1。コナジラミコロニーのメンテナンス<ol><li> 環境条件：コナジラミコロニーを制御成長室で維持されるべきである。相対湿度、温度、光周期、および光強度の制御は、最適なコロニー増殖（ 図1）に必須である。 28℃の温度、30〜50％相対湿度、および14時間光周期が18日で羽化（今回は植​​物宿主によって異なります）に卵から開発してコロニーが得られます。相対湿度は、昆虫や植物の真菌病原体の増殖を阻止するために70％以下に維持されるべきである。肥料率と水やりは真菌病原体と塩の蓄積を阻止するために小さくしなければならない。コロニーのための光強度はかなり高くなければならない。キャノピーの高さで約800〜1,000フィートキャンドルを生成するのに十分な数で使用するVHO蛍光灯（ すなわち 。綿、インゲンマメ、ライマメ、トマト）ほとんどの植物に適しています。清潔さは不可欠である最適な飼育条件を維持するためにコナジラミコロニー。 </li><li> コロニーケージ：コナジラミはなく成長部屋に無料ではなく、ケージの中で植物に維持されるべきである。ケージは様々な材料で構成することができますが、考慮しなければなりません：換気、アクセスのしやすさ、必要とされるコナジラミ個体群を生成するのに十分な植物を維持するために、コナジラミエスケープまたは浸潤し、十分なサイズのを防止する機能。良好な結果がオーガンザプラスアルミスクリーニング（強度）と同様コナジラミ防スクリーニング（特定の機器および消耗品の表を参照）で得られた。 </li><li> コロニープラント準備：コナジラミコロニーを開始するときに選択した植物の種が重要な考慮事項です。工場は崩壊せずに高い昆虫の人口を支えることができるはずです。 nonviruliferousコロニーのために選択された工場は、植民地の汚染を避けるために送信されるように意図されたとviruliを維持している場合、ウイルスやウイルスのための非宿主であるべきferousコロニー、それがウイルスの宿主であることが必要です。植物は植民地に導入されたの18日以内に、新成人の出現をサポートするために、かなり迅速に成長する必要がありますが、それほど早く4週間以内にケージを脱却する。彼らはしばしば背品種と同様の葉面積を生成するが、茎の伸長せずにドワーフ、ブッシュ、またはパティオ型植物品種をお勧めします。 </li><li>コナジラミや他の昆虫を除外ケージ内温室で植民地のためにリア植物に非常に重要です。彼らは植民地に入る前にコナジラミ、アザミウマ、またはダニがはびこっている植物の使用は、コロニーが崩壊する可能性があります。寄生植物はまた、ウイルス感染の調査を妨害する昆虫が媒介するウイルスに感染する可能性を持っている。 </li></ol> 2。コナジラミコロニー設立<ol><li>クリーンコナジラミを使用して初めてコロニーを開始 - 植物ウイルス、他の昆虫や昆虫病原体の無料のものを。これらを得ることができる共同研究者から、またはフィールドから。フィールドが収集した場合、コナジラミは、植物ウイルスの非宿主植物に少なくとも8週間飼育し、それらが植物ウイルスの自由であることを確認するため、プラントの症状の有無を確認するべきである。 </li><li>週1：植物の最初のケージにきれいなコナジラミを紹介。コナジラミは、既知数の吸引によって、またはそっとコロニーへの要求に応じて、別のソース工場からコナジラミを振ることにより導入することができる。 1週の間に、コナジラミは、植物の葉の表面の下側に卵を産卵している。おおよその人口規模は、卵を産むために使用、大人の人数と、問題の宿主植物のメスコナジラミによる産卵数の平均値に基づいて、それぞれの出現のために予測することができる。 </li><li> 2週目：卵を産むために、新しい宿主植物にコナジラミを導入することにより、別のケージを開始します。週1で起動しケージ内の植物は卵、葉の裏側（ 図2）をカバーするいくつかの未熟コナジラミを持つことになります。いくつかの1週の間に導入成人コナジラミはまだ生きているでしょう。 </li><li>週3：卵を産むために新しい植物にコナジラミを導入することにより、第三のケージを開始します。週1で起動しケージ内の植物が未熟なだけでなく、新興多くの新成人のコナジラミになり、成人コナジラミ人口の非常に顕著な増加があるはずです。週2で始まっケージ内の植物は葉の裏側をカバーする多くの卵や未熟コナジラミを持つことになります。 </li><li>週4：卵を産むために新しい植物にコナジラミを導入することにより、第四のケージを開始します。週1で起動しケージ内の植物は約一週間後の出現であり、多くの大人のコナジラミを持つことになります。週2で始まっケージ内の植物は新興多くの新しい成人コナジラミを持つことになりますし、コナジラミ人口の非常に顕著な増加があるはずです。 3週の間に開始したケージ内の植物は葉の裏側をカバーする多くの卵や未熟コナジラミを持つことになります。 </li><li>最初の4おしっこの後毎週KS：毎週、新しい、きれいなケージに新工場に第四の最古のケージ（ケージは週1で起動し）から成人コナジラミを導入することにより、新しいケージを開始。古いケージは削除され、その植物は破棄されるべきである。これらのコナジラミは、約1週間後に出現しています。病原体を持つ植民地の場合、これらのコナジラミは、新工場にウイルスを送信するだけでなく、コナジラミ次世代の卵を産む。 </li><li>第3週のケージの中に出てくるコナジラミを使用する伝送実験を計画します。よりコナジラミが必要な場合は、植物の数字を大きくすることができ、よりコナジラミはコナジラミの集団を増加させるために1週間保持器に添加することができる。 </li></ol> 3。試験植物の接種のための方法<ol><li>高い伝送速度を保証するには：1）コナジラミは、伝送速度が低下します昆虫の損傷を防ぐために、静かに、可能な限り処理しなければなりません、2）EITするコナジラミに利用可能十分な葉面積が存在する必要があります彼女のプローブまたはフィード。取得時刻又は取得宿主植物の数の増加の増加は、取得又は接種アクセス期間のいずれかで混雑による試験植物に感染性の低い率を高めることができる。 </li><li> コナジラミのコレクション。以下は、実験目的のために必要コナジラミの正確な数字の集合や移動するための手順です。例えば抵抗スクリーニングのために必要とされるようにコナジラミの大規模な番号を移動するには、それは静かに試験植物やウイルスに感染した買収ホスト（およびそれ以降試験植物）にわたってコナジラミが出没する植物を振ることだけが必要である。集約効果を最小限にするために多くの場所を介して植物を振るようにしてください。 </li><li>新たに浮上して成人コナジラミは、（1-3日後に出現）高活性であり、それほど頻繁に餌最高伝送速度4を与える傾向にある。古いコナジラミはまだ低い周波数で送信するけど。テストプラントごとに複数のコナジラミ（PLA当たり15-40NTは）プラント当たりコナジラミ1の比が伝送率の高さのために使用されるべきでは、多くの場合、許容できないほど低い伝送レート3,4をもたらす。数が取得及び試験植物のウイルスや種依存が必要でした。 </li><li>吸引デバイスとコレクションバイアルを組み立てます。 （ 図3） </li><li>片手で、コナジラミを収集することができるように含まれているコロニーケージの内側に黄色のプラスチック製のカードを保持します。優しく大人コナジラミが飛ぶことを奨励する植物をタップします。コナジラミはイエローカードに魅了され、彼らはアスピレーター、非常に穏やかな息を使って収集することができるカードに植物から飛びます。植物を食べているコナジラミを吸引しないでください。給餌ので植物は彼らのスタイレットを破るでしょうそれらをオフに引っ張ってくるとのどちらかを取得または（ 図4）ウイルスを送信することが、彼 ​​らができないレンダリングながらスタイレットは、プラント内に埋め込 ​​まれている。 </li><li>シングルコッレに約20成人コナジラミを収集繰り返さ抱負（ 図5）から、昆虫に物理的な損傷を最小限に抑えるためctionバイアル。 </li><li>コナジラミはタッピングから混乱している間、コレクションバイアルを変更するには、静かにパラフィルムで硬い表面とキャップでバイアルをタップします。 </li><li>アスピレーターに新しい収集バイアルを入れ、必要コナジラミの数が収集されるまで繰り返します。コナジラミは、数時間室温で回収バイアル中に残ることができる。 </li><li> 買収。コナジラミは、ウイルスに感染した植物の上に置き、48〜72時間のために感染した植物に供給するために許可されています。 72時間よりも長く取得期間は、一般的に伝送速度を増加させない。それぞれ読み取り専用またはsemipersistentようにして、1時間、数時間で送信これらのウイルスについては、十分な捕捉アクセス期間（ 表1）である。コナジラミは、単一の植物や昆虫にを閉じ込める檻の植物への自由なアクセスを与えられているときに最良の結果が得られます複数の工場。しかし、いくつかの実験は、クリップケージを使用することができる場合には、特定の葉からの取得を要求する。クリップケージを使用する場合には、葉の裏側のためのコナジラミ餌の好みに対応することが重要です。また、クリップケージにコナジラミの混雑と、伝送速度を減らすことができます - 送信の許容率は、直径2.5cmのクリップケージあたり10女性コナジラミを使用して達成されている。 </li><li> 接種。接種のサイズに適したケージを準備し、内部試験植物を配置。唯一つの植物を接種する場合は単一の植物ケージを検討してください。複数の植物が小さいPVCフレーム/オーガンザバッグケージまたはアルミニウムケージ（ 図6）を考慮接種する場合。接種に使用されるケージのサイズは、接種される植物（複数可）の大きさも若干大きくなければならない。コナジラミが近い植物キャノピーに保たれ、空き容量の多くを与えられていないときに、より高い伝送速度が得られる。 </li><li>買収ホストからコナジラミの収集実験のニーズによって異なります。小さな数字が必要な場合は、上記のようにコナジラミを吸引。工場の近くにケージの中にコナジラミのコレクションバイアルを置き、蓋（ 図7）を取り外します。バイアルを開き、コナジラミを離したり、反転させ、穏やかにコナジラミを解放するためにバイアルをタップします。大きな数字が必要な場合は、単に試験植物が配置されているケージにコナジラミと取得工場を移動し、優しく取得宿主植物からコナジラミを振る。導入の両方のタイプの場合は、集約を最小限に抑え、均一な接種を保証するために、植物全体でコナジラミを配布するようにしてください。 </li><li>コナジラミがウイルスに再び依存し、適切な時間のためのプローブまたは供給することを許可するとある程度宿主植物（ 表1）。 </li><li>あることコナジラミを保証するために接種アクセス期間中に少なくとも一度コナジラミをチェックケージを開き、それぞれの植物にいくつかの葉を上に回して、プローブまたは給餌。 </li><li>長い接種アクセス期間に、植物の上部を磨いて、植物に再配布するコナジラミを奨励するために（竹の棒または同等を使用して）静かに植物を乱す。コナジラミの再配布は、集計にコナジラミの自然な傾向に対抗することによって、より高い伝送速度を確保するのに役立ちます。 </li><li> 終了は。接種アクセス期間は承認の化学物質とコナジラミを殺すことによって終了します。接触殺虫剤素早く次の週との接触殺虫剤（ 図8）で逃したもので開発任意のコナジラミを終了するために、成人コナジラミおよび全身殺虫剤を終了する：2殺虫相次いを適用します。このような殺虫石鹸などイミダクロプリドやピメトロジンなどの全身殺虫剤として接触殺虫剤は、良好な成功を収めて使用されている。 </li></ol>

<ol>
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利害の衝突は宣言されていない。

ここで説明する方法は、二十年にわたって開発され、コナジラミトランスミッション、動作、および生物学の多くの研究が提供する基本的な情報に基づいています。多くの出版物があるので、この原稿はこの技術を開発するために使用されるデータの種類を説明するためにレビューすると、いくつかの選択された特定の出版物に主として指す。それはコナジラミが脚とアンテナの破壊以来、優しく扱われることを、この手順では非常に重要なのは、異常行動と伝送率の低下につながることができます。掃除機やその他の機械的な吸引装置を持つコレクションは、良い結果をもたらしませんでした。成功のための別の考慮事項は、試験植物〜100％の透過率を得るために使用コナジラミの数は、植物宿主とウイルスの組み合わせごとに決定されなければならないということである。この最適比は、一度確立される必要がある。最良の結果は、それらグラム以来、若い成人コナジラミを（1-3日過去の出現）を使用して得られている伝送の最高速度をアイブ。高齢者を用いることができるがコナジラミの大きい番号が送信それらの低減率を補償するために必要とされる。女性は、彼らがより頻繁に男性よりも養うことから、男性よりも高いレートで伝送することが知られている。しかしそれは、通常、送信のために男女を分離するための時間価値はありません。この手順は、研究者のリソースやニーズに合わせて多くの方法で変更することができる。 複数のウイルスを扱うときには、ウイルスの非宿主植物で飼育コナジラミの単一コロニーを維持するのが最善です。これらコナジラミは、取得するためのウイルスに感染した植物に置か収集することができ、次いで、取得した後、コナジラミを試験植物に再度移動させることができる。コロニーのために意図された植物は別のウイルスに感染させる可能性があり、それらをコナジラミの導入を防ぐために、ケージに温室で栽培されるべきである。ダニ、アザミウマ、および他の植物の害虫とのこれらの植物の寄生は、Hが損なわれる可能性がコロニーのealth、それが崩壊する原因となります。ついにコロニー植物の水やりには注意して行う必要があります。これらの植物は非常に多くのコナジラミと、通常よりも低い光条件の給餌によって極度のストレスにさらされています。植物は一度でもoverwateredいる場合養ミックスで泥炭に導入されているルート腐朽菌が問題になることができます。殺菌剤水薬と植物の前処理は、問題のいくつかを排除することができます。 植物ウイルスのコナジラミ送信は時間がかかり、貴重なリソース（成長室など）を必要とすることができますが、それは我々が送信の他の手段を持たないようないくつかのウイルスの伝達のために不可欠です。それはフィールド内の植物をレジストすることが期待されることが変速機の同じ型を使用するとしても、ウイルスに耐性のスクリーニング植物の貴重な手段である。トランスミッションのより人工的な手段の使用は常にヴィルための遺伝資源の評価において最高の結果を生むとは限らないS-抵抗。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Item</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue No.</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whitefly proof screening</td>
			<td>Klayman Meteor Ltd. Petah Tikva 49130, Israel</td>
			<td>---</td>
			<td>BioNet 50 mesh screen Antivirus Insect Screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whitefly proof screening</td>
			<td>Hummert International (www.hummert.com)</td>
			<td>27-4050-1 - 27-4062-1</td>
			<td>BioNet 50 mesh screen Antivirus Insect Screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whitefly Collection Devices</td>
			<td>BioQuip</td>
			<td>1135A</td>
			<td>Can also be made using eye droppers, flexible plastic tubing, plastic vacuum adaptors, and cheesecloth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection vials</td>
			<td>BioQuip</td>
			<td>8909</td>
			<td>Vials used depend on which aspirator is used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow plastic cards</td>
			<td>any company</td>
			<td>---</td>
			<td>Any bright yellow plastic card will work, can be purchased in many places.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whitefly Cages</td>
			<td>---</td>
			<td>---</td>
			<td>These are not commercially available and must be constructed. 60 cm x 60 cm x 60 cm cages work well for us. Our preference is for those constructed of aluminum window screening, nylon organdy, vinyl plastic, with a structure created using aluminum window frames. Doors are attached using piano hinges and sealed with weather stripping; tops of the cages are vinyl plastic. Cages can also be made of 1) plexiglass glued together on the edges with ventilation provided by screened openings cut on the side pieces; 2) large bags of nylon organdy, organza, or 50 mesh whitefly screening with internal supports provided by PVC pipes and fittings cut to desired lengths and assembled inside the bags, 3) wood frames and nylon organdy, organza, or 50 mesh whitefly screening.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transmitting plant viruses using whiteflies

コナジラミ、 半翅目：コナジラミ、タバココナジラミ 、形態学的にindistinquishable種5の複合体は、多くの植物ウイルスのベクトルである。これらのコナジラミ-透過植物ウイルス（Begomovirus、Carlavirus、Crinivirus、Ipomovirus、Torradovirus）のいくつかの属には、重要な食料と繊維作物の新興国や経済的に重要な病原体（9,10,16によって審査）の数百種を含む。これらのウイルスは、そのベクトルには複製されませんが、それにもかかわらず、様々な手段（2,6,7,9,10,11,17によって審査）で大人のコナジラミによって工場から工場へ容易に移動されます。他の人が唯一のプロービングに必要とされている間、これらのウイルスのほとんどコナジラミ供給は、取得及び接種が必要です。これらのウイルスの多くが容易にできない場合、または他の手段によって送信することができない。ウイルス培養、生物学的および分子特性（宿主範囲や症状の識別）3,13のよってメンテナンス、生態2,12は 、ウイルスがコナジラミベクトルを用いた実験のホストに送信されている必要があります。さらに、新たな化学物質14又は化合物15、新たな文化的アプローチ1,4,19の評価、あるいは抵抗性品種7,8,18の選定や開発などの管理への新しいアプローチの開発は、、のためのコナジラミを使用する必要がありますウイルス感染。選択と育種プログラムにおける抵抗性品種の開発のための植物ウイルスのコナジラミトランスミッションの使用は特に7に挑戦している。抵抗のための効果的な選択およびスクリーニングは、植物の多数を採用し、抵抗性遺伝子を有するいくつかの遺伝子型を検出するために接種する植物の100％が必要である。これらの研究は、多くの場合、病原体を持つコナジラミ、年間数回の大規模な番号を使用します。 コナジラミのメンテナンスはここで説明され、数百または数千を生成することができます植物に成人コナジラミ毎週、年間を通して、他の植物ウイルスの汚染なし。コナジラミとウイルスの両方の自由植物は毎週コナジラミ植民地に導入するために生産されている必要があります。コナジラミ培養はコナジラミ病原菌、寄生虫、およびコナジラミ個体数を減らすこと、および/またはウイルスの伝達効率を減らすことができる寄生の自由保たれなければならない。記載された方法で製造コロニーを迅速に、必要に応じて個体数を増減するようにスケーリングすることができ、ウイルスの植物宿主に基づくコナジラミの摂食嗜好に適応するように調整することができる。 nonviruliferousと病原体を持つコナジラミのコロニー：維持できるコナジラミのコロニーの2つの基本タイプがあります。 nonviruliferousコロニーは、ウイルスフリーの植物で飼育コナジラミで構成されており、異なる文化からウイルスを送信するために使用することができますコナジラミの毎週の可用性を可能にする。病原体を持つコナジラミコロニー、ウイルスに感染した植物で飼育コナジラミ成る、ウイルス送信プロセスの1つのステップを省くため、ウイルスを獲得したコナジラミの毎週の可用性を可能にします。

植物ウイルスを送信するためにこれらのコナジラミコロニーの確立と維持のための方法と同様に、操作は研究4,11,12,14と同様に引用していない他の多くの数で正常に使用されている。永続的に送信されるウイルスで、これらのメソッドを使用して、我々は日常的に伝送に干渉する能力（と抵抗誘導化合物の評価）13,14,17,18（のために殺虫剤をスクリーニングする、抵抗のための選択のために100％の透過率の望ましい速度を得ている図9）。ここで説明する手順は、公共および民間の研究施設で、多くの場所に適合させることができるようにしました。 <table border="1"><tbody><tr><td> 伝送の種類 </td><td> アクイジション·アクセス期間（時間） </td><td> 接種アクセス期間（時間） </td><td> REF。 </td></tr><tr><td>非永続</td><td> 1 </tD&gt; <td> 2-24 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Semipersistent </td><td> 6-24 </td><td> 8-24 </td><td> 10、16 </td></tr><tr><td>永続的な</td><td> 48-72 </td><td> 48-72 </td><td>図3、図6、図8、図9 </td></tr></tbody></table> 表1。そのベクトルタバココナジラミ種の錯体。所要時間との関係の異なる種類のウイルスの透過率が高い製造することができる推定時間は、80から100までパーセント伝送に必要ないくつかのケースで修正された公表最小時間に基づいてい潜伏期間とコナジラミ個体、ウイルス、および宿主植物間の違いを考慮し。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig1.jpg" /> 図1。病原体を持つコナジラミコロニーの例。この成長室がbegomovirusとINFEに感染した植物のケージが含まれています病原体を持つのコナジラミとSTED。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig2.jpg" /> 図2。左：コナジラミの幼虫の段階で、 タバココナジラミ MEAMクレード扇子デバロー6約1週間後に出現し、右：大人コナジラミ、多くの植物ウイルスの効果的なベクトル。 <img alt="図3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4332/4332fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig3.jpg" /> 図3。植物ウイルスの送信のためのコナジラミを収集するために使用することができる収集装置のタイプ。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig4.jpg" /> 図4。左：コレクションの準備がコナジラミを示すコナジラミ大人を収集するために使用される黄色のプラスチック製のカード<html> 。右：黄色のプラスチック製のカードからコナジラミの収集。コナジラミは、小さな白い/灰色の斑点のようにカードで見ることができます。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig5.jpg" /> 図5。コナジラミは、買収または接種のどちらかの準備がコロニーから（バイアル中20）吸引によって収集。 <img alt="図6" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4332/4332fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig6.jpg" /> 図6。左上：取得または接種のどちらかのために使用される単一の植物ケージ右上：PVCパイプとオーガンジーで作られた大きなケージ。下段：コナジラミコロニーのために意図された温室含む植物におけるアルミニウム/画面とオーガンジーケージ。 32fig7.jpg &quot;/&gt; 図7。コナジラミは、接種のために単一の植物（または取得）に転送される。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig8.jpg" /> 図8。全身殺虫剤の添加は、水薬コナジラミ接種アクセス期間を終了する。 <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig9.jpg" /> 図9。 トマト黄化葉巻ウイルスに対する抵抗性の評価の下のフィールド工場。すべての植物は5週齢の苗として接種した後、評価のためのフィールドに移植した。前景の植物が抵抗性遺伝資源のラインですが、バックグラウンドで植物は感受性の遺伝資源のラインです。

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Transmitting Plant Viruses Using Whiteflies

の我々の理解と昆虫透過植物ウイルスの多くを管理する当社の能力を改善することは、ベクトルを使用する必要があります。植物ウイルスの昆虫送信がtritrophic相互作用であり、そのようなものとして昆虫、ウイルス、プラントの操作を必要とする。ベクターは、大量に飼育や植物をテストするために、伝送率の高さを確保するような方法で操作する必要があります。コナジラミを飼育し、操作の基本、<em&gt; Bemisaコナジラミ</em&gt;（<em&gt;半翅目：コナジラミ</em&gt;）、経済的に重要なウイルスの大多数を代表するいくつかの新たな植物ウイルス属に属する植物ウイルスのベクターは、提示される。

コナジラミを使用した送信植物ウイルス

Whiteflies, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, a complex of morphologically indistinquishable species5, are vectors of many plant viruses. Several ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

28.7K ビュー.  University of Florida. の我々の理解と昆虫透過植物ウイルスの多くを管理する当社の能力を改善することは、ベクトルを使用する必要があります。植物ウイルスの昆虫送信がtritrophic相互作用であり、そのようなものとして昆虫、ウイルス、プラントの操作を必要とする。ベクターは、大量に飼育や植物をテストするために、伝送率の高さを確保するような方法で操作する必要?...

ビデオ: Transmitting Plant Viruses Using Whiteflies

Testing the Physiological Barriers to Viral Transmission in Aphids Using Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When an uninfected aphid feeds on an infected plant it contracts the virus through the plant phloem. Once ingested, the virus must pass from the insect gut to the hemolymph (the insect  blood ) and then must pass through the salivary gland, in order to be transmitted back to a new plant. An aphid may take up different viruses when munching on a plant, however only a small fraction will pass through the gut and salivary gland, the two main barriers for transmission to infect more plants. In the lab, we use physalis plants to study PLRV transmission. In this host, symptoms are characterized by stunting and interveinal chlorosis (yellowing of the leaves between the veins with the veins remaining green). The video that we present demonstrates a method for performing aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut is preventing viral transmission.
The video that we present demonstrates a method for performing Aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut or salivary gland is preventing viral transmission.

Aphids are effective transmitters of plant viruses. Aphid microinjection of virus, the procedure we will show you today, is a technique allowing researchers to inject virus directly into the hemocoel of the aphid, bypassing the gut, one of the 2 major barriers for virus transmission in a circulative manner. The same technique is also used to inject dsRNA for RNAi.

マイクロインジェクションを使用してアブラムシのウイルス伝播の生理学的障壁のテスト

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When ...

生物学

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well know to have insecticidal properties. One response of tobacco plants to herbivory, or being gnawed upon by insects, is to increase the production of this neurotoxic alkaloid. Here, we will demonstrate how to set up an experiment to address this question of whether a tobacco-adapted strain of the green peach aphid, Myzus persicae, can tolerate higher levels of nicotine than the a strain of this insect that does not infest tobacco in the field.

In this video and assay is demonstrated that tests the tolerance of nicotine to two types of aphids one that infests tobacco plants in the field and one that does not.

人工飼料の実験を使用してアブラムシにニコチン耐性をテスト

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

ウイルス誘導ジーンサイレンシング（VIGS）でタバコbenthamianaとトマト

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

同位体タグ質量分析法を用いたチオールレドックスプロテオームのプロファイリング

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit aroma. Maturity at harvest is one of the key factors influencing the flavor quality of fruits and vegetables1. The validation of robust methods that rapidly assess fruit maturity and aroma quality would allow improved management of advanced breeding programs, production practices and postharvest handling. 
Over the last three decades, much research has been conducted to develop so-called electronic noses, which are devices able to rapidly detect odors and flavors2-4. Currently there are several commercially available electronic noses able to perform volatile analysis, based on different technologies. The electronic nose used in our work (zNose, EST, Newbury Park, CA, USA), consists of ultra-fast gas chromatography coupled with a surface acoustic wave sensor (UFGC-SAW). This technology has already been tested for its ability to monitor quality of various commodities, including detection of deterioration in apple5; ripeness and rot evaluation in mango6; aroma profiling of thymus species7; C6 volatile compounds in grape berries8; characterization of vegetable oil9 and detection of adulterants in virgin coconut oil10. 
This system can perform the three major steps of aroma analysis: headspace sampling, separation of volatile compounds, and detection. In about one minute, the output, a chromatogram, is produced and, after a purging cycle, the instrument is ready for further analysis. The results obtained with the zNose can be compared to those of other gas-chromatographic systems by calculation of Kovats Indices (KI). Once the instrument has been tuned with an alkane standard solution, the retention times are automatically converted into KIs. However, slight changes in temperature and flow rate are expected to occur over time, causing retention times to drift. Also, depending on the polarity of the column stationary phase, the reproducibility of KI calculations can vary by several index units11. A series of programs and graphical interfaces were therefore developed to compare calculated KIs among samples in a semi-automated fashion. These programs reduce the time required for chromatogram analysis of large data sets and minimize the potential for misinterpretation of the data when chromatograms are not perfectly aligned.
We present a method for rapid volatile compound analysis in fruit. Sample preparation, data acquisition and handling procedures are also discussed.

A rapid method for volatile compound analysis in fruit is described. The volatile compounds present in the headspace of a homogenate of the sample are rapidly separated and detected with ultra-fast gas chromatography (GC) coupled with a surface acoustic wave (SAW) sensor. A procedure for data handling and analysis is also discussed.

電子鼻を使用した果実の揮発性の分析

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

マイクロアレイを用いた植物細胞壁ポリマーの糖鎖プロファイリング

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

ルシフェラーゼを発現する組換えウイルスの高スループット滴定

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, several traits are typically characterized using molecular assays to aid in epidemiological studies. These traits include species identification, insecticide resistance, parasite infection status, and host preference. Since populations of the Anopheles gambiae complex are morphologically indistinguishable, a polymerase chain reaction (PCR) is traditionally used to identify species. Once the species is known, several downstream assays are routinely performed to elucidate further characteristics. For instance, mutations known as KDR in a para gene confer resistance against DDT and pyrethroid insecticides. Additionally, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) or Plasmodium parasite DNA detection PCR assays are used to detect parasites present in mosquito tissues. Lastly, a combination of PCR and restriction enzyme digests can be used to elucidate host preference (e.g., human vs. animal blood) by screening the mosquito bloodmeal for host-specific DNA. We have developed a multi-detection assay (MDA) that combines all of the aforementioned assays into a single multiplex reaction genotyping 33SNPs for 96 or 384 samples at a time. Because the MDA includes multiple markers for species, Plasmodium detection, and host blood identification, the likelihood of generating false positives or negatives is greatly reduced from previous assays that include only one marker per trait. This robust and simple assay can detect these key mosquito traits cost-effectively and in a fraction of the time of existing assays.

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

マラリア蚊。送信のためのマルチ検出分析

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

タバコ一過性発現系を使用したMAPKシグナル伝達経路の空間再編のイメージング

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...