我々は、議論とコメントのためのスザンナ·ヒューイット、特に、Skokラボのメンバーに感謝したいと思います。この作品は、健康補助金総合研究所R01GM086852、RC1CA145746（JAS）によってサポートされています。 JASは白血病リンパ腫協会の学者です。 JCは、がん研究所のア​​ーヴィング研究所フェロー。 MMは、国立科学財団助成統合大学院教育研究見習（NSF IGERT 0333389）によってサポートされています。

1。フルオロフォアとのDNAプローブのラベリング：ニック翻訳（〜6時間） <ol><li>クリーンBAC DNA（マキシプレップにより調製）またはプラスミドやPCR産物は、H 2 Oに再懸濁した全てが、標識に使用することができます注堅牢FISHの信号については、プローブは少なくとも10キロバイトに及ぶべきであること。 </li><li> 37℃（全ての試薬 ​​を表1に記載されています）で30分間のRNaseのDNAインキュベートする。 </li><li> 16℃（ 表2、表3を参照）で2時間、ニックトランスレーション反応をインキュベートする。直接標識の代替方法は、（：魚タグ、インビトロジェン例）を使用することができる。 </li><li> -80℃で1時間反応を不活性化する-20℃℃または一晩</li><li> 2％アガロースゲル上でプローブサイズを決定します。塗抹標本は、約300から500塩基対（Cy5でプローブのスミアが表示されていないことに注意してください ）での過半数で、100〜1,000 bpの間でなければなりません。 DNAが十分に消化されていない場合は、それ以上のDNA Pol IはとDNase Iを反応に添加し、16℃でさらに2時間インキュベートすることができます</li><li>暗闇の中で2時間、H 2 0で埋め2リットルビーカーで0.025ミリメートルフィルター上のプローブを精製する。 </li><li>次のようにプローブにブロッキング要因を追加します：COT-1 DNA、Hybloc10μgのDNAとDNAプローブ10μgのためのサケ精子の100μg10μgの。 -20℃で保存されたDNAプローブ</li></ol> 2。プローブ降水量/変性/プレアニーリング（3-4時間） <ol><li> 0.3μgおよびDNAプローブ1μgの間には、カバースリップあたりに使用されます。ミックス-80℃で1時間インキュベート3M NAACの0.1倍量（pH5.2）との100％エタノールを2.5倍量のプローブ、℃または-20℃で一晩、4℃、13,000 rpmでスピンダウン℃で30分間。 DNAプローブの量はDNAとハイブリダイゼーションの核領域の品質に応じて調整することができることに注意してください。直接標識の代替方法は、減少した量の使用を許すかもしれませんプローブ。 1スライド上の複数のDNA FISHシグナルの検出のために、異なるプローブ（反復配列のようなプレアニーリングしてはならないプローブを除く）一緒に沈殿させることができる。同時に行われ、いくつかの実験のためのプローブも一緒に析出させることができる。ペレットを軽く（プローブの少量が沈殿している場合は、ペレットが見えないかもしれません）を使用する蛍光団によると着色することがあります。 </li><li>乾燥ペレットと37から45℃（約20分間）で暗所（エッペンドルフサーモミキサーを使用して）を振とうしながらカバースリップあたり（ 表4を参照）15μlのハイブリダイゼーション緩衝液で再懸濁します。 </li><li> 75から95で5分間変性プローブ​​℃、 </li><li> 30〜60分間、37℃でプローブをプレアニール。プレアニールの長さは、プローブの複雑さと品質に応じて調整することができる。 </li><li>一晩ハイブリダイゼーション用のカバーガラス（セクション3を参照）にプローブを適用します。 </li></ol> 3。 3次元DNA魚 - 一日目（〜3時間） <ol><li>非接着細胞を1×PBS（カバースリップあたり5〜10μlの1×PBS中〜2×10 5細胞）を少量に濃縮し、ポリ-L-リジンコートカバースリップの中央にドロップされます。接着細胞は、少なくとも24時間（〜70％コンフルエント）（カバーガラスを0.1％ゼラチンでコーティングしてもよい）のカバースリップ上で培養されるべきである。スクエア18×18に24〜24ミリメートルのカバーを6ウェルプレートに配置され、プロトコル全体、各溶液2ミリリットルを（あるいはラウンド1.5mmのカバーガラスが12/24-wellプレートに配置することができます）ウェルあたりに使用されます。 </li><li> RT（4％PFAの株式は-20℃で保存し、等分することができます）で10分間、2％パラホルムアルデヒド/ 1×PBS、pHが7から7.4で細胞を固定してください。パラホルムアルデヒド（16％）溶液で購入することができ、または4％の原液を粉末/プリルから調製することができる。パラホルムアルデヒド粉末を調整し、氷の上で&gt; 60℃（pHは溶解を容易にするために8-9に増加させることができる）、冷却されたダウンで1X PBSに溶解さED pHが7から7.4にし、濾過し、ハヤブサに分注し、-20℃で週間保存</li><li> 1X PBSで3回洗浄した後、氷上で5分間冷やした冷0.4パーセントトリトン-X-100 / 1X PBSで細胞を透過。透過処理の長さは、細胞型に応じて調整することができるNBは ：DNAのFISHは免疫と組み合わされている場合は、免疫染色は（ セクション4を見てください）、この段階で行うべきである。 </li><li> 37℃で1時間、1×PBS、1×PBS中の0.1μg/μLのRNase Aを持つインキュベート細胞内で3回洗浄した後℃にカバースリップをパラフィルムで解決策または湿潤チャンバー内のスライドの100μlの上にドロップセル側を下に配置されます。カバースリップを慎重にピンセットで除去されます。任意の抵抗が発生した場合は、カバーガラスは、細胞の損傷を避けるために、1×PBSでフラッディングされなければなりません。 </li><li> 1X PBSで3回洗浄した後、氷上で10分間冷やした冷0.7パーセントトリトン-X-100 / 0.1M HCl中で細胞を透過。 </li><li> 3回洗浄した後、私nを1×PBS、室温で30分間1.9 M塩酸で変性細胞。交互に、細胞を少なくとも30分間75から80℃で50％ホルムアミド/ 2×SSC中で変性させることができます。ハイブリダイゼーション長（および温度）細胞型に応じて最適化することができることに注意してください 。 </li><li>氷冷1X PBSで3回洗浄した後、℃の暗多湿室で37℃で一晩プローブを用いて細胞をハイブリダイズする。カバーガラスをスライド上のプローブの15μlの上にドロップセル側を下に置かれ、ラバーセメントで封止されている。 </li></ol> 4。 3次元免疫魚 - 初日（6月7日〜HR） <ol><li>組み合わせた免疫蛍光DNA /魚のため、免疫染色は、0.4％トリトンX-100（ ステップ3.3）で透過処理した後に実行されるべきである。 </li><li>室温で30分（2.5％ウシ血清アルブミン（BSA）、10％正常ヤギ血清、0.1％のTween-20）のためにブロッキング溶液中で細胞をインキュベートします。ブロッキング溶液を濾過し、1.5mlのEppendorfsに等分し、mに格納されている-20℃でonths </li><li>湿潤チャンバー内の室温で1時間、タンパク質またはブロッキング溶液で希釈した関心のヒストン修飾に対して惹起された一次抗体を用いて細胞を培養する。ここでは、H2AXのリン酸化セリン-139（;詳細については、 表5を参照して 、γ-H2AX、ミリポア）に対する抗体の一例を示す。カバースリップをパラフィルムで解決策または湿潤チャンバー内のスライドの100μlの上にドロップセル側を下に配置されます。カバースリップを慎重にピンセット（必要に応じて1×PBSで水浸し）で削除されます。希釈およびインキュベーション長は抗体および細胞型の品質に応じて調整することができることに注意してください。 </li><li>振とうしながら、0.2％のBSA / 0.1％のTween-20/1×PBS、室温で3時間5分で細胞を洗浄します。 </li><li>暗くて湿ったチャンバー内で室温で1時間ブロッキング溶液で希釈した適切な蛍光色素標識二次抗体を用いて細胞をインキュベートします。ここでは、との検出の例を示す二次ヤギ抗マウス抗体（のAlexa Fluor 488または555、インビトロジェン、詳細については表5を参照）。ハプテン標識二次抗体（ビオチン、ジゴキシゲニン、等）を使用することもできる。この場合、適切な検出（ストレプトアビジン、抗DIG、etc）のための余分なステップは一晩、DNA-FISHハイブリダイゼーションの前または後に実行することができます。 </li><li>暗闇の中で振とうしながら、0.1％のTween-20/1×PBS、室温で3時間5分で細胞を洗浄します。 </li><li>暗闇の中で室温で10分間、2％パラホルムアルデヒド/ 1X PBSでポストフィックス細胞。 </li><li>前述のRNase A（ ステップ3.4）中でのインキュベーションからのDNA FISHを続ける。 </li></ol> 5。 3次元DNA FISH /免疫魚 - 2日目（〜2時間） <ol><li>慎重にラバーセメント、2X SSCと洪水のカバーを取り外し、慎重にピンセットで除去し、洗浄液を含むウェルの中に置いてください。 </li><li> 37℃で30分間振とうしながら、暗闇の中でCの2×SSC中で細胞を洗浄します。</li><li>振盪しながら、暗闇の中で、室温で30分間2×SSC中で細胞を洗浄します。 </li><li>振盪しながら、暗闇の中で、室温で30分間1×SSC中で細胞を洗浄ホルムアミドと変性の場合には、洗浄は、次のように置き換えなければならないことに注意してください：50％ホルムアミド/ 2×SSCおよび2x SSC、5で3回洗浄で3回洗浄37℃で、それぞれをmin℃に </li><li>全DNAの対比は1.5μg/ mlのDAPI（4,6 - ジアミジノ-2 - フェニル）を含むゴールドマウンティングメディウムを延長で細胞をマウントします。カバーガラスをスライド上に媒体をマウントの10〜15μlのドロップにセル側を下に配置し、マニキュアで封止されている。スライドは、-20℃で数ヶ月の​​ために保持されてい</li></ol> 6。 3D顕微鏡と分析<ol><li> 3D画像は、異なる顕微鏡システムで取得することができます。我々の実験では、0.3μm以下で区切ら光学切片はライカSP5 AOBS共焦点システム（音響光学ビームスプリッタ）で収集されます。 視神経の間の分離に注意してくださいリットルプレーンは分析の種類に応じて調整することができる。 </li><li> 3D画像スタックは、さまざまなソフトウェアやツールを用いて分析することができる。我々は、関心のある遺伝子座の間の距離の測定値を評価するために、サブ核コンパートメントまたはタンパク質と興味のある遺伝子座の協会の様々なタイプを分析するイメージJソフトを使用しています。 </li><li>異なる種類の細胞やステージ間の比較は、目的の異なる遺伝子座の間の比較：すべての統計分析は意義のペアごとの評価（複数可）と2（またはそれ以上）の異なる生物学的条件を比較するために行われている。 1.00E-3≤P≤1.00E-2 *;すべての統計的検定では、P値≤5.00E-2（= 0.05）（1.00E-2≤*著しいP≤5.00E-2重要であると解釈される*非常に重要な、P &lt;1.00E-3 ***非常に重要）。 </li></ol> 二つの対立遺伝子間の距離の全体の分布の統計解析。我々は最初のc我々はノンパラメトリック二標本コルモゴロフ·スミルノフ（KS）のテスト13,14を使用する実証的対立遺伝子間の距離の分布の差の有意性を評価する2 alleles.To間で測定された距離の範囲全体にわたって累積分布の周波数曲線をonstruct。 カットオフの最適な距離を使用して、2つの対立遺伝子の密接な関連の統計解析（すなわちペアリング）。二つの対立遺伝子または遺伝子座の間の距離で最も堅牢な差の範囲を指定するには、我々は2つのテールフィッシャー正確確率検定15秒のシリーズをご使用ください。すなわち、それぞれの測定距離で、我々は一つの条件が大幅に2つのサンプル間の短い距離で過剰表現されているかどうかをテストします。 P値の分布の最小値は、二つの対立遺伝子の密接な関連のカットオフ（ すなわちペアリング）として考慮されるべきである距離の範囲を示しています。続いて2テールフィッシャー正確確率検定は、tを使用されている同定されたカットオフ値15で2つの対立遺伝子のペアリングの意義を評価O。多重検定補正は16を実行フィッシャーテストの総数を考慮するために適用されます。 サブ核コンパートメントまたはタンパク質と目的の遺伝子座の協会の統計分析は、2つのテールフィッシャー正確確率検定は、異なる区画またはタンパク質15を用いて目的の遺伝子座の協会の意義を分析するために使用されます。

<ol>
	<li>Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+in+mouse+embryonic+stem+cells:+analysis+of+histone+modifications+and+transcriptional+activity+using+immunofluorescence+and+FISH.">X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH.</a> Methods in enzymology. , 376-405 (2004).</li><li>Cremer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+3D+fluorescence+in+situ+hybridization+for+imaging+interphase+chromosomes.">Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes.</a> Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).</li><li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunofluorescence,+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization,+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes,+transcriptional+activity,+nuclear+organization,+and+X-chromosome+inactivation.">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).</li><li>Solovei, I., Cremer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-FISH+on+cultured+cells+combined+with+immunostaining.">3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining.</a> Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).</li><li>Markaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+3D-FISH+and+super-resolution+structured+illumination+microscopy+for+studies+of+3D+nuclear+architecture:+3D+structured+illumination+microscopy+of+defined+chromosomal+structures+visualized+by+3D+(immuno)-FISH+opens+new+perspectives+for+studies+of+nuclear+architecture.">The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture.</a> BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).</li><li>Heard, E., Bickmore, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+gene+regulation+and+chromosome+territory+organisation.">The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation.</a> Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).</li><li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+sequence:+cellular+organization+of+genome+function.">Beyond the sequence: cellular organization of genome function.</a> Cell. 128, 787-800 (1016).</li><li>Fraser, P., Bickmore, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+organization+of+the+genome+and+the+potential+for+gene+regulation.">Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation.</a> Nature. 447, 413-417 (2007).</li><li>Cremer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+territories--a+functional+nuclear+landscape.">Chromosome territories--a functional nuclear landscape.</a> Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).</li><li>Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+function+of+nuclear+bodies.">Biogenesis and function of nuclear bodies.</a> Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).</li><li>Dostie, J., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+organization+in+the+nucleus+-+charting+new+territory+across+the+Hi-Cs.">Chromosome organization in the nucleus - charting new territory across the Hi-Cs.</a> Current opinion in genetics &amp; development. 22, 125-131 (2012).</li><li>van Steensel, B., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+tools+for+unraveling+chromosome+architecture.">Genomics tools for unraveling chromosome architecture.</a> Nature. 28, 1089-1095 (2010).</li><li>Massey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kolmogorov-Smirnov+Test+for+Goodness+of+Fit.">The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit.</a> Journal of the American Statistical Association. 253, 1951 (1951).</li><li>Collins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RUNX+transcription+factor-mediated+association+of+Cd4+and+Cd8+enables+coordinate+gene+regulation.">RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation.</a> Immunity. 34, 303-314 (2011).</li><li>Fisher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+interpretation+of+&#967;2+from+contingency+tables,+and+the+calculation+of+P.">On the interpretation of &#967;2 from contingency tables, and the calculation of P.</a> Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).</li><li>Benjamini, Y. H., Yosef, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+false+discovery+rate:+a+practical+and+powerful+approach+to+multiple+testing.">Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).</li><li>Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+accessibility,+nuclear+positioning,+recombination,+and+transcription+at+the+Igkappa+locus.">Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus.</a> J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).</li><li>Fuxa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax5+induces+V-to-DJ+rearrangements+and+locus+contraction+of+the+immunoglobulin+heavy-chain+gene.">Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene.</a> Genes Dev. 18, 411-422 (2004).</li><li>Goldmit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+ontogeny+of+the+Igk+locus+during+B+cell+development.">Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development.</a> Nature. 6, 198-203 (2005).</li><li>Hewitt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+the+Igk+and+Igh+immunoglobulin+loci+mediated+by+the+3'+Igk+enhancer+induces+'decontraction'+of+the+Igh+locus+in+pre-B+cells.">Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3' Igk enhancer induces 'decontraction' of the Igh locus in pre-B cells.</a> Nature. 9, 396-404 (2008).</li><li>Johnson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+Functionally+Segregates+the+Pro-B+Cell+Stage+by+Regulating+Transcription+of+Recombination+Mediators+across+Cell+Cycle.">IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle.</a> Journal of Immunology. , (2012).</li><li>Karnowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+and+nuclear+repositioning+of+the+lambda5+gene+locus+at+the+pre-b+cell+stage+requires+Aiolos+and+OBF-1.">Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1.</a> PLoS ONE. 3, e3568 (2008).</li><li>Kosak, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subnuclear+compartmentalization+of+immunoglobulin+loci+during+lymphocyte+development.">Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development.</a> Science. 296, 158-162 (2002).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yin+Yang+1+is+a+critical+regulator+of+B-cell+development.">Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development.</a> Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).</li><li>Parker, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pre-B-cell+receptor+induces+silencing+of+VpreB+and+lambda5+transcription.">The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription.</a> Embo J. 24, 3895-3905 (2005).</li><li>Roldan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locus+'decontraction'+and+centromeric+recruitment+contribute+to+allelic+exclusion+of+the+immunoglobulin+heavy-chain+gene.">Locus 'decontraction' and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene.</a> Nature immunology. 6, 31-41 (2005).</li><li>Skok, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonequivalent+nuclear+location+of+immunoglobulin+alleles+in+B+lymphocytes.">Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes.</a> Nature. 2, 848-854 (2001).</li><li>Skok, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+contraction+by+looping+of+the+Tcra+and+Tcrb+loci+in+rearranging+thymocytes.">Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes.</a> Nature immunology. 8, 378-387 (2007).</li><li>Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+element+in+the+mouse+Igkappa+locus+that+specifies+repertoire+and+Ig+loci+subnuclear+location.">A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location.</a> Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).</li><li>Hewitt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAG-1+and+ATM+coordinate+monoallelic+recombination+and+nuclear+positioning+of+immunoglobulin+loci.">RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci.</a> Nature immunology. 10, 655-664 (2009).</li><li>Deriano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAG2+C+terminus+suppresses+genomic+instability+and+lymphomagenesis.">The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis.</a> Nature. 471, 119-123 (2011).</li><li>Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+repositioning+of+genes+in+the+nucleus+of+lymphocytes+preparing+for+cell+division.">Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division.</a> Molecular cell. 3, 207-217 (1999).</li><li>Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX:+the+histone+guardian+of+the+genome.">H2AX: the histone guardian of the genome.</a> DNA repair. 3, 959-967 (2004).</li><li>Croft, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+localization+and+morphology+of+chromosomes+in+the+human+nucleus.">Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus.</a> The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).</li><li>Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Xist+RNA+in+the+formation+of+a+repressive+nuclear+compartment+into+which+genes+are+recruited+when+silenced.">A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced.</a> Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).</li><li>Walter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+many+colors+in+FISH+on+3D-preserved+interphase+nuclei.">Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei.</a> Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).</li><li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+wave+of+cellular+imaging.">A new wave of cellular imaging.</a> Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).</li><li>Dobbie, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMX:+a+new+platform+for+multimodal,+multichannel+wide-field+imaging.">OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).</li><li>Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+with+high-complexity+repeat-free+oligonucleotide+probes+generated+by+massively+parallel+synthesis.">Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis.</a> Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).</li></ol>

著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

上記の詳細テクニックは、リンパ球の30,31を開発中の免疫グロブリンおよびTCRA / D座のV（D）J組み換えの規制を分析するために私たちの研究室で使用されていた。我々は、この技術は、異なる細胞型では、様々な核タンパク質、核コンパートメントと遺伝子座の検出に適応させることができると確信しています。プロトコルの修正が必要になることがあり、この場合に集中する主な手順は次のとおりです。まず、透過処理の長さは、細胞型に応じて調整することができる。一次抗体のインキュベーションの第2の長さはまた、抗体の質と目的のタンパク質（例えば、いくつかのケースでは、インキュベーションを4℃で一晩行うことができる）の豊富さに応じて調整することができる。重要なのは、変性ステップを適応させることができ、HCl処理は、DNA FISH 20のホルムアミド3,4,34とNaOHで変性することによって置き換えられる可能性があります。また繰り返す液体窒素のED凍結融解サイクルは、DNA FISH単独で4,34のために固定化/透過処理後に細胞に適用することができる。いくつかのヒストン修飾、RNAポリメラーゼIIと補因子が正常にこの方法30,35を用いて検出されたが最後、他の核内タンパク質の免疫染色は、DNA FISHハイブリダイゼーション4の後に実行することができる。 3D画像解析は、広視野落射蛍光（デコンボリューションと相まって）と共焦点レーザー顕微鏡顕微鏡36を含む異なる種類の、の使用を含むことができます。撮像方法の選択が必要な解像度に依存しますが、蛍光団の数は、サンプルとDNAやタンパク質の信号の質の深さ。新しい高分解能顕微鏡の開発は、核と細胞プロセス37から39までの正確な可視化に完全に新しい道を開きます。 generatioためにさらに、新技術n（いいえ）反復配列を含まないカスタムメイドのプローブのエクソン40の複雑なプールに、15キロバイト特定の遺伝子座から、ゲノム領域のクリーンな検出を可能にする。これは核プロセスのダイナミクスを追跡する高分解能顕微鏡の精度と感度を向上させます。

エピジェネティックなメカニズムトリガ成立と発達と細胞型特異的転写プロファイルの継承。 1レベルでこれは、アクティブまたはサイレントゲノム領域を定義クロマチン包装の変調を伴う。大規模に、ゲノムと核構造のグローバル3D組織はまた、転写パターンの制御に役割を果たしています。したがって、これらのepigenomic機能の解剖は、遺伝子が6-11を規制されている方法を完全に理解するために不可欠です。 組み合わせた免疫蛍光法および3DのDNA FISHは、特異的な相互作用/核内のDNA配列および/またはタンパク質の関連を評価することによって、分子および生化学的解析を補完するユニークな機会を提供します。さらに、このようなクロマチン免疫沈降（ChIP-seq）が染色体またはキャプチャのコンフォメーションなどのゲノムワイドなハイスループット技術は深いシーケンシングと相まってしばらく（4C-SEQ、5Cは、Hi-C）にグローバルdatを提供細胞集団は12日 、免疫蛍光/ DNA FISHの技術は、単一細胞レベルでの解析を可能にします。 ここでは、3D顕微鏡や分析（3D免疫FISH）が続いたDNA FISHによって免疫蛍光法およびDNA配列によってヒストン修飾の同時検出のためのプロトコルを記述します。このプロトコルの利点は、DNAやタンパク質の構造の保全を組み合わせた視覚化したものです。この分野での我々の経験では、既存のプロトコルを改善し、簡素化することができるようになりました。我々は組換えを受けてリンパ球におけるDNA二本鎖切断を検出するには、このプロトコルを使用していたが、この方法は、他のタンパク質と他の細胞型に適用することができます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td>フィッシャー</td><td> ＃BP2470 </td><td></td></tr><tr><td>アーゼ</td><td>シグマ</td><td> ＃R4642 </td><td></td></tr><tr><td>のdNTP </td><td>シグマ</td><td> ＃DNTP100 </td><td></td></tr><tr><td>アレクサdUTPを</td><td>インビトロジェン</td><td> C-11401に＃C11397 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3またはCy5 dUTPを</td><td>フィッシャー</td><td> ＃45-001-XXX </td><td></td></tr><tr><td> DNase Iを</td><td>ロッシュ</td><td> ＃04536282001 </td><td></td></tr><tr><td> DNA Pol Iは</td><td>バイオラボズ</td><td> ＃M0209 </td><td></td></tr><tr><td> 0.025μmフィルター</td><td> Millipor電子</td><td> ＃VSWP02500 </td><td></td></tr><tr><td> COT-1 DNAを1 mg / mlの</td><td>インビトロジェン</td><td> ＃18440 </td><td></td></tr><tr><td> Hybloc DNAを1 mg / mlの</td><td>応用遺伝学</td><td> ＃MHB </td><td></td></tr><tr><td>サケ精子</td><td>シグマ</td><td> ＃D1626 </td><td>粉末をH 2 O中に10 mg / mlで再懸濁される</td></tr><tr><td> NAAC（酢酸ナトリウム、pH 5.2緩衝液） </td><td>シグマ</td><td> ＃S7899 </td><td></td></tr><tr><td>フィコール400（モルBIOLグレード） </td><td>フィッシャー</td><td>第525位</td><td></td></tr><tr><td>ポリビニルピロリドン（MOL BIOLグレード） </td><td>フィッシャー</td><td> ＃BP431 </td><td></td></tr><tr><td>デキストラン硫酸パウダー</td><td>シグマ</td><td> ＃D8906 </td><td></td></tr><tr><td> SSPE（生理食塩水リン酸ナトリウム、EDTA）を20倍ソリューション</td&gt; <td>フィッシャー</td><td> ＃BP1328 </td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>フィッシャー</td><td> ＃BP227 </td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>フィッシャー</td><td> ＃12-548-B </td><td></td></tr><tr><td>スライド</td><td>フィッシャー</td><td> ＃12から550 </td><td></td></tr><tr><td> 6ウェルプレート</td><td>フィッシャー</td><td> ＃0720080 </td><td></td></tr><tr><td> 10×PBS、 </td><td>フィッシャー</td><td> ＃MT-46-013-CM </td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン溶液</td><td>シグマ</td><td> ＃P8920 </td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、プリル、95％ </td><td>シグマ</td><td> ＃441244 </td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100、MOL BIOLグレード</td><td>シグマ</td><td> ＃T8787 </td><td></td></tr><tr><td> BSA（ウシ血清アルブミン）フラクションV </td><td>フィッシャー</td><td> ＃BP 1600 </td><td></td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>ベクトルラボ</td><td> ＃S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20を、モルBIOLグレード</td><td>シグマ</td><td> ＃P9416 </td><td></td></tr><tr><td> SSC（食塩クエン酸ナトリウム）20倍ソリューション</td><td>フィッシャー</td><td> ＃BP1325 </td><td></td></tr><tr><td> Gold退色防止試薬を延長</td><td>インビトロジェン</td><td> ＃P36930 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI（4 &#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール） </td><td>シグマ</td><td> ＃D9542 </td><td></td></tr><tr><td>最高のテスト1コートラバーセメント</td><td>アートやオフィス用品店</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表1に特異的な試薬及び小型機器。 </td></tr></tbody></table>

combined immunofluorescence and dna fish on 3d-preserved interphase nuclei to study changes in 3d nuclear organization

3D共焦点顕微鏡（3DのDNA FISH）を、続いて3次元的に保存核にDNAプローブを用いた蛍光 in situハイブリダイゼーションは、個々の細胞における遺伝子座の位置、サブ領域の染色体または全体の領土を視覚化するための最も直接的な方法を表しています。このタイプの分析は、核のグローバルアーキテクチャだけでなく、核空間内の特定のゲノム遺伝子座や地域の行動への洞察を提供します。免疫蛍光法は、他の一方で、核タンパク質の検出（修正ヒストン、ヒストンバリアントと修飾、転写機構や要因、原子力サブコンパートメントなど）を許可します。免疫蛍光法および3DのDNA FISHを組み合わせるにおける主要な課題は核の3Dアーキテクチャと同様に抗体によって検出されるエピトープを保持する一方であり、他方では、DNAプローブの浸透が検出できるように遺伝子座や染色体テリトリーの1月5日。ここでは、3D保存核内ゲノム遺伝子座とクロマチン修飾の可視化を組み合わせたプロトコルを提供します。

DNAと免疫FISHはBおよびTリンパ球の開発時に抗原受容体遺伝子座のV（D）J組み換えのプロセスに関連付けられている核の組織の変化を研究するためにSkokラボで使用されています。私に私たちを有効にする）遺伝子座の両端（収縮）の間の測定距離は上記の詳細技術ⅱ）対立遺伝子または遺伝子座の間の測定距離（ペアリング）、iii）は座、静脈内で発生するDNA損傷を解析するには）対立遺伝子の位置を評価すると（我々の研究では抑圧的なセントロメアヘテロクロマチン）サブコンパートメント核、およびvの相対座は）対立遺伝子と遺伝子座（我々の研究では、γ-H2AXのリン酸化ヒストンの協会）に核タンパク質の関連を評価する。特に、我々はB細胞の17から30を開発中の免疫グロブリン遺伝子座の V（D）J組換えの制御における軌跡ダイナミクスの役割を分析し、CD4 +およびCD8 + Tの間に系譜コミットメントの調節にセル14。我々はまた、コンビナーゼタンパク質RAG2 31の変異型を運ぶT細胞の開発には、T細胞受容体遺伝子座の一つ、TCRA / dでDNA損傷を評価した。 <img src="/files/ftp_upload/50087/50087fig1.jpg" alt="図1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50087/50087fig1highres.jpg" /> 図1。二つの対立遺伝子または遺伝子座の間の距離の解析（A）共焦点のセクションでは、個々の核内で対になっていない代表（右）またはペア（左）対立遺伝子を示す。のDNA FISHプローブは、目的の遺伝子座にまたがるBAC（〜200キロバイト）から生成されました。対立遺伝子間の距離は、3D画像スタック内の各BAC信号の重心との間で測定した。破線の円は、核の形状を簡単に説明します。スケールバー=1μmである。 （B）の累積度数分布曲線は、2つの対立遺伝子間の距離の全範囲を示す■2つの異なる生物学的条件（野生型対変異）で測定。ノンパラメトリック二標本KSテストは2つの分布間の差の有意性を評価するために使用されていました。間対立遺伝子の距離で最も堅牢な差の範囲は、二尾フィッシャー正確検定（ブルードット）のシリーズを使用して評価した。最も堅牢なP値は（高いドット）1μm付近の距離でした。したがって、2つの対立遺伝子の密接な関係（ つまり、ペアリング）のカットオフは1μmに設定された。 （C）の累積度数曲線は、2つの異なった生物学的条件で0から1.5μmから2対立遺伝子間の距離を示す。二つの対立遺伝子のペアリングの意義は、1μmでカットオフするための2つのテールフィッシャー正確確率検定を用いて評価した。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50087/50087fig1large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 図2。サブ核コンパートメントに相対座の位置の解析。我々の研究では、我々の興味のある遺伝子座およびセントロメアヘテロクロマチン（PCH）32によって形成された抑圧的なサブ核コンパートメントとの間の関係を分析する。目的の遺伝子座のためのBAC信号は、PCH（BACおよびγ-サテライトDNA FISHシグナルのエッジ間ではピクセル）にハイブリダイズする、γ-衛星信号と隣接または重複するときは、PCHの対立にあると見なされます。共焦点セクションPCHに対する相対TCRA対立遺伝子の位置の代表：PCHにある（ 上 ）ノー対立、（ 中東 ）、PCHで一つの対立、（ 下 ）PCHにおける二つの対立。赤の軌跡、そして白のγ-衛星。黄色の矢印は、PCHにある対立遺伝子を示す。破線の円は、核の形状を概説。スケールバー=1μmである。 <img src="/files/ftp_upload/50087/50087fig3.jpg" alt="図3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50087/50087fig3highres.jpg"/> 図3。核タンパク質と遺伝子座上のヒストン修飾の関連を分析した結果、（A）我々の研究では、DNAの二重のために、私たちの興味のある遺伝子座およびヒストンH2AX（γ-H2AX）のリン酸化形態の関係をとして読み出し解析本鎖切断33。共焦点のセクションでは、個々の核内に1 TCRA対立遺伝子（ 下 ）上の無γ-H2AX協会（ トップ ）若しくは団体の例を示しています。 γ-H2AXに関連付けられているとして、BAC信号および免疫蛍光巣が少なくとも部分的に重なっていた場合、対立遺伝子が（共局在の少なくとも1つの画素）定義されていました。座は白に赤とγ-H2AXに示されている。破線の円輪郭Nucleus形状。スケールバー=1μmである。 それはPCHまたはγ-H2AX病巣BACに信号の共局在化分析が自動化されたしきい値なしでイメージJソフトウェアを使用して手動で実行されていることに注意です。（B）は変性した後、γ-H2AXの信号の一部の損失であるこの免疫のDNA FISHプロトコルによって提起される主要な技術的な質問の1。ここでは、前（ 上 ）と（ 下 ）塩酸ベースの変性処理（ホルムアミド処理（図示せず）が同様の結果が得られた）後の免疫の一例を示す。信号が弱かったが、染色の主な機能は、特に病巣の数は、治療後に残っている。ライカ共焦点SP5を使用して、前と変性後561レーザーの設定は以下のとおりであった：35％のパワー/スマートゲイン730Vで、それぞれ750Vで45％の電力/スマートゲイン。さらに、我々はここで別のヒストンmの免疫蛍光染色の例を示し以前に1,3公開されているように、このプロトコルは、他のヒストンマークにも適用できることを示すodification、H3K27me3（ 右パネル ）。 γ-H2AXは赤に黄色とH3K27me3に示されている。破線の円は、核の形状を簡単に説明します。スケールバー=2μmである。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50087/50087fig3large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> Catalogm番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td>フィッシャー</td><td> ＃BP2470 </td><td></td></tr><tr><td>アーゼ</td><td>シグマ</td><td> ＃R4642 </td><td></td></tr><tr><td>のdNTP </td><td>シグマ</td><td> ＃DNTP100 </td><td></td></tr><tr><td>アレクサdUTPを</td><td>インビトロジェン</td><td> ＃C11397はC-11401 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3またはCy5 dUTPを</td><td>フィッシャー</td><td> ＃45-001-XXX </td><td></td></tr><tr><td> DNase Iを</td><td>ロッシュ</td><td> ＃04536282001 </td><td></td></tr><tr><td> DNA Pol Iは</td><td>バイオラボズ</td><td> ＃M0209 </td><td></td></tr><tr><td> 0.025μmフィルター</td><td>ミリポア</td><td> ＃VSWP02500 </td><td></td></tr><tr><td> COT-1 DNAを1 mg / mlの</td><td>インビトロジェン</td><td> ＃18440 </td><td></td></tr><tr><td> Hybloc DNAを1 mg / mlの</td><td>応用遺伝学</td><td> ＃MHB </td><td></td></tr><tr><td>サケ精子</td><td>シグマ</td><td> ＃D1626 </td><td>粉末をH 2 O中に10 mg / mlで再懸濁される</td></tr><tr><td> NAAC（酢酸ナトリウム、pH 5.2緩衝液） </td><td>シグマ</td><td> ＃S7899 </td><td></td></tr><tr><td>フィコール400（モルBIOLグレード） </td><td>フィッシャー</td><td>第525位</td><td></td></tr><tr><td>ポリビニルピロリドン（MOL BIOLグレード） </td><td>フィッシャー</td><td> ＃BP431 </td><td></td></tr><tr><td>デキストラン硫酸パウダー</td><td>シグマ</td><td> ＃D8906 </td><td></td></tr><tr><td> SSPE（生理食塩水リン酸ナトリウム、EDTA）を20倍ソリューション</td><td>フィッシャー</td><td> ＃BP1328 </td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>フィッシャー</td><td> ＃BP227 </td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>フィッシャー</td><td> ＃12-548-B </td><td></td></tr><tr><td>スライド</td><td>フィッシャー</td><td> ＃12から550 </td><td></td></tr><tr><td> 6ウェルプレート</td><td>フィッシャー</td><td> ＃0720080 </td><td></td></tr><tr><td> 10×PBS、 </td><td>フィッシャー</td><td> ＃MT-46-013-CM </td><td></td></tr><tr><td&gt;ポリ-L-リジン溶液</td><td>シグマ</td><td> ＃P8920 </td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、プリル、95％ </td><td>シグマ</td><td> ＃441244 </td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100、MOL BIOLグレード</td><td>シグマ</td><td> ＃T8787 </td><td></td></tr><tr><td> BSA（ウシ血清アルブミン）フラクションV </td><td>フィッシャー</td><td> ＃BP 1600 </td><td></td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>ベクトルラボ</td><td> ＃S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20を、モルBIOLグレード</td><td>シグマ</td><td> ＃P9416 </td><td></td></tr><tr><td> SSC（食塩クエン酸ナトリウム）20倍ソリューション</td><td>フィッシャー</td><td> ＃BP1325 </td><td></td></tr><tr><td> Gold退色防止試薬を延長</td><td>インビトロジェン</td><td> ＃P36930 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI（4 &#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール）</td><td>シグマ</td><td> ＃D9542 </td><td></td></tr><tr><td>最高のテスト1コートラバーセメント</td><td>アートやオフィス用品店</td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 表1に特異的な試薬及び小型機器。 <table border="1"><tbody><tr><td> アレクサ·フルオロフォアと相まってdUTPを使用してNT </td><td> 量 </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td> 10μgのDNA </td><td> μlのX </td><td></td></tr><tr><td>アーゼ - 0.17μg/μLの</td><td> 10μlの</td><td></td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 260μlに埋める</td><td></td></tr><tr><td>合計 - 37℃で30分間</td><td> 260μlを</td><td></td></tr><tr><td> 10倍のNTバッファー</td><td> 50μlの</td><td> 1X </td></tr><tr><td> 100mMの＆であるTA; - メルカプトエタノール</td><td> 50μlの</td><td> 10μMの</td></tr><tr><td> dNTPミックス</td><td> 40μlの</td><td> 40μMの各dNTP </td></tr><tr><td> 0.1mMのdTTPを</td><td> 50μlの</td><td> 10μMの</td></tr><tr><td> 1mMのアレクサのdUTP </td><td> 12μlの</td><td> 30μMの</td></tr><tr><td> DNアーゼI（ワーキング溶液、下記の表を参照してください） </td><td> 30μlの</td><td></td></tr><tr><td> DNA Pol Iは</td><td> 7.5μlの</td><td> 15 U / mlの</td></tr><tr><td>合計 - 16℃で2時間</td><td> 500μlの</td><td></td></tr><tr><td> Cy3またはCy5で結合されたdUTPを使用してNT </td><td> 量 </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td> 10μgのDNA </td><td> μlのX </td><td></td></tr><tr><td>アーゼ - 0.17μg/μLの</td><td> 10μlの</td><td></td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 300μlに埋める</td><td></td></tr><tr><td>合計 - 37℃で30分間</td><td> 300μlの</td><td></td></tr><tr><td> 10倍のNTバッファー</td><td> 50μlの</td><td> 1X </td></tr><tr><td> 100mMのβ-メルカプトエタノール</td><td> 50μlの</td><td> 10μMの</td></tr><tr><td> dNTPミックス</td><td> 50μlの</td><td> 50μMの各dNTP </td></tr><tr><td> 1mMののCy3またはCy5-dUTPを</td><td> 12μlの</td><td> 30μMの</td></tr><tr><td> DNase Iを</td><td> 〜30μlの</td><td> 〜1.2 U /μlの</td></tr><tr><td> DNA Pol Iは</td><td> 7.5μlの</td><td> 15 U / mlの</td></tr><tr><td>合計 - 16℃で2時間</td><td> 500μlの</td><td></td></tr></tbody></table> 10μgのDNAについては、 表2。RNase A処理とニック翻訳。 <table border="1"><tbody><tr><td> ソリューション </td><td></td><td> ストック </td></tr><tr><td>アーゼ</td><td> 実用的なソリューション ：0.17μg/μLの</td><td>新鮮で構成</td></tr><tr><td> 10xのNTのバッファ： </td><td> 0.5Mトリス-HCl、pH 8、50 mMのMgCl 2、0.5 mg / mlのBSA </td><td> -20℃で1.5 mlチューブ</td></tr><tr><td> dNTPを混在さ： </td><td>のdATP、dCTP、およびdGTP：0.5mMのH 2 O中の各</td><td> -20°Cで1.5 mlチューブ</td></tr><tr><td> DNアーゼI： </td><td> ストック溶液 ：20mMのトリスpH 7.5/50％glycerol/50 mMのNaClに20,000 U / mlとなるように再構成</td><td> -20℃で0.5 mlチューブ</td></tr><tr><td></td><td> ワーキング溶液 ：DNase Iストック溶液のそれぞれの新しいバッチは、（10 U / mlで、H 2 O中の20単位/ ml、40 U / ml）を異なる希釈でテストする必要があります。 100〜1,000 bpの（参照間のDNAのスメアを与える希釈ステップ5）は実用的なソリューションとして使用する必要があります。 </td><td>新鮮で構成</td></tr></tbody></table> 表3。RNase A処理とニック翻訳のためのソリューション。 <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> ハイブリダイゼーション緩衝液 </td><td> ソリューション </td><td> ストック </td></tr><tr><td> 10パーセント</td><td> 50倍デンハルト溶液： </td><td> 1グラムフィコール400、1グラムポリビニルピロリドンと100 mlのH 2 0 -フィルタされた</td><td> -20℃で50mlファルコン</td></tr><tr><td> 40パーセント</td><td> 25パーセント硫酸デキストラン： </td><td>デキストラン硫酸パウダー℃で37から65で12.5x SSPE中に溶解させる</td><td> -20℃で50mlファルコン</td></tr><tr><td> 50パーセント</td><td>ホルムアミド</td><td></td><td> 4℃でボトル</td></tr><tr><td colspan="4"> 1.5 mlのEppendorfsでアリコートを-20＆で保存される度、C </td></tr></tbody></table> 表4。ハイブリダイゼーション緩衝液。 <table border="1"><tbody><tr><td> 抗体 </td><td> サプライヤー </td><td> カタログ番号 </td><td> 希釈 </td></tr><tr><td> γ-H2AX - モノクローナルホスホH2A.X、クローンJBW301、マウス</td><td>ミリポア</td><td> ＃05636 </td><td> 200分の1 </td></tr><tr><td> H3K27me3、クローン、ウサギポリクローナル</td><td>ミリポア</td><td> ＃07449 </td><td> 200分の1 </td></tr><tr><td>のAlexa Fluor 555ロバ抗マウス</td><td>インビトロジェン</td><td> ＃-31570 </td><td> 500分の1 </td></tr><tr><td>のAlexa Fluor 488ヤギ抗マウス</td><td>インビトロジェン</td><td> ＃-11001 </td><td> 500分の1 </td></tr><tr><td>のAlexa Fluor 488ヤギ抗ウサギ</td><td>インビトロジェン</td><td> ＃-11008 </td><td> 500分の1 </td> &lt;/ TR&gt; </tbody></table> 表5一次抗体および二次抗体。

Watch this Scientific Journal Video about Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization at JoVE.com

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

ここでは、3D顕微鏡や分析（3D免疫DNA FISH）が続いたDNA FISHによる蛍光抗体法およびDNA配列によるヒストン修飾の同時検出のためのプロトコルを記述します。

3D原子力組織の変化を研究するために3D保存状態間期核に組み合わさ免疫やDNA FISH

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

combined-immunofluorescence-dna-fish-on-3d-preserved-interphase

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.3K ビュー.  New York University School of Medicine. ここでは、3D顕微鏡や分析（3D免疫DNA FISH）が続いたDNA FISHによる蛍光抗体法およびDNA配列によるヒストン修飾の同時検出のためのプロトコルを記述します。

ビデオ: Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

DNA 変更染色: 共焦点画像の数値解析

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

遺伝学

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a better understanding of tumor heterogeneity and thus facilitate the selection of patients for personalized treatment. However, this is hampered because of the rarity of CTCs. We present an innovative approach for sampling a high volume of the patient blood and obtaining information about presence, phenotype, and gene translocation of CTCs. The method combines immunofluorescence staining and DNA fluorescent-in-situ-hybridization (DNA FISH) and is based on a functionalized medical wire. This wire is an innovative device that permits the in vivo isolation of CTCs from a large volume of peripheral blood. The blood volume screened by a 30-min administration of the wire is approximately 1.5-3 L. To demonstrate the feasibility of this approach, epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) expression and the chromosomal translocation of the ALK gene were determined in non-small-cell lung cancer (NSCLC) cell lines captured by the functionalized wire and stained with an immuno-DNA FISH approach. Our main challenge was to perform the assay on a 3D structure, the functionalized wire, and to determine immuno-phenotype and FISH signals on this support using a conventional fluorescence microscope. The results obtained indicate that catching CTCs and analyzing their phenotype and chromosomal rearrangement could potentially represent a new companion diagnostic approach and provide an innovative strategy for improving personalized cancer treatments.

We present a new approach to characterize tumor cells. We combined immunofluorescence with DNA fluorescent-in-situ-hybridization to evaluate cells captured by a functionalized medical wire capable of in vivo enriching CTCs directly from patient blood.

循環腫瘍細胞を取り込むため医療用ワイヤー線を用いた腫瘍細胞の特性解析: 蛍光抗体法や DNA 魚に基づく 3 D アプローチ

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

がん研究

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene expression, cell identity and differentiation. Many approaches developed to study the 3D architecture of the genome can be divided into two complementary categories: chromosome conformation capture based technologies (C-technologies) and imaging. While the former is based on capturing the chromosome conformation and proximal DNA interactions in a population of fixed cells, the latter, based on DNA fluorescence in situ hybridization (FISH) on 3D-preserved nuclei, allows contemporary visualization of multiple loci at a single cell level (multicolor), examining their interactions and distribution within the nucleus (3D multicolor DNA FISH). The technique of 3D multicolor DNA FISH has a limitation of visualizing only a few predetermined loci, not permitting a comprehensive analysis of the nuclear architecture. However, given the robustness of its results, 3D multicolor DNA FISH in combination with 3D-microscopy and image reconstruction is a possible method to validate C-technology based results and to unambiguously study the position and organization of specific loci at a single cell level. Here, we propose a step by step method of 3D multicolor DNA FISH suitable for a wide range of human primary cells and discuss all the practical actions, crucial steps, notions of 3D imaging and data analysis needed to obtained a successful and informative 3D multicolor DNA FISH within different biological contexts.

3D multicolor DNA FISH represents a tool to visualize multiple genomic loci within 3D preserved nuclei, unambiguously defining their reciprocal interactions and localization within the nuclear space at a single cell level. Here, a step by step protocol is described for a wide spectrum of human primary cells.

ヒト初等細胞の核アーキテクチャを研究する3D多色DNA FISHツール

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk of conceiving an aneuploid fetus increases dramatically and this phenomenon is known as the maternal age effect. One requirement for accurate chromosome segregation during the meiotic divisions is maintenance of sister chromatid cohesion during the extended prophase period that oocytes experience. Cytological evidence in both humans and model organisms suggests that meiotic cohesion deteriorates during the aging process. In addition, segregation errors in human oocytes are most prevalent during meiosis I, consistent with premature loss of arm cohesion. The use of model organisms is critical for unraveling the mechanisms that underlie age-dependent loss of cohesion. Drosophila melanogaster offers several advantages for studying the regulation of meiotic cohesion in oocytes. However, until recently, only genetic tests were available to assay for loss of arm cohesion in oocytes of different genotypes or under different experimental conditions. Here, a detailed protocol is provided for using fluorescence in situ hybridization (FISH) to directly visualize defects in arm cohesion in prometaphase I and metaphase I arrested Drosophila oocytes. By generating a FISH probe that hybridizes to the distal arm of the X chromosome and collecting confocal Z stacks, a researcher can visualize the number of individual FISH signals in three dimensions and determine whether sister chromatid arms are separated. The procedure outlined makes it possible to quantify arm cohesion defects in hundreds of Drosophila oocytes. As such, this method provides an important tool for investigating the mechanisms that contribute to cohesion maintenance as well as the factors that lead to its demise during the aging process.

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

This manuscript presents a detailed method for generating X-chromosome arm probes and performing fluorescence in situ hybridization (FISH) to examine the state of sister chromatid cohesion in prometaphase and metaphase I arrested Drosophila oocytes. This protocol is suitable for determining whether meiotic arm cohesion is intact or disrupted in different genotypes.

Prometaphase の腕凝集度と中期の状態を監視する蛍光In Situハイブリダイゼーション (魚) を使用して私はショウジョウバエの卵母細胞

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

発生生物学

ヒト初代細胞における核タンパク質染色の解析ワークフロー

A Versatile Pipeline for Analyzing Dynamic Changes in Nuclear Bodies in a Variety of Cell Types

Various nuclear processes, such as transcriptional control, occur within discrete structures known as foci that are discernable through the immunofluorescence technique. Investigating the dynamics of these foci under diverse cellular conditions via microscopy yields valuable insights into the molecular mechanisms governing cellular identity and functions. However, performing immunofluorescence assays across different cell types and assessing alterations in the assembly, diffusion, and distribution of these foci present numerous challenges. These challenges encompass complexities in sample preparation, determination of parameters for analyzing imaging data, and management of substantial data volumes. Moreover, existing imaging workflows are often tailored for proficient users, thereby limiting accessibility to a broader audience.
In this study, we introduce an optimized immunofluorescence protocol tailored for investigating nuclear proteins in different human primary T cell types that can be customized for any protein of interest and cell type. Furthermore, we present a method for unbiasedly quantifying protein staining, whether they form distinct foci or exhibit a diffuse nuclear distribution.
Our proposed method offers a comprehensive guide, from cellular staining to analysis, leveraging a semi-automated pipeline developed in Jython and executable in Fiji. Furthermore, we provide a user-friendly Python script to streamline data management, publicly accessible on a Google Colab notebook. Our approach has demonstrated efficacy in yielding highly informative immunofluorescence analyses for proteins with diverse patterns of nuclear organization across different&#160;contexts.

著者スポットライト:免疫蛍光アッセイを用いたヒト細胞の可塑性と環境適応性を調査するための包括的なエピジェネティック解析(英語)

This method describes an immunofluorescence protocol and quantification pipeline for evaluating protein distribution with varied nuclear organization patterns in human T lymphocytes. This protocol provides step-by-step guidance, starting from sample preparation and continuing through the execution of semi-automated analysis in Fiji, concluding with data handling by a Google Colab notebook.

さまざまな細胞タイプの原子核体の動的変化を解析するための汎用性の高いパイプライン

Various nuclear processes, such as transcriptional control, occur within discrete structures known as foci that are discernable through the ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

直接標識プローブを用いた堅牢な3DのDNA FISH

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

生物学

Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve the three-dimensional chromatin arrangement of testicular germ cells found in mice; this method has been termed as the three-dimensional (3D) slide method. In this method, testicular tubules are directly treated with a permeabilization step that removes cytoplasmic material, followed by a fixation step that fixes nuclear materials. Tubules are then dissociated, the cell suspension is cytospun, and cells adhere to slides. This method improves sensitivity towards detection of subnuclear structures and is applicable for immunofluorescence, DNA, and RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) and the combination of these detection methods. As an example of a possible application of the 3D slide method, a Cot-1 RNA FISH is shown to detect nascent RNAs. The 3D slide method will facilitate the detailed examination of spatial relationships between chromatin structure, DNA, and RNA during testicular germ cell differentiation.

The material here describes a method developed to preserve the three-dimensional chromatin structure of testicular germ cells. This has been termed the three-dimensional (3D) slide method. This method improves sensitivity for detection of subnuclear structures and is applicable for immunofluorescence, DNA, and RNA fluorescence in situ hybridization (FISH).

精巣生殖細胞の三次元クロマチンアーキテクチャを保存するためのスライド調製方法

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

3D原子力組織の変化を研究するために3D保存状態間期核に組み合わさ免疫やDNA FISH

要約

さらに動画を探す

この動画の章

DNA 変更染色: 共焦点画像の数値解析

循環腫瘍細胞を取り込むため医療用ワイヤー線を用いた腫瘍細胞の特性解析: 蛍光抗体法や DNA 魚に基づく 3 D アプローチ

ヒト初等細胞の核アーキテクチャを研究する3D多色DNA FISHツール

Prometaphase の腕凝集度と中期の状態を監視する蛍光In Situハイブリダイゼーション (魚) を使用して私はショウジョウバエの卵母細胞

さまざまな細胞タイプの原子核体の動的変化を解析するための汎用性の高いパイプライン

さまざまな細胞タイプの原子核体の動的変化を解析するための汎用性の高いパイプライン

さまざまな細胞タイプの原子核体の動的変化を解析するための汎用性の高いパイプライン

直接標識プローブを用いた堅牢な3DのDNA FISH

精巣生殖細胞の三次元クロマチンアーキテクチャを保存するためのスライド調製方法

組み合わせたDNA-RNA蛍光