件を決定すること。例えば、選択的イオノフォア22や、ジ穿孔試薬（ 例えば、Ca 2 +のイオノマイシン）gitonin 23は、外部濃度の細胞内基質濃度を平衡化するために使用することができる。 このプロトコルで実証実験の種類が制限の1つは、低スループットであり;分析では、細胞の比較的小さい（&lt;10）数1の代謝産物の解析に限られている。技術の進歩は、このような限界を克服するために、しかし、行われている。例えば、自動化され、高含有量のスクリーニングの進歩と、それは小分子またはRNAiライブラリーと組み合わせて遺伝的にコードされたセンサを使用することが可能になりました。バイオセンサーを発現する細胞は、高スループットフォーマット（ 例えば、96 -または384 -ウェル）中で増殖することができ、次いで個々のウェルは、siRNAまたは化学物質のいずれかで処理し画像化することができる。このような実験は、バイオセンサ24,25によって観察することができる生物学的プロセスを破壊するsiRNA構築物または化学物質の同定を可能にする。別の刺激的な最近の進歩もの含めるデ細胞レベル26でFRET効率の変化のハイスループット検出を可能にするサイトメーター時間分解マイクロ流体流の開発。このような技術的進歩は、生物学的プロセスで新薬候補の発見や新しいコンポーネントを支援します。

により細胞レベルでのトランスクリプトームやプロテオームの検査を可能にする技術の目覚しい進歩により、現在では、生化学および代謝物とイオンの結果としてフラックスは非常に細胞型特異的であることが明らかになってきた。例えば、哺乳動物の肝臓において、シーケンシャルグルタミン分解及び合成は、後者1-3で過剰のアンモニアを消費しながら、前者の細胞型において尿素サイクルにアンモニアを供給し、それぞれ門脈周囲細胞および静脈周囲の細胞によって同時に行われる。いくつかの場合において、重要な生化学的異質性は、単一の「細胞型」4,5で検出される。このような空間的な特異性に加えて、代謝産物およびイオンの細胞レベル（ 例えば、例えばCa 2 +および環状ヌクレオチドなどのシグナル伝達分子）は非常に動的である。代謝産物およびイオンの時空間パターンは、多くの場合、シグナル伝達に重要な役割を果たす。 M代謝物やイオンの細胞動態をonitoringしかし、ユニークな課題をもたらす。多くの場合、濃度の変化は、迅速かつ一過性の、例えば、樹状突起棘6〜20ミリ秒以内に減衰のCa 2 +のようなシグナル伝達分子の場合が例示される。さらに、細胞内および間の生化学的経路の区画化が困難抽出およびカラムクロマトグラフィー/質量分析技術を用いて代謝産物およびイオンのダイナミクスを定量化することができる。 生物学的分子のための遺伝的にコードされたセンサーは、現在広くにより実験者が（7、8に概説されている）短命および/ ​​または区画化された分子動力学を研究することを可能にする、高時空間解像度に使用されている。これらの遺伝的にコードされたセンサーは、大きく2つのカテゴリに分けることができ;強度ベースのセンサとratiometicセンサー。強度ベースのセンサは、通常、結合ドメインやインフルエンザで構成されてorescentタンパク質（FPS）、および結合ドメインに結合する溶質は、蛍光強度が変化します。 Ratiometicセンサは、一方で、多くの場合、FRETペアとして機能する2つのFPとの間のフォスター共鳴エネルギー移動（FRET）を利用する。これらのセンサは、結合ドメイン二つのFPからなり、溶質の結合は、2つのFPとの間のFRET効率の変化を誘導する。生物学的に重要な代謝産物およびイオンのための多数のセンサは、過去10年間8,9開発されている。 そのような遺伝的にコードされたセンサによって提供される刺激的な可能性の一つは、以前に、細胞レベルで検出することは容易ではなかった膜輸送プロセスの高分解能分析におけるそれらの使用である。遺伝的にコードされたセンサは、基質特異性およびpH依存10,11等の搬送機構の分析を容易にする。また、遺伝的RESとの組み合わせでRNAiのライブラリがモデル生物のために構築ourcesこのように、それは遺伝的にコードされたセンサーを用いた新規輸送プロセスのためのゲノムワイドな検索を行うことができるようになりました。実際、複数のケースで以前に特徴づけられていない輸送体の発見に遺伝的にコード化されたセンサリードの使用12、13。 最近、私たちの研究室では、グルタミンのためのFRETに基づくセンサーのシリーズを開発しました。我々は、細胞のグルタミンレベルが例えばFRETグルタミンセンサ10を用いて可視化することができることを実証した。これらのセンサは、glnHのC末端（ 図1）での細菌グルタミン結合タンパク質glnHに挿入されたFRETドナー（mTFP1）、およびFRETアクセプター（ヴィーナス）から構成されています。これらのセンサのFRET効率は、アクセプター/ドナー強度比の減少をもたらす、グルタミンの結合時に減少する。グルタミン輸送プロセスの微調整は、例えばneurotransmなどの生物学的プロセスにおいて重要であるission 14,15および肝臓1、16、17における尿素サイクルの維持。 ここでは、広視野蛍光顕微鏡セットアップを使用して、グルタミンFRETセンサーを輸送活性を分析する方法論を示す。ここに示された実験の目的は、単一の細胞においてトランスポーター活性を検出し、一過性に発現トランスポーターの基質特異性を検討することである。

<table><tbody><tr><td>Inverted fluorescent microscope</td><td>Olympus</td><td>IX81F-3-5</td><td>An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also be appropriate.</td></tr><tr><td>Excitation filter (mTFP1)</td><td>Omega Optical</td><td>3RD450-460</td><td>Band width 450-460 nm</td></tr><tr><td>Excitation filter (Venus)</td><td>Chroma</td><td>ET500/20</td><td>Band width 490-510 nm</td></tr><tr><td>Emission filter (mTFP1)</td><td>Chroma</td><td>HQ495/30m</td><td>Band width 475-505 nm</td></tr><tr><td>Emission filter (Venus)</td><td>Chroma</td><td>ET535/30m</td><td>Band width 520-550 nm</td></tr><tr><td>Dichroic mirror (FRET channels)</td><td>Chroma</td><td>470dcxr</td><td>Long pass, 470 nm cut off</td></tr><tr><td>Dichroic mirror (YFP channel)</td><td>Chroma</td><td>89002bs</td><td>Passes 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm</td></tr><tr><td>mCherry filter set</td><td>Chroma</td><td>49008</td><td>Excitation 540-580 nm, long pass dichroic with 585 nm cut off, emission filter 595-695 nm</td></tr><tr><td>Light source</td><td>Olympus</td><td>U-LH100L-3-5</td><td>LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Qimaging</td><td>Rolera-MGi EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>Apochromatic fluorescence objective</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusion system, ValveBank II</td><td>AutoMate Scientific</td><td>[01-08]</td><td>Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work</td></tr><tr><td>Laminar-flow chambers</td><td>C&amp;amp;L Instruments</td><td>VC-MPC-TW</td><td>Other larminar-flow chambers would also work.</td></tr><tr><td>Chambered slide</td><td>Lab-Tek</td><td>154534</td><td>For open-chamber experiments</td></tr><tr><td>Perfusion pump</td><td>Thermo Scientific</td><td>74-046-12131</td><td>For open-chamber experiments</td></tr><tr><td>Software supporting ratiometric measurements</td><td>Intellegenent Imaging Innovation</td><td>Slidebook 5.5</td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow biosafety cabinet</td><td>ESCO</td><td>LA-3A2</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp CO&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-255-25</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s MEM (DMEM)</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Cosmic calf serum</td><td>Hyclone</td><td>SH3008703</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I)</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td>Used with Lipofectamine 2000</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine solution</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>25 mm circular glass cover slips</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-545-102</td><td>In case VC-MPC-TW is used</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td>Other transfection reagents can also be used.</td></tr><tr><td>Solution A (Hank&#039;s buffer)</td><td></td><td></td><td>9.7 g HANK salt (Sigma H1387), 0.35 g NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 5.96 g HEPES to 1 L, pH adjusted to 7.35 with NaOH</td></tr><tr><td>Solution B</td><td></td><td></td><td>Solution A + 0.04 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution C</td><td></td><td></td><td>Solution A + 0.2 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution D</td><td></td><td></td><td>Solution A + 1 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution E</td><td></td><td></td><td>Solution A + 5 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution F</td><td></td><td></td><td>Solution A + 5 mM Ala</td></tr></tbody></table>

glutamine flux imaging using genetically encoded sensors

遺伝的にコードされたセンサーは、細胞下解像度での生体分子のリアルタイムモニタリングを可能にする。生物学的分子のためのようなセンサの驚異的な様々な多くの研究室で日常的に使用される不可欠なツールとなったそのうちのいくつかは、過去15年で利用可能となりました。 遺伝的にコードされたセンサの刺激的な用途の一つは、細胞輸送プロセスを調査において、これらのセンサの使用である。そのような動態および基質特異性などの輸送体の特性は、輸送活性の細胞型特異的な分析の可能性を提供し、細胞レベルで調べることができる。この記事では、トランスポーターのダイナミクスは、一例として、遺伝的にコードされグルタミンセンサーを使用して観察することができる方法を紹介します。実験後の分析のための実験計画、実験的な設定の技術的な詳細、および考慮事項が議論される。

典型的な時間経過実験を、図2に示されている。これらの実験では、8 mMの（FLIPQTV3.0_8m、 図2Aおよび2B）および100μM（FlipQTV3.0_100μC及びD）の親和性グルタミンセンサーFRETと共発現させたCOS7細胞10における必須のアミノ酸交換ASCT2 18。グルタミンの流入は、ドナー（mTFP1）およびアクセプター（金星）（ 図2Aおよび2C）との間の蛍光強度比の変化として検出される。別の基板（ALA）の存在下でのグルタミンの流出も明らかに、これらの実験で実証されている。両方のセンサが、正規化された蛍光強度を観察比の変化は確かに起因トンであることを示唆している基質の存在下で（アクセプター強度は、ダウン図2B及び2Dに行くほど、すなわち、ドナー強度が上がる）往復変更FRET効率の変化O。これらの実験は、これらの細胞中のグルタミン濃度は、実験条件の下で非常にダイナミックに変動することを示している; 100μMセンサの検出範囲から8mMのセンサのための近飽和濃度。 トランスポーターの基質特異性はまた、これらの実験では、細胞は、グルタミンを予めロードした。 図3に示されているセンサを用いて検査することができ、その後、様々なアミノ酸は、それらのアミノ酸がグルタミン流出を誘導し得るかどうかを調べるために、細胞外潅流液に添加した。予想通り、ASCT2基板位（Ala、Serであり、システイン、スレオニン、D-セリン）誘導性グルタミン流出（ 図3A）、非基質アミノ酸（Proは、彼の、リジン）がなかったのに対して（ 図3B）で裏付けこれまでの研究18。通常、基質特異性は、競合する基質と混合する無線同位体で標識された基質を用いた競合アッセイによって測定される、かなり面倒であり、均一に検討されるトランスポーターを発現している細胞の集団を必要とする。ここで例示する光イメージングは​​、別のアプローチを提供しています。 何FRET効率の変化は基質の添加時に観察されていない場合、いくつかの理由が考えられる。一つの可能​​な理由は、テストされている基板および/または細胞内濃度を維持する酵素の高い活性のための低吸収能である。例えば、グルタミン濃度変化は、この細胞株は、明らかに主窒素源（ 図4）にそのグルタミン培地中で成長することができるにもかかわらず、試験した条件下でASCT2トランスポーターを発現しないCOS7細胞中で最小であった。センサーの親和性は細胞内濃度に比べて高すぎたり低すぎいずれかである場合に加えて、センサータンパク質の大部分は、それぞれ、構成的に、結合または非結合のままであろう。したがって何のFRET効率変化は、Dませんetected。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig1highres.jpg" width="500" /> FRETグルタミンセンサーの図1。の構成。（A）オープン（シアン）、glnH、 大腸菌からのグルタミン結合タンパク質（黄色）コンホメーションを閉じた。 mTFP1が挿入された位置は、マゼンタにマークされている。FLIPQTV_3.0センサ（B）の概略図。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig2highres.jpg" width="500" /> 図2。FLIPQ-TV3.0_8mと100μセンサーを用いたin vivoグルタミン測定。 （A）COS7細胞を同時発現FLIPQ-TV3.0_8mセンサとASCT2-mCherryのvenus/mTFP1比。 mCherryタグは、輸送体を発現する細胞を同定するために使用されたER mTFP1や金星放出チャネルを干渉することなく。細胞はHEPES緩衝ハンクス緩衝液（pH 7.35）で灌流した。細胞外グルタミン（赤）とアラニン（青）の灌流培地に添加した時点を、グラフの上のボックスとして示されている。実線と破線は、同じ実験で測定された2つの個々のセルを表す。（B）ドナー（mTFP1）及び（A）に示す実験においてアクセプター（金星）チャネルの強度。値は、（C）ベースラインに正規化し、光退色に対して補正及び（D）（A）と同様の実験及び（B）、FLIPQ-TV3.0_100μセンサを発現するCOS7細胞を用いて行った。 （10から変更図）。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig3highres.jpg" width="500" /> 図3。携帯グルタミンTの排除外部アミノ酸の存在下でASCT2トランスポーターhrough、FLIPQ-TV3.0_8mセンサーを用いて可視化。 （A）細胞質のグルタミンは、細胞外のAla、Serで、システイン、スレオニン、およびD-セリンを添加することによってエクスポートされます。プロ、リジン、彼（ブラックボックス）の細胞外グルタミン（赤箱）、または他のアミノ酸（青箱）は、灌流培地に添加された時点でグラフの上のボックスとして示されている。（B）の添加は、細胞質ゾルグルタミン濃度を変化させない、アラ（青箱）の追加は、グルタミンの輸出を促進するのに対し。実線および破線は、同じ実験で測定された2つの個々のセルを表す。すべてのアミノ酸は、5 mMの外部濃度で添加した。 （図は、もともと10年に出版された）。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig4highres.jpg" width="500" /> 図4。COS7細胞のvenus/mTFP1比EFLIPQ-TV3.0_8mセンサ（A）と100μセンサー（B）をxpressing。細胞はHEPES緩衝ハンクス緩衝液で灌流した。細胞外グルタミン（5 mmの）灌流培地に添加した時点は、グラフの上に赤いボックスで示されている。実線および破線は、同じ実験で測定された2つの個々のセルを表す。 <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig5highres.jpg" width="500" /> 図5光退色のための修正。（A）は、図2Aおよび2Cに示される二つのセルからの生強度（B）のベースラインを計算するために選択したデータポイント。多項式フィッティング曲線を図に示します。Bに、この図に使用されるデータセットを計算し、ベースラインに対して標準化（C）（a）に示すチャネルの強度は、IDEである図2Aおよび2Cに示すものとntical。 <img alt="図6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig6highres.jpg" width="500" /> 図6。FLIPQ-TV3.0_1.5mセンサーを用いたin vivoグルタミン測定。（A）COS7細胞のvenus/mTFP1比はFLIPQ-TV3.0_1.5mセンサとASCT2-mCherryを共発現。 mCherryタグは、mTFP1又はビーナス放出チャネルを干渉することなく、トランスポーターを発現する細胞を同定するために使用した。細胞はHEPES緩衝ハンクス緩衝液（pH 7.35）で灌流した。細胞外グルタミン（赤）とアラニン（青）の灌流培地に添加した時点を、グラフの上のボックスとして示されている。実線および破線は、同じ実験で測定された2つの個々のセルを表す。（B）ドナーの強度（mTFP1）およびアクセプター（金星）チャネル実験では（A）に示す。値は、ベースラインに退色し、正規化のために補正した。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="474"><tbody><tr><td>時間（分） </td><td>溶液A </td><td> B液</td><td>溶液C </td><td>溶液D </td><td> E液</td><td>溶液F </td></tr><tr><td> 0 </td><td>のバルブ</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td>開閉弁</td><td>のバルブ</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td>のバルブ</td><td>開閉弁</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td>開閉弁</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>のバルブ</td></tr><tr><td> 8 </td><td>のバルブ</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>開閉弁</td></tr&gt; <tr><td> 10 </td><td>開閉弁</td><td></td><td>のバルブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td>のバルブ</td><td></td><td>開閉弁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 14 </td><td>開閉弁</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>のバルブ</td></tr><tr><td> 16 </td><td>のバルブ</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>開閉弁</td></tr><tr><td> 18 </td><td>開閉弁</td><td></td><td></td><td>のバルブ</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 20 </td><td>のバルブ</td><td></td><td></td><td>開閉弁</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 22 </td><td>開閉弁</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>のバルブ</td></tr><tr><td> 24 </td><td>のバルブ</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>開閉弁</td></tr&gt; <tr><td> 26 </td><td>開閉弁</td><td></td><td></td><td></td><td>のバルブ</td><td></td></tr><tr><td> 28 </td><td>のバルブ</td><td></td><td></td><td></td><td>開閉弁</td><td></td></tr><tr><td> 30 </td><td>開閉弁</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>のバルブ</td></tr><tr><td> 32 </td><td>のバルブ</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>開閉弁</td></tr><tr><td> 34 </td><td>開閉弁</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 表1本実験で用いた灌流プロトコルの例A液：9.7グラムのハンク塩（H1387）、0.35グラムのNaHCO 3、5.96グラムのHEPES NaOHで7.35に調整した1リットルpHに溶液B：溶液A + 0.04 mMのGLN 溶液C：溶液A + 0.2 mMのグルタミンsolutをイオンD：A液+ 1 mMのグルタミン溶液E：溶液A + 5 mMのグルタミン溶液F：溶液A + 5 mMのアラバマ

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Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

この記事では、FRETを使用して、生細胞内のグルタミンダイナミクスを監視する方法を紹介します。遺伝的にコードされたセンサーは、細胞下解像度での生体分子のリアルタイムモニタリングを可能にする。実験後の分析のための実験計画、実験的な設定の技術的な詳細、および考慮事項が遺伝的にコードされたグルタミンセンサに議論される。

遺伝的にコードされたセンサを用いたグルタミンフラックスイメージング

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

glutamine-flux-imaging-using-genetically-encoded-sensors

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.5K ビュー.  Virginia Tech. この記事では、FRETを使用して、生細胞内のグルタミンダイナミクスを監視する方法を紹介します。遺伝的にコードされたセンサーは、細胞下解像度での生体分子のリアルタイムモニタリングを可能にする。実験後の分析のための実験計画、実験的な設定の技術的な詳細、および考慮事項が遺伝的にコードされたグルタミンセンサに議論される。 

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Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including destruction of the sample, introduction of potential artifacts, and a lack of specificity for the reactive species involved. Thus, there is a current need in the field of toxicology for non-destructive, sensitive, and specific methods that can be used to observe and quantify intracellular redox perturbations, more commonly referred to as oxidative stress. Here, we present a method for the use of two genetically-encoded fluorogenic sensors, roGFP2 and HyPer, to be used in live-cell imaging studies to observe xenobiotic-induced oxidative responses. roGFP2 equilibrates with the glutathione redox potential (EGSH), while HyPer directly detects hydrogen peroxide (H2O2). Both sensors can be expressed into various cell types via transfection or transduction, and can be targeted to specific cellular compartments. Most importantly, live-cell microscopy using these sensors offers high spatial and temporal resolution that is not possible using conventional methods. Changes in the fluorescence intensity monitored at 510 nm serves as the readout for both genetically-encoded fluorogenic sensors when sequentially excited by 404 nm and 488 nm light. This property makes both sensors ratiometric, eliminating common microscopy artifacts and correcting for differences in sensor expression between cells. This methodology can be applied across a variety of fluorometric platforms capable of exciting and collecting emissions at the prescribed wavelengths, making it suitable for use with confocal imaging systems, conventional wide-field microscopy, and plate readers. Both genetically-encoded fluorogenic sensors have been used in a variety of cell types and toxicological studies to monitor cellular EGSH and H2O2 generation in real-time. Outlined here is a standardized method that is widely adaptable across cell types and fluorometric platforms for the application of roGFP2 and HyPer in live-cell toxicological assessments of oxidative stress.

This manuscript describes the use of genetically-encoded fluorogenic reporters in an application of live-cell imaging for the examination of xenobiotic-induced oxidative stress. This experimental approach offers unparalleled spatiotemporal resolution, sensitivity, and specificity while avoiding many of the shortcomings of conventional methods used for the detection of toxicological oxidative stress.

遺伝子にコードされた蛍光センサーを用いた毒性酸化ストレスの評価へのアプローチをイメージング

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

がん研究

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

FIBS対応の非侵襲メタボリック·プロファイリング

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

生物工学

Visualizing Cellular Gibberellin Levels Using the nlsGPS1 F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor

The phytohormone gibberellin (GA) is a small, mobile signaling molecule that plays a key role in seed germination, cellular elongation, and developmental transitions in plants. Gibberellin Perception Sensor 1 (GPS1) is the first F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)-based biosensor that allows monitoring of cellular GA levels in vivo. By measuring a fluorescence emission ratio of nuclear localized-GPS1 (nlsGPS1), spatiotemporal mapping of endogenously and exogenously supplied GA gradients in different tissue types is feasible at a cellular scale. This protocol will describe how to image nlsGPS1 emission ratios in three example experiments: steady-state, before-and-after exogenous gibberellin A4 (GA4) treatments, and over a treatment time-course. We also provide methods to analyze nlsGPS1 emission ratios using both Fiji and a commercial three-dimensional (3-D) micrograph visualization and analysis software and explain the limitations and likely pitfalls of using nlsGPS1 to quantify gibberellin levels.

Gibberellin Perception Sensor 1 (GPS1) is the first F&#246;rster resonance energy transfer-based biosensor for measuring the cellular levels of gibberellin phytohormones with a high spatiotemporal resolution. This protocol reports on the method to visualize and quantify cellular gibberellin levels using the genetically encoded nlsGPS1 biosensor in Arabidopsis hypocotyls and root tips.

NlsGPS1 蛍光共鳴エネルギーを使用して可視化、細胞ジベレリン レベル移動 (FRET) バイオ センサー

The phytohormone gibberellin (GA) is a small, mobile signaling molecule that plays a key role in seed germination, cellular elongation, and developmental ...

発生生物学

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

生物発光カルシウムインジケーター、GFPエクオリンに基づいて生体内脳機能イメージングのアプローチで

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

神経科学

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

生物学

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

感受性グリシン/D-セリン、グルタミン酸と NMDA 受容体を研究する高スループット カルシウム変化分析

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other neurodegenerative disorders, this independence might be compromised due to insufficient glutamate clearance and the resulting spill-in and spill-out effects. Altered astrocytic coverage of the presynaptic terminals and/or dendritic spines as well as a reduced size of glutamate transporter clusters at glutamate release sites have been implicated in the pathogenesis of diseases resulting in symptoms of dys-/hyperkinesia. However, the mechanisms leading to the dysfunction of glutamatergic synapses in HD are not well understood. Improving and applying synapse imaging we have obtained data shedding new light on the mechanisms impeding the initiation of movements. Here, we describe the principle elements of a relatively inexpensive approach to achieve single synapse resolution by using the new genetically encoded ultrafast glutamate sensor iGluu, wide-field optics, a scientific CMOS (sCMOS) camera, a 473 nm laser and a laser positioning system to evaluate the state of corticostriatal synapses in acute slices from age appropriate healthy or diseased mice. Glutamate transients were constructed from single or multiple pixels to obtain estimates of i) glutamate release based on the maximal elevation of the glutamate concentration [Glu] next to the active zone and ii) glutamate uptake as reflected in the time constant of decay (TauD) of the perisynaptic [Glu]. Differences in the resting bouton size and contrasting patterns of short-term plasticity served as criteria for the identification of corticostriatal terminals as belonging to the intratelencephalic (IT) or the pyramidal tract (PT) pathway. Using these methods, we discovered that in symptomatic HD mice ~40% of PT-type corticostriatal synapses exhibited insufficient glutamate clearance, suggesting that these synapses might be at risk to excitotoxic damage. The results underline the usefulness of TauD as a biomarker of dysfunctional synapses in Huntington mice with a hypokinetic phenotype.

We present a protocol to evaluate the balance between glutamate release and clearance at single corticostriatal glutamatergic synapses in acute slices from adult mice. This protocol uses the fluorescent sensor iGluu for glutamate detection, a sCMOS camera for signal acquisition and a device for focal laser illumination.

正常マウスおよびハンチントンマウスからの急性脳スライスにおけるグルタミン酸放出および取り込みの単一シナプス指標

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other ...

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical manifestations include weight loss, dyslipidemia, and hypermetabolism; however, it remains unclear how these relate to motor neuron degeneration. Using a Drosophila model of TDP-43 proteinopathy that recapitulates several features of ALS including cytoplasmic inclusions, locomotor dysfunction, and reduced lifespan, we recently identified broad ranging metabolic deficits. Among these, glycolysis was found to be upregulated and genetic interaction experiments provided evidence for a compensatory neuroprotective mechanism. Indeed, despite upregulation of phosphofructokinase, the rate limiting enzyme in glycolysis, an increase in glycolysis using dietary and genetic manipulations was shown to mitigate locomotor dysfunction and increased lifespan in fly models of TDP-43 proteinopathy. To further investigate the effect on TDP-43 proteinopathy on glycolytic flux in motor neurons, a previously reported genetically encoded, FRET-based sensor, FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, was used. This sensor is comprised of a bacterial glucose-sensing domain and cyan and yellow fluorescent proteins as the FRET pair. Upon glucose binding, the sensor undergoes a conformational change allowing FRET to occur. Using FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, glucose uptake was found to be significantly increased in motor neurons expressing TDP-43G298S, an ALS causing variant. Here, we show how to measure glucose uptake, ex vivo, in larval ventral nerve cord preparations expressing the glucose sensor FLII12Pglu-700&#181;&#948;6 in the context of TDP-43 proteinopathy. This approach can be used to measure glucose uptake and assess glycolytic flux in different cell types or in the context of various mutations causing ALS and related neurodegenerative disorders.

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Glucose uptake is increased in Drosophila motor neurons affected by TAR DNA binding protein (TDP-43) proteinopathy, as indicated by a FRET-based, genetically encoded glucose sensor.

TDP-43蛋白症の ショウジョウバエ モデルにおけるグルコース取り込みの測定

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant thiol-disulfide redox buffer glutathione is considered a central player in antioxidant defenses. Therefore, measuring the mitochondrial glutathione redox potential provides useful information about mitochondrial redox status and oxidative stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) is a genetically encoded, green fluorescent protein (GFP)-based ratiometric indicator of the glutathione redox potential that has two redox-state-sensitive excitation peaks at 400 nm and 490 nm with a single emission peak at 510 nm. This article describes how to perform confocal live microscopy of mitochondria-targeted Grx1-roGFP2 in primary hippocampal and cortical neurons. It describes how to assess steady-state mitochondrial glutathione redox potential (e.g., to compare disease states or long-term treatments) and how to measure redox changes upon acute treatments (using the excitotoxic drug N-methyl-D-aspartate (NMDA) as an example). In addition, the article presents co-imaging of Grx1-roGFP2 and the mitochondrial membrane potential indicator, tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE), to demonstrate how Grx1-roGPF2 can be multiplexed with additional indicators for multiparametric analyses. This protocol provides a detailed description of how to (i) optimize confocal laser scanning microscope settings, (ii) apply drugs for stimulation followed by sensor calibration with diamide and dithiothreitol, and (iii) analyze data with ImageJ/FIJI.

This article describes a protocol to determine differences in basal redox state and redox responses to acute perturbations in primary hippocampal and cortical neurons using confocal live microscopy. The protocol can be applied to other cell types and microscopes with minimal modifications.

レシオメトリック指標を用いた一次ニューロンにおけるミトコンドリアグルタチオンレドックス状態の生画像化

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

遺伝的にコードされたセンサを用いたグルタミンフラックスイメージング

要約

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この動画の章

遺伝子にコードされた蛍光センサーを用いた毒性酸化ストレスの評価へのアプローチをイメージング

FIBS対応の非侵襲メタボリック·プロファイリング

NlsGPS1 蛍光共鳴エネルギーを使用して可視化、細胞ジベレリンレベル移動 (FRET) バイオセンサー

生物発光カルシウムインジケーター、GFPエクオリンに基づいて生体内脳機能イメージングのアプローチで

蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

感受性グリシン/D-セリン、グルタミン酸と NMDA 受容体を研究する高スループットカルシウム変化分析

正常マウスおよびハンチントンマウスからの急性脳スライスにおけるグルタミン酸放出および取り込みの単一シナプス指標

TDP-43蛋白症のショウジョウバエモデルにおけるグルコース取り込みの測定

レシオメトリック指標を用いた一次ニューロンにおけるミトコンドリアグルタチオンレドックス状態の生画像化

スクリーニング可能

遺伝的にコードされたセンサを用いたグルタミンフラックスイメージング

要約

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遺伝子にコードされた蛍光センサーを用いた毒性酸化ストレスの評価へのアプローチをイメージング

FIBS対応の非侵襲メタボリック·プロファイリング

NlsGPS1 蛍光共鳴エネルギーを使用して可視化、細胞ジベレリン レベル移動 (FRET) バイオ センサー

生物発光カルシウムインジケーター、GFPエクオリンに基づいて生体内脳機能イメージングのアプローチで

蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

感受性グリシン/D-セリン、グルタミン酸と NMDA 受容体を研究する高スループット カルシウム変化分析

正常マウスおよびハンチントンマウスからの急性脳スライスにおけるグルタミン酸放出および取り込みの単一シナプス指標

TDP-43蛋白症の ショウジョウバエ モデルにおけるグルコース取り込みの測定

レシオメトリック指標を用いた一次ニューロンにおけるミトコンドリアグルタチオンレドックス状態の生画像化

スクリーニング可能

NlsGPS1 蛍光共鳴エネルギーを使用して可視化、細胞ジベレリンレベル移動 (FRET) バイオセンサー

感受性グリシン/D-セリン、グルタミン酸と NMDA 受容体を研究する高スループットカルシウム変化分析

TDP-43蛋白症のショウジョウバエモデルにおけるグルコース取り込みの測定