The authors thank all previous and present members of the department of Reproduction and Development of the Erasmus MC for helpful and stimulating discussions during the past years. We also want to thank the three anonymous reviewers for providing helpful feedback. Work in the Gribnau lab is supported by funding from the Dutch research council (NWO-VICI) and an ERC starting grant.

1。女性の胚性幹細胞における分化の誘導X染色体の不活性化を誘導するために注：（ご要望に応じて入手可能）雌マウスの胚性幹細胞は、マウス胚線維芽細胞（MEFに）でコーティングされたゼラチン化培養皿上で、標準的なES細胞条件下で増殖されています。ここでは、読者は、標準的な細胞培養技術39〜41に精通していることを前提としています。分化を誘導するために、T25皿中で増殖させたES細胞は、MEFのから分離され、分化培地にプレーティングする。 <ol><li> ES細胞培養からES培地を外し、細胞培養、PBSで2回洗浄します。 </li><li> 1.5ミリリットルのトリプシン-EDTAを（37℃に予め温めておいた）を追加し、7分間37℃で細胞をインキュベートする。 3.5分後、コロニーを分割する優しく料理を振る。 </li><li>細胞への分化培地の3.5ミリリットルを追加することにより、トリプシン-EDTAを不活性化する。上下にピペット細胞は、単一細胞溶液を取得し、収集する15mlチューブ中。 200×gで5分間スピンし、分化培地10ml中で細胞を集める。 </li><li>非ゼラチン化培養皿に細胞懸濁液を追加し、細胞培養インキュベーター中で1時間インキュベートする。注：ES細胞懸濁液中に残るのに対し、MEFのは、非ゼラチン化培養皿に接着することができるようになります。 </li><li>一方で、6ウェルプレートに滅菌したガラスカバースリップ（24×24 mm）を追加し、0.2％ゼラチンを追加し、室温で最小5分間インキュベートする。 </li><li> 1時間後、主に非接着ES細胞からなるであろうプレめっきES細胞培養物の上清を回収。カバーグラスを含有する6ウェルプレートにプレートES細胞。注：使用⅙6ウェルプレートの6ウェルについてコンフルエントT25皿の目 。これはよく分化の3日後にコンフルエントの差別化を可能にする。日常的にメディアを変更します。長い分化タイムコース、細菌皿で分化培地中でプレート事前メッキES細胞、およびincub用細胞培養インキュベーター中に組み込ま細胞シェーカー上で食べた。これは、細胞が1〜2日前固定をカバーグラスにメッキすることができる胚様体を形成することができます。 </li></ol>その後、DNA-RNA FISH分析のための分化したES細胞の2。固定<ol><li>分化培養物から分化培地を外し、細胞培養、PBSで2回洗浄します。注：細胞は洗い流されるのを防ぐために慎重にPBSを追加します。 </li><li>細胞培養PBSを除去し、4％パラホルムアルデヒド（PFA）/ PBSを加えることによって細胞を固定し、室温で10分間インキュベートする。注意：PFAは毒性があり、吸入する場合や、皮膚や目に接触した時に重大な健康リスクを引き起こす可能性があります。さらに、PFAは発がん性がある。 </li><li> 4％PFA / PBSを削除し、70％エタノールでカバースリップ3回洗う。注：PFAの痕跡は、後続のFISH手順を妨害するように正しい洗浄が重要です。カバースリップの前にF数カ月間-20℃で70％エタノール中で保存することができるISH解析。 </li></ol> FISH実験のためのDNAプローブの3。の標識注：目的の遺伝子のDNA断片を得る（RNA FISHのための最小限の長さ&gt; 2キロバイト、またはDNA魚&gt; 20キロバイト）、あるいは目的の遺伝子をカバーするBAC。 RNA検出のために、小さなプローブが最も可能性の高い転写を同時に検出することができる、複数の転写をもたらすので、DNAの検出と比較して十分であることができる。単一コピーDNA鎖上の強い信号は、より長いプローブは、組み込まれたハプテンの十分な数を検出することができるように、必要とされる。好ましくは、非転写ゲノム領域を、DNAプローブを設計するために選択される。 RNAを検出するための小さなプローブを使用する場合に加えて、これは完全に排除できないが、RNAが転写されたゲノム遺伝子座を合わせ、DNA-RNA FISH法で検出されることが防止される。マウスXistのを検出するために、5.5キロバイトのcDNAプローブを用いた。 DET用X染色体のECTION、いくつかのBACプローブを使用することができる。良好な結果がのXist遺伝子座のすぐ近くに位置していたBAC RP23-100E1およびBAC CT7-474E4、の混合物で得られている。目的の遺伝子や染色体に応じて、いくつかの異なるプローブが最適な結果を得るために必要とされる場合があります。たびに、滅菌フィルターチップを使用し、RNA-FISHのために使用される材料を扱う、RNA分解酵素フリーのH 2 O、およびクリーンな環境で動作します。 <ol><li> 1μgのDNAを取り、16μlの全容量を H 2 Oに希釈する。ジゴキシゲニンまたはビオチン標識液4μl加え（試薬を参照）、ボルテックスで混和し、90分間16℃でインキュベートする。注：ビオチンまたはジゴキシゲニン標識ヌクレオチドは現在、ニックトランスレーションによって組み込まれます。 </li><li>一方、非統合型ヌクレオチドを​​除去するためにG50の列を用意しております。 、2ミリリットルの注射器を取るスタンパーを削除し、シリンジに滅菌綿を追加します。解TにG50ボールを追加O 1分間642×gで15ミリリットルチューブおよび遠心分離器で注射器を配置し、注射器を埋める。注：注射器の約80％が現在、G50で埋めなくてはなりません。少ないG50が存在するときに繰り返します。 </li><li> 90分後、ニックトランスレーション反応混合物に、H 2 Oを40μLを追加し、G50カラムへの反応を追加します。列の下にある空のチューブを追加し、2分間642×gで遠心する。反応チューブ内を通る流れを集める。 </li><li>ピペットで通る流れの体積を測定し、総容量200μlに到達するために、H 2 Oを加える。 13.3μlのサケ精子DNA（10 mg / ml）を、13.3μlの酵母tRNA（10 mg / ml）を、26.7μlのマウス用ベッド-1 DNA（1 mg / ml）を28μlの2 MのNaAc、pHを添加することによって通る流れを沈殿させる5.6。ボルテックスで混和し、533μLの氷冷100％エタノールを加える。 4℃で30分間16200×gでチューブ、遠心分離を振る</li><li>上清を除去し、70％エタノールで2回ペレットを洗浄。で5分間16200×gで遠心分離4℃、空気ペレットを乾燥する。 50 +ハイブリダイゼーション溶液の50μlを加えて、溶解を容易にするために30分間37℃でインキュベートする。 NOTE：標識プローブは、-20℃で数年間保存することができる注意：50 +ハイブリダイゼーション溶液は、毒性があり、皮膚、目や呼吸器系を刺激することができ、また、催奇形物質であるホルムアルデヒドが含まれています。 </li></ol> 4。透過処理、複合DNA-RNA魚固定した細胞の前処理及びハイブリダイゼーション<ol><li> 70％エタノールおよび6ウェルプレートに細胞培養PBSの添加を除去することにより、カバースリップ上に固定した細胞を再水和する。 5分間インキュベートします。合計3回繰り返します。 </li><li>細胞培養、PBSを外し、6穴プレートに0.2％のペプシンを加え、細胞を透過する。 4分間37℃の水浴中で6ウェルプレートをインキュベートする。ペプシンを削除し、RNA分解酵素フリーのH 2 Oで不活性化する</li><li>室温で5分間、4％PFA / PBSでインキュベートすることにより接尾細胞。 fixati後に上で5分間、細胞培養をPBSで2回洗浄する。 </li><li> 3分間、3分間、3分間、100％エタノール、90％エタノール、70％エタノールでインキュベートすることによって細胞を脱水する。転送は、6ウェルプレートのうちカバースリップ、数分間空気乾燥したカバースリップ。 </li><li>熱板上で1時間65℃でカバースリップをインキュベートすることによって、年齢細胞。 </li><li> 、分析しようとするすべてのカバースリップのために一緒に追加することにより、マウスCOT-1 DNAとFISHプローブをプレハイブリダイズ50 +ハイブリダイゼーション溶液25μL、0.5μLマウスCOT-1 DNA、ビオチン標識のXistプローブの1μLおよびジゴキシゲニンの1μL X染色体を検出するラベルされたBACプローブ。ボルテックスで混和し、5分間99℃で変性する。プローブ中に存在する配列を繰り返すようにハイブリダイズする簡易ベッド-1 DNAを可能にするために、45分間37℃で直ちにインキュベートする。 </li><li>熟成後、スライドガラス上に（SSC/10 10mMのリン酸緩衝液formamide/2x 70％からなる）変性緩衝液50μlをスポットし、細胞がtowarに対向して上にカバースリップを置く変性緩衝DS。 2分間65℃でインキュベートする。 </li><li> 5分間氷冷70％エタノール中でインキュベートすることによってバック6ウェルプレートにカバースリップ、およびポストフィックスセルを追加する。 </li><li> 3分間、3分間、3分間、100％エタノール、90％エタノール、70％エタノール中に後続のインキュベーションによって細胞を脱水する。 6ウェルプレートからカバースリップを外し、数分間空気乾燥してみましょう。 </li><li>スライドガラス上に事前にハイブリダイズしたプローブを見つけ、その上にカバースリップをインキュベートする。場所のSSC formamide/2x 50ミリリットル50パーセントで満たされた加湿チャンバー内にスライドし、37℃で一晩インキュベート</li></ol> 5。ハイブリダイゼーション後の洗浄およびプローブの抗体仲介検出<ol><li> 2×SSCで6ウェルプレートに充填し、前加温42℃まで一晩のインキュベーションの後にカバースリップを追加し、5分間42℃でインキュベートする。 </li><li> 2×SSCを取り外し、42℃で10分間50％formamide/2x SSCでカバースリップをインキュベート合計3回（全部で洗浄30分）に繰り返します。 </li&gt; <li> SSC formamide/2x 50％を削除して、室温で2×5分間トリス生理食塩水 - ツイーン（TST）でスライドを洗浄します。 </li><li>スポット50μlの新しいスライドガラス上カバースリップあたりのトリス - 生理食塩水-BSA（TSBSA）し、TST加湿暗室において室温で30分の間に遮断するための上下を逆にカバースリップをインキュベートする。 </li><li>転送はバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。 </li><li>新しいガラススライド上にスポットカバースリップあたりのヒツジ抗DIG抗体（TSBSA中1:500）を50μl、およびTST加湿暗室において室温で30分間の最初のインキュベーション工程のためのカバースリップの逆さまをインキュベートする。 </li><li>転送はバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。 </li><li>スポット50ウサギ抗ヒツジ新しいガラススライド上にカバースリップあたりFITC（TSBSA中1:250）と結合した抗体液、およびTST加湿暗室中、室​​温で30分間の第2のインキュベーション工程のために逆さまカバースリップを下にインキュベート。 </li><li>トランスFERはバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。 </li><li>スポット50新しいガラススライド上にカバースリップあたりFITC（TSBSA中1:250）と結合したヤギ抗ウサギ抗体液、およびTST加湿暗室中、室​​温で30分間の第三のインキュベーション工程のために逆さまにカバースリップをインキュベートする。 。 </li><li>転送はバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。 </li><li>スポット50の新しいスライドガラス上カバースリップあたりのマウス抗ビオチン抗体の液（TSBSA中1:200）とTST加湿暗室において室温で30分間の第四インキュベーション工程のために逆さまにカバースリップをインキュベートする。 </li><li>転送はバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。 </li><li>スポット50新しいガラススライド上にカバースリップあたりローダミン（TSBSA中1:250）と共役ロバ抗マウス抗体μlの、および逆さまTST加湿暗CHAMB中、室温で30分間の第五のインキュベーション工程のためにカバースリップをインキュベートするER。 </li><li>転送はバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。 </li><li>スポット50の新しいスライドガラス上カバースリップあたりローダミン（TSBSA中1:250）と結合したヤギ抗馬の抗体のμL、およびTST加湿暗室において室温で30分間の第六のインキュベーションステップのために逆さまにカバースリップをインキュベート。 NOTE：ヤギ抗ウマ抗体は、ロバ抗マウス抗体を認識するであろう。とき研究者が利用できる、ヤギ抗ロバ抗体も同様に動作します。 </li><li>転送はバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。トリス生理食塩水（TS）でさらに5分間洗浄します。 </li><li> 3分間、3分間、3分間、100％エタノール、90％エタノール、70％エタノール中に後続のインキュベーションによって細胞を脱水する。 6ウェルプレートからカバースリップを外し、数分間空気乾燥してみましょう。 </li><li>スライドガラス上に（試薬を参照）DAPIで封入剤のドロップを見つけ、その上に逆さまにカバースリップを追加します。マニキュアでスライドをシールし、蛍光顕微鏡によってFISH結果を評価（ 図1）。 </li></ol>

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S., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+chromosome+inactivation+and+embryonic+stem+cells.">X chromosome inactivation and embryonic stem cells.</a> Adv Exp Med Biol. 695, 132-154 (2010).</li><li>Chaumeil, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Xist+RNA+in+the+formation+of+a+repressive+nuclear+compartment+into+which+genes+are+recruited+when+silenced.">A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced.</a> Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).</li><li>Okamoto, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eutherian+mammals+use+diverse+strategies+to+initiate+X-chromosome+inactivation+during+development.">Eutherian mammals use diverse strategies to initiate X-chromosome inactivation during development.</a> Nature. 472, 370-374 (2011).</li><li>Gribnau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+chromosome+choice+occurs+independently+of+asynchronous+replication+timing.">X chromosome choice occurs independently of asynchronous replication timing.</a> J Cell Biol. 168, 365-373 (2005).</li><li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+nascent+RNA,+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos.">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li><li>Van Tine, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+in+situ+detection+of+RNA,+DNA,+and+protein+using+tyramide-coupled+immunofluorescence.">Simultaneous in situ detection of RNA, DNA, and protein using tyramide-coupled immunofluorescence.</a> Methods Mol Biol. 292, 215-230 (2005).</li><li>Pollex, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-Cell+Imaging+Combined+with+Immunofluorescence,+RNA,+or+DNA+FISH+to+Study+the+Nuclear+Dynamics+and+Expression+of+the+X-Inactivation+Center.">Live-Cell Imaging Combined with Immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to Study the Nuclear Dynamics and Expression of the X-Inactivation Center.</a> Methods Mol Biol. 1042, 13-31 (2013).</li><li>Chaumeil, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunofluorescence,+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization,+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes,+transcriptional+activity,+nuclear+organization,+and+X-chromosome+inactivation.">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).</li><li>Lin, S., Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+culturing+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 690, 31-56 (2011).</li><li>Meissner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+manipulation+of+murine+embryonic+stem+cells.">Derivation and manipulation of murine embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 482, 3-19 (2009).</li><li>Nichols, J., Ying, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+propagation+of+embryonic+stem+cells+in+serum-+and+feeder-free+culture.">Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum- and feeder-free culture.</a> Methods Mol Biol. 329, 91-98 (2006).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

DNAの魚に適した条件が少なく、安定したRNA分子のためにあまりにも過酷なように組み合わせたDNA-RNA FISHは、技術的に挑戦することができます。いくつかのアプローチは、DNAおよびRNAの両方を検出するプローブとの同時インキュベーションの必要性を回避し、同じ細胞においてDNA及びRNAの両方を研究するために適用されている。例えば、重畳アプローチにおいて、最初のRNA FISHが行われ、細胞が撮像され、その座標が取られる。その後、同じスライドをRNA FISHの信号が失われている間、DNA FISHのために使用される。 DNA FISH後、細胞を再び撮像して、RNAおよびDNA FISHの両方から得られた画像が重畳される。固定した細胞のDNAは安定しており、初期のRNA FISHのために必要な処置によって影響を受けないように、このアプローチは、ほとんどの場合では使えますが、これは、少なくとも4日間の費用がかかりますが非常に手間のかかるアプローチです。別のアプローチでは、第一のRNA FISHが行われ、RNAのFISH信号はoを添加することによって固定されているDNAのFISHを適用した後のfの固定剤、。また、このアプローチは動作することができますが、RNAの魚から由来の蛍光シグナルの一部が定着時失われる可能性があります。これは、特に低レベルでしか発現している転写物の検出を妨げる可能性があります。本明細書に提示されるアプローチは、単一のFISH実験における1つのRNA標的つDNA標的の両方の同時検出のために最適化し、両方の結果が信頼できる結果を、2日以内に、単一の実験で得ることができるという利点を有している。 FISHプロトコルにおけるいくつかのステップは、最適な結果を得ることが重要である。 RNA分子を扱うときはいつでも、最初に、1が使用され、任意のバッファーまたは溶液中でRNA分解酵素を導入しないように注意する必要があります。このため、クリーンな作業環境を確立すべきである、とペッティング試薬は魚のために使用される際フィルターチップを使用する必要があります。ケアRNAseフリー化合物（例えばRNAseフリー水、細胞培養グレードのPBS、絶対的なを使用するように注意してくださいLY純エタノール等 ）。これらの単純なルールに従っている場合には、使用する試薬に補充された追加のRNアーゼ阻害剤を使用する必要はない。第二に、ペプシンを使用した透過処理手順が少なすぎる、またはあまりにも多くの透過性との間に緩やかな均衡である。使用される特定の細胞型に依存して、透過処理に許される時間、またはペプシン濃度を最適化するために必要とされる場合があります。アクティビティは異なる場合があり、後者はまた、ペプシンのあなたの特定のバッチに依存します。代替として、透過化、特定の条件下で良好な結果で5分間結果の0.1％Triton-X100/PBSを用いて、FISHは、透過化のこの方法を用いる利点は、核または細胞質タンパク質を検出するために免疫染色と組み合わせることができました。 FISHの第三の重要な側面として、老化、変性、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度は一定に保たれるべきである。目標温度から少しでもずれが少なくeffをもたらすことができるicient変性、ハイブリダイゼーション、またはそれ以上のバックグラウンド染色になりますそれほど厳格回の洗浄、。また、2分、5分、80℃での初期変性、65℃での変性、続いて65℃で1時間熟成工程の代替として、老化せずに、良好な結果を与えることができる。一般的にはこの手順は、より信頼性の高いDNAのFISHシグナルを与えるとして、我々は、高齢化の手順を好む。最後に、特定のDNAプローブは、それらが十分な検出のための抗体の三層を必要としないこと、そのように特異的である。これは経験的に、すべての新しく生成されたプローブのためにテストする必要があります。 現在のプロトコルは、X染色体の不活性化およびXistのを検出し、RNAとDNAの複合検出の研究でロバストに動作しますが、他の設定ではより複雑かもしれません。これは、特に、検出されることを目的とするRNA種が非常に低いレベルで発現される場合に可能性があり、反復配列の完全であるか、または比較的短いトランスクリプト。このような状況では、対象の限定された、最適ではない可能額への効率的なハイブリダイゼーションを可能にします最適なプローブを設計することはかなり難しいかもしれません。このような状況では、RNAの魚のための最初の条件を最適化する価値があるかもしれません。いくつかの代替プローブが試すことができ、ニック翻訳によるプローブ標識の持続時間は、組み込まれたハプテンの量を最適化するために、滴定することができる。重要なのは、目的とするRNAは、例えばRT-PCRによる発現を検証することによって、調査される細胞において発現していることを確認すべきである。細胞の異なるタイプを分析する場合にも、これは技術的、FISH関連する問題、または新しいタイプにおける発現の単純な非存在との間の区別を可能にする可能性があるため、以前は、陽性対照として検出された発現が細胞を含むことが必須である細胞を分析した。検証式にもかかわらず、さまざまなプローブおよび標識化条件の最適化の使用は、RNA FISHは、nを行う際に、クリア信号でotの結果は、それが使用されるホルムアミドの量、またはプローブハイブリダイゼーションの持続時間および温度を変えることによって、ハイブリダイゼーション条件を変化させる価値があるかもしれない。代わりに、直接標識されたオリゴヌクレオチドプローブは、9月10日に使用されるかもしれません。同様の最適化ステップは、その後のDNA FISH、およびDNAおよびRNAの同時検出を改善するために適用することができる。 合わせたDNA-RNA FISHプロトコールを使用して、我々は雌ES細胞を分化におけるX染色体不活性化を研究することができた。同様の結果は、異なる細胞型および胚を用いた我々の研究において得られた、我々は現在、組織切片上で組み合わされたDNA-RNA FISHを適用するための条件を最適化している。多くの生物学的プロセスにおける非コードRNAの重要な役割はますます高く評価となるように、我々は同じプロトコルは、おそらくそれらの特異的クロマチンとの関連で、他の非コーディングRNAを研究するために使用することができることを予見する。

蛍光in situハイブリダイゼーション （FISH）を用いて細胞や組織を研究することは、1、1970年代後半に導入されて以来、細胞内レベルでのクロマチン組織と遺伝子発現、研究者は遺伝子を研究することができました。 DNAのFISHは、しばしば細胞遺伝学、核型2、癌診断3と着床前遺伝子検査4で使用され、それはそれらの天然環境中の核酸の検出を可能にするので、分子の研究5-6において重要な役割を有している。 RNA FISHによる単一細胞発現解析は、天然の一次転写産物を検出することができるし、非コードRNAは、染色体から転写され、例えばを含む集団レベルでの遺伝子発現を評価する他の技術に利点を提供する定量的RT-PCR、ゲノムワイド発現分析またはノーザンブロッティング。それらの起源部位から直接由来するRNA転写産物を可視化することにより、例えばあった遺伝子発現は7確率的であり、時には8対立遺伝子特異的であることができることに気づいた。技術の改善はあっても、細胞9月11日内の単一mRNA分子の検出および定量を可能にした。 FISHの基本原理は非常に特異的ワトソンとクリックの塩基対形成によって、核酸プローブに細胞内の核酸のハイブリダイゼーションで構成されています。プローブは、顕微鏡的に可視化することができるシグナルを生じる、直接的または間接的に検出することができる。最初の試みは、安全性の問題、制限された空間分解能と時間12月14日に1つだけの標的を検出する能力に基づいて欠点を持っていた放射性標識プローブ、から構成されていた。蛍光色素、ハプテン、および酵素などの非放射性標識のその後の開発は、ルーチン的な分子生物学技術としてFISHの普及使用を可能にした。 FISHプローブは、直接的fluorochで標識することができる核酸の蛍光分子の化学結合によるromes 15及び蛍光標識ヌクレオチドの組込み16-19配列、またはプローブを間接的にコンジュゲートしたハプテン特異的抗体によって（ビオチンおよびジゴキシゲニンを含む）ハプテンの統合およびハプテンの免疫学的検出の後に可視化することができる蛍光レポーターは、20〜21の分子が含まれる。後者のアプローチは、元の信号を増強するために使用される蛍光標識された抗体のいくつかの層を用いてシグナル増幅を可能にし、低レベルで発現されるRNA種の検出を可能にする。直接的および間接的な標識技術および種々のハプテンを組み合わせることによって、いくつかのターゲットが同時に同じ細胞内で可視化することができる。 FISHプロトコルにおける最も重要な工程の一つは、その標的へのプローブのハイブリダイゼーションである。理論的には、プローブは、具体的には、実際には、唯一のその標的へのこの特異的に結合するであろうがプローブは相同領域に結合すること、およびハイブリダイゼーション条件は、常に特定のDNA領域またはRNA種のための理想的ではないでしょう、いつものように、達成されない。それらはFISH手順のストリンジェンシーを増加させることができ、背景雑音の高レベルをもたらすFISHプローブの非特異的結合を防止することができるように、ハイブリダイゼーション後の洗浄は、したがって、特に重要である。 RNA分子は、一本鎖されると、それらは容易にFISHプローブにハイブリダイズすることができる。対照的に、二本鎖DNA分子は、第一プローブがハイブリダイズすることができ、その後の変性工程を必要とする。これは、通常、DNAの変性をもたらす試料の加熱によって達成される。しかし、これらの過酷な条件下では、壊れやすい、一本鎖RNA分子が失われる可能性があります。したがって、合わせたDNA-RNA FISH条件の有意な最適化を必要とし、唯一のRNAまたはDNAの分離検出と比較して、より技術的に困難である。 ここでは、プレゼン私たちは、雌マウスの胚性幹細胞の22〜24の差別化X染色体の不活性化（XCI）を研究することができました組み合わせて、同時DNA-RNA魚TA詳細なプロトコル。 XCIは、女性の胚発生25のために重要なエピジェネティック機構であり、ヘテロクロマチンをもたらし、ひいては女性の個体では2本のX染色体の1 26〜27のサイレン。このプロセスに不可欠RNF12 22〜23とREX1 24タンパク質によって制御されている非コードRNAはXistの 28〜30は 、ある。Xistの発現は、胚発生中またはin vitroでのES細胞の分化の際に、将来の不活性X染色体（XI）にアップレギュレートになる、およびX染色体に沿って広がり、それによってX染色体31の転写シャットダウンするクロマチンリモデリング酵素を引き付けることができる。このXistの RNAの広がりは、X染色体のコーティングとしてRNA FISHによって可視化することができるいくつものXist雲とも呼ばれる。女性のES細胞は、ゲノム不安定性に起因し、そのX染色体の1を失う可能性がありますので、他は唯一の核型、安定した細胞は、この重要なプロセス22,32の分析で評価していることを確認するために、XCIを研究するために結合するDNA-RNA魚を採用している-34。すべての分子生物学技術と同様に、いくつかの異なるプロトコルが優れた35-38を公開されている。ここでは、プローブのハイブリダイゼーション、透過処理およびその後のプローブの取り込みを可能にするために、マウスES細胞、細胞の固定、ニックトランスレーションによるFISHプローブを標識する、固定された細胞の前処理における分化誘導から始めて、我々の方法を提示ターゲット、そして最終的に蛍光標識した抗体によるプローブの検出。プロトコルは提示され、ここには2日間の期間内のXist RNA及びX染色体の忠実な検出を可能にし、この技術の基本はそうOTに適合させることができる彼女のシステムや研究の分野。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="874">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">female mouse embryonic stem cells</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">will be made available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">mouse embryonic fibroblasts</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g Millipore</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">ES cell culture medium</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DMEM, 15% foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM &#223;-mercaptoethanol, and 1000 U ml-1 LIF. Filter sterilize and store at 4&#186;C for maximal 2 weeks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">LIF</td>
			<td style="width:124px;">Chemicon</td>
			<td style="width:119px;">ESG1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">DMEM</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11960085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Fetal Calf Serum&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Penicillin&#8211;streptomycin (100&#215;)</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Non-essential aminoacids&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">&#223;-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">ES cell differentiation medium</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 &#956;l/l monothioglycerol and 50 &#956;g/ml ascorbic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">IMDM-Glutamax</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">31980-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Ascorbic acid (50 mg/ml)</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">monothioglycerol</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">T25 cell culture dishes</td>
			<td style="width:124px;">Greiner Bio-one</td>
			<td align="right" style="width:119px;">690160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">6-well cell culture dishes</td>
			<td style="width:124px;">Greiner Bio-one</td>
			<td align="right" style="width:119px;">662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">cell culture grade PBS</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">falcon tubes</td>
			<td style="width:124px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">24x24 mm coverslips</td>
			<td style="width:124px;">Menzle</td>
			<td align="right" style="width:119px;">780882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">gelatin</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1890-100G</td>
			<td>prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>prepare 4% PFA/PBS solutions, by dissolving PFA in PBS. Stir at 70 &#7484;C until completely dissolved and cool down to room temperature. Aliquots can be stored at -20&#7484;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">absolute 100%&#160; ethanol</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32221-2.5L</td>
			<td>use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">RNAse free water</td>
			<td style="width:124px;">Baxter</td>
			<td>TKF7114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">sterile filter tips</td>
			<td style="width:124px;">Rainin Bio Clean</td>
			<td style="width:119px;">GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation)</td>
			<td style="width:124px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11745816910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">biotin-labeling kit (Biotin Nick translation)</td>
			<td style="width:124px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11745824910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Sephadex G50</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">2 ml syringe</td>
			<td style="width:124px;">BD Plastipak</td>
			<td align="right" style="width:119px;">300013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">sterilized cotton</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">eppendorf tubes</td>
			<td style="width:124px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">yeast tRNA 10 mg/ml</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15401-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Salmon Sperm DNA 10 mg/ml</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">mouse cot-1 DNA&#160; 1 mg/ml</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">18440-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">eppendorf bench top microcentrifuge</td>
			<td style="width:124px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">Model 5417R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Eppendorf Refrigerated Centrifuge</td>
			<td style="width:124px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">Model 5810R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">2M NaAc, pH 5.6</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">50+ hybridization solution</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">formamide</td>
			<td style="width:124px;">Acros organics</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3272350000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">dextran sulfate</td>
			<td style="width:124px;">Fluka</td>
			<td align="right" style="width:119px;">31403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">pepsin</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6887</td>
			<td>prepare a 0.2% solution in RNAse free water, and add 84 &#181;l 37% HCL per 100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">HCL, 37% solution&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Fluka</td>
			<td align="right" style="width:119px;">84422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">object glasses</td>
			<td style="width:124px;">Starfrost</td>
			<td style="width:119px;">8037/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">20x SSC</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM9763</td>
			<td>dilute to 2x SSC in RNAse free water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">10 mM Phosphate buffer, pH 7</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>add 57.7 ml of 1M Na2HPO4 and 42.3 ml 1M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">denaturation buffer</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>70% Formamide/2xSSC/10mM phosphate buffer pH 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Tween-20</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">2M Tris pH 7.5 solution</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Tris-Saline-Tween washing solution (TST)</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>100 ml 10x Saline, 50 ml 2M Tris, 500 &#181;l Tween-20, add RNAse free water till 1 liter&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:464px;">10x Saline solution</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>dissolve 85 g NaCl in 1 liter RNAse free H2O, and autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:464px;">Tris-Saline-BSA (TSBSA)</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>500 &#956;l 10x Saline, 250 &#956;l 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml RNAse free H2O</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">BSA, purified, 100x&#160;</td>
			<td style="width:124px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">B9001S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">sheep-anti-dig antibody</td>
			<td style="width:124px;">Roche diagnostics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:500 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC</td>
			<td style="width:124px;">Jackson labs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:250 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC</td>
			<td style="width:124px;">Jackson labs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:250 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">mouse-anti-biotin antibody</td>
			<td style="width:124px;">Roche diagnostics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:200 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine</td>
			<td style="width:124px;">Jackson labs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:250 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine</td>
			<td style="width:124px;">Jackson labs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:250 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:464px;">Tris-Saline washing solution (TS)</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10 ml 10x Saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td style="width:124px;">Vectorlabs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nail-varnish</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">fluorescent miscroscope</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined dna-rna fluorescent in situ hybridization (fish) to study x chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells

in situハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光は、細胞中の核酸の検出を可能にする分子技術である。 DNAのFISHは、多くの場合、細胞遺伝学および癌の診断に使用され、多くの場合、重要な臨床的意義を有するゲノムの異常を検出することができる。 RNA FISHは、細胞内でRNA分子を検出するために使用することができ、遺伝子発現の調節において重要な洞察を提供した。同じセル内でDNAとRNA FISHを組み合わせることにより、DNAのFISHに適した条件が壊れ、一本鎖RNA分子に対する厳しすぎるかもしれないような、技術的に困難である。ここでは、X染色体にコードされるのXist RNAとDNAの複合、同時検出を可能にし、容易に適用可能なプロトコルを提示する。この結合されたDNA-RNA FISHプロトコルは、おそらくRNAとDNAの両方を検出する必要がある他のシステムに適用することができる。

合わせたDNA-RNA FISHのための上述したプロトコルを用いて、我々は、女性の胚性幹細胞を分化におけるX染色体不活性化を可視化することができた。1は、我々 は Xistの （あるの両方を検出したDNA-RNA FISH実験の代表例を示す図不活性X染色体上のいわゆるのXist RNAの雲とアクティブX染色体上の基礎転写ピンポイント）と、ピンポイント信号として表示されているX染色体の領域として見える。それによってXistの雲が実際に沿って局在化、およびX染色体を被覆していることを示す、ピンポイント信号のいずれかがXistのクラウド内に配置されている。細胞の99％以上では（データは示していない）正しいDNAシグナルを我々のプロトコルを使用して検出する。 RNA-FISHと比較して、Xistの雲が組み合わされ、DNA-RNA FISH法を用いて可視化変性したDNAが大きな面積を占めるように見えるように、時には大きく見える。私たちは、OBを持っているヒトES細胞は、ヒトのリンパ球および様々な種の様々な線維芽細胞株を用いて同様の結果をtained、同様のプロトコルがRnf12を含む様々なX連鎖遺伝子座の遺伝子発現を研究するために適用されている。このプロトコルは、未分化雌ES細胞に適用した場合に加えて、両方のX染色体から基底Xistの発現は低レベルで発現され、また、このプロトコルを使用して遺伝子が（データは示さない）可視化できることを示している、検出することができた。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51628/51628fig1highres.jpg" width="600" /> 図1複合DNA-RNA FISH分化雌ES細胞における合わせ DNA-RNA FISHためのプロトコルを、本明細書に記載した後に得られた代表的な結果。 X染色体（XがCHR量）を、FITCにコンジュゲートした抗体を用いて可視化されたジゴキシゲニン標識BACプローブ（緑色の記号を用いて検出されるら）。ほとんどすべての細胞において、2つのX染色体が検出される。 のXist RNAは、ローダミン（赤色信号）に結合する抗体を用いて可視化されたビオチン標識cDNAプローブを用いて検出される。不活性X染色体（Xistの雲 ）とアクティブX染色体（Xistのをピンポイント）から基底のXist発現への両方に大きなのXistの蓄積が検出された（注：差別化の際に、この基礎のXistの発現は、今後の積極的なX染色体上に停止したため、検出されないすべての核内で）。核をDAPI（青）で対比されています。スケールバーは10μmで表しています。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51628/51628fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a>

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Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

in situハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光は、細胞内でのそれらの天然環境中の核酸の検出を可能にする。ここでは、マウス胚性幹細胞におけるX染色体不活性化を研究するために使用することができるFISHによるRNAおよびDNAの合成、同時検出のためのプロトコルを記載している。

組み合わせたDNA-RNA蛍光<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）差別雌マウス胚性幹細胞におけるX染色体の不活性化を研究するために、

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

combined-dna-rna-fluorescent-situ-hybridization-fish-to-study-x

Nanyang Technological University

Research

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JoVE Journal

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Molecular Biology

Biology

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Unit 2

Studying DNA and RNA

SCIENTISTS IN ACTION

27.6K ビュー.  Erasmus MC - University Medical Center.  in situハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光は、細胞内でのそれらの天然環境中の核酸の検出を可能にする。ここでは、マウス胚性幹細胞におけるX染色体不活性化を研究するために使用することができるFISHによるRNAおよびDNAの合成、同時検出のためのプロトコルを記載している。 

ビデオ: Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

生物学

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

蛍光その場で</emヒト精子の>ハイブリダイゼーション（FISH）プロトコル

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

全体のマウント<em&gt;上皮内</emE11.5マウス胚へのE8.5&gt;ハイブリダイゼーション

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

GFPをレトロウイルスベクターを用いた誘導多能性幹細胞（性IPSC）にヒト体細胞を再プログラミングする

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

蛍光によるウイルスRNAの検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

RNAの蛍光による単一細胞遺伝子転写の解析<em&gt; in situで</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

蛍光灯と組み合わせることで染色体の複製タイミング<em&gt;その場</em&gt;ハイブリダイゼーション

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

ホールマウントRNAを蛍光<em&gt;その場で</emの&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

3D原子力組織の変化を研究するために3D保存状態間期核に組み合わさ免疫やDNA FISH

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...