Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención 1R21NS064412, subvención NSF 1052048 y Jeffress Memorial Trust subvención J-908.

1. Preparación de la muestra Nota: En muchos casos, los experimentos de perfusión verterlo una porción significativa de las células, lo que puede convertirse en un problema frustrante. Aunque no es necesario para todas las líneas celulares, las superficies de vidrio cubierta de recubrimiento con poli-L-lisina (añadir 1,0 ml/25 cm 2 de solución de 0,01% de la superficie, incubar&gt; 5 min, se lava dos veces con agua de calidad de cultivo celular, y en seco la cabina de bioseguridad) mejora la adhesión celular. Además, tenga en cuenta el nivel de bioseguridad (BSL) de la línea celular utilizada, y siga el procedimiento operativo estándar aprobado por la oficina local de salud y seguridad ambiental. En este experimento, se utilizaron células Cos-7 debido a la baja actividad de transporte de glutamina endógena (véase la Figura 4). <ol><li> Células COS7 de semillas a ~ 70-80% de confluencia en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) + 10% de suero de ternera cósmica y 100 U / ml de penicilina / estreptomicina, ya sea en cubreobjetos de vidrio 25 mm estériles colocados en el cultivo de 6 pocillosplato o 8 pocillos diapositivas con fondo de cristal. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2, 100% de humedad durante 24 horas. </li><li> Cambiar el medio de crecimiento a DMEM suero de ternera cósmica 10% (sin antibióticos), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Crecer O / N a 37 ° C, 5% de CO2 a 100% de humedad. </li><li> Añadir 0,4 mg de cada uno de ADN plásmido que codifica el sensor de glutamina (pcDNA3.1, llevando sensor de FLIPQTV3.0 bajo el promotor de CMV 10) y la ASCT2 mCherry-etiquetado 10 a 50 ml de medio libre de suero (OPTI-MEM) y mezclar suavemente. </li><li> Añadir 1 ml de reactivo de transfección a 50 ml de medio libre de suero. Incubar a TA durante 5 min. </li><li> Mezclar las dos soluciones que contienen ADN (paso 1.3) y reactivo de transfección (paso 1,4) y se incuba durante 20 min. </li><li> Añadir suavemente el reactivo de transfección en la parte superior de las células y mezclar suavemente oscilando la cámara. Incubar durante 24 horas a 37 ° C, 5% de CO 2, el 100% de humedad. </li><li> Después de 24 horas, cambiar el medio a DMEM + 10% de suero de ternera Cósmica(CCS) + 100 unidad de penicilina / estreptomicina. </li><li> Las células se crean imágenes de 48 a 72 horas después de la transfección. </li></ol> 2. Experimento de perfusión Nota: Para las células COS7 utilizados en este experimento, los medios de comunicación de perfusión y la cámara se mantuvieron a temperatura ambiente y ambiente concentración de CO 2. Sin embargo, si las células que están siendo utilizados requieren una temperatura más alta y CO 2 de control de concentración para la supervivencia, platina del microscopio calentado y / o una cámara ambiental debe ser utilizado. <ol><li> Preparar la perfusión AF tampón (Ver Lista de Materiales). Coloque las llaves de paso para jeringas de 50 ml, cierre las llaves de paso y luego llenarlos con las soluciones para infusión. Abrir la llave de paso durante un breve periodo para llenar el espacio de cabeza en la llave de paso con el tampón. </li><li> Encienda el 8 canales, sistema de perfusión de alimentación por gravedad con un lápiz de perfusión, a continuación, seleccione &quot;Modo Manual&quot; en Seleccione la opción Función. Coloque un recipiente debajo del el lápiz de perfusión. </li><li> A manoactivar los puertos pulsando los números correspondientes y llenar los tubos utilizando 10 ml jeringa que contiene agua, y luego cerrar el puerto. Una vez que los puertos están llenos de agua, ponga las jeringas que contienen tampones AF en el puerto 1-6 del sistema de perfusión y, a continuación, abrir las llaves de paso. Abrir los puertos de nuevo para reemplazar el agua en la tubería con los tampones. La velocidad de flujo debe estar alrededor de 0,8 ml / min. </li><li> Pulse cancelar una vez en el controlador de la perfusión para volver al menú &quot;FUNCION&quot;. Cambie a la opción &quot;Editar programa&quot;, a continuación, escriba en el protocolo de perfusión indica en la Tabla 1. Guarde el programa de perfusión. </li><li> Tome las células de la incubadora. Lavar dos veces con el tampón de perfusión, a continuación, establezca las células en el escenario. Conecte el sistema de perfusión a la cámara. Si se utiliza una cámara abierta, configure otra bomba que elimina la solución de perfusión de la cámara. </li><li> Abra el software Slidebook. Iniciar una nueva diapositiva. Nota: Lasiguiente procedimiento es específico para el software Slidebook, pero otro software, como MetaFluor y NIS-elemento también se puede utilizar para el tipo de formación de imágenes se describe aquí. Teóricamente experimentos se pueden realizar utilizando cualquier software que permite obtener imágenes del curso del tiempo, y las secuencias de imágenes pueden ser analizados post-experimental utilizando software como ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) o Fiji (http:/ / fiji.sc / Fiji). Sin embargo, el software que permite la supervisión en tiempo real de la relación de aceptor / donante es de gran utilidad. </li><li> Montar el portaobjetos sobre la platina del microscopio fluorescente. Encuentre las células que expresan co-sensor y ASCT-mCherry utilizando conjuntos de filtros apropiados (véase la lista de materiales) bajo la función &quot;FOCUS&quot;. Ajuste la ganancia haciendo clic en la pestaña &quot;Cámara&quot; y arrastrando la barra deslizante debajo de &quot;ganancia&quot;. Además, ajuste la configuración del filtro de densidad neutra desde el menú desplegable de filtro de densidad neutra. Nota: Si el cubo de filtro no incluye un filtro de ojo, no utilice las piezas oculares desde shorluz de excitación t-longitud de onda es perjudicial para los ojos. Utilice la pantalla de la computadora para encontrar las células en su lugar. </li><li> Adquirir imágenes de las células with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (Filtros se especifican en la Lista de Materiales). Haga clic en &quot;Captura de imagen&quot;, y luego, en la ventana de adquisición, especifique los filtros que se van a utilizar. Haga clic en el botón &quot;TEST&quot; para ajustar el tiempo de exposición al escribir el tiempo de exposición deseado en la casilla junto a la configuración del filtro. Nota: Todos los tres canales necesitan ser expuestos para la misma longitud. Al ajustar los parámetros de la imagen, tomar el cambio en la eficiencia FRET esperado y doblar a aumentar en cuenta: por ejemplo, si se espera que la eficiencia de FRET a subir de 2 veces durante el experimento, los parámetros de imagen se deben ajustarde manera que la intensidad del Donante Aceptor ex em en el estado de reposo debería ser &lt;50% del valor máximo que se puede grabar por el instrumento, de manera que el canal no se sature durante el experimento. De señal de las células marcadas debe ser al menos tres veces mayor que en la región del fondo. </li><li> Dibuje una región de interés usando la herramienta de las regiones en el software. Alternativamente, una función de software para seleccionar píxeles por encima de cierta intensidad se puede utilizar, y luego se convierte en regiones. Para ello, haga clic en Máscara - Segmento, luego mueva la barra de desplazamiento para resaltar las áreas deseadas. </li><li> Seleccione &quot;lapso de tiempo&quot; en el cuadro Tipo de captura, a continuación, especifique el intervalo (10 segundos en este experimento) y puntos de tiempo para el experimento. </li><li> Dibuje una región en una zona sin presencia de células fluorescentes. Esta área se utiliza para la sustracción de fondo. Haga clic derecho en la región dibujada, y luego configurarlo como fondo. Nota: Lo ideal sería que las células que no sonT que expresan los sensores debe ser utilizado como la región del fondo para tener en cuenta tanto la autofluorescencia y la fluorescencia de fondo detectada por la cámara. Si no hay tales células están disponibles en el campo de visión, por lo menos una región sin las células debe ser utilizado para tener en cuenta la fluorescencia de fondo. </li><li> Seleccione el programa deseado en &quot;Select Function - Ejecutar programas de&quot; opción. Cambie al programa guardado (vea el paso 2.3), y luego pulsa ENTER en el mando a la perfusión. Ahora el programa se carga, y golpear una tecla comenzará la perfusión. </li><li> Asegúrese de perfusión y el experimento de imágenes se inicia al mismo tiempo haciendo clic en el botón &quot;Inicio&quot; en la ventana de captura, al mismo tiempo que se pulsa una tecla en el controlador de la perfusión. Nota: Se recomienda anotar el punto de tiempo en que se intercambiaron las soluciones (esto se puede hacer uso de &quot;Notas&quot; de función, que se encuentran dentro de la pestaña de la adquisición). </li><li> Realice el mismo protocolo de perfusión using de células que expresan un sensor que se espera que sea o bien saturado o no unido bajo la condición experimental. Nota: Aquí, FLIPQTV3.0_1.5μ, que está saturado bajo la condición experimental, se utiliza como un control, la Figura 6 Tales experimentos de control son necesarios para confirmar que el cambio en la eficiencia de FRET es debido al cambio real en el sustrato y no. debido al cambio en otros parámetros tales como el pH celular. </li></ol> 3. Análisis Post-experimento <ol><li> Examinar si se ha producido la muestra de deriva durante el experimento. Dibuje las regiones de interés (ROI) s en la imagen tomada en punto de tiempo 0, luego mueva la barra de desplazamiento en la parte superior de la ventana de imagen y compruebe si las células se caen de las regiones de interés en las imágenes tomadas posteriormente en el experimento. </li><li> En caso afirmativo, a continuación, utilizar la función de seguimiento para corregir la deriva, en primer lugar, la creación de máscaras alrededor de las células mediante la selección de la máscara - Segmento, luego deslice la línea que especifica el punto de corte de highlight las regiones que contienen células. Seguimiento de las regiones haciendo clic Máscara - seguimiento de partículas - rastreo de partículas básico. </li><li> Re-dibujar el rendimiento de la inversión y la región del fondo cuando sea necesario. </li><li> Exportación de la intensidad media de las regiones de interés en el transcurso del experimento. Haga clic en Estadísticas - Exportaciones - Datos Ratio / timelapse. </li><li> Cuando la eficiencia de FRET y la cuantificación de la concentración de sustrato no es necesario, trazar el curso temporal de la relación de intensidad (de donantes ex Aceptador em, / Donante ex Donante em) como un proxy de la dinámica del sustrato. Para determinar la concentración citosólica, calcular la máxima y la mínima relación de cambio (es decir, en la saturación y la ausencia de sustrato, respectivamente),? R máx -? R min, mediante regresión no lineal de Δratio (Delta R) con la siguiente ecuación: ? R = [S] / (K d + [S]) x (? R <sub&gt; max - min? R) +? R min donde [S] es la concentración de sustrato en el citosol. Utilizando los? R max - valores? R min obtenidos, la saturación (S) del sensor a una determinada? R se calcula como S = (? R -? R min) / (? R max - min? R) S además se puede convertir en la concentración de sustrato [S] utilizando la siguiente ecuación: S = [S] / (K d + [S]) Nota: la intensidad de canal em Aceptador ex Aceptador debe ser también traza para examinar si la condición experimental influyó en la fluorescencia del aceptor directamente. </li><li> Cuando se observa una deriva de referencia debido a la foto-blanqueo, realizar una corrección de la línea base. Para ello, trazar las intensidades de donante y aceptor en el tiempo (Figura 5A). Luego de identificar los puntos de tiempo utilizados para el the la línea de base, de acuerdo a la demora en el sistema de perfusión y la actividad de transporte de la célula particular (Figura 5B). </li><li> Calcula un polinomio de ajuste que mejor describe la línea base. Entonces, normalizar la intensidad prima a partir de cada punto de tiempo de la línea de base (Figura 5C). Cálculo de la relación de intensidad (de donantes ex Aceptador em, / Donante ex Donante em) de los donantes y aceptores de intensidades normalizadas. </li></ol>

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	<li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+hepatic+ammonia+metabolism:+the+intercellular+glutamine+cycle.">Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle.</a> Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).</li><li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+glutamine+metabolism.">Hepatic glutamine metabolism.</a> Beitr Infusionther Klin Ernahr. 17, 144-157 (1987).</li><li>Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+glutamine+metabolism.">Hepatic glutamine metabolism.</a> Nutrition. 18, 301-303 (2002).</li><li>Mustroph, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis.">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).</li><li>Sasagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz-Seq:+a+highly+reproducible+and+sensitive+single-cell+RNA+sequencing+method,+reveals+non-genetic+gene-expression+heterogeneity.">Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity.</a> Genome Biol. 14, R31 (2013).</li><li>Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+cycle+of+Ca(2+)+ions+in+dendritic+spines.">The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines.</a> Neuron. 33, 439-452 (2002).</li><li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+with+fluorescent+biosensors.">Quantitative imaging with fluorescent biosensors.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).</li><li>Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encodable+fluorescent+biosensors+for+tracking+signaling+dynamics+in+living+cells.">Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells.</a> Chemical reviews. , 111-3666 (2011).</li><li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors.">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).</li><li>Gruenwald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+glutamine+transporter+activities+in+living+cells+using+genetically+encoded+glutamine+sensors.">Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors.</a> PLoS One. 7, e38591 (2012).</li><li>Chaudhuri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protonophore-+and+pH-insensitive+glucose+and+sucrose+accumulation+detected+by+FRET+nanosensors+in+Arabidopsis+root+tips.">Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips.</a> Plant Journal. 56, 948-962 (2008).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499, 295-300 (2013).</li><li>Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+RNAi+Screen+Identifies+Letm1+as+a+Mitochondrial+Ca2+/H++Antiporter.">Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter.</a> Science. , 326-147 (2009).</li><li>Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Muller+cell+glutamine+synthetase+rapidly+impairs+the+retinal+response+to+light.">Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light.</a> Glia. 30, 64-73 (2000).</li><li>Rothstein, J. D., Tabakoff, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+Striatal+Glutamate+Release+after+Glutamine-Synthetase+Inhibition.">Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition.</a> J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).</li><li>Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+amino+acid+transporter+SNAT3+by+insulin+in+hepatocytes.">Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes.</a> J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).</li><li>Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serine/threonine+kinases+SGK1,+3+and+PKB+stimulate+the+amino+acid+transporter+ASCT2.">The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2.</a> Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).</li><li>Br&#246;er, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+astroglial+ASCT2+amino+acid+transporter+as+a+mediator+of+glutamine+efflux.">The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux.</a> J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).</li><li>Wallace, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-spike+detection+in+vitro+and+in+vivo+with+a+genetic+Ca2++sensor.">Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor.</a> Nature. 5, 797-804 (2008).</li><li>Haugh, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+microscopy+with+molecular+biosensors:+what+are+we+really+measuring.">Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring.</a> Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).</li><li>San Martin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+FRET+lactate+sensor+and+its+use+to+detect+the+Warburg+effect+in+single+cancer+cells.">A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells.</a> PLoS One. 8, e57712 (2013).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).</li><li>Ponsioen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+cAMP-induced+Epac+activation+by+fluorescence+resonance+energy+transfer:+Epac+as+a+novel+cAMP+indicator.">Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator.</a> Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).</li><li>Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+ratio+imaging+to+profile+caspase+activity:+potential+application+in+multiparameter+high+content+apoptosis+analysis+and+drug+screening.">High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening.</a> PLoS One. 6, e20114 (2011).</li><li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2+/H++antiporter.">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li><li>Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+examination+of+fluorescence+resonance+energy+transfer-detected+metal-ion+response+in+mammalian+cells.">High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells.</a> J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).</li></ol>

No hay nada que revelar.

El éxito de los experimentos de imagen depende de algunos factores críticos. Uno de estos factores es la afinidad de sensores utilizado, como se discutió anteriormente. Concentración absoluta del sustrato en el compartimiento subcelular de interés, sin embargo, es a menudo desconocida. Por lo tanto le recomendamos probar múltiples sensores con afinidades escalonados para encontrar el que funciona mejor bajo la condición experimental deseado. Por ejemplo, en nuestro caso transfectadas las células COS7 con sensores de glutamina con 1.5μ, 100μ, 2 m, y 8m (figura 3 y datos no presentados). Otro factor importante es el nivel de expresión de proteínas de sensores. El nivel de expresión requerido para la detección varía entre, experimentos, Por ejemplo, cuando un evento de corta duración (por ejemplo, solo potencial de acción) necesita ser observado un mayor nivel de expresión podría ser necesario 19. Por lo tanto, en la mayoría de los casos, el nivel requerido debe ser empiricallY determinado. Si existe el objetivo en muy baja concentración en la célula, la perturbación de los procesos endógenos debido a orientar el agotamiento puede ser un problema 20. Un ensayo independiente para evaluar esta posibilidad, si está disponible, por lo tanto deseable. En los experimentos que se muestran en este artículo, la expresión de proteínas impulsada por el promotor de CMV se encontró que era suficiente. En situaciones en las que los promotores con actividades mucho más débiles necesitan ser utilizado, ajustes para aumentar las intensidades de señal pueden llegar a ser necesario. Por ejemplo, el compromiso entre la intensidad de la señal y de fotoblanqueado durante la exposición tiene que ser alcanzado. Además de un mayor tiempo de exposición, como factores tales como el brillo de los fluoróforos, el cambio de intensidad máxima del sensor, binning, y la sensibilidad de la cámara CCD se pueden cambiar para mejorar la intensidad de la señal. Cuando no se observa ningún cambio de la relación bajo la condición experimental a pesar de que los dos criterios anteriores es probable que loscumplirse, es posible que la homeostasis celular para el metabolito o ion dado es suficiente para enmascarar la actividad de transporte fuerte (ver la sección de resultados). En tales casos, las líneas celulares con diferentes actividades bioquímicas pueden ser necesarias como un fondo para detectar las actividades del transportador 10, 21. Mientras que estos sensores permiten a uno supervisar la dinámica de concentración del sustrato en una resolución mucho mayor espacio-temporal que los métodos basados ​​en extracción-, determinación de la concentración absoluta requiere nuevas medidas experimentales y consideraciones. Por lo general, la concentración de sustrato se calcula en el supuesto de que la afinidad del sensor, por lo general calculado por titulación de la proteína purificada del sensor, no se modifica cuando se expresa en la célula. La concentración se calcula utilizando la siguiente isoterma de unión única, [S] = Kd x (r - r min) / (r &lt;/ Em&gt; max - r) [S] es la concentración de sustrato, Kd es la constante de disociación determinada in vitro, r es la relación de aceptor / donante observado en un punto de tiempo dado, R min es la relación de aceptor / donante cuando los sensores están en la forma apo, y R max es la relación de aceptor / donante cuando todos los sensores están unidos al sustrato. Rmin y Rmax son influenciados por parámetros tales como la concentración de sensores, la configuración de imagen utilizadas y la composición de la Millett celular, y por lo tanto necesitar ser medido in situ . Para determinar los valores máximos r r min y, las condiciones experimentales que permite la modificación de la concentración de sustrato intracelular se convierte en necesario. Por ejemplo, los ionóforos selectivos (por ejemplo, ionomicina para el Ca 2 +) 22 o un reactivo de perforación tal como digitonin 23 se puede utilizar para equilibrar la concentración de sustrato intracelular con la concentración externa. Una de las limitaciones en el tipo de experimentos demostrados en este protocolo es el bajo rendimiento; el análisis se limita al análisis de un metabolito en un número relativamente pequeño (&lt;10) de las células. Los avances tecnológicos se están haciendo, sin embargo, para superar esas limitaciones. Por ejemplo, con el avance en, cribado de alto contenido automatizado, ahora es posible utilizar sensores codificados genéticamente en combinaciones con pequeña molécula o RNAi biblioteca; las células que expresan un biosensor se pueden cultivar en un formato de alto rendimiento (por ejemplo, 96 - o 384 pocillos), a continuación, los pocillos individuales se pueden tratar con cualquiera de ARNsi o productos químicos y la imagen. Estos experimentos permiten la identificación de las construcciones de siRNA o productos químicos que perturban el proceso biológico que se puede observar por el biosensor 24 25. Otra emocionante inclusión avance recientedes el desarrollo de un flujo de microfluidos resuelta en el tiempo citómetro, que permite la detección de alto rendimiento de cambio en la eficiencia de FRET en un nivel celular 26. Estos avances técnicos ayudarán descubrimientos de nuevos candidatos a fármacos y nuevos componentes en los procesos biológicos.

Debido a la notable progreso en tecnologías que permite el examen del transcriptoma y el proteoma a nivel celular, ahora ha quedado claro que la bioquímica y el flujo resultante de los metabolitos y los iones son altamente tipo específico de célula. Por ejemplo, en el hígado de los mamíferos, la degradación y la síntesis de glutamina secuencial se llevan a cabo de forma simultánea por las células periportal y células perivenosos respectivamente, la alimentación de amonio para el ciclo de la urea en el primer tipo de células, mientras que consume el exceso de amoníaco en este último 1-3. En algunos casos, se detecta heterogeneidad bioquímica significativa incluso en un solo &quot;tipo celular&quot; 4, 5. Además de tales especificidad espacial, los niveles celulares de metabolitos e iones son altamente dinámico (por ejemplo, moléculas de señalización tales como Ca 2 + y nucleótidos cíclicos). Los patrones espacio-temporales de metabolitos e iones a menudo desempeñan un papel crítico en la transducción de señales. MONITOREO dinámica celular de metabolitos e iones, sin embargo, plantean desafío único. En muchos casos, el cambio en las concentraciones son rápida y transitoria, ejemplificada por el caso de moléculas de señalización tales como Ca 2 +, que se desintegra dentro de ~ 20 mseg en las espinas dendríticas 6. Además, la compartimentación de las rutas bioquímicas dentro y entre las células hace que sea difícil de cuantificar la dinámica de metabolitos e iones usando extracción y cromatografía en columna / técnicas de espectrometría de masas. Sensores codificados genéticamente para moléculas biológicas son ampliamente utilizados debido a la alta resolución espacio-temporal que permite al experimentador para estudiar la dinámica molecular de corta duración y / o compartimentadas (revisado en 7, 8). Estos sensores codificados genéticamente pueden dividirse en dos categorías; sensores basados ​​en la intensidad y sensores ratiometic. Sensores basados ​​en la intensidad general consisten en un dominio de unión y una gripeproteína orescent (fps), y la unión al dominio de unión soluto cambia la intensidad fluorescente. Sensores Ratiometic, por otro lado, a menudo se aprovechan de Föster de transferencia de energía de resonancia (FRET) entre dos programas marco que funcionan como un par de FRET. Estos sensores consisten en un dominio de unión y dos programas marco, y la unión soluto induce el cambio en la eficiencia de FRET entre los dos programas marco. Un gran número de sensores para metabolitos e iones biológicamente importantes se han desarrollado en la última década 8, 9. Una de la excitante posibilidad ofrecida por tales sensores codificados genéticamente es su uso en el análisis de alta resolución de los procesos de transporte de membrana, que anteriormente no era fácil de detectar en el nivel celular. Sensores codificados genéticamente facilitar el análisis de los mecanismos de transporte, tales como especificidad de sustrato y la dependencia de pH 10, 11. Por otra parte, en combinación con la res genéticosuentes como la biblioteca de RNAi construye de organismos modelo, ahora es posible realizar búsquedas en todo el genoma para nuevos procesos de transporte por medio de sensores codificados genéticamente. De hecho, el uso de cable del sensor codificado genéticamente para el descubrimiento de los transportadores de no caracterizados previamente en múltiples casos 12, 13. Recientemente, nuestro laboratorio ha desarrollado una serie de sensores basados ​​en FRET de glutamina. Hemos demostrado que los niveles de glutamina celular pueden ser visualizados usando tales sensores de glutamina de FRET 10. Estos sensores constan de un donante de FRET (mTFP1) insertado en una proteína bacteriana de unión glutamina glnH, y un aceptor de FRET (Venus) en el extremo C-terminal de glnH (Figura 1). FRET eficiencia de estos sensores a disminuir tras la unión de glutamina, lo que resulta en la disminución de la relación de intensidad de aceptor / donador. Fine regulación de los procesos de transporte de la glutamina es importante en los procesos biológicos, tales como neurotransmisión 14, 15 y el mantenimiento de ciclo de la urea en el hígado 1, 16, 17. Aquí se presenta la metodología de análisis de las actividades de transporte con sensores FRET para glutamina, usando un campo amplio de fluorescencia microscopio puesta a punto. El objetivo de los experimentos que se muestran aquí son para detectar las actividades del transportador en una sola célula y para examinar la especificidad de sustrato de un transportador expresado transitoriamente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1129">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81F-3-5</td>
			<td>An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also appropriate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exitation filter (mTFP1)</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>3RD450-460</td>
			<td>band width 450-460 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exitation filter (Venus)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET500/20</td>
			<td>band width 490-510 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (mTFP1)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ495/30m</td>
			<td>band width 475-505nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (Venus)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET535/30m</td>
			<td>band width 520-550nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (FRET channels)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>470dcxr</td>
			<td>long pass, 470nm cut off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (YFP channel)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>89002bs</td>
			<td>passes 445-490nm, 510-560nm, 590-680nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry filter set</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49008</td>
			<td>excitation 540-580nm, long pass dichroic with 585nm cut off, emission filter 595-695nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-LH100L-3-5</td>
			<td>LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>Rolera-MGi EMCCD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apochromatic fluorescence objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion system, ValveBank II</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>[01-08]</td>
			<td>Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow chambers</td>
			<td>C&#38;L Instruments</td>
			<td>VC-MPC-TW</td>
			<td>Other larminar-flow chambers would also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered slide</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154534</td>
			<td>For open-chamber experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion pump</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>74-046-12131</td>
			<td>For open-chamber experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software supporting ratiometric measurements</td>
			<td>Intellegenent Imaging Innovation</td>
			<td>Slidebook 5.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow biosafety cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>LA-3A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-255-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s MEM (DMEM)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3008703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td>Used with Lipofectamine 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine solution</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mm circular glass cover slips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-545-102</td>
			<td>in case VC-MPC-TW is used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Other transfection reagents can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution A (Hank&#39;s buffer)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>9.7g HANK salt (Sigma H1387), 0.35g NaHCO3, 5.96g HEPES to 1L, pH adjusted to 7.35 with NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 0.04mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 0.2mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 1mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution E</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 5mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution F</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 5mM Ala</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glutamine flux imaging using genetically encoded sensors

Sensores codificados genéticamente permiten la monitorización en tiempo real de las moléculas biológicas con una resolución subcelular. Una enorme variedad de tales sensores para moléculas biológicas se hizo disponible en los últimos 15 años, algunos de los cuales se convirtió en herramientas indispensables que se utilizan rutinariamente en muchos laboratorios. Una de las emocionantes aplicaciones de sensores codificados genéticamente es el uso de estos sensores en la investigación de los procesos de transporte celulares. Propiedades de los transportistas, como la cinética y especificidades de sustrato se pueden investigar a nivel celular, que proporciona posibilidades de análisis específicos de tipo celular de las actividades de transporte. En este artículo, vamos a demostrar cómo la dinámica del transportador se pueden observar utilizando el sensor de glutamina codificado genéticamente como ejemplo. Diseño experimental, detalles técnicos de los parámetros experimentales, y las consideraciones para los análisis post-experimentales serán discutidos.

Tiempo curso experimentos típicos se representan en la Figura 2. En estos experimentos, FRET sensores de glutamina con afinidades de 8 mM (FLIPQTV3.0_8m, Figura 2A y 2B) y 100 M (FlipQTV3.0_100 μ C y D) fueron co-expresada con un ASCT2 intercambiador de aminoácidos obligatoria 18 en células COS7 10. La afluencia de glutamina se detecta como el cambio en las relaciones de intensidad de fluorescencia entre el donante (mTFP1) y el aceptor (Venus) (Figura 2A y 2C). Flujo de salida de la glutamina en presencia de otro sustrato (Ala) también se demuestra claramente en estos experimentos. Con los dos sensores, intensidad de fluorescencia normalizados cambian recíprocamente (es decir, la intensidad de donante aumenta a medida que la intensidad aceptor disminuye, Figura 2B y 2D) en presencia del sustrato, lo que sugiere que el cambio de la relación observada es de hecho debido to el cambio en la eficiencia de FRET. Estos experimentos muestran que las concentraciones de glutamina en estas células fluctúan muy dinámicamente bajo la condición experimental; de la gama de detección de 100 sensor de M a la concentración cerca de saturación para el sensor de 8 mM. Especificidades de sustrato de los transportadores también pueden ser examinados utilizando sensores, demostrado en la Figura 3. En estos experimentos las células fueron pre-cargados con glutamina, y luego se añadieron diversos aminoácidos al perfundido extracelular para examinar si esos aminoácidos pueden inducir flujo de salida de glutamina. Como era de esperar, sustratos ASCT2 (Ala, Ser, Cys, Thr, D-serina) inducida eflujo glutamina (Fig. 3A), mientras que los aminoácidos no-sustrato (Pro, His, Lys) no (Fig. 3B), corroborando con estudios previos 18. Por lo general, la especificidad del sustrato se mide por ensayos de competición usando un sustrato marcado con un isótopo de radio mezclado con sustrato competidor, Lo que es bastante laborioso y requiere una población de células que están expresando de manera uniforme el transportador a estudiar. Imágenes ópticas ejemplificada aquí ofrece un enfoque alternativo. Cuando no se observan cambios en la eficiencia de FRET tras la adición del sustrato, varias razones podrían ser considerados. Una posible razón es la baja capacidad de absorción para el sustrato que está siendo probado y / o altas actividades de las enzimas que mantienen la concentración en las células. Por ejemplo, cambio de la concentración de glutamina fue mínima en células COS7 que no expresan transportador ASCT2 bajo la condición probada, a pesar de que esta línea celular puede crecer claramente en los medios de comunicación en la que la glutamina en la principal fuente de nitrógeno (Figura 4). Además, si la afinidad del sensor es demasiado alta o demasiado baja en comparación con la concentración intracelular, la mayoría de las proteínas sensor permanecen constitutivamente unido o no unido, respectivamente; por lo tanto, no hay cambio en la eficiencia FRET será Detected. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Configuración de un sensor de glutamina FRET. (A) Abierto (cian) y cerrados (amarillo) la conformación de glnH, glutamina unión a proteínas de E. coli. La posición donde se inserta mTFP1 está marcado en color magenta. (B) representaciones esquemáticas de sensores FLIPQTV_3.0. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. In vivo mediciones de glutamina mediante sensores 100μ FLIPQ-TV3.0_8m y. (A) La relación venus/mTFP1 de células COS7 que expresan co-sensor de FLIPQ-TV3.0_8m y ASCT2-mCherry. mCherry etiqueta se utiliza para identificar las células que expresan el transporteer sin interferir los canales de emisión mTFP1 o Venus. Las células se sometieron a perfusión con tampón de HEPES de búfer de Hank (pH 7,35). Puntos de tiempo cuando se añadió glutamina extracelular (rojo) y alanina (azul) a los medios de perfusión se indican como cajas sobre el gráfico. Las líneas continuas y de trazos representan dos células individuales medidas en el mismo experimento. (B) Las intensidades de los donantes (mTFP1) y aceptor (Venus) canales en el experimento que se muestra en (A). Los valores fueron corregidos para photobleaching y normalizado a la línea de base. (C) y (D) Un experimento similar como en (A) y (B), realizado con células COS7 que expresan el sensor FLIPQ-TV3.0_100μ. (Modificado a partir de la Figura 10). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Eliminación de la glutamina celular Tediante el transportador ASCT2 en la presencia de aminoácidos externos, visualizado usando el sensor de FLIPQ-TV3.0_8m. (A) glutamina citosólica se exporta por la adición de extracelular Ala, Ser, Cys, Thr, y D-Ser. Puntos de tiempo cuando se añadieron glutamina extracelular (cuadros rojos) u otros aminoácidos (cajas azules) a los medios de perfusión se indican como cajas sobre el gráfico. (B) Adición de Pro, Lys, His (cajas negras) no altera la concentración de glutamina citosólica , mientras que la adición de Ala (cajas azules) promueve la exportación de glutamina. Las líneas continuas y de trazos representan dos células individuales medidas en el mismo experimento. Todos los aminoácidos se añadieron a 5 concentraciones externas mm. (Figura fue publicado originalmente en el 10). <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. La relación venus/mTFP1 de células COS7 correoXpressing sensor de FLIPQ-TV3.0_8m (A) y el sensor de 100μ (B). Las células fueron perfundidos con tampón de Hank tamponada con HEPES. Puntos de tiempo cuando se añadió glutamina extracelular (5 mM) a los medios de perfusión se indican como cajas de color rojo sobre el gráfico. Las líneas continuas y de trazos representan dos células individuales medidas en el mismo experimento. <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Corrección para photobleaching. (A) cruda intensidad de dos células representadas en la Figura 2A y 2C. (B) puntos de datos que fueron seleccionados para el cálculo de las líneas de base. Curvas de ajuste polinómico se muestran en la figura. (C) Las intensidades de los canales mostrados en A, normalizado contra la línea de base calculada en B. El conjunto de datos utilizado en esta figura es IDEntical a la que se muestra en la Figura 2A y 2C. <img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. In vivo utilizando mediciones de glutamina sensor de FLIPQ-TV3.0_1.5m. (A) La relación venus/mTFP1 de células COS7 que expresan co-sensor de FLIPQ-TV3.0_1.5m y ASCT2-mCherry. tag mCherry se utilizó para identificar las células que expresan el transportador sin interferir los canales de emisión mTFP1 o Venus. Las células se sometieron a perfusión con tampón de HEPES de búfer de Hank (pH 7,35). Puntos de tiempo cuando se añadió glutamina extracelular (rojo) y alanina (azul) a los medios de perfusión se indican como cajas sobre el gráfico. Las líneas continuas y discontinuas representan dos células individuales medidas en el mismo experimento. (B) Las intensidades de los donantes (mTFP1) y aceptor (Venus) CanalesEn el experimento mostrado en (A). Los valores fueron corregidos para photobleaching y normalizado a la línea de base. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="474"><tbody><tr><td> Tiempo (min) </td><td> Solución A </td><td> Solución B </td><td> Solución C </td><td> Solución D </td><td> Solución E </td><td> Solución F </td></tr><tr><td> 0 </td><td> válvula en </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> la válvula de </td><td> válvula en </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td> válvula en </td><td> la válvula de </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> la válvula de </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> válvula en </td></tr><tr><td> 8 </td><td> válvula en </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> la válvula de </td></tr&gt; <tr><td> 10 </td><td> la válvula de </td><td></td><td> válvula en </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td> válvula en </td><td></td><td> la válvula de </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 14 </td><td> la válvula de </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> válvula en </td></tr><tr><td> 16 </td><td> válvula en </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> la válvula de </td></tr><tr><td> 18 </td><td> la válvula de </td><td></td><td></td><td> válvula en </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 20 </td><td> válvula en </td><td></td><td></td><td> la válvula de </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 22 </td><td> la válvula de </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> válvula en </td></tr><tr><td> 24 </td><td> válvula en </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> la válvula de </td></tr&gt; <tr><td> 26 </td><td> la válvula de </td><td></td><td></td><td></td><td> válvula en </td><td></td></tr><tr><td> 28 </td><td> válvula en </td><td></td><td></td><td></td><td> la válvula de </td><td></td></tr><tr><td> 30 </td><td> la válvula de </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> válvula en </td></tr><tr><td> 32 </td><td> válvula en </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> la válvula de </td></tr><tr><td> 34 </td><td> la válvula de </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> . Tabla 1 Ejemplo de protocolo de perfusión utilizado en este experimento Solución A:. 9,7 g de sal de Hank (H1387), 0,35 g de NaHCO3, 5,96 g de HEPES a 1 L de pH se ajustó a 7,35 con NaOH Solución B:. Solución A + 0,04 mM Gln Solución C:.. Solución A + mM Gln 0,2 Solutiones de D:. Solución A + 1 mM Gln solución E:. Solución A + 5 mM Gln Solución F: Solución A + mm Ala 5

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Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Este artículo le mostrará cómo controlar la dinámica de glutamina en las células vivas mediante FRET. Sensores codificados genéticamente permiten la monitorización en tiempo real de las moléculas biológicas con una resolución subcelular. Diseño experimental, detalles técnicos de los parámetros experimentales, y las consideraciones para los análisis post-experimentales serán discutidos para los sensores de glutamina codificados genéticamente.

Glutamina Flux Imaging utilizando sensores codificados genéticamente

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

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9.5K vistas.  Virginia Tech.  Este artículo le mostrará cómo controlar la dinámica de glutamina en las células vivas mediante FRET. Sensores codificados genéticamente permiten la monitorización en tiempo real de las moléculas biológicas con una resolución subcelular. Diseño experimental, detalles técnicos de los parámetros experimentales, y las consideraciones para los análisis post-experimentales serán discutidos para los sensores de glutamina codificados genéticamente. 

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Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

Bacterial Detección e Identificación Usando sensores electroquímicos

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Investigación

Bioingeniería

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Un biochip electroquímico basado en microfluidos para el análisis de hibridación ADN-Label libre

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Flying Insect Detection and Classification with Inexpensive Sensors

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow for the development of many useful applications in vector and pest control for both medical and agricultural entomology. Given this, the last sixty years have seen many research efforts devoted to this task. To date, however, none of this research has had a lasting impact. In this work, we show that pseudo-acoustic optical sensors can produce superior data; that additional features, both intrinsic and extrinsic to the insect&#8217;s flight behavior, can be exploited to improve insect classification; that a Bayesian classification approach allows to efficiently learn classification models that are very robust to over-fitting, and a general classification framework allows to easily incorporate arbitrary number of features. We demonstrate the findings with large-scale experiments that dwarf all previous works combined, as measured by the number of insects and the number of species considered.

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Flying detección de insectos y Clasificación con Sensores Barato

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Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Estudios electrotaxis de pulmón células de cáncer utilizando un Multicanal Dual-campo eléctrico chip de microfluidos

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

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Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

La eliminación selectiva de células de Cultura mezclada 3D mediante técnica de infrarrojo cercano Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

Monitoreo en tiempo real de intracelular del ácido biliar Dinámica El uso de un sensor de ácido biliar basada FRET-codificados genéticamente

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds during repair, which gives rise to a lack of sufficient blood supply and causes necrosis of the new tissues. Rapid vascularization is a vital prerequisite for new tissue survival and integration with existing host tissue. The de novo generation of vasculature in scaffolds is one of the most important steps in making bone regeneration more efficient, allowing repairing tissue to grow into a scaffold. To tackle this problem, the genetic modification of a biomaterial scaffold is used to accelerate angiogenesis and osteogenesis. However, visualizing and tracking in vivo blood vessel formation in real-time and in three-dimensional (3D) scaffolds or new bone tissue is still an obstacle for bone tissue engineering. Multiphoton microscopy (MPM) is a novel bio-imaging modality that can acquire volumetric data from biological structures in a high-resolution and minimally-invasive manner. The objective of this study was to visualize angiogenesis with multiphoton microscopy in vivo in a genetically modified 3D-PLGA/nHAp scaffold for calvarial critical bone defect repair. PLGA/nHAp scaffolds were functionalized for the sustained delivery of a growth factor pdgf-b gene carrying lentiviral vectors (LV-pdgfb) in order to facilitate angiogenesis and to enhance bone regeneration. In a scaffold-implanted calvarial critical bone defect mouse model, the blood vessel areas (BVAs) in PHp scaffolds were significantly higher than in PH scaffolds. Additionally, the expression of pdgf-b and angiogenesis-related genes, vWF and VEGFR2, increased correspondingly. MicroCT analysis indicated that the new bone formation in the PHp group dramatically improved compared to the other groups. To our knowledge, this is the first time multiphoton microscopy was used in bone tissue-engineering to investigate angiogenesis in a 3D bio-degradable scaffold in vivo and in real-time.

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Here, we present a protocol to visualize blood vessel formation in vivo and in real-time in 3D scaffolds by multiphoton microscopy. Angiogenesis in genetically modified scaffolds was studied in a murine calvarial critical bone defect model. More new blood vessels were detected in the treatment group than in controls.

Visualización de angiogénesis por microscopía multifotón En Vivo en modificados genéticamente 3D-PLGA/nHAp andamio para Calvarial críticos de la reparación del defecto óseo

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. The introduced genetic material may integrate into the embryonic genome and generate transgenic animals with foreign genetic information following transfer of the injected embryos to foster mothers. Following the success in mice, PN injection has been applied successfully in many other animal species. Recently, PN injection has been successfully employed to introduce reagents with gene-modifying activities, such as the CRISPR/Cas9 system, to achieve site-specific genetic modifications in several laboratory and farm animal species. In addition to mastering the special set of microinjection skills to produce genetically modified animals by PN injection, researchers must understand the reproduction physiology and behavior of the target species, because each species presents unique challenges. For example, golden Syrian hamster embryos have unique handling requirements in vitro such that PN injection techniques were not possible in this species until recent breakthroughs by our group. With our species-modified PN injection protocol, we have succeeded in producing several gene knockout (KO) and knockin (KI) hamsters, which have been used successfully to model human diseases. Here we describe the PN injection procedure for delivering the CRISPR/Cas9 complex to the zygotes of the hamster, the embryo handling conditions, embryo transfer procedures, and husbandry required to produce genetically modified hamsters.

Pronuclear (PN) injection of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated protein-9 nuclease (CRISPR/Cas9) system is a highly efficient method for producing genetically engineered golden Syrian hamsters. Herein, we describe the detailed PN injection protocol for the production of gene knockout hamsters with the CRISPR/Cas9 system.

Producción de hámsters sirios dorados genéticamente por inyección Pronuclear del complejo CRISPR/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Targeting Neuronal Fiber Tracts for Deep Brain Stimulation Therapy Using Interactive, Patient-Specific Models

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for movement disorders and is being applied to a growing number of disorders. Computational modeling has been successfully used to predict the clinical effects of DBS; however, there is a need for novel modeling techniques to keep pace with the growing complexity of DBS devices. These models also need to generate predictions quickly and accurately. The goal of this project is to develop an image processing pipeline to incorporate structural magnetic resonance imaging (MRI) and diffusion weighted imaging (DWI) into an interactive, patient specific model to simulate the effects of DBS. A virtual DBS lead can be placed inside of the patient model, along with active contacts and stimulation settings, where changes in lead position or orientation generate a new finite element mesh and solution of the bioelectric field problem in near real-time, a timespan of approximately 10 seconds. This system also enables the simulation of multiple leads in close proximity to allow for current steering by varying anodes and cathodes on different leads. The techniques presented in this paper reduce the burden of generating and using computational models while providing meaningful feedback about the effects of electrode position, electrode design, and stimulation configurations to researchers or clinicians who may not be modeling experts.

The goal of this project is to develop an interactive, patient-specific modeling pipeline to simulate the effects of deep brain stimulation in near real-time and provide meaningful feedback as to how these devices influence neural activity in the brain.

Dirigidos a los tractos de fibras neuronales para la terapia de estimulación cerebral profunda mediante modelos interactivos, específico para cada paciente

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located in. Although traditional imaging techniques are useful in identifying protein interactions and morphology in fixed tissue, they are not able to give insight as to how quickly cells are able to bind and uptake proteins, and once activated how their morphology changes in vivo. In the present study, we ask 2 major questions: 1) what is the time-course of fibroblast activation via toll-like receptor-4 (TLR4) and lipopolysaccharide (LPS) interaction and 2) how do these cells behave once activated? Using 2-photon imaging, we have developed a novel technique to assess the ability of LPS-FITC to bind to its cognate receptor, TLR4, expressed on peripheral fibroblasts in the genetic reporter mouse line; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox&#160;in vivo. This unique approach allows researchers to create in-depth, time-lapse videos and/or pictures of proteins interacting with live cells that allows one to have an increased level of granularity in understanding how proteins can alter cellular behavior.

Morphological changes occur in immune responsive fibroblast cells following activation and promote alterations in cellular recruitment. Utilizing 2-photon imaging in conjunction with a genetically engineered Fibroblast-specific protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) mouse line and green fluorescently tagged lipopolysaccharide-FITC, we can illustrate highly specific uptake of lipopolysaccharide in dermal fibroblasts and morphological changes in vivo.

In Vivo 2-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...