私がリー研究所にいたとき、このプロジェクトを監督してくれたジニー・T・リーと、原稿を編集してくれたタイラー・ブローリングに感謝します。この作品は、ダイムズ財団のマーチからバジル・オコナースタータースカラー賞とNIHグラントGM098605によって支えられました。

1.3D スライドの準備
<ol><li>以下の試薬を準備します。<ol>
<li>CSKバッファ:100 mM NaCl、300 mMスクロース、10 mMパイプ、3 mM MgCl2.1 M NaOH で pH を 6.8 に調整します。CSKバッファーは4°Cで保管してください。</li>
		<li>0.5%トリトンX-100のCSKバッファ:200 μlのトリトンX-100から40 mlのCSKバッファを加えます。トリトンX-100が完全に溶解するまで、磁気撹拌機を使用して溶液を混合します。CSKバッファーを0.5%トリトンX-100で4°Cで保管してください。</li>
		<li>4% パラホルムアルデヒド (PFA)-PBS、 pH 7.4: 約 70-80 ml の水に PFA の 4 g を溶解します。溶解プロセスを迅速化するために、約20 μlの4 N NaOHを加え、PFAが完全に溶解して溶液が透明になるまで、水浴中の溶液を60°Cに保ちます。このプロセスは約1時間かかります。PFAが完全に溶解した後、10x PBSの10mlを加えます。水で最終体積を100mlに調整し、溶液を室温(25°C)に冷却します。新しい実験ごとに、新たに準備したソリューションを使用します。 注:すべての動物の仕事のための制度的許可を得て、関連する動物のケアガイドラインに従ってください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>雄マウスを安楽死させる。鉗子とはさみを使用して、マウスから精巣を切除する。テストをPBS(またはRPMI 1640)に入れる。精巣を除去した後、RNAの分解を防ぐために、以下のステップ1.3-1.4を迅速に実施する。</li>
	<li>小さなペトリ皿の精巣を破裂させ、 チュニカアルブギネアを取り除く.鉗子を使用して氷の上のPBSで半日本の細管を解き明かす。</li>
	<li>鉗子を使用して、500 mlのCSKバッファー+0.5%トリトンX-100を含む4ウェル皿の1つの井戸に、いくつかの管状(長さ約5〜10mmの細管)を1つの井戸に移し、6分間インキュベートする。CSKバッファーへの過度の露出は、細胞の破壊につながる可能性があります。</li>
	<li>鉗子を使用して、4%PFA-PBS溶液を含む4ウェル皿の1つの井戸にすべての細管を移す。このステップは、実体顕微鏡なしで前形をすることができるが、任意で使用することができる。室温で10分間インキュベートします。同時にインキュベーション期間中に12個の細胞スピンチャンバーの準備を開始する。</li>
	<li>鉗子を使用して、すべての細管をPBSを含む4ウェル皿の1つの井戸に移します。室温で5分間インキュベートします。</li>
	<li>ガラススライドの裏側で、すべての管を30 μlのPBSに移します(カチオン電荷のため、スライドの上部は避けてください)。2つの鉗子の先端を使用して、細管を粉々に引き裂く。2つの鉗子の先端の間で管を切り取り、鉗子を水平に引っ張ることによって、管を水平方向に刻みます。この手順を約 10 ~ 20 秒間続けます。</li>
	<li>P20ピペットを用いてピペットで懸濁液を混ぜます。</li>
	<li>懸濁液をマイクロ遠心チューブに移し、PBSで約1.3mlに希釈します。12個のサイトスピンチャンバ(合計1.2 ml)のそれぞれに100 μlの懸濁液を塗布します。この工程では、細胞の濃度を決定する必要はありません。</li>
	<li>細胞回転は、室温で10分間2,000rpmでサンプルを回転させます。サイトスピニング後、実験室のベンチで室温で数分間スライドします。スライドが数分完全に乾燥した後、次のステップに進みます。</li>
	<li>PBSを含むコプリン瓶を使用して、室温で5分間スライドを洗浄します。</li>
	<li>70%エタノールを含むコプリン瓶にスライドを移し、RNA FISHの開始前に少なくとも2分待ちます。スライドは、4°Cで70%エタノール中の数週間安定である。 長期保存の場合、コプリン瓶に80%と100%エタノールを使用して2分間連続処理を施し、スライドを完全に脱水乾燥します。スライドボックスに-80°Cで保管してください。</li>
</ol>2. ランダムプライミングによるコト-1 DNAプローブ調製
<ol><li>以下の試薬を準備します。<ol>
<li>ハイブリダイゼーションバッファ:ハイブリダイゼーションバッファストックの900 mlを準備するために進行コンポーネントを混合します。このソリューションは、プローブのストックに使用されます。このハイブリダイゼーションバッファーストックは、ハイブリダイゼーションの前にRNase阻害剤溶液(リボヌクレオシドバナジル錯体)の10%の体積の添加を可能にします。<table><tbody>
<tr>
<td>コンポーネント</td>
					<td>量(μl)</td>
					<td>最終濃度</td>
				</tr>
<tr>
<td>ホルムアミド</td>
					<td>500</td>
					<td>50% (v/v)</td>
				</tr>
<tr>
<td>デキストラン 50%</td>
					<td>200</td>
					<td>10% (w/v)</td>
				</tr>
<tr>
<td>20x SSC</td>
					<td>100</td>
					<td>2x</td>
				</tr>
<tr>
<td>1% BSA</td>
					<td>100</td>
					<td>0.1%</td>
				</tr>
</tbody></table>ハイブリダイゼーションの前に、200 mM リボヌクレオシド バナジルコンプレックスまたは水の 1/10 vol を最終濃度に合わせてハイブリダイゼーション バッファー ストックに加えます。-20°Cでは、この混合物は1年以上安定している。</li>
		<li>20x SSC:クエン酸ナトリウム88.2g、NaCl175.3gを約800mlの水に溶かします。1 M HCl の数滴を使用して pH を 7.0 に調整し、水を加え、オートクレーブ処理で最終ボリュームを 1 L. 滅菌に調整します。調製後、20倍のSSCを室温で保存することができます。</li>
		<li>50%(w/v)デキストラン:水をかき混ぜ、ゆっくりと50gのデキストラン硫酸塩を加えます。室温で一晩かき混ぜ続けます。水を加えると、最終容積を100mlに調整します。室温で保管してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>以下の成分を PCR チューブに追加します。PCR機を使用して、95°Cで5分間混合してインキュベートします。<table><tbody>
<tr>
<td>コンポーネント</td>
				<td align="center">反応あたりの量 (μl)</td>
				<td align="center">最終的な</td>
			</tr>
<tr>
<td>コト-1 DNA:1 mg/ml</td>
				<td align="center">1</td>
				<td align="center">1 μg</td>
			</tr>
<tr>
<td>ランダム9マープライマー(キットから)</td>
				<td align="center">10</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>水</td>
				<td align="center">27</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>遠心分離機は簡単に氷の上に置きます。</li>
	<li>次のコンポーネントを追加します。PCR機を使用して37°Cで30分間混合し、インキュベートします。(使用したキットの詳細については、試薬および装置の表を参照してください。<table><tbody>
<tr>
<td>コンポーネント</td>
				<td align="center">反応あたりの量 (μl)</td>
				<td align="center">最終濃度</td>
			</tr>
<tr>
<td>ステップ2.2から調製された混合物</td>
				<td align="center">38</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>5xヌクレオチドバッファー(キットから)</td>
				<td align="center">9.2</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>サイ3-dUTP (1 mM)</td>
				<td align="center">0.8</td>
				<td align="center">16 μM</td>
			</tr>
<tr>
<td>クレノウ (キットより)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>2 μlのストップバッファー(キットから)を加えると、反応を中止します。</li>
	<li>マイクロスピンカラムを使用して停止した反応を精製します。</li>
	<li>精製された分率に50μg(5μl)のニシン精子DNA(鋳型Cot-1 DNAの50倍の過剰量)を加えます。</li>
	<li>ピペットを使用して総体積を測定します。0.7倍のエタノール量100%、酢酸ナトリウム3M(pH 5.2)の0.1倍の体積を加え、よく混ぜ、遠心分離機を最大速度(17,000 x g)で4°Cのマイクロ遠心分離機を使用して15分間加えます。</li>
	<li>液体を取り出し、200μlの70%エタノールを加え、4°Cで最高速度で5分間よく混ぜます。</li>
	<li>余分な液体を取り除きます。沈殿物を室温で10〜30分間乾燥させます。</li>
	<li>20 μlのハイブリダイゼーションバッファーストックにペレットを溶かします。ペレットは溶解しにくいことが多いため、ピペットを繰り返し使用する。代替オプションとして、ボルテックスミキサーを使用してペレットを効率的に溶解することもできます。プローブは使用するまで-20°Cに保つことができます。</li>
</ol>3. コト-1 RNAフィッシュ
<ol><li>以下のコンポーネントを PCR チューブに追加します。PCR機を用いて、80°Cで10分間インキュベートし、続いて42°Cで約10〜30分間の前焼成工程を行う。 ハイブリダイゼーションが行なくなるまで42°Cに保ちます。リボヌクレオシドバナジル複合体は任意です。それは水と交換することができます。<table><tbody>
<tr>
<td>コンポーネント</td>
				<td align="center">反応あたりの量 (μl)</td>
				<td align="center">最終的な</td>
			</tr>
<tr>
<td>コト-1 DNAプローブ(50 ng/μl)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center">100 ng</td>
			</tr>
<tr>
<td>リボヌクレオシド・ヴァナジル・コンプレックス (200 mM)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center">20mM</td>
			</tr>
<tr>
<td>ハイブリダイゼーションバッファ</td>
				<td align="center">20 に追加</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>80%エタノールを含むコプリン瓶で2分間脱水スライドし、続いて100%エタノールを含むコプリン瓶を2分間脱水する。室温の実験室のベンチの乾燥スライドは完全に。</li>
	<li>42°Cインキュベーターにチップボックスチャンバー(2〜3cmの水で満たされた)を予熱します。先端箱の部屋の上にスライドを置きます。プレアンネプローブとピペットを脱水スライドに直接遠心分離します。泡を作らないようにしてください。スライドをカバースリップでそっと覆います。</li>
	<li>42°Cで6時間から一晩(14〜15時間)ハイブリダイズする。</li>
	<li>コプリンの瓶(2x SSCと50%のフォルミドを備えた2つの瓶、2倍のSSCを備えた2つの瓶)で洗浄液を準備します。42°Cで水浴で30分間予熱します。</li>
	<li>かみそりの刃を使用して、スライドの端からカバースリップを取り外します。サンプルを引っ掻かないようにします。2x SSCと50%ホルムアミドを含むコプリン瓶にスライドを45°Cで5分間洗浄します。 この手順を 1 回繰り返します。</li>
	<li>2x SSCを含むコプリン瓶にスライドを5分間45°Cで洗います。 この手順を 1 回繰り返します。</li>
	<li>スライドに20μlのDAPI取り付けメディアを追加し、カバースリップでカバーします。カバーガラスを軽く押して、余分な取り付けメディアを取り外します。洗浄ティッシュと余分な土台媒体をブロット。スライドは顕微鏡評価の準備ができています。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Namekawa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice.">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr Biol. 16, 660-667 (2006).</li><li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+nascent+RNA,+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos.">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li><li>Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RNA+FISH+to+study+gene+expression+during+mammalian+meiosis.">Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis.</a> Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).</li><li>Hall, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ectopic+human+XIST+gene+can+induce+chromosome+inactivation+in+postdifferentiation+human+HT-1080+cells.">An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).</li><li>Huynh, K. D., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+a+pre-inactivated+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos.">Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Nature. 426, 857-862 (2003).</li><li>Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+chromosome+silencing+in+the+marsupial+male+germ+line.">Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).</li><li>Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+imprinted+X+inactivation:+repeat+versus+genic+silencing+in+the+mouse.">Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse.</a> Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).</li><li>Ichijima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDC1+directs+chromosome-wide+silencing+of+the+sex+chromosomes+in+male+germ+cells.">MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells.</a> Genes Dev. 25, 959-971 (2011).</li><li>Sin, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF8+regulates+active+epigenetic+modifications+and+escape+gene+activation+from+inactive+sex+chromosomes+in+post-meiotic+spermatids.">RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids.</a> Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).</li></ol>

著者は開示するものは何もない。

3Dスライドの準備では、パーメアビライゼーションステップは固定ステップの前に行います。これらのステップは、半細管上で直接行われ、それによって、3次元クロマチン構造を維持する。RNA/DNA FISHのクロマチン構造を保存するための代替オプションは、パーメアビライゼーションステップと固定ステップを同時に行うことである。この代替技術は、有袋類生殖細胞およびマウスの着床前胚7,8において行われている。しかし、固定工程がパーメアビライズステップに先行する場合、高い細胞質背景を生じさせる可能性がある。したがって、RNAおよびDNA FISHのスライド最適化の重要な決定要因は、透過性の順序と固定ステップに依存します。パーメアビライズステップの持続時間は、スライド調製の最適化のための重要な要素でもあります。この方法では、6 分が一般的な条件です。ただし、使用する材料のバリエーションに応じて調整できます。
3次元クロマチン構造の保存は、表面スプレッドスライドから明確に分離する3Dスライドの特徴です。この利点は、染色体拡散製剤の場合とは大きく異なる。3Dスライド法では、3次元クロマチン構造を保持しますが、核全体を包含するために複数のZセクションを使用してデータを取得する必要があります。1 つの z セクションは、核のすべてのシグナルをキャプチャできません。したがって、複数の z セクションの必要性は、この方法の大きな制限です。単一のz断面で核を取り込むには、表面の広がりが有利です。したがって、3D法と表面広がり製剤は、明らかな利点を有し、明知および精子形成の研究のために相互に互いの特徴を補償する。
3Dスライド法は、精巣内で見つかったすべての細胞タイプに適用することができます, 精子,円形精子,セルトリ細胞を含む.この方法は、Meiotic性染色体不活性化の発症時における性染色体のクロマチン圧縮を調べ、PMSC10に対するエピジェネティック修飾を調べることにも適用されている。将来の応用の観点から、この方法は他の組織または細胞に適用され得る。その場合は、パーメアビライゼーション手順を固定手順の前にすることをお勧めします。あるいは、パーメアビライズ工程と固定工程を同時に行うことができる。

精巣では、生殖細胞は、二数葉化精子腫から、成熟したハプロイド精子に対するマイオシスを介して分化する。この過程において、胚芽細胞の核クロマチン構造は、連続的かつ動的に再モデル化される。表面の広がりは、個々の精子細胞の細胞学的検査に一般的に使用される。表面広がりの一般的な方法は、個々の精子細胞が広がり、平坦化される低調薬治療を採用する1.これらの条件は、精密染色体の詳細な分析に最適です。シナプス状態や再結合病巣などの染色体特徴は、この方法を用いて容易に観察される。しかし、低張治療は亜核クロマチンアーキテクチャを破壊し、したがってこの技術は核の構造解析には適さない。その結果、精巣生殖細胞の三次元クロマチン構造を維持するように改良された方法が設計されている。この方法は、3次元(3D)スライド法と呼ばれる(図1)。3Dスライド法は、その現場でのRNA蛍光による精巣胚芽細胞分化中の遺伝子発現およびクロマチン状態を調べるために最初に最適化されたため、核内の新生RNA局在化の検出を可能にした(FISH)2,3。この3D法は、免疫蛍光、DNA、RNA FISHの組み合わせにも適用可能です。さらに、この方法は、ポストメオティック性クロマチン(PMSC)の発見に役立ち、ポストメオティック精子2に見られる性染色体の無声コンパートメントである。
3Dスライド法は、核染色に一般的に使用されるスライド調製の2つの重要なステップの組み合わせによって、もともと最適化されました:核物質を固定するために設計された固定ステップと、抗体やFISHプローブなどの染色試薬の入手可能性を向上させるために細胞質材料を除去することを意図した透過性ステップ。他の刊行3で既に説明したように、低細胞質バックグラウンドで最適な結果を得るためには、パーメアビレーションステップが固定工程の前になければならないことが決定された。この3Dスライド法では、透過化ステップとその後の固定ステップを半細管上で直接行い、続いて細胞回転前に細胞を鉗子で生殖細胞を滑らかに回転させます。精子細胞のRNA FISHの代替方法が別の実験室4で開発された。この方法では、3D法と一致し、RNA FISHの最適な結果を得るためにパーメアビライゼーションステップが固定工程の前になければなりません。
以下のプロトコルは、3Dスライド法について説明し、核新生RNAの検出に可能な応用例であるCot-1 RNA FISHを提供する。Cot-1 DNAは、ゲノム中の反復的な要素から構成されています。ここで、Cot-1 DNAプローブは、新生転写物のイントロンとUTRにハイブリダイズされ、核5,6内の転写活性領域を検出する。3Dスライドは汎用性が高く、クロマチンアーキテクチャ間の空間的関係の詳細な検査を得るために、免疫蛍光、DNAおよびRNA FISH技術の組み合わせに適用することができます。

<table><tbody><tr><td>Cot-1 DNA&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td></td></tr><tr><td>Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit</td><td>Agilent</td><td>300380</td><td></td></tr><tr><td>Herring sperm DNA Solution</td><td>Invitrogen</td><td>15634-017</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol. 200 proof (absolute)</td><td>Pharmco-aaper</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Formamide deionized</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600-00500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Lifeblood Medical</td><td>77110-100</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6001</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>A10491-01</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76240</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1200</td><td></td></tr><tr><td>Ribonucleoside-vanadyl complex</td><td>New England Biolabs</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>Illustra MicroSpin G-50 Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>VWR</td><td>300-050</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td>Bioexpress</td><td>C-3262-1</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 3</td><td>Shandon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Fisher</td><td>08-815</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost /Plus Microscope Slides</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>4-well dish</td><td>Fisher</td><td>12-566-301</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Air incubator</td><td>Revolutionary Science</td><td>RS-IF-203</td><td></td></tr></tbody></table>

slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells

精巣胚芽細胞分化の間、核クロマチンの構造は動的に変化する。以下は、マウスに見られる精巣生殖細胞の三次元クロマチン配置を維持するために設計された方法を説明します;この方法は三次元(3D)スライド法と呼ばれる。この方法では、精巣細管は細胞質材料を除去する透過性のステップで直接処理され、続いて核物質を固定する固定ステップが続く。次いで、尿細管を解合し、細胞懸濁液を細胞紡ぎ、細胞はスライドに付着させる。この方法は、亜核組織の検出に対する感度を向上させ、免疫蛍光、DNA、および蛍光をその 中で の蛍光、DNA、およびRNA蛍光(FISH)およびこれらの検出方法の組み合わせに適用可能である。3Dスライド法の応用例として、Cot-1 RNA FISHが新生RNAを検出することが示されています。3Dスライド法は、精巣胚芽細胞分化中のクロマチン構造、DNA、RNA間の空間的関係の詳細な検討を容易にする。

3D スライドの代表的な結果を図 2に示します。この実験では、コト1RNA FISHを、抗CBX1およびγH2AX抗体を用いた免疫染色と共に新生転写を検出するために行った。RNA FISHと免疫染色を組み合わせるために、免疫染色を最初に行い、続いて3に記載されるRNA FISHを行った。CBX1は、XY体(または性体)と呼ばれるメイオシスにおける中心血球ヘテロクロマチンおよびサイレントセックス染色体に局部するヘテロクロマチンタンパク質である。γH2AXはヒストン変異体H2AXのリン酸化形態であり、XY体上に局地化する。この写真では、Cot-1信号は、ユークロマティック領域に蓄積しますが、心間血球ヘテロクロマチンとXY体から除外されています。
表面広がり調製中、低張性溶液による処理は核を膨らみ、核下構造を物理的に拡張する。この一般的な方法は、単一のzプレーン1ですべてのメオティック染色体をキャプチャするのに最も適しています。低張治療後の3Dスライド法と表面広がりの違いを明らかにするために、各実験のパキテイン精子細胞の代表的な写真が、蛍光顕微鏡を用いて同じ倍率を用いて示されている(図2A 及び 2B)。低張液で処理された表面スプレッドでは、三次元クロマチン構造が破壊され、すべてのメオティック染色体軸を単一のZ平面内で捕捉することができます。しかし、3Dスライド調製は、クロマチン構造を維持します。
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50819/50819fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50819/50819fig1.jpg"> 図 1.3Dスライド法の概略図。3Dスライド法は、3次元クロマチン構造を保持することができる。スライドの立体的性質により、複数のzセクションを含むデータ取得は、核をカバーする必要があります。
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50819/50819fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50819/50819fig2.jpg"> 図 2.3Dスライド法と表面の比較は、同じ倍率で低調処理後に広がります。(A)3Dスライドを用いて、Cot-1 RNA FISH(cy3)および抗CBX1(fitc)およびγH2AX(cy5)抗体による免疫染色が行われる。単一のzセクションを有するパキテネ精子細胞が示されている。(B)表面広がりを用いて、抗SCP3およびγH2AX抗体による免疫染色が行われる。パキテイン精子細胞が示されている。円: XY ボディ。バー:10 μm。

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Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

ここでの材料は精巣生殖細胞の三次元クロマチン構造を維持するために開発された方法を記述する。これは三次元(3D)スライド法と呼ばれます。この方法は、亜核組織の検出感度を向上させ、免疫蛍光、DNA、および蛍光をその 中で の蛍光(FISH)に適用可能です。

精巣生殖細胞の三次元クロマチンアーキテクチャを保存するためのスライド調製方法

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K ビュー.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. ここでの材料は精巣生殖細胞の三次元クロマチン構造を維持するために開発された方法を記述する。これは三次元(3D)スライド法と呼ばれます。この方法は、亜核組織の検出感度を向上させ、免疫蛍光、DNA、および蛍光をその 中で の蛍光(FISH)に適用可能です。

ビデオ: Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

クロマチン広がるマウス卵母細胞の進行を前期から中期 II の分析のための準備

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

遺伝学

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

ゼブラフィッシュの精子細胞からのマイオサイト染色体の広がりの調製

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

標準的な実験装置を用いてマウス精巣からパチテン精子細胞と精子を濃縮

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

発生生物学

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

抗体標識用ショウジョウバエ多糸染色体のカボチャの準備

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

生物学

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

生きた無傷組織における細胞分裂解析のためのショウジョウバエ・ラーバルとプパル精巣の調製

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

フライ精巣における撮像中心体

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;精巣

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法<em&gt;シロイヌナズナ</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

蛍光DNAための簡単​​な方法<em&gt;その場で</em&gt;ぺしゃんこ染色体へのハイブリダイゼーション

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on the surface of slides (rather than dropping them from a height), we demonstrate an optimized technique on mouse spermatocytes that was first described in 1997. This method is widely used in laboratories to study mammalian meiosis because it yields a plethora of high quality nuclei undergoing substages of prophase I. Seminiferous tubules are first placed in a hypotonic solution to swell spermatocytes. Then spermatocytes are released into a sucrose solution to create a cell suspension, and nuclei are spread onto fixative-soaked glass slides. Following immunostaining, a diversity of proteins germane to meiotic processes can be examined. For example, proteins of the synaptonemal complex, a tripartite structure that connects the chromosome axes/cores of homologs together can be easily visualized. Meiotic recombination proteins, which are involved in repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination, can also be immunostained to evaluate progression of prophase I. Here we describe and demonstrate in detail a technique widely used to study mammalian meiosis in spermatocytes from juvenile or adult male mice.

Meiosis is the developmental process by which gametes are formed through a single round of DNA replication and two successive rounds of chromosome segregation. Mammalian meiosis can be examined by utilizing a technique to prepare meiotic chromosome spreads. Here, we demonstrate a method of preparing surface-spread nuclei from mouse spermatocytes.

マウス精母細胞から減数分裂期染色体の準備をスプレッドします。

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

精巣生殖細胞の三次元クロマチンアーキテクチャを保存するためのスライド調製方法

要約

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クロマチン広がるマウス卵母細胞の進行を前期から中期 II の分析のための準備

ゼブラフィッシュの精子細胞からのマイオサイト染色体の広がりの調製

標準的な実験装置を用いてマウス精巣からパチテン精子細胞と精子を濃縮

抗体標識用ショウジョウバエ多糸染色体のカボチャの準備

生きた無傷組織における細胞分裂解析のためのショウジョウバエ・ラーバルとプパル精巣の調製

フライ精巣における撮像中心体

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備

ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法

蛍光DNAための簡単な方法

マウス精母細胞から減数分裂期染色体の準備をスプレッドします。

精巣生殖細胞の三次元クロマチンアーキテクチャを保存するためのスライド調製方法

要約

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クロマチン広がるマウス卵母細胞の進行を前期から中期 II の分析のための準備

ゼブラフィッシュの精子細胞からのマイオサイト染色体の広がりの調製

標準的な実験装置を用いてマウス精巣からパチテン精子細胞と精子を濃縮

抗体標識用ショウジョウバエ多糸染色体のカボチャの準備

生きた無傷組織における細胞分裂解析のためのショウジョウバエ・ラーバルとプパル精巣の調製

フライ精巣における撮像中心体

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備

ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法

蛍光DNAための簡単​​な方法

マウス精母細胞から減数分裂期染色体の準備をスプレッドします。

蛍光DNAための簡単な方法